CN112481158B - 一种用于马铃薯黑痣病的复合微生物菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于马铃薯黑痣病的复合微生物菌剂，所述菌剂包含萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)CICC 20238、多粘芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)ACCC 10122和非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)ACCC 33109；本发明涉及的复合微生物菌剂对马铃薯黑痣病防治效果优良，有效降低了马铃薯黑痣病的发病率，并且具有一定的促生作用。

Description

一种用于马铃薯黑痣病的复合微生物菌剂
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种用于马铃薯黑痣病的复合微生物菌剂。
背景技术
马铃薯是我国四大农作物之一，其块茎富含蛋白质和淀粉，可食用也可用于工业生产。马铃薯种植区域广泛且逐年扩大，重茬土传病害较为普遍，其中马铃薯黑痣病日趋严重且普遍，发病区域不断扩大，一般可造成马铃薯减产15％左右，严重时可造成全部毁灭。马铃薯黑痣病对马铃薯的产量和品质造成了严重的影响。
马铃薯黑痣病(又称茎溃疡病、茎基腐病、丝核菌溃疡病和黑色粗皮病)由立枯丝核菌引起，是一种真菌性病害，以带病种薯和土壤为主要传播途径。病原菌主要危害幼芽、茎基部及茎块。可造成芽腐缺苗、茎腐、立枯、顶端萎蔫或叶片卷曲等症状，成熟时在薯块上形成黑痣，影响其商品以及种薯质量，严重影响了马铃薯产业的发展。
目前我国主要集中于化学农药解决这一问题，但化学农药对土传病害的防治效果并不理想。而且会产生农药残留，破坏土壤环境，造成病原菌抗药性上升，食品安全性降低等问题。微生物防治指的是在微生物的作用下通过寄生、溶菌、激活抗性等多种方式达到抑制病原物活性的病害防治方法。但目前多数微生物菌剂的防治效果并不稳定。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于马铃薯黑痣病的复合微生物菌剂。
一种用于马铃薯黑痣病的复合微生物菌剂，所述菌剂包含萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)CICC 20238、多粘芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)ACCC10122和非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)ACCC 33109；
所述萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)CICC 20238购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
所述多粘芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)ACCC 10122、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)ACCC 33109均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
根据本发明优选的，上述复合微生物菌剂，按重量份计所述萎缩芽孢杆菌5～10份、多粘类芽孢杆菌20～30份、非洲哈茨木霉30～40份。
根据本发明优选的，所述萎缩芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、非洲哈茨木霉的质量比为10:30:40。
优选的，上述复合微生物菌剂每克含有有效活菌数≥35亿个。
上述复合微生物菌剂的制备方法，包括步骤如下：
(1)将萎缩芽孢杆菌CICC 20238接种于LB液体培养基，在30～37℃条件下，经摇瓶培养36～48h，制得液体种子，将制得的液体种子接种于液体发酵培养基A中，调控pH值至7.0～8.0、通气比为1:(0.5～1)、转速100～200转/分，在30～37℃培养36～48h，制得发酵液，将所述发酵液经喷雾干燥得到含有萎缩芽孢杆菌CICC 20238有效活菌数40～60亿/g的固体菌剂A；
(2)将多粘芽胞杆菌ACCC 10122接种于LB液体培养基，在30～37℃条件下，经摇瓶培养36～48h，制得液体种子，将制得的液体种子接种于液体发酵培养基B中，调控pH值至7.0～8.0、通气比为1:(0.5～1)、转速100～200转/分，在30～37℃培养24～36h，制得发酵液，将发酵液与麦饭石1：1混合风干后得含有多粘芽胞杆菌ACCC 10122有效活菌数20～50亿/g的固体菌剂B；
(3)将非洲哈茨木霉ACCC 33109接种于PDA固体培养基，在25～30℃条件下固体培养45～50h，加入无菌水调整孢子浓度到108个/ml，然后按10～20wt％的接种量将非洲哈茨木霉接种于固体培养基C中，在25～30℃培养5～7天，制得含有非洲哈茨木霉ACCC 33109有效活菌数10～30亿/g的固体菌剂C；
(4)将固体菌剂A、固体菌剂B和固体菌剂C混合均匀，制得复合微生物菌剂。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的液体培养基A每升组分如下：
玉米粉10～15g，豆饼粉10～15g，葡萄糖5～10g，硫酸铵5～10g，磷酸二氢钾0.5～0.8g，硫酸镁0.1～0.25g，硫酸锰0.1～0.25g，硫酸亚铁0.1～0.2g，余量水，调整pH值7～8。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的液体培养基B每升组分如下：
玉米粉10～15g，豆饼粉10～15g，葡萄糖5～10g，蛋白胨1～5g，酵母粉1～5g，氯化钠5～10g，硫酸镁0.1～0.25g，硫酸锰0.1～0.25g，硫酸亚铁0.1～0.2g，碳酸钙1～4g余量水，调整pH值7～8。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的固体培养基C重量组份如下：
麸皮粉200～400份，玉米面600～800份，过磷酸钙3～5份，水400～700份，pH 6.0～6.5。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，按重量份计将固体菌剂A5～10份、固体菌剂B20～30份和固体菌剂C 30～40份混合均匀，制得复合微生物菌剂。
进一步优选的，所述步骤(4)中，按重量份计将固体菌剂A10份、固体菌剂B 30份和固体菌剂C 40份混合均匀，制得复合微生物菌剂。
上述复合微生物菌剂应用于防治马铃薯黑痣病和/或增加马铃薯的产量。
上述LB液体培养基和PDA固体培养基均为本领域常用培养基，LB液体培养基组分如下：
酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，用NaOH和HCl调节pH7.0～7.2，分装灭菌；
PDA固体培养基组分如下：
马铃薯汁1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g，溶化后分装灭菌。
有益效果
本发明涉及的复合微生菌剂可以有效防治马铃薯黑痣病，刺激作物生长，有效改善马铃薯的品质，增加了种植户的经济收益。同时还可以调整土壤菌群平衡，促进氮磷钾的利用率。
具体实施方法
下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
微生物材料来源
实施例中所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CICC10088、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)CICC 20238均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
所述多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus sp.)ACCC 01043、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ACCC 30371、多粘芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)ACCC 10122、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)ACCC 33109均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
防治马铃薯黑痣病的复合微生物菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)将萎缩芽孢杆菌CICC 20238接种于LB液体培养基，在37℃条件下，经摇瓶培养36h，制得液体种子，将制得的液体种子接种于液体发酵培养基A中，调控pH值至7.0、通气比为1:1、转速170转/分，在37℃培养36h，制得发酵液，将所述发酵液经离心干燥得含有萎缩芽孢杆菌CICC 20238有效活菌数50亿/g的固体菌剂A；
(2)将多粘芽胞杆菌ACCC 10122接种于LB液体培养基，在35℃条件下，经摇瓶培养40h，制得液体种子，将制得的液体种子接种于液体发酵培养基B中，调控pH值至7.0、通气比为1:0.75、转速150转/分，在35℃培养24h，制得发酵液，将发酵液与麦饭石1：1混合风干后得含有多粘芽胞杆菌ACCC 10122有效活菌数50亿/g的固体菌剂B；
(3)将非洲哈茨木霉ACCC 33109接种于PDA固体培养基，在30℃条件下固体培养50h，加入无菌水调整孢子浓度到108个/ml，然后按15wt％的接种量将非洲哈茨木霉接种于固体培养基C中，在28℃培养5天，制得含有非洲哈茨木霉ACCC 33109有效活菌数30亿/g的固体菌剂C；
(4)取5重量份步骤(1)制得的固体菌剂A、20重量份步骤(2)制得的固体菌剂B、30重量份步骤(3)制得的固体菌剂C进行混合，制得复合微生物菌剂。
所述液体培养基A每升组分如下：
玉米粉15g，豆饼粉15g，葡萄糖10g，硫酸铵10g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.2g，硫酸亚铁0.2g，余量水，调整pH值7；
所述液体培养基B每升组分如下：
玉米粉15g，豆饼粉10g，葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母粉5g，氯化钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.1g，硫酸亚铁0.1g，碳酸钙4g余量水，调整pH值7；
所述固体培养基C重量组份如下：
麸皮粉30kg，玉米面70kg，过磷酸钙0.4kg，水50L，pH 6.0。
经检测每克复合微生物菌剂含有：萎缩芽孢杆菌CICC 20238有效活菌数4.5亿/g、多粘芽胞杆菌ACCC 10122有效活菌数18亿/g、非洲哈茨木霉ACCC 33109有效活菌数16亿/g，总有效活菌数38.5亿/g
实施例2
采用如实施例1所述的方法，不同之处在于，按重量份计将步骤(4)中固体菌剂A7份、固体菌剂B 20份、固体菌剂C 30混合。
制得的用于防治马铃薯黑痣病的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有：萎缩芽孢杆菌CICC 20238有效活菌数6亿/g、多粘芽胞杆菌ACCC 10122有效活菌数17亿/g、非洲哈茨木霉ACCC 33109有效活菌数15亿/g，总有效活菌数38亿/g。
实施例3
采用如实施例1所述的方法，不同之处在于，按重量份计将步骤(4)中固体菌剂A10份、固体菌剂B 20份、固体菌剂C 30份混合。
制得的用于防治马铃薯黑痣病的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有：萎缩芽孢杆菌CICC 20238有效活菌数8亿/g、多粘芽胞杆菌ACCC 10122有效活菌数16亿/g、非洲哈茨木霉ACCC 33109有效活菌数15亿/g，总有效活菌数39亿/g。
实施例4
采用如实施例1所述的方法，不同之处在于，按重量份计将步骤(4)中固体菌剂A10份、固体菌剂B 30份、固体菌剂C 30份混合。
制得的用于防治马铃薯黑痣病的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有：萎缩芽孢杆菌CICC 20238有效活菌数7亿/g、多粘芽胞杆菌ACCC 10122有效活菌数21亿/g、非洲哈茨木霉ACCC 33109有效活菌数12亿/g，总有效活菌数40亿/g。
实施例5
采用如实施例1所述的方法，不同之处在于，按重量份计将步骤(4)中固体菌剂A10份、固体菌剂B 30份、固体菌剂C 40份混合。
制得的用于防治马铃薯黑痣病的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有：萎缩芽孢杆菌CICC 20238有效活菌数6亿/g、多粘芽胞杆菌ACCC 10122有效活菌数18亿/g、非洲哈茨木霉ACCC 33109有效活菌数15亿/g，总有效活菌数39亿/g。
对照例1
与实施例5不同之处在于所述复合微生物菌剂中不添加萎缩芽孢杆菌CICC20238。
对照例2
与实施例5不同之处在于所述复合微生物菌剂中不添加多粘芽胞杆菌ACCC10122。
对照例3
与实施例5不同之处在于所述复合微生物菌剂中不添加非洲哈茨木霉ACCC33109。
对照例4
与实施例5不同之处在于所述复合微生物菌剂中不添加萎缩芽孢杆菌CICC 20238而是添加同样方法制备的，有效活菌数相同的枯草芽孢杆菌CICC10088。
对照例5
与实施例5不同之处在于所述复合微生物菌剂中不添加多粘芽胞杆菌ACCC 10122而是添加同样方法制备的，有效活菌数相同的多粘类芽胞杆菌ACCC01043。
对照例6
与实施例5不同之处在于所述复合微生物菌剂中不添加非洲哈茨木霉ACCC 33109而是添加同样方法制备的，有效活菌数相同的哈茨木霉ACCC 30371。
应用例
将实施例1-5与对比例1-6制备的复合微生物菌剂在宁夏同心县下马关镇进行效果验证，分别应用种植马铃薯和甘薯。复合微生物菌剂用量5kg每亩，与底肥同施，不施菌剂做空白组对照。用随机取样方法采收面积为20m2的马铃薯和甘薯，并对马铃薯和甘薯黑痣病发病薯块进行统计，并计算发病薯个数占总贮藏薯个数的百分率，马铃薯黑痣病发病率统计结果见表1，马铃薯统计产量结果见表2；甘薯黑痣病发病率统计结果见表3。
表1马铃薯抗黑痣病效果分析表
Figure BDA0002800655620000051
表2对马铃薯的促生作用
Figure BDA0002800655620000052
表3甘薯抗黑痣病效果分析表
Figure BDA0002800655620000053
由上述实验结果可以看出，本发明涉及的复合微生物菌剂对马铃薯黑痣病防治效果优良，有效降低了马铃薯黑痣病的发病率，并且具有一定的促生作用；复合微生物菌剂的菌种组成与其他菌种组成的复合微生物菌剂相比，产生一定的协同作用；本发明涉及的复合微生物菌剂对防治马铃薯黑痣病的作用具有一定的特异性，对防治甘薯黑痣病的作用效果一般，可能是因为引起甘薯黑痣病的病原菌与引起马铃薯黑痣病的病原菌不同；也有可能是因为本发明涉及复合微生物菌剂在不同植物根部的富集代谢情况不同所产生的效果不同。
由表1与表3中对比例6与对比例3使用效果的发病率可以看出，并不是简单的微生物组成种类越多，所起的作用效果越好，而是需要特定组合的微生物种类组成才可以产生一定的协同作用。

Claims (8)

1.一种用于马铃薯黑痣病的复合微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂包含萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus CICC 20238、多粘芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa ACCC10122和非洲哈茨木霉Trichoderma afroharzianum ACCC 33109；
所述萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）CICC 20238购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
所述多粘芽胞杆菌（Paenibacillus polymyxa）ACCC 10122、非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）ACCC 33109均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心；
所述的复合微生物菌剂，按重量份计所述萎缩芽孢杆菌5～10份、多粘类芽孢杆菌20～30份、非洲哈茨木霉30～40份。
2.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述萎缩芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、非洲哈茨木霉的质量比为10: 30: 40。
3.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂每克含有有效活菌数≥35亿个。
4.权利要求1-3任一项所述复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
（1）将萎缩芽孢杆菌CICC 20238接种于LB液体培养基，在30～37℃条件下，经摇瓶培养36～48h，制得液体种子，将制得的液体种子接种于液体发酵培养基A中，调控pH值至7.0～8.0、通气比为1:(0.5～1)、转速100～200转/分，在30～37℃培养36～48h，制得发酵液，将所述发酵液经喷雾干燥得到含有萎缩芽孢杆菌CICC 20238有效活菌数40～60亿/g的固体菌剂A；
（2）将多粘芽胞杆菌ACCC 10122接种于LB液体培养基，在30～37℃条件下，经摇瓶培养36～48h，制得液体种子，将制得的液体种子接种于液体发酵培养基B中，调控pH值至7.0～8.0、通气比为1:(0.5～1)、转速100～200转/分，在30～37℃培养24～36h，制得发酵液，将发酵液与麦饭石1：1混合风干后得含有多粘芽胞杆菌ACCC 10122有效活菌数20～50亿/g的固体菌剂B；
（3）将非洲哈茨木霉ACCC 33109接种于PDA固体培养基，在25～30℃条件下固体培养45～50h，加入无菌水调整孢子浓度到108个/ml，然后按10~20wt%的接种量将非洲哈茨木霉接种于固体培养基C中，在25～30℃培养5~7天，制得含有非洲哈茨木霉ACCC 33109有效活菌数10～30亿/g的固体菌剂C；
（4）将固体菌剂A、固体菌剂B和固体菌剂C混合均匀，制得复合微生物菌剂。
5.如权利要求4所述复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的液体培养基A每升组分如下：
玉米粉10～15g，豆饼粉10～15g，葡萄糖5～10g，硫酸铵5～10g，磷酸二氢钾0.5～0.8g，硫酸镁0.1～0.25g，硫酸锰0.1～0.25g，硫酸亚铁0.1～0.2g，余量水，调整pH值7～8。
6.如权利要求4所述复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的液体培养基B每升组分如下：
玉米粉10～15g，豆饼粉10～15g，葡萄糖5～10g，蛋白胨1～5g，酵母粉1～5g，氯化钠5～10g，硫酸镁0.1～0.25g，硫酸锰0.1～0.25g，硫酸亚铁0.1～0.2g，碳酸钙1～4g余量水，调整pH值7～8。
7.如权利要求4所述复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的固体培养基C重量组份如下：
麸皮粉200～400份，玉米面600～800份，过磷酸钙3～5份，水400～700份，pH 6.0~6.5。
8.如权利要求1-3任一项所述的复合微生物菌剂应用于防治马铃薯黑痣病和/或增加马铃薯的产量。
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《马铃薯黑痣病生防菌的筛选及防治效果》;李磊等;《植物病理学报》;植物病理学报;20200629;294-297 *

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