CN112479754A - 一种农业种植用微生物肥料的制备方法及其应用 - Google Patents

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CN112479754A CN202011490841.7A CN202011490841A CN112479754A CN 112479754 A CN112479754 A CN 112479754A CN 202011490841 A CN202011490841 A CN 202011490841A CN 112479754 A CN112479754 A CN 112479754A
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石泉
王宏志
韩高阳
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Xinjiang Herun Water Industry Co ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
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Abstract

本发明公开了一种农业种植用微生物肥料的制备方法及其应用。该方法包括以下步骤：S1，固氮菌、解磷菌和解钾菌分别进行活化培养和种子培养；S2，种子培养得到的湿菌体进行混合，得到复合菌体；用培养基悬浮，得到复合菌液；S3，植物秸秆材料的吸附载体的制备；S4，将所述复合菌体吸附到吸附载体上，得到所述农业种植用微生物肥料。本发明的农业种植用微生物肥料组成的微生物之间没有拮抗，微生物之间的相互促进生长的作用，制成的微生物肥料可以长时间保持活性。

Description

一种农业种植用微生物肥料的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于肥料技术领域，具体涉及一种农业种植用微生物肥料的制备方法及其应用。
背景技术
根瘤菌肥料，能在豆科植物上形成根瘤或茎瘤，同化空气中的氮气，供应豆科植物的氮素营养。固氮菌肥料，能在土壤和很多作物根际中同化空气中的氮气，供应作物氮素营养，又能分泌激素刺激作物生长。磷细菌肥料，能把土壤中难溶性磷，转化为作物可以利用的有效磷，改善作物磷素营养。用下列菌种之一制造。硅酸盐细菌肥料，能对土壤中云母，长石等含钾的铝硅酸盐及磷灰石进行分解，释放出钾、磷与其他灰分元素，改善作物的营养条件。复合微生物肥料含有两种或以上的微生物。
目前已经有很多复合微生物作为肥料的相关研究，除了开发新的肥料微生物菌种，研究很大一部分是现有的肥料微生物的组合。复合微生物肥料涉及的微生物菌种众多，有的微生物之间会出现拮抗，更谈不上微生物之间的相互促进生长的作用。有的复合微生物肥料存储和销售环节存活率显著下降。
发明内容
针对上述问题，本发明提出了一种农业种植用微生物肥料的制备方法，组成的微生物之间没有拮抗，微生物之间的相互促进生长的作用，制成的微生物肥料可以长时间保持活性。
本发明的第一方面在于公开一种农业种植用微生物肥料的制备方法，包括以下步骤：
S1，固氮菌、解磷菌和解钾菌分别进行活化培养和种子培养；
S2，种子培养得到的湿菌体进行混合，得到复合菌体；用培养基悬浮，得到复合菌液；
S3，植物秸秆材料的吸附载体的制备；
S4，将所述复合菌体吸附到吸附载体上，得到所述农业种植用微生物肥料。
在本发明的一些实施方式中，S1步骤中，所述固氮菌包括褐球固氮菌和固氮红细菌。
在本发明的一些实施方式中，S1步骤中，所述解磷菌包括解磷巨大芽孢杆菌。
在本发明的一些实施方式中，S1步骤中，所述解钾菌包括伯克霍尔德氏菌。
在本发明的一些实施方式中，，S1步骤中，所述固氮菌、解磷菌和解钾菌的活化培养为斜面菌种分别在活化培养基上，28-30℃平板培养100-120h，传代2-4次。
在本发明的一些实施方式中，S1步骤中，所述固氮菌、解磷菌和解钾菌的活化培养为活化的菌种分别在活化培养基中，28-30℃摇瓶培养100-120h。
在本发明的一些实施方式中，S1步骤中，所述固氮菌的活化培养的培养基每1000ml包括蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.2g、KH2PO4 0.2g、NaCl 0.2g，CaCO3 5g、琼脂20g，pH6.8-7.0。
在本发明的一些实施方式中，S1步骤中，所述固氮菌的种子培养的培养基除了不含琼脂外，其余与活化培养的培养基相同。
在本发明的一些实施方式中，S1步骤中，所述解磷菌的活化培养基每1000ml包括蛋白胨0.5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.02g、FeSO4·7H2O0.02g、(NH4)2SO40.5g、Ca(PO4)2 5.0g、琼脂20g，pH7.2-7.4。
在本发明的一些实施方式中，S1步骤中，所述解磷菌的种子培养的培养基除了不含琼脂外，其余与所述活化培养基相同。
在本发明的一些实施方式中，S1步骤中，所述解钾菌的活化培养基每1000ml包括蔗糖3g、Na2HPO4 2g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeCl3 0.005g、CaCO3 0.1g、琼脂20g，pH 7.0-7.4。
在本发明的一些实施方式中，S1步骤中，所述解钾菌的种子培养的培养基除了不含琼脂外，其余与所述活化培养基相同。
在本发明的一些实施方式中，S2步骤中，所述固氮菌、解磷菌和解钾菌的湿菌体混合中，所述褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的菌数量比为(1-5):(1-5):(1-10):(1-10)，优选为(0.5-1.5):(0.5-1.5):(2-4):(4-6)。
在本发明的一些实施方式中，除了褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌，还包括10-30％(重量)的复合菌种，所述复合菌种中包括阿氏枯草芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、解木聚糖类芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。所述阿氏枯草芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、解木聚糖类芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的数目比例为(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)。
在本发明的一些实施方式中，S2步骤中，悬浮所述复合菌体的培养基为稀释的固氮菌液体培养基，优选为稀释5-15倍的固氮菌液体培养基，所述复合菌液中细胞的数量为107-109cfu/ml。
在本发明的一些实施方式中，S3步骤中，所述植物秸秆材料的吸附载体的制备方法为植物秸秆干燥后切成小段，优选为干玉米秸秆在30-45℃干燥30-60min后粉碎成1-5mm的小段。
在本发明的一些实施方式中，所述复合菌体吸附到吸附载体上的方法为将复合菌液分批次与吸附载体，每次吸附前进行干燥；优选为，将(5-10):(90-95)的重量比将复合菌液与吸附载体混合，在30-45℃干燥30-60min；重复吸附一道二次。
在本发明的一些实施方式中，S2步骤中，通过下述方法确定褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的菌数比例：
S21，先预设褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的比例范围(1-5):(1-5):(1-10):(1-10)；
S22，选择不同的比例组合得到复合菌体，液态培养后测量总的菌数CFU；
S13，用下列公式计算得出的各个比例对总的菌数的影响因子：
Figure BDA0002840644060000041
Figure BDA0002840644060000042
S14，比较褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的比例的影响因子，若两个影响因子C1和C2的比值＞Cri，则认为C2没有影响，其中Cri为常数取4-10；
S15，根据褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的影响因子确定褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的数目比例。
在本发明的一些实施方式中，S3步骤中，所述吸附载体的长度通过以下方法确定：
S61，制备至少3中不同长度Li的玉米秸秆；
S62，用制备的载体在同样的条件下吸附复合菌液；
S63，测定经保存的微生物肥料的存活率Si；
S64，通过下列公式确定下一个玉米秸秆的长度Li+1：
Figure BDA0002840644060000043
S65，制备玉米秸秆载体，测定经保存的微生物肥料的存活率；
S66，取Li+1与Li的存活率中靠近最大存活率的L值的两个L值和两个L值之间的一点，重复S65和S65步骤，取最大值为吸附载体的长度。
本发明第二方面在于公开第一方面所述方法制备的农业种植用微生物肥料的应用。
本发明的有益技术效果是：
本发明的农业种植用微生物肥料组成的微生物之间没有拮抗，微生物之间的相互促进生长的作用，制成的微生物肥料可以长时间保持活性。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。除非特别指出，实施例和对比例采用相同的处理方法和步骤。本发明中，除非特别声明，操作在无菌环境中进行。
实施例1
一种农业种植用微生物肥料的制备方法：
采用的微生物均为商业化的菌株，其中固氮菌包括：
褐球固氮菌Azotobacter chroococcum，中国普通微生物保藏管理中心编号为1.233；
固氮红细菌Rhodobacter azotoformans，中国普通微生物保藏管理中心编号为1.5023。
解磷菌为解磷巨大芽孢杆菌、解钾菌为伯克霍尔德氏菌，购自邓州市汇邦生物科技有限公司。
固氮菌的液体培养基：每1000ml包括蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.2g、KH2PO40.2g、NaCl0.2g，CaCO3 5g，pH 6.8-7.0。
解磷菌的液体培养基：每1000ml包括蛋白胨0.5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.02g、FeSO4·7H2O 0.02g、(NH4)2SO4 0.5g、Ca(PO4)2 5.0g，pH7.2-7.4。
解钾菌的液体培养基：每1000ml包括蔗糖3g、Na2HPO4 2g、MgSO4·7H2O0.5g、FeCl30.005g、CaCO3 0.1g，pH 7.0-7.4。
固体培养基为每100ml液体培养基中添加20g的琼脂。
固体培养基分别湿热灭菌，121℃，18min，分装到平板中。
褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌分别接种来自斜面培养的菌种，28℃平板培养72h；传代3次，得到各个活化的菌种；
液体培养基湿热灭菌，121℃，18min，分别接种活化的菌种，250ml摇瓶装液50ml，接种1环，28℃摇瓶培养120h，转速300rmp；
得到的种子液离心后，用无菌水冲洗，离心，重复3次，得到湿菌体；
取褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的种子液，测量体积和菌密度，得到发酵液中的菌数量。按1:1:3:3的菌数量比取样，离心，得到湿菌体，混合，得到复合菌体。用一定量的稀释10倍的固氮菌的液体培养基悬浮，得到复合菌液；复合菌体与悬浮液的比例为控制复合菌液中细胞的数量为107-109cfu/ml。
干玉米秸秆在40℃干燥30min，粉碎成1-3mm的小段，得到吸附载体；
吸附：将10:90的重量比将复合菌液与吸附载体混合，在40℃干燥30min；重复吸附一次，得到所述的农业种植用微生物肥料。
实施例2
一种农业种植用微生物肥料的制备方法：
采用的微生物均为商业化的菌株，其中固氮菌包括：
褐球固氮菌Azotobacter chroococcum，中国普通微生物保藏管理中心编号为1.233；
固氮红细菌Rhodobacter azotoformans，中国普通微生物保藏管理中心编号为1.5023。
解磷菌为解磷巨大芽孢杆菌、解钾菌为伯克霍尔德氏菌，购自邓州市汇邦生物科技有限公司。
固氮菌的液体培养基：每1000ml包括蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.2g、KH2PO40.2g、NaCl0.2g，CaCO3 5g，pH 6.8-7.0。
解磷菌的液体培养基：每1000ml包括蛋白胨0.5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.02g、FeSO4·7H2O 0.02g、(NH4)2SO4 0.5g、Ca(PO4)2 5.0g，pH7.2-7.4。
解钾菌的液体培养基：每1000ml包括蔗糖3g、Na2HPO4 2g、MgSO4·7H2O0.5g、FeCl30.005g、CaCO3 0.1g，pH 7.0-7.4。
固体培养基为每100ml液体培养基中添加20g的琼脂。
固体培养基分别湿热灭菌，121℃，18min，分装到平板中。
褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌分别接种来自斜面培养的菌种，28℃平板培养72h；传代3次，得到各个活化的菌种；
液体培养基湿热灭菌，121℃，18min，分别接种活化的菌种，250ml摇瓶装液50ml，接种1环，28℃摇瓶培养120h，转速300rmp；
得到的种子液离心后，用无菌水冲洗，离心，重复3次，得到湿菌体；
取褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的种子液，测量体积和菌密度，得到发酵液中的菌数量。按1:1:1:1的菌数量比取样，离心，得到湿菌体，混合，得到复合菌体。按实施例1的比例用稀释10倍的固氮菌的液体培养基悬浮，得到复合菌液。
干玉米秸秆在40℃干燥30min，粉碎成1-3mm的小段，得到吸附载体；
吸附：将10:90的重量比将复合菌液与吸附载体混合，在40℃干燥30min；重复吸附一次，得到所述的农业种植用微生物肥料。
实施例3
一种农业种植用微生物肥料的制备方法：
采用的微生物均为商业化的菌株，其中固氮菌包括：
褐球固氮菌Azotobacter chroococcum，中国普通微生物保藏管理中心编号为1.233；
固氮红细菌Rhodobacter azotoformans，中国普通微生物保藏管理中心编号为1.5023。
解磷菌为解磷巨大芽孢杆菌、解钾菌为伯克霍尔德氏菌，购自邓州市汇邦生物科技有限公司。
固氮菌的液体培养基：每1000ml包括蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.2g、KH2PO40.2g、NaCl0.2g，CaCO3 5g，pH 6.8-7.0。
解磷菌的液体培养基：每1000ml包括蛋白胨0.5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.02g、FeSO4·7H2O 0.02g、(NH4)2SO4 0.5g、Ca(PO4)2 5.0g，pH7.2-7.4。
解钾菌的液体培养基：每1000ml包括蔗糖3g、Na2HPO4 2g、MgSO4·7H2O0.5g、FeCl30.005g、CaCO3 0.1g，pH 7.0-7.4。
固体培养基为每100ml液体培养基中添加20g的琼脂。
固体培养基分别湿热灭菌，121℃，18min，分装到平板中。
褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌分别接种来自斜面培养的菌种，28℃平板培养72h；传代3次，得到各个活化的菌种；
液体培养基湿热灭菌，121℃，18min，分别接种活化的菌种，250ml摇瓶装液50ml，接种1环，28℃摇瓶培养120h，转速300rmp；
得到的种子液离心后，用无菌水冲洗，离心，重复3次，得到湿菌体；
取褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的种子液，测量体积和菌密度，得到发酵液中的菌数量。按1:1:3:5的菌数量比取样，离心，得到湿菌体，混合，得到复合菌体。按实施例1的比例用稀释10倍的固氮菌的液体培养基悬浮，得到复合菌液。
干玉米秸秆在40℃干燥30min，粉碎成1-3mm的小段，得到吸附载体；
吸附：将10:90的重量比将复合菌液与吸附载体混合，在40℃干燥30min；重复吸附一次，得到所述的农业种植用微生物肥料。
实施例4
一种农业种植用微生物肥料的制备方法：
与实施例1的区别在于，S2步骤中，通过下述方法确定褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的菌数比例：
S21，先预设褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的比例范围(1-5):(1-5):(1-10):(1-10)；
S22，选择不同的比例组合得到复合菌体，液态培养后测量总的菌数CFU；
S13，用下列公式计算得出的各个比例对总的菌数的影响因子：
Figure BDA0002840644060000091
Figure BDA0002840644060000092
S14，比较褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的比例的影响因子，若两个影响因子C1和C2的比值＞Cri，则认为C2没有影响，其中Cri为常数取4-10；
S15，根据褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的影响因子确定褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的数目比例。
本发明的研究中发现，褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌之间存在促进生长的现象。通过本实施例的方法，可以较快的确定各个菌株之间的促进生长的程度，方便确定微生物肥料中各个菌之间的数目比例。
实施例5
一种农业种植用微生物肥料的制备方法：
与实施例1的区别在于，S3步骤中，所述吸附载体的长度通过以下方法确定：
S61，制备至少3中不同长度Li的玉米秸秆；
S62，用制备的载体在同样的条件下吸附复合菌液；
S63，测定经保存的微生物肥料的存活率Si；
S64，通过下列公式确定下一个玉米秸秆的长度Li+1：
Figure BDA0002840644060000101
S65，制备玉米秸秆载体，测定经保存的微生物肥料的存活率；
S66，取Li+1与Li的存活率中靠近最大存活率的L值的两个L值和两个L值之间的一点，重复S65和S65步骤，取最大值为吸附载体的长度。
吸附载体的长度会影响菌体的吸附情况，进而影响吸附的菌体的保存生存率。本实施例的方法可以在进行尽量少的实验的情况下确定筛选比较具有较高存活率的玉米秸秆的长度。
对比例1
一种农业种植用微生物肥料的制备方法：
采用的微生物均为商业化的菌株，其中固氮菌包括：
褐球固氮菌Azotobacter chroococcum，中国普通微生物保藏管理中心编号为1.233。
解磷菌为解磷巨大芽孢杆菌、解钾菌为伯克霍尔德氏菌，购自邓州市汇邦生物科技有限公司。
固氮菌的液体培养基：每1000ml包括蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.2g、KH2PO40.2g、NaCl0.2g，CaCO3 5g，pH 6.8-7.0。
解磷菌的液体培养基：每1000ml包括蛋白胨0.5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.02g、FeSO4·7H2O 0.02g、(NH4)2SO4 0.5g、Ca(PO4)2 5.0g，pH7.2-7.4。
解钾菌的液体培养基：每1000ml包括蔗糖3g、Na2HPO4 2g、MgSO4·7H2O0.5g、FeCl30.005g、CaCO3 0.1g，pH 7.0-7.4。
固体培养基为每100ml液体培养基中添加20g的琼脂。
固体培养基分别湿热灭菌，121℃，18min，分装到平板中。
褐球固氮菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌分别接种来自斜面培养的菌种，28℃平板培养72h；传代3次，得到各个活化的菌种；
液体培养基湿热灭菌，121℃，18min，分别接种活化的菌种，250ml摇瓶装液50ml，接种1环，28℃摇瓶培养120h，转速300rmp；
得到的种子液离心后，用无菌水冲洗，离心，重复3次，得到湿菌体；
取褐球固氮菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的种子液，测量体积和菌密度，得到发酵液中的菌数量。按2:3:3的菌数量比取样，离心，得到湿菌体，混合，得到复合菌体。按实施例1的比例用稀释10倍的固氮菌的液体培养基悬浮，得到复合菌液。
干玉米秸秆在40℃干燥30min，粉碎成1-3mm的小段，得到吸附载体；
吸附：将10:90的重量比将复合菌液与吸附载体混合，在40℃干燥30min；重复吸附一次，得到微生物肥料。
对比例2
一种农业种植用微生物肥料的制备方法：
采用的微生物均为商业化的菌株，其中固氮菌包括：
褐球固氮菌Azotobacter chroococcum，中国普通微生物保藏管理中心编号为1.233；
固氮红细菌Rhodobacter azotoformans，中国普通微生物保藏管理中心编号为1.5023。
解磷菌为解磷巨大芽孢杆菌、解钾菌为伯克霍尔德氏菌，购自邓州市汇邦生物科技有限公司。
固氮菌的液体培养基：每1000ml包括蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.2g、KH2PO40.2g、NaCl0.2g，CaCO3 5g，pH 6.8-7.0。
解磷菌的液体培养基：每1000ml包括蛋白胨0.5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.02g、FeSO4·7H2O 0.02g、(NH4)2SO4 0.5g、Ca(PO4)2 5.0g，pH7.2-7.4。
解钾菌的液体培养基：每1000ml包括蔗糖3g、Na2HPO4 2g、MgSO4·7H2O0.5g、FeCl30.005g、CaCO3 0.1g，pH 7.0-7.4。
固体培养基为每100ml液体培养基中添加20g的琼脂。
固体培养基分别湿热灭菌，121℃，18min，分装到平板中。
褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌分别接种来自斜面培养的菌种，28℃平板培养72h；传代3次，得到各个活化的菌种；
液体培养基湿热灭菌，121℃，18min，分别接种活化的菌种，250ml摇瓶装液50ml，接种1环，28℃摇瓶培养120h，转速300rmp；
得到的种子液离心后，用无菌水冲洗，离心，重复3次，得到湿菌体；
取褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的种子液，测量体积和菌密度，得到发酵液中的菌数量。按1:1:3:3的菌数量比取样，离心，得到湿菌体，混合，得到复合菌体。
复合菌体不用培养基悬浮和载体吸附。复合菌体用悬浮液冲洗3次，离心后，40℃干燥30min。载体40℃干燥30min后，二者混合。
实验例1菌株的相互作用
1拮抗实验
分别取实施例1中得到的褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的种子液0.5ml，混合后，在固氮固体培养基上涂布均匀，28℃培养120h。在高倍显微镜下观察，发现各单一菌株生长良好并无排斥现象。
2促生长实验
分别取同样数目的实施例1-3和对比例1、2得到的复合菌体，接种到固氮液体培养基中，50ml摇瓶装液50ml，28℃摇瓶培养120h，转速300rmp。采用平板涂布法测定各菌株数。结果见表1。
表1混合培养对增殖的影响
Figure BDA0002840644060000131
实验例2经保存的微生物肥料的存活率
取实施例和对比例的微生物肥料，室温保存，分别在10天、30天和60天取样。测定其中的菌株总数目cfu/g。存活率为与第0天(不经保存)的菌株数目的百分比，结果见表2。
表2经保存的微生物肥料的细菌存活率
Figure BDA0002840644060000132
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一种农业种植用微生物肥料的制备方法，包括以下步骤：
S1，固氮菌、解磷菌和解钾菌分别进行活化培养和种子培养；
S2，种子培养得到的湿菌体进行混合，得到复合菌体；用培养基悬浮，得到复合菌液；
S3，植物秸秆材料的吸附载体的制备；
S4，将所述复合菌体吸附到吸附载体上，得到所述农业种植用微生物肥料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1步骤中，所述固氮菌包括褐球固氮菌和固氮红细菌，所述解磷菌包括解磷巨大芽孢杆菌，所述解钾菌包括伯克霍尔德氏菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S1步骤中，所述固氮菌、解磷菌和解钾菌的活化培养为斜面菌种分别在活化培养基上，28-30℃平板培养100-120h，传代2-4次；
S1步骤中，所述固氮菌、解磷菌和解钾菌的活化培养为活化的菌种分别在活化培养基中，28-30℃摇瓶培养100-120h。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S1步骤中，所述固氮菌的活化培养的培养基每1000ml包括蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.2g、KH2PO4 0.2g、NaCl 0.2g，CaCO3 5g、琼脂20g，pH 6.8-7.0；所述固氮菌的种子培养的培养基除了不含琼脂外，其余与活化培养的培养基相同；
S1步骤中，所述解磷菌的活化培养基每1000ml包括蛋白胨0.5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O0.2g、MnSO4·H2O 0.02g、FeSO4·7H2O 0.02g、(NH4)2SO4 0.5g、Ca(PO4)2 5.0g、琼脂20g，pH7.2-7.4；所述解磷菌的种子培养的培养基除了不含琼脂外，其余与所述活化培养基相同；
S1步骤中，所述解钾菌的活化培养基每1000ml包括蔗糖3g、Na2HPO4 2g、MgSO4·7H2O0.5g、FeCl3 0.005g、CaCO3 0.1g、琼脂20g，pH 7.0-7.4；所述解钾菌的种子培养的培养基除了不含琼脂外，其余与所述活化培养基相同。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S2步骤中，所述固氮菌、解磷菌和解钾菌的湿菌体混合中，所述褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的菌数量比为(1-5):(1-5):(1-10):(1-10)，优选为(0.5-1.5):(0.5-1.5):(2-4):(4-6)；
S2步骤中，悬浮所述复合菌体的培养基为稀释的固氮菌液体培养基，优选为稀释5-15倍的固氮菌液体培养基，所述复合菌液中细胞的数量为107-109cfu/ml。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S3步骤中，所述植物秸秆材料的吸附载体的制备方法为植物秸秆干燥后切成小段，优选为干玉米秸秆在30-45℃干燥30-60min后粉碎成1-5mm的小段。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述复合菌体吸附到吸附载体上的方法为将复合菌液分批次与吸附载体，每次吸附前进行干燥；优选为，将(5-10):(90-95)的重量比将复合菌液与吸附载体混合，在30-45℃干燥30-60min；重复吸附一到二次。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S2步骤中，通过下述方法确定褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的菌数比例：
S21，先预设褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的比例范围(1-5):(1-5):(1-10):(1-10)；
S22，选择不同的比例组合得到复合菌体，液态培养后测量总的菌数CFU；
S13，用下列公式计算得出的各个比例对总的菌数的影响因子：
Figure FDA0002840644050000021
Figure FDA0002840644050000022
S14，比较褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的比例的影响因子，若两个影响因子C1和C2的比值＞Cri，则认为C2没有影响，其中Cri为常数取4-10；
S15，根据褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的影响因子确定褐球固氮菌、固氮红细菌、解磷巨大芽孢杆菌和伯克霍尔德氏菌的数目比例。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S3步骤中，所述吸附载体的长度通过以下方法确定：
S61，制备至少3中不同长度Li的玉米秸秆；
S62，用制备的载体在同样的条件下吸附复合菌液；
S63，测定经保存的微生物肥料的存活率Si；
S64，通过下列公式确定下一个玉米秸秆的长度Li+1：
Figure FDA0002840644050000031
S65，制备玉米秸秆载体，测定经保存的微生物肥料的存活率；
S66，取Li+1与Li的存活率中靠近最大存活率的L值的两个L值和两个L值之间的一点，重复S65和S65步骤，取最大值为吸附载体的长度。
10.根据权利要求1-9任意所述的方法制备的农业种植用微生物肥料的应用。
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