CN112501151B - 一种腈水合酶突变体及其应用 - Google Patents

一种腈水合酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种腈水合酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明对腈水合酶氨基酸基序中β亚基上的第48号构建的单点突变体L48D和L48H的酶活分别为750.26±1.63U/mg、820.01±0.98U/mg，与未进行改造的野生型腈水合酶的比酶活220.30±2.28U/mg相比，都有明显的提高。其中，突变体L48D与突变体L48H的酶活分别为野生型的3.4和3.7倍。上述这两个氨基酸残基的突变显著改善腈水合酶催化活性，有利于应用于工业上精细化学品如烟酰胺的生产，提高催化效率，降低生产成本。

Description

一种腈水合酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种腈水合酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)，是一类可以催化腈类物质通过水合反应转化为高附加值酰胺类化合物的金属酶，在精细化学品烟酰胺的工业生产上有着巨大的应用潜力。酰胺类的生物法生产技术是生物法替代化学法的典型案例，具有绿色环保、反应条件较温和、安全系数高等优势，符合可持续发展和绿色生产理念。
酰胺类产品在工业、农业及医药等领域有着极大的应用价值，尤其以烟酰胺和丙烯酰胺的生物催化最为常见。其中，烟酰胺是一种重要的化工生产原料，用途广泛。烟酰胺本身为维生素B12的辅酶，可以作为维生素补剂，还可用来合成多种维生素衍生物，市场前景广阔。
腈水合酶不仅在应用层面展现了重要作用，另外，作为一种能够结合钴离子或铁离子的金属酶，其催化活性和稳定性也引起了研究者的广泛关注。腈水合酶通常由α和β两个亚基构成，研究发现，目前已报道的原核生物来源的腈水合酶大都存在稳定性差、催化活性低、催化底物谱窄的问题。许多研究团队通过构建共价键相互作用、盐键和添加Link以及亚基融合等策略提高其稳定性，但是几乎没有通过酶的改造同时提高其酶活和稳定性，甚至拓宽底物谱的报道。
温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillus thermarum TA2.A1)来源的腈水合酶具有较好的热稳定性，基于这一特性，可以尝试提高其催化活性及拓宽底物谱。目前工业上的大宗化学品生产，比如丙烯酰胺和烟酰胺，除了受限于热稳定性外，催化效率也不高。因此，提高腈水合酶的稳定性和催化活性具有极大的应用价值和广阔的应用前景。
发明内容
针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种来源于温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillus thermarum TA2.A1)的腈水合酶的氨基酸基序及其在底物催化生产上的应用。
本发明的第一个目的是提供腈水合酶突变体，含有α亚基、β亚基以及调控蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。
在本发明的一种实施方式中，所述β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5。
在本发明的一种实施方式中，所述调控蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体。
本发明的第四个目的是提供所述腈水合酶突变体的微生物细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET系列质粒为载体。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒为pET-24(+)。
本发明的第五个目的是提供一种提高腈水合酶酶活力的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的腈水合酶β亚基第48位亮基酸突变为天冬氨酸或组氨酸。
本发明的第六个目的是提供一种重组表达所述腈水合酶突变体的方法，将表达所述腈水合酶突变体的微生物细胞接种于LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于24℃诱导12-16h。
本发明的第七个目的是提供上述的腈水合酶突变体或含有腈水合酶突变体的微生物细胞在生产含烟酰胺的产品中的应用。
有益效果：
本发明提供了一段Cal.t-NHase的氨基酸基序及突变体的氨基酸基序，该基序与其他来源的腈水合酶基序在α亚基上酶活中心的108、111和113位点均是高度保守的，它们分别与钴离子形成配位键。本发明对腈水合酶氨基酸基序中β亚基上的第48号构建的单点突变体L48D和L48H的酶活分别为750.26±1.63U/mg、820.01±0.98U/mg，与未进行改造的野生型腈水合酶的比酶活220.30±2.28U/mg相比，都有明显的提高。其中，突变体L48D的酶活约为野生型的3.4倍，突变体L48H的酶活约为野生型的3.7倍。上述这两个氨基酸残基的突变显著改善腈水合酶催化活性，有利于应用于工业上精细化学品如烟酰胺的生产，提高催化效率，降低生产成本。
附图说明
图1：纯酶的SDS-PAGE电泳图，M：蛋白Marker，1:pET24a，2：WT，3：L48D，4：L48H。
图2：Cal.t NHase野生酶WT与突变体L48D、L48H、A41K、Y46E以及V126K的比酶活。
图3：Cal.t NHase突变体L48H应用生产烟酰胺。
具体实施方式
1、培养基：
LB培养基(L-1)：胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物5g，pH 7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉20g。
无甘油TB培养基(L-1)：胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，KH2PO4 2.31g，K2HPO412.54g。
2、缓冲液：
结合缓冲液：20mM Na2HPO4·12H2O，280mM NaCl，6mM KCl，pH 7.4
洗脱缓冲液：20mM Na2HPO4·12H2O，280mM NaCl，6mM KCl，2.5mM d-Desthiobiotin，pH 7.4。
腈水合酶的酶活力(U)：单位酶活力定义为25℃下，每分钟催化烟腈生成1μmol烟酰胺所需要的酶量。
腈水合酶的比酶活(U/mg)：每毫克腈水合酶所具有的酶活力。
实施例1：腈水合酶突变体的质粒构建
以野生型质粒pET24a(+)-Cal.t WT(张赛兰,李婷,程中一等.新型耐热腈水合酶的异源表达及其催化工艺研究[J].食品与发酵工业,2020,第46卷(14):108-113中pET24a(+)-Cal.t NHase)为模板，将突变位点L48D和L48H设计在引物上，通过PCR扩增出碱基序列发生突变的质粒，所用引物序列如表1所示，扩增体系如表2所示。
PCR扩增反应条件为95℃预变性3min，98℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min45s，72℃延伸5min，共30个循环。将PCR产物用DpnI消化酶消化2-3h，转化E.coli DH5α，涂布于含50mg/L卡那霉素的LB培养基平板，37℃倒置过夜培养。
挑取单菌落接种于5mL LB培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜，使用商品化质粒抽提试剂盒获得重组质粒，由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序验证，最终得到重构质粒pET24a(+)-L48D，pET24a(+)-L48H。
表1引物序列
Figure BDA0002826654010000031
(注：F代指上游引物，R代指下游引物)
表2 PCR扩增体系
Figure BDA0002826654010000032
Figure BDA0002826654010000041
实施例2：野生酶WT与各突变体的表达与纯化
步骤1：将实施例1获得的Cal.t NHase的野生型pET24a(+)-Cal.t WT及重构质粒pET24a(+)-L48D，pET24a(+)-L48H分别转化E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落至5mL LB培养基，37℃、200rpm条件下培养7-8h。将种子液按1％(v/v)接种量转接至100mL 2×YT培养基，37℃、200rpm条件下培养至OD600至0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)以及0.1g/L的CoCl2·6H2O，改变培养温度为24℃，诱导表达12-16h。
步骤2：采用亲和层析的方法纯化野生型WT及其2个突变体，纯化柱为GE公司的StrepTrap HP 1mL柱。在10000rpm条件下离心3min收集菌体细胞，用20mL结合缓冲液重悬，于冰水混合物中超声破碎。破碎液在4℃、12000rpm条件下离心30min，取上清液过0.22μm有机滤膜。纯化柱在用结合缓冲液平衡后，进行上样，然后用结合缓冲液洗去杂蛋白，目的蛋白用100％的洗脱缓冲液洗脱并收集。蛋白浓度使用Bradford蛋白浓度检测试剂盒进行定量。采用SDS-PAGE检测目的蛋白的纯化质量，检测如图1所示，可见野生型及其突变体所表达的蛋白在纯化后蛋白条带单一，纯化质量高。
实施例3：Cal.t NHase的野生型及突变体催化效率检测
用10mM KPB(pH 7.4)溶液将WT及其突变体纯酶的浓度稀释至0.5mg/mL，取10μL至1.5mL离心管中，置于25℃金属浴上。向离心管中加入490μL底物(200mM烟腈溶液)，充分涡旋混匀，25℃下反应10min，然后加入500μL纯乙腈溶液进行终止。将反应液用纯乙腈溶液稀释适当倍数，过0.22μm滤膜。液相检测方法：流动相组成为乙腈：水＝1：2(v/v)，流速为0.6mL/min，检测波长为215nm，柱温为40℃，测定反应体系中产物烟酰胺的生成量。WT及突变体的比酶活计算结果如图2所示，野生酶WT的比酶活为220.30±2.28U/mg，突变体L48D和L48H的酶活分别为750.26±1.63U/mg、820.01±0.98U/mg。
两突变体酶活较野生型分别提高了约70％和73％，即当对该位点氨基酸残基发生突变时，腈水合酶的比酶活均有不同程度地提高，说明上述这个个氨基酸残基可能在两个亚基的关键结构域，对于腈水合酶的催化活性具有重要作用。
实施例4：腈水合酶野生型和突变体在烟酰胺生产上的应用
将实施例2步骤1得到的BL21(DE3)/pET24a(+)-Cal.t NHase-L48H菌液离心收集，水洗后再次离心收集，10mmol/L、pH＝7.4H3PO4缓冲溶液重悬浮，调整至菌液OD600＝8。调整温度为30℃，烟腈以0.4mol/L的终浓度加入到OD600＝8的菌液中，并不断搅拌，每隔6min添加烟腈，添加量为0.4mol/(L·次)。反应体系中产物烟酰胺的生成量的测定同实施例3，计算得到烟酰胺的浓度为706g/L，如图3所示。文献中报道的野生型腈水合酶的烟酰胺产量为495g/L(张赛兰,李婷,程中一等.新型耐热腈水合酶的异源表达及其催化工艺研究[J].食品与发酵工业,2020,第46卷(14):108-113)，相对来说催化提高了42.6％。
对比例1：突变体pET24a(+)-L48H与pET24a(+)-Y46E催化效率比较
具体实施方式同实施例1，区别在于，对位点46位的酪氨酸进行突变为谷氨酸，按照实施例2制备得到酶突变体，并用于烟酰胺的催化反应，结果如图2所示，其催化烟腈的酶活为375.29±0.65U/mg，相比实施例1提供的突变体L48H低了54％，突变体pET24a(+)-L48H酶活显著高于pET24a(+)-Y46E。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种腈水合酶突变体及其应用
<130> BAA201487A
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 210
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Asp Asn Asn Lys Val His His His His Pro His Pro Glu Ser
1 5 10 15
Phe Trp Ser Ala Arg Ala Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu Lys
20 25 30
Gly Ile Leu Ser Ser Asp Ala Ile Asp Arg Val Val Gln His Tyr Glu
35 40 45
His Glu Leu Gly Pro Met Asn Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ala Trp
50 55 60
Thr Asp Pro Ala Phe Lys Gln Arg Leu Leu Glu Asp Pro Glu Thr Val
65 70 75 80
Leu Arg Glu Leu Gly Tyr Tyr Gly Leu Gln Gly Glu His Ile Arg Val
85 90 95
Val Glu Asn Thr Asp Thr Val His Asn Val Val Val Cys Thr Leu Cys
100 105 110
Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Leu Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys
115 120 125
Glu Pro Thr Tyr Arg Ser Arg Ile Val Lys Glu Pro Arg Lys Val Leu
130 135 140
Arg Glu Glu Phe Gly Leu Asp Leu Pro Asp Thr Val Glu Ile Arg Val
145 150 155 160
Trp Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Tyr Met Val Leu Pro Gln Arg Pro
165 170 175
Glu Gly Thr Glu Gly Met Thr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Ile Val Thr
180 185 190
Arg Asp Ser Met Ile Gly Val Ala Lys Val Gln Pro Ser Ser Val Thr
195 200 205
Val Arg
210
<210> 2
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Asn Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Met Asp Gly Phe Gly Lys Ile
1 5 10 15
Ile Arg Glu Glu Asn Glu Pro Leu Phe His Lys Asp Trp Glu Arg Ile
20 25 30
Ala Phe Gly Leu Leu Ile Gly Thr Ala Gly Gln Gly Leu Tyr Asn Leu
35 40 45
Asp Glu Phe Arg His Ala Ile Glu Arg Met Asn Pro Val Asp Tyr Leu
50 55 60
Thr Ser Gly Tyr Tyr Gly His Trp Val Ala Ser Ile Ala Thr Leu Leu
65 70 75 80
Val Glu Lys Gly Ile Leu Asp Ala Ser Glu Leu Val Ser Arg Thr Gln
85 90 95
Thr Tyr Leu Ala Gln Pro Asp Thr Lys Thr Pro Arg Arg Glu Asn Pro
100 105 110
Glu Leu Val Asn His Leu Glu Gln Val Ile Lys Val Gly Val Ser Thr
115 120 125
Val Arg Glu Val Ser Ser Ala Pro Arg Phe Asn Val Gly Asp Arg Val
130 135 140
Lys Thr Lys Asn Ile His Pro Ser Gly His Thr Arg Leu Pro Arg Tyr
145 150 155 160
Ala Arg Asp Lys Tyr Gly Val Ile Ala Met Tyr His Gly Ala His Val
165 170 175
Phe Pro Asp Ala Asn Ala His Gly Lys Gly Glu Ser Pro Gln His Leu
180 185 190
Tyr Cys Ile Arg Phe Glu Ala Asn Glu Leu Trp Gly Ile Gln Gln Gly
195 200 205
Glu Ala Val Tyr Ile Asp Leu Trp Glu Ser Tyr Leu Glu Pro Val Ser
210 215 220
His
225
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Glu Lys Asn Cys Val Ser Gln Ser Val Asp Ser Lys Ile Ala Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Glu Ser Ala Ala Pro Pro Arg Lys Asn Gly Glu Leu Val Phe
20 25 30
Glu Glu Pro Trp Glu Arg Arg Ser Phe Gly Met Ala Leu Ala Leu Tyr
35 40 45
Glu Glu Lys Arg Tyr Thr Ser Trp Asp Asp Phe Arg Thr Arg Leu Ile
50 55 60
Gln Glu Ile Ala Lys Trp Glu Ser Ser Glu Asn Gln Asp Lys Leu Asp
65 70 75 80
Trp Asn Tyr Tyr Glu His Trp Leu Ala Ala Leu Glu Gln Leu Val Val
85 90 95
Glu Thr Gly Met Ile Asp Lys His Asp Ile Asp Ala Arg Thr Lys Glu
100 105 110
Phe Leu Ser Gly Glu Arg Asp Glu Phe Phe
115 120
<210> 4
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Asn Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Met Asp Gly Phe Gly Lys Ile
1 5 10 15
Ile Arg Glu Glu Asn Glu Pro Leu Phe His Lys Asp Trp Glu Arg Ile
20 25 30
Ala Phe Gly Leu Leu Ile Gly Thr Ala Gly Gln Gly Leu Tyr Asn Asp
35 40 45
Asp Glu Phe Arg His Ala Ile Glu Arg Met Asn Pro Val Asp Tyr Leu
50 55 60
Thr Ser Gly Tyr Tyr Gly His Trp Val Ala Ser Ile Ala Thr Leu Leu
65 70 75 80
Val Glu Lys Gly Ile Leu Asp Ala Ser Glu Leu Val Ser Arg Thr Gln
85 90 95
Thr Tyr Leu Ala Gln Pro Asp Thr Lys Thr Pro Arg Arg Glu Asn Pro
100 105 110
Glu Leu Val Asn His Leu Glu Gln Val Ile Lys Val Gly Val Ser Thr
115 120 125
Val Arg Glu Val Ser Ser Ala Pro Arg Phe Asn Val Gly Asp Arg Val
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Lys Thr Lys Asn Ile His Pro Ser Gly His Thr Arg Leu Pro Arg Tyr
145 150 155 160
Ala Arg Asp Lys Tyr Gly Val Ile Ala Met Tyr His Gly Ala His Val
165 170 175
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Tyr Cys Ile Arg Phe Glu Ala Asn Glu Leu Trp Gly Ile Gln Gln Gly
195 200 205
Glu Ala Val Tyr Ile Asp Leu Trp Glu Ser Tyr Leu Glu Pro Val Ser
210 215 220
His
225
<210> 5
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Asn Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Met Asp Gly Phe Gly Lys Ile
1 5 10 15
Ile Arg Glu Glu Asn Glu Pro Leu Phe His Lys Asp Trp Glu Arg Ile
20 25 30
Ala Phe Gly Leu Leu Ile Gly Thr Ala Gly Gln Gly Leu Tyr Asn His
35 40 45
Asp Glu Phe Arg His Ala Ile Glu Arg Met Asn Pro Val Asp Tyr Leu
50 55 60
Thr Ser Gly Tyr Tyr Gly His Trp Val Ala Ser Ile Ala Thr Leu Leu
65 70 75 80
Val Glu Lys Gly Ile Leu Asp Ala Ser Glu Leu Val Ser Arg Thr Gln
85 90 95
Thr Tyr Leu Ala Gln Pro Asp Thr Lys Thr Pro Arg Arg Glu Asn Pro
100 105 110
Glu Leu Val Asn His Leu Glu Gln Val Ile Lys Val Gly Val Ser Thr
115 120 125
Val Arg Glu Val Ser Ser Ala Pro Arg Phe Asn Val Gly Asp Arg Val
130 135 140
Lys Thr Lys Asn Ile His Pro Ser Gly His Thr Arg Leu Pro Arg Tyr
145 150 155 160
Ala Arg Asp Lys Tyr Gly Val Ile Ala Met Tyr His Gly Ala His Val
165 170 175
Phe Pro Asp Ala Asn Ala His Gly Lys Gly Glu Ser Pro Gln His Leu
180 185 190
Tyr Cys Ile Arg Phe Glu Ala Asn Glu Leu Trp Gly Ile Gln Gln Gly
195 200 205
Glu Ala Val Tyr Ile Asp Leu Trp Glu Ser Tyr Leu Glu Pro Val Ser
210 215 220
His
225

Claims (10)

1.一种腈水合酶突变体，其特征在于，含有α亚基、β亚基以及调控蛋白；
所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1；
所述β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5；
所述调控蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3。
2.编码权利要求1所述腈水合酶突变体的基因。
3.含有权利要求2所述基因的重组载体。
4.表达权利要求1所述腈水合酶突变体的微生物细胞。
5.如权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞包括大肠杆菌。
6.如权利要求4或5所述的微生物细胞，其特征在于，所述细胞是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET系列质粒为载体。
7.如权利要求6所述的微生物细胞，其特征在于，所述质粒为pET-24(+)。
8.一种提高腈水合酶酶活力的方法，其特征在于，是将来源于温泉热碱芽孢杆菌（Caldalkalibacillus thermarum）TA2.A1的腈水合酶的β亚基的氨基酸序列的第48位亮基酸突变为天冬氨酸或组氨酸；β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.一种生产腈水合酶的方法，其特征在于，将表达权利要求1所述腈水合酶突变体的微生物细胞接种于LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于24℃诱导12-16 h。
10.权利要求1所述的腈水合酶突变体或权利要求4所述的微生物细胞在生产含烟酰胺的产品中的应用。
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