CN112481140B - 一种微生物固态发酵生产茉莉酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用微生物固态发酵生产茉莉酸的方法，属于生物技术领域。Lasiodiplodia.sp在接种到含麦粒的固态发酵培养基中，静置发酵6‑15天可以产生4128mg/Kg麦粒的茉莉酸。该方法为微生物发酵生产茉莉酸的放大提供了可行性。
Description
技术领域
本发明涉及本发明涉及一种微生物固态发酵生产茉莉酸的方法，属于生物技术领域。
背景技术
茉莉酸(化学名称3-氧-2-2＇-顺-戊烯基-环戊烷-1-乙酸，分子式C12H18O3，)是一种新型的植物激素。高等植物的茎端、嫩叶、根尖等营养器官中都含有茉莉酸，在植物的生长发育过程中发挥着广泛的作用，包括促进、诱导和抑制等多个方面。茉莉酸是植物防卫反应和胁迫反应中的信号分子，当植物受到物理或化学的伤害时，诱导激活植物体内的防卫基因，抵御外界的伤害。在农业生产中，可以代替部分杀虫剂，并可用于提高植物的抗旱性。在香料业的生产中，茉莉酸及其甲酯因具有清淡、幽雅的香味可作为很多香花精油主香的成分，应用于香烟、肥皂、口香糖等的生产中。此外，研究表明茉莉酸甲酯具有抗肿瘤活性，可以抑制多种肿瘤细胞的增殖。
茉莉酸的制备方法主要是从植物中提取、化学合成和微生物发酵合成。但是，植物中茉莉酸的含量低，满足不了当今市场的需求。化学合成法存在反应收率不高(30％以下)，反应条件苛刻，合成的产物具有外消旋的缺陷，限制了其使用的范围。因此，微生物发酵生产茉莉酸受到人们的关注。ALDRIDGE等最早在可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobroma)的培养液中，分离到茉莉酸，表明在某些微生物中存在合成茉莉酸的途径。美国专利US20020110881A1公开了棉色二孢菌(Diplodiagossypina)发酵产茉莉酸及其衍生物的方法，在含有500mL培养基的2.8L锥形瓶中发酵产茉莉酸浓度可达1.2g/L。国内专利CN107227264 A公开了毛色二孢菌(Lasiodiplodia iranensis)液态发酵产茉莉酸的方法，在含有100mL培养基的500mL锥形瓶最佳条件下产物浓度达到1.7g/L。但是这些都是在液态静置发酵下进行的，当按常规液态深层发酵罐放大时，菌体形态受剪切力影响大，生长与发酵罐内氧气、物质传递相矛盾，茉莉酸产量低，故常规深层发酵罐放大困难。
丝状真菌固态发酵有许多优点，如为菌体提供附着位点、能耗小、工艺操作简单、废水少、微生物在接近自然条件下生长、避免形成过粘液体、克服了液体深层培养中产物合成的分解代谢阻遏、溶氧、搅拌对菌丝损伤等，而微生物固态发酵产茉莉酸的尚未见报道。
发明内容
针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供一种微生物固态发酵生产茉莉酸的方法。
本发明的第一个目的是提供一种微生物固态发酵生产茉莉酸的方法，是将Lasiodiplodia.sp菌株接种在固体培养基中静置培养6-15天。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基含水量为20％-80％，每Kg培养基包含固体基质200-800g，硝酸钠1-15g，磷酸二氢钾0.5-3g，氯化钾0.1-0.4g，镁盐1-9g，铁盐0.1-0.9g，氯化钙0.055-5.55g，玉米浆1-5g。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基固态基质包括麸皮、麦粒中的一种或混合。
在本发明的一种实施方式中，所述的Lasiodiplodia.sp菌株，包括伊朗毛色二孢菌Lasiodiplodia iranensis CCTCC NO：M2017288、可可毛色二孢菌Lasiodiplodiatheobroma MTCC 3068以及其突变株。
本发明的第二个目的是提供一种在摇瓶或平皿或多层浅盘发酵罐中表面发酵的方法。
在本发明的一种实施方式中，表面发酵的发酵接种量为8％-15％(v/w)。
本发明的第三个目的是提供一种多层浅盘发酵罐，10L发酵罐装直径15-25cm，高30-50cm的8-12个盘子，并由浅盘支架支撑，浅盘间隙0.5-1.5cm，每个浅盘带1-4个溢流口，溢流口高度0.15-1.5cm，通过溢流接种，通无菌空气、控温、控湿，通气管壁设有间距相同、大小递增的出气孔。
在本发明的一种实施方式中，摇瓶或平皿或多层浅盘发酵罐中发酵温度为20-35℃，发酵湿度为80～100％。
本发明的第四个目的是提供上述的微生物固态培养基在在生产茉莉酸中的应用。
有益效果
本发明采用固态发酵形式利用Lasiodiplodia.sp发酵生产茉莉酸，该方法操作简单，相较于液态发酵形式，为菌株生长提供了更多的附着位点，对菌体损伤小，Lasiodiplodia.sp接种到含麦粒的固态发酵培养基中，静置发酵6-15天可以产生4128mg/Kg麦粒的茉莉酸。液态发酵常规放大困难，本发明可以实现10L浅盘式发酵罐水平下固态发酵生产茉莉酸，产量可达2698mg/Kg麦粒，较液态发酵茉莉酸每批次发酵成本下降了约40％，耗水量减少0.75L。本发明具有操作方便，耗水量较低，污染小，空间经济；发酵介质简单；机械、设备和控制***的简单；资本投资较低等优点。
附图说明
图1产物鉴定GC-MS图
图2 10L浅盘式发酵罐结构图
具体实施方式
茉莉酸产物分析方法:
气质联用(GC-MS)：用气质联用(GC-MS)对甲酯化后的产物进行鉴定。参照文献方法。气质条件：气相色谱柱AB—5MS 30m×0.25mm×0.25μm，载气为氦气，压力为130Kg/cm2，分表压力为0.31Kg/cm2，流速为0.8mL/min。色谱柱采用程序升温，从起始温度50℃以20℃/min升至180℃后保持4min，再以10℃/min升至290℃后保持15min，250℃进样，不分流，进样体积1μL。
高效液相色谱(HPLC)：用HPLC(高效液相色谱)对甲醇浸提液中产物的浓度进行检测，参照文献方法。流动相为甲醇：0.1％磷酸＝55:45；进液量为20μL；流速为1mL/min；检测器为紫外检测器。
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。
PDB培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。
具体实施方法
实施例1利用不同固态基质进行茉莉酸的固态发酵
伊朗毛色二孢菌CCTCC NO：M2017288菌株经PDA培养基活化，10％(v/w)接种量接于装有100g已灭菌固态发酵培养基的250mL三角瓶中，于28℃的培养箱中静置发酵培养12天。其中，固态基质分别为20g甘蔗渣或玉米秸秆或大豆粕或麸皮或麦粒。其它成分包括，蔗糖3.75g，硝酸钠0.3375g，磷酸二氢钾0.15g，氯化钾0.03g，七水合硫酸镁0.45g，七水合硫酸亚铁0.0675g，氯化钙0.021g，玉米浆0.1125g，微量元素溶液0.75mL。所述微量元素溶液含有：七水合硫酸锌0.03g/L，七水合硫酸锰0.003g/L，七水合硫酸铜0.003g/L，二水合钼酸钠0.003g/L。在28℃培养箱中静置培养12天，发酵结束后甲醇浸提产物并用HPLC测产物的浓度，结果如表1。
表1不同固态基质对菌株固态发酵产茉莉酸的影响
| 固体基质 | 茉莉酸产量(mg/Kg固体基质) |
| 甘蔗渣 | 0 |
| 大豆粕 | 13 |
| 玉米秸秆 | 6 |
| 麦粒 | 945 |
| 麸皮 | 658 |
当固态基质使用麸皮和麦粒时，茉莉酸产量较高，达到600mg/Kg固体基质以上。后续实施例中所述发酵培养基均以麦粒作为固态基质。
实施例2利用不同初始含水量的培养基进行茉莉酸的固态发酵
伊朗毛色二孢菌CCTCC NO：M2017288菌株经PDA培养基活化，10％(v/w)接种量接于装有100g已灭菌固态发酵培养基的250mL三角瓶中，于28℃的培养箱中静置发酵培养12天。具体实施方式同实施例1，区别在于，固态基质为20g麦粒，本实施例在培养基的初始含水量为40％、50％、60％、65％、70％、75％和80％。发酵结束后用甲醇浸提发酵培养基，用HPLC测产物的浓度，结果如表2。
表2固态基质为麦粒时，初始含水量对菌株固态发酵产茉莉酸的影响
| 培养基组成 | 茉莉酸产量(mg/Kg麦粒) |
| 40％初始含水量 | 78 |
| 50％初始含水量 | 65 |
| 60％初始含水量 | 122 |
| 65％初始含水量 | 785 |
| 70％初始含水量 | 1622 |
| 75％初始含水量 | 1701 |
| 80％初始含水量 | 945 |
根据实例结果，固态培养基中初始含水量对菌株发酵产茉莉酸影响显著，初始含水量在60％以下时，茉莉酸产量较低；初始含水过高也会造成茉莉酸产量减少，当含水量在80％以上时，茉莉酸产量开始下降。当固态培养基初始含水量设置为75％时，茉莉酸产量达到本实例最高值。因此，后续实施例中所述培养基初始含水量为75％。
实施例3利用不同浓度CaCl2的培养基进行茉莉酸的固态发酵
伊朗毛色二孢菌CCTCC NO：M2017288菌株经PDA培养基活化，10％(v/w)接种量接于装有100g已灭菌固态发酵培养基的250mL三角瓶中，于28℃的培养箱中静置发酵培养12天。具体实施方式同实施例2，区别在于，初始含水量75％，本实施例在培养基中添加不同浓度CaCl2(0.04g/Kg培养基、0.21g/Kg培养基、0.42g/Kg培养基、0.62g/Kg培养基、4.16g/Kg培养基)。发酵结束后甲醇浸提产物并用HPLC测产物的浓度，结果如表3。
表3 CaCl2对菌株固态发酵产茉莉酸的影响
固态培养基中Ca2+对菌株发酵产茉莉酸具有促进作用，且随着Ca2+浓度逐渐增加，该促进作用的程度先增大后减小，当CaCl2浓度设置为0.21g/Kg培养基时，促进作用最显著，茉莉酸产量达到2489mg/Kg麦粒，相较于不添加Ca2+提高了46.32％。因此，后续实施例培养基中CaCl2浓度设置为0.21g/Kg培养基。
实施例4利用不同成分的无机盐基进行茉莉酸的固态发酵
伊朗毛色二孢菌CCTCC NO：M2017288菌株经PDA培养基活化，10％(v/w)接种量接于装有100g已灭菌固态发酵培养基的250mL三角瓶中。具体实施方式同实施例3，区别在于，其中在培养基中添加0.0021g CaCl2，本实施例在培养基中加入不同无机盐进行分组实验，其具体如下：
对照组(每Kg培养基)：磷酸二氢钾1.5g、氯化钾0.3g、七水硫酸镁4.5g、七水硫酸亚铁0.675g、微量元素7.5mL。
实验组1(每Kg培养基)：磷酸二氢钾1.5g、氯化钾0.3g、七水硫酸镁4.5g、七水硫酸亚铁0.675g。
实验组2(每Kg培养基)：氯化钾0.3g、七水硫酸镁4.5g、七水硫酸亚铁0.675g。
实验组3(每Kg培养基)：磷酸二氢钾1.5g、七水硫酸镁4.5g、七水硫酸亚铁0.675g。
实验组4(每Kg培养基)：磷酸二氢钾1.5g、氯化钾0.3g、七水硫酸亚铁0.675g。
实验组5(每Kg培养基)：磷酸二氢钾1.5g、氯化钾0.3g、七水硫酸镁4.5g。
在28℃培养箱中静置培养12天，发酵结束后甲醇浸提产物并用HPLC测产物的浓度，结果如表4。
表4无机盐对菌株固态发酵产茉莉酸的影响
根据实例结果，固态培养基在麦粒25％、初始含水量75％CaCl2 0.21g/Kg培养基基础上，补加不同营养物组合。通过对照组和实验组1相比可以看出，微量元素抑制了菌株产茉莉酸；通过实验组1与实验组3相比可以看出氯化钾的适当添加有利于菌株产茉莉酸；实验组1与实验组2相比可以看出，磷酸二氢钾的有无对茉莉酸产量影响较小；实验组4和5较实验组1产量明显下降，说明七水硫酸镁和七水硫酸亚铁对菌株产茉莉酸是至关重要的。因此，后续实施例培养基中磷酸二氢钾1.5g/Kg、氯化钾0.3g/Kg、七水硫酸镁4.5g/Kg、七水硫酸亚铁0.675g/Kg。
实施例5利用添加不同碳源基进行茉莉酸的固态发酵
伊朗毛色二孢菌CCTCC NO：M2017288菌株经PDA培养基活化，10％(v/w)接种量接于装有100g已灭菌固态发酵培养基的250mL三角瓶中，于28℃的培养箱中静置发酵培养12天。具体实施方式同实施例4，区别在于，培养基中添加磷酸二氢钾0.15g，氯化钾0.03g，七水合硫酸镁0.45g，七水合硫酸亚铁0.0675g，本实施例在培养基中加不同碳源，发酵结束后甲醇浸提产物并用HPLC测产物的浓度，结果如表5。
表5不同外加碳源对菌株固态发酵产茉莉酸的影响
| 碳源 | 茉莉酸产量(mg/Kg麦粒) |
| 对照(不添加碳源) | 4182 |
| 37.5g蔗糖 | 2830 |
| 37.5g葡萄糖 | 2213 |
| 37.5g果糖 | 3584 |
| 2.92g亚麻酸 | 3854 |
| 2.92g亚油酸 | 3781 |
根据表5可以看出，在培养基中不添加额外碳源能使茉莉酸产量最高达到4182mg/Kg，较添加37.5g葡萄糖的培养基茉莉酸产量高了41％，显然培养基中不加额外碳源更有利于茉莉酸的产量。
实施例6利用不同装量培养基进行茉莉酸的固态发酵
伊朗毛色二孢菌CCTCC NO：M2017288菌株经PDA培养基活化，10％(v/w)接种量接于装有不同质量固体培养的150mm培养皿中，于28℃的培养箱中静置发酵培养12天。具体实施方式同实施例3，发酵结束后甲醇浸提产物并用HPLC测产物的浓度，结果如表6。
表6不同培养基装量对菌株固态发酵产茉莉酸的影响
| 培养基装量 | 茉莉酸产量(mg/Kg麦粒) |
| 对照(100g培养基/250mL锥形瓶) | 2489 |
| 150g培养基/培养皿 | 223 |
| 200g培养基/培养皿 | 3885 |
| 250g培养基/培养皿 | 1725 |
根据实例结果，在直径为150mm的培养皿中进行菌株固态发酵，装量会显著影响最终茉莉酸产量。本实例中，在200g装量条件下得到了最高茉莉酸产量，为3885mg/Kg麦粒，相比对照组在锥形瓶中的产量高了36％。
实施例7 10L浅盘式发酵罐中发酵生产茉莉酸
固态发酵培养基中固体基质装入浅盘式发酵罐(如图)后同时灭菌，培养基其它成分单独灭菌。伊朗毛色二孢菌CCTCC NO：M2017288菌株经PDB培养基活化，活化后的种子液按8％(v/w)接种量接种到灭菌后的培养基其它成分中。培养基其它成分及种子液通过发酵罐补料口以及圆盘上溢流口补加至各圆盘中。发酵过程通入无菌空气，维持湿度95％，温度控制在28℃。静置培养12天，发酵结束后甲醇浸提产物并用HPLC测产物的浓度，结果茉莉酸产量2698mg/Kg麦粒。对产物进行气质联用GC-MS鉴定，产物分子为茉莉酸3-氧-2-2′-顺-戊烯基-环戊烷-1-乙酸。
对比例1液态深层发酵生产茉莉酸
液态深层发酵：伊朗毛色二孢菌CCTCC NO：M2017288菌株经PDB培养基活化，活化后的种子液按8％(v/v)接种到灭菌后的液体发酵培养基中(如中国专利201710616357.6中所述培养基)。发酵过程通入无菌空气，通气量设为0.1vvm，温度控制在28℃。静置培养12天，发酵结束后用HPLC测产物的浓度。
根据实例结果，在发酵罐中进行伊朗毛色二孢菌CCTCC NO：M2017288液态深层发酵产茉莉酸每批可产0.98g，而实施例7采用固态浅盘发酵每批可获得2.02g茉莉酸。固态浅盘发酵较液态深层发酵高了51％，由此可见，液态深层发酵并不利于茉莉酸发酵生产。
对比例2液态浅盘发酵生产茉莉酸
固态浅盘发酵具体实施方式同实施例7。
液态浅盘发酵：装好圆盘的发酵罐单独灭菌，液态发酵培养基(如中国专利201710616357.6中所述培养基)单独灭菌。伊朗毛色二孢菌CCTCC NO：M2017288菌株经PDB培养基活化，活化后的种子液按8％(v/v)接种到灭菌后的培养基中。培养基及种子液通过发酵罐补料口以及圆盘上溢流口补加至各圆盘中。发酵过程通入无菌空气，温度控制在28℃。静置培养7天，发酵结束后用HPLC测产物的浓度。应用浅盘式发酵罐，液态发酵和固态发酵在每批次发酵中分别可以获得2.10和2.02g茉莉酸。
液态浅盘发酵要用到蔗糖，价格40.76元/Kg，每批次要用到150g，即6.114元；固态浅盘发酵不需要此成分，所用的是麦芽，价格4元/Kg，每批次要用到750g，即3元，明显少于液态浅盘发酵。液态浅盘发酵要用到微量元素，每批次成本为0.344元；固态浅盘发酵不需要此成分。固态浅盘发酵所用的外加有机、无机氮源和无机盐是液态浅盘发酵所用量的75％，每批次发酵可以节省1.037元。固态浅盘发酵每批次耗水量2.25L，液态浅盘发酵每批次耗水量3.00L。综上，固态发酵较液态发酵茉莉酸每批次发酵成本下降了约40％，耗水量减少0.75L，固态发酵具有原料价格低廉、耗水量少等优势，有利于实现茉莉酸工业化生产。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (3)
1.一种微生物固态发酵生产茉莉酸的方法，其特征在于，将Lasiodiplodiasp.菌株接种在固体培养基中静置培养6-15天；
所述培养基初始含水量为20-80%，每Kg培养基组分如下：固体基质200-800 g，硝酸钠1-15 g，磷酸二氢钾0.5-3 g，氯化钾0.1-0.4 g，镁盐1-9 g，铁盐0.1-0.9 g，氯化钙0.055-5.55 g，玉米浆1-5 g，其余为水；
所述培养基固态基质为麸皮、麦粒中的一种或混合；
在平皿或多层浅盘发酵罐中进行表面发酵；
发酵温度为20-35℃，发酵湿度为80~100%；
所述的Lasiodiplodiasp.菌株为伊朗毛色二孢菌Lasiodiplodia iranensis CCTCCNO：M2017288。
2.根据权利要求1所述的一种微生物固态发酵生产茉莉酸的方法，其特征在于，发酵接种量为8%-15%（v/w）。
3.根据权利要求1所述的一种微生物固态发酵生产茉莉酸的方法，其特征在于，所述多层浅盘发酵罐是10 L发酵罐装直径15-25 cm，高30-50 cm的8-12个盘子，并由浅盘支架支撑，浅盘间隙0.5 -1.5 cm，每个浅盘带1-4个溢流口，溢流口高度0.15-1.5 cm，通过溢流接种，通无菌空气、控温、控湿，通气管壁设有间距相同、大小递增的出气孔。
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