CN112480290A - 一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鱿鱼软骨β‑壳聚糖的制备方法，现有酶法加工β‑壳聚糖存在耗时长、杂质多、提取率及纯度低的问题。其经过以下工艺步骤：1）磷酸酶提取；2）β‑壳聚糖提取；3）β‑壳聚糖精制；4）喷雾干燥；5）脱色。本发明利用磷酸酶和聚磷酸协同作用，脱除鱿鱼软骨中的有机物和矿物质，剩余的甲壳素被分解为大分子β‑壳聚糖，经反复醇沉并联合超滤和透析，获得精制β‑壳聚糖后干燥，氧化脱色获得本发明产品。本工艺磷酸酶耦合聚磷酸制备大分子壳聚糖利用了两相试剂互作，酶控反应制备壳聚糖，其工艺温和、环保。本发明耗时短，效率高，成本低；产物脱乙酰度和纯度高，保留产物大的分子，且水溶性好，提高β‑壳聚糖应用性能。
Description
技术领域
本发明涉及壳质多糖的制备，尤其是一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法。
背景技术
甲壳素(Chitin)是一种由N-乙酰-D-氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的天然高分子线性多糖，以有序的晶体微纤维形式存在，导致不溶于水。在自然界中甲壳素广泛存在，数量是仅次于纤维素的天然多糖类。
鱿鱼生产生成大量鱿鱼软骨，因其不可食性，作为加工废弃物丢弃。鱿鱼软骨中含有平行糖链组成的β-甲壳素，常与胶原蛋白相结合，具有防“三高”，抑制细菌活性，排重金属功效。鱿鱼软骨有效利用，将变废为宝，原料资源充分利用，由于β-甲壳素在水介质无溶解性，限制了其应用，因此需要一种有效、简便的β-壳聚糖的制备方法。
现有壳聚糖提取技术中，中国专利CN 201510129839.X、CN110452316A公开了β-壳聚糖的制备方法，经过稀酸溶液脱盐、稀碱溶液脱有机物和浓碱去除乙酰基，获得β-壳聚糖，但是采用酸碱法提取甲壳素已不适宜节能发展，此工艺已经被禁用。中国专利CN111171181A公开了酶法加工β-壳聚糖的方法，通过酶解脱除乙酰基，得到含高蛋白质和灰分的β-壳聚糖，利用酶虽然减少了对环境的污染，但耗时长，杂质多，降低了生产的有效性。
发明内容
为了克服现有酶法加工β-壳聚糖存在耗时长、杂质多、提取率及纯度低的不足，本发明的目的在于提供一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法，本发明的制备方法耗时短，效率高，成本低；产物脱乙酰度和纯度高，保留产物大的分子，且水溶性好，显著提高了β-壳聚糖应用性能。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法，其特征在于，其经过以下工艺步骤：
1）磷酸酶提取：取缺磷土地中植物根部土壤，粉碎后放入200目的筛网中，用pH4-7的淋洗液淋洗3-5次，静置5-8h，取上清液，冷冻干燥，即得磷酸酶；
2）β-壳聚糖提取：将步骤1）中得到的磷酸酶加到聚磷酸和鱿鱼软骨混合物中，充分搅拌均匀，在18-45℃反应5-10h，升温至62-85℃搅拌1.5-3.2h，1500-3000r/min离心，取上清液，即得β-壳聚糖粗提取物；
3）β-壳聚糖精制：取步骤2）所得的β-壳聚糖粗提取物，加入乙醇至乙醇质量百分含量为65-85%，离心取沉淀，用去离子水复溶和乙醇沉淀反复操作3-5次，得清洗后的β-壳聚糖；清洗后的β-壳聚糖进行超滤，截留30万Da分子量的壳聚糖，截留液浓缩后，放入15万Da的透析袋中去除杂质，透析袋中溶液，即为精制β-壳聚糖溶液；
4）喷雾干燥：将步骤3）所得精制β-壳聚糖溶液喷雾干燥，得到β-壳聚糖；
5）脱色：将步骤4）所得β-壳聚糖用超临界二氧化碳装置处理，萃取釜中剩余物料加入氧化剂进行脱色，获得β-壳聚糖成品。
作为优选，在步骤1）中，所述的淋洗液由磷酸铵、磷酸、丙酮和水组成。
作为优选，在步骤2）中，所述的磷酸酶、聚磷酸和鱿鱼软骨质量比为1:5-15:45-60。
作为优选，在步骤4）中，所述的喷雾干燥条件为喷头转速20000-22000r/min、进口温度180-220℃、进料速度100-180ml/min、出料口温度65-80℃、风速1-3m/s。
作为优选，在步骤5）中，所述的超临界二氧化碳装置参数设置为二氧化碳流速15-25kg/h、萃取压力25-34MPa、萃取温度30-45℃、时间60-90min。
作为优选，在步骤2）中，所述的搅拌的同时还进行超声处理，超声处理条件为：超声频率10-15KHz，超声功率0.5-2W/cm2，超声波施加周期5-8min/h。
作为优选，所述的淋洗液各组分质量百分含量为磷酸铵4.2%、磷酸5-8%和丙酮15-30%，余量为水。
本发明有益效果：
(1)本发明采用聚磷酸和磷酸酶提取壳聚糖，利用磷酸酶分解鱿鱼软骨中的有机物，释放磷酸，启动聚磷酸的分解和鱿鱼软骨中矿物质释放，进而聚磷酸在磷酸酶作用下进行可控释放并协助进行壳聚糖提取；
(2)本发明采用醇沉联合超滤和透析进行壳聚糖的纯化，最大限度的去除了有机物、无机盐等杂质，使壳聚糖提取率和纯度较传统方法大为提高，分别为98.98%和97.62%。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述，所述的实施案例有助于对本发明的理解和实施，并非构成对本发明的限制。本发明的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。
实施例1
一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法，其经过以下工艺步骤：
1）磷酸酶提取：取缺磷土地中植物根部土壤，粉碎后放入200目的筛网中，用pH5.2的淋洗液淋洗4次，静置7h，取上清液，冷冻干燥，即得磷酸酶；其中，淋洗液由磷酸铵、磷酸、丙酮和水组成，各组分质量百分含量为磷酸铵4.2%、磷酸6.3%和丙酮24%，余量为水；
2）β-壳聚糖提取：将步骤1）中得到的磷酸酶加到聚磷酸和鱿鱼软骨混合物中，充分搅拌均匀，在32℃反应8h，升温至80℃搅拌2.8h，2000r/min离心，取上清液，即得β-壳聚糖粗提取物；其中，磷酸酶、聚磷酸和鱿鱼软骨质量比为1:12:50；在搅拌的同时还进行超声处理，超声处理条件：超声频率12KHz，超声功率1.2W/cm2，超声波施加周期6min/h；
3）β-壳聚糖精制：取步骤2）所得的β-壳聚糖粗提取物，加入乙醇至乙醇质量百分含量为75%，离心取沉淀，用去离子水复溶和乙醇沉淀反复操作4次，得清洗后的β-壳聚糖；清洗后的β-壳聚糖进行超滤，截留30万Da分子量的壳聚糖，截留液浓缩后，放入15万Da的透析袋中去除杂质，透析袋中溶液，即为精制β-壳聚糖溶液；
4）喷雾干燥：将步骤3）所得精制β-壳聚糖溶液喷雾干燥，得到β-壳聚糖；其中，喷雾干燥条件为喷头转速21000r/min、进口温度195℃、进料速度150ml/min、出料口温度70℃、风速2m/s；
5）脱色：将步骤4）所得β-壳聚糖用超临界二氧化碳装置处理，参数设置为二氧化碳流速20kg/h、萃取压力29MPa、萃取温度35℃、时间82min，萃取釜中剩余物料加入氧化剂进行脱色，获得β-壳聚糖成品。
实施例2
一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法，其经过以下工艺步骤：
1）磷酸酶提取：取缺磷土地中植物根部土壤，粉碎后放入200目的筛网中，用pH4的淋洗液淋洗3次，静置5h，取上清液，冷冻干燥，即得磷酸酶；其中，淋洗液由磷酸铵、磷酸、丙酮和水组成，各组分质量百分含量为磷酸铵4.2%、磷酸5%和丙酮15%，余量为水；
2）β-壳聚糖提取：将步骤1）中得到的磷酸酶加到聚磷酸和鱿鱼软骨混合物中，充分搅拌均匀，在18℃反应5h，升温至62℃搅拌1.5h，1500r/min离心，取上清液，即得β-壳聚糖粗提取物；其中，磷酸酶、聚磷酸和鱿鱼软骨质量比为1:5:45，在搅拌的同时还进行超声处理，超声处理条件：超声频率10KHz，超声功率0.5W/cm2，超声波施加周期5min/h；
3）β-壳聚糖精制：取步骤2）所得的β-壳聚糖粗提取物，加入乙醇至乙醇质量百分含量为65%，离心取沉淀，用去离子水复溶和乙醇沉淀反复操作3次，得清洗后的β-壳聚糖；清洗后的β-壳聚糖进行超滤，截留30万Da分子量的壳聚糖，截留液浓缩后，放入15万Da的透析袋中去除杂质，透析袋中溶液，即为精制β-壳聚糖溶液；
4）喷雾干燥：将步骤3）所得精制β-壳聚糖溶液喷雾干燥，得到β-壳聚糖；其中，喷雾干燥条件为喷头转速20000r/min、进口温度180℃、进料速度100ml/min、出料口温度65℃、风速1m/s；
5）脱色：将步骤4）所得β-壳聚糖用超临界二氧化碳装置处理，参数设置为二氧化碳流速15kg/h、萃取压力25MPa、萃取温度30℃、时间60min，萃取釜中剩余物料加入氧化剂进行脱色，获得β-壳聚糖成品。
实施例3
一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法，其经过以下工艺步骤：
1）磷酸酶提取：取缺磷土地中植物根部土壤，粉碎后放入200目的筛网中，用pH7的淋洗液淋洗5次，静置8h，取上清液，冷冻干燥，即得磷酸酶；其中，淋洗液由磷酸铵、磷酸、丙酮和水组成，各组分质量百分含量为磷酸铵4.2%、磷酸8%和丙酮30%，余量为水；
2）β-壳聚糖提取：将步骤1）中得到的磷酸酶加到聚磷酸和鱿鱼软骨混合物中，充分搅拌均匀，在45℃反应10h，升温至85℃搅拌3.2h，3000r/min离心，取上清液，即得β-壳聚糖粗提取物；其中，磷酸酶、聚磷酸和鱿鱼软骨质量比为1:15:60；在搅拌的同时还进行超声处理，超声处理条件：超声频率15KHz，超声功率2W/cm2，超声波施加周期8min/h；
3）β-壳聚糖精制：取步骤2）所得的β-壳聚糖粗提取物，加入乙醇至乙醇质量百分含量为85%，离心取沉淀，用去离子水复溶和乙醇沉淀反复操作5次，得清洗后的β-壳聚糖；清洗后的β-壳聚糖进行超滤，截留30万Da分子量的壳聚糖，截留液浓缩后，放入15万Da的透析袋中去除杂质，透析袋中溶液，即为精制β-壳聚糖溶液；
4）喷雾干燥：将步骤3）所得精制β-壳聚糖溶液喷雾干燥，得到β-壳聚糖；其中，喷雾干燥条件为喷头转速22000r/min、进口温度220℃、进料速度180ml/min、出料口温度80℃、风速3m/s；
5）脱色：将步骤4）所得β-壳聚糖用超临界二氧化碳装置处理，参数设置为二氧化碳流速25kg/h、萃取压力34MPa、萃取温度45℃、时间90min，萃取釜中剩余物料加入氧化剂进行脱色，获得β-壳聚糖成品。
对比例1
在本对比例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤2）不使用聚磷酸。
对比例2
在本对比例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤2）中不接种磷酸菌。
对比例3
在本对比例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤2）中不进行超声处理。
对比例4
在本对比例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤3）不醇沉处理。
对比例5
在本对比例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤5）不进行超临界二氧化碳除杂处理。
对比例6
采用中国专利CN110615855A中的实施例4。
按照国家标准GB/T5009.4-2003《食品中灰分的测定》用灼烧称量法测定所提取得到的可溶性β-甲壳素中残留的灰分，按照国家标准GB/T5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》用紫外分光光度法测定提取后的可溶性β-甲壳素的蛋白质含量，水分结合能力、脂肪结合能力、相对分子量和脱乙酰度参照中国专利CN110452316A中检测方法。检测结果如表1所示。
表1 不同处理条件提取物理化学特性测定结果
| 组别 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | 对比例6 |
| 灰分/% | 0.09 | 0.12 | 0.08 | 1.53 | 0.89 | 0.57 | 0.31 | 0.26 | 0.24 |
| 氮含量/% | 7.02 | 6.83 | 6.36 | 1.28 | 6.15 | 5.33 | 6.24 | 6.31 | 6.26 |
| 水分结合能力/% | 258.14 | 242.55 | 230.08 | 10.79 | 198.62 | 228.15 | 232.60 | 189.47 | 201.07 |
| 相对分子量/kDa | 432 | 427 | 415 | --- | 393 | 402 | 430 | 429 | 223 |
| 脱乙酰度/% | 97.31 | 96.65 | 97.01 | --- | 90.12 | 82.47 | 95.91 | 95.05 | 95.73 |
由表1可知，聚磷酸和磷酸酶均对甲壳素分解制备壳聚糖有重要影响，对比例1表明磷酸酶是聚磷酸作用于甲壳素的控制因素，两者具有协同效果；实施例1和对比文件2相比，相对分子量差别显著，说明磷酸酶对聚磷酸作用具有调节效果，利于大分子壳聚糖的产生；对比例1、2和3表明超声处理、醇沉和超临界二氧化碳处理均对壳聚糖的制备有影响。产物的脱乙酰度和氮含量差异不大，但实施例1均最高，表明实施例1壳聚糖制备方法在保证高脱乙酰度的同时保持了氨基保留量，增加了产物分子的含氮量。实施例1和对比例3相比较可知，两者产物的脱乙酰度和氮含量差异均显著，说明超声处理对产物的脱乙酰度和高氨基保留量影响显著。
以β-壳聚糖提取率和纯度为指标，分析工艺提取效果。提取率（%）=提取物重量*100/原料重量；纯度（%）=提取物中β-壳聚糖*100/提取物总重量。
表2 β-壳聚糖提取率和纯度分析结果
| 组别 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | 对比例6 |
| 提取率/% | 98.98 | 97.91 | 98.35 | 3.59 | 70.34 | 89.42 | 96.65 | 97.11 | 90.73 |
| 纯度/% | 97.62 | 97.23 | 96.95 | 96.62 | 97.01 | 96.99 | 95.43 | 95.94 | 93.41 |
由表2可知，本发明制备β-壳聚糖提取率和纯度优于对比例6。对比例1、2和3表明磷酸酶、聚磷酸和超声处理对β-壳聚糖提取具有显著影响，三者协同可显著提高β-壳聚糖制备工艺的效果。
Claims (7)
1.一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法，其特征在于，其经过以下工艺步骤：
1）磷酸酶提取：取缺磷土地中植物根部土壤，粉碎后放入200目的筛网中，用pH4-7的淋洗液淋洗3-5次，静置5-8h，取上清液，冷冻干燥，即得磷酸酶；
2）β-壳聚糖提取：将步骤1）中得到的磷酸酶加到聚磷酸和鱿鱼软骨混合物中，充分搅拌均匀，在18-45℃反应5-10h，升温至62-85℃搅拌1.5-3.2h，1500-3000r/min离心，取上清液，即得β-壳聚糖粗提取物；
3）β-壳聚糖精制：取步骤2）所得的β-壳聚糖粗提取物，加入乙醇至乙醇质量百分含量为65-85%，离心取沉淀，用去离子水复溶和乙醇沉淀反复操作3-5次，得清洗后的β-壳聚糖；清洗后的β-壳聚糖进行超滤，截留30万Da分子量的壳聚糖，截留液浓缩后，放入15万Da的透析袋中去除杂质，透析袋中溶液，即为精制β-壳聚糖溶液；
4）喷雾干燥：将步骤3）所得精制β-壳聚糖溶液喷雾干燥，得到β-壳聚糖；
5）脱色：将步骤4）所得β-壳聚糖用超临界二氧化碳装置处理，萃取釜中剩余物料加入氧化剂进行脱色，获得β-壳聚糖成品。
2.根据权利要求1所述的一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法，其特征在于，在步骤1）中，所述的淋洗液由磷酸铵、磷酸、丙酮和水组成。
3.根据权利要求1所述的一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，所述的磷酸酶、聚磷酸和鱿鱼软骨质量比为1:5-15:45-60。
4.根据权利要求1所述的一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法，其特征在于，在步骤4）中，所述的喷雾干燥条件为喷头转速20000-22000r/min、进口温度180-220℃、进料速度100-180ml/min、出料口温度65-80℃、风速1-3m/s。
5.根据权利要求1所述的一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法，其特征在于，在步骤5）中，所述的超临界二氧化碳装置参数设置为二氧化碳流速15-25kg/h、萃取压力25-34MPa、萃取温度30-45℃、时间60-90min。
6.根据权利要求1所述的一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，所述的搅拌的同时还进行超声处理，超声处理条件为：超声频率10-15KHz，超声功率0.5-2W/cm2，超声波施加周期5-8min/h。
7.根据权利要求1或2所述的一种鱿鱼软骨β-壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述的淋洗液各组分质量百分含量为磷酸铵4.2%、磷酸5-8%和丙酮15-30%，余量为水。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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