CN112470932A - 一种利用ems试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，该方法步骤如下：a、诱导百合胚性愈伤组织；b、配置耐盐诱变培养基；c、耐盐诱变：把愈伤组织放置于含EMS试剂的耐盐诱变培养基上诱变；d、诱导成苗：存活的愈伤组织依次接种到成苗培养基、鳞茎培养基上培养，长出直径为0.1cm‑0.5cm的百合小鳞茎备用；e、耐盐筛选：把培养好的直径为0.1cm‑0.5cm的百合小鳞茎转接到筛选培养基上培养，正常生长的耐盐百合鳞茎即为耐盐百合新品系。本发明的方法通过在盐环境培养条件下进行定向诱变而选育出耐盐百合新品系的方法，操作简单、可操作性强且利用诱变效率高，短时间内可极大丰富百合耐盐种质资源。

Description

一种利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法
技术领域
本发明涉及种苗技术领域，具体地说是一种利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，该方法能够高效的培育出百合耐盐新种质。
背景技术
随着世界百合生产和种球贸易的扩大，百合生产面积及种球需求量，然而百合生长条件较为严格，喜欢适宜在排水良好的微酸性环境中生长, 对盐较敏感。土壤盐碱度是关系到百合能否正常生长的关键因素, 而中国北方大部分地区水和土壤偏盐碱性，极大地限制了百合产业的发展。
目前关于百合耐盐品种的研究主要集中在耐盐体系的评价及田间筛选方面，但存在种质资源较少、耐盐品系进程缓慢等问题，难以满足百合产业发展的需求。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提供一种利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，该方法能够高效的培育出耐盐百合新种质。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，其特征在于：该方法步骤如下：
a、诱导百合胚性愈伤组织：把百合鳞片放置于诱导愈伤培养基上诱导出淡黄色愈伤颗粒出现，备用；
b、配置耐盐诱变培养基：配置耐盐诱变培养基：MS+5mg/L2,4-D+2g/LNaCL+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖+0.5%EMS，配好后分装备用；
c、愈伤组织耐盐诱变：把步骤a中备用的愈伤组织，放置于步骤b配置出的含EMS试剂的耐盐诱变培养基上，进行耐盐诱变；
d、诱导成苗：把耐盐诱变存活的愈伤组织接种到成苗培养基上培养，愈伤组织上长出的百合小鳞茎转到鳞茎培养基上继续培养，待长出直径为0.1cm-0.5cm的百合小鳞茎备用；
e、耐盐筛选：把培养好的直径为0.1cm-0.5cm的百合小鳞茎转接到筛选培养基上进行耐盐筛选培养，筛选培养基的配方为：MS+0.1mg/LNAA+4g/LNaCL +6.5g/L琼脂+60g/L，35-40d后筛选出正常生长的耐盐百合鳞茎即为耐盐百合新品系。
所述步骤a中的百合鳞片处理过程为：把百合鳞片用流水冲洗0.5-2小时；用75%的酒精浸泡30-40s后放入0.1%-0.2%的升汞中7-9min，再用无菌水冲洗4-6次，然后把鳞片切成小块并凹面朝上放置于诱导愈伤培养基上诱导培养。
所述小块的尺寸为0.5cm*0.5cm。
所述步骤a中的百合鳞片培养条件为：暗培养、培养温度为23-26℃、培养时间为50-60d。
所述步骤b中的耐盐诱变培养基的配置方法为：先做好MS+5mg/L2,4-D+2g/LNaCL+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖的诱变培养基，该诱变培养基的pH=5.8-6.0；诱变培养基经高温灭菌后，使诱变培养基保持50℃以上即液体状态；在无菌通风橱内添加EMS母液，配置出耐盐诱变培养基：MS+5mg/L2,4-D+2g/LNaCL+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖+0.5%EMS，配好后分装备用。
添加EMS母液的过程需要穿上防辐射工作服和带上防毒面具，并采用直径为0.22µm的一次性过滤器添加EMS母液。
所述步骤c中的愈伤组织需要先在无菌条件下切成黄豆大小(0.2cm*0.2cm)，再放置于含EMS试剂的耐盐诱变培养基上进行耐盐诱变，培养条件为光暗培养时间10h/14h、培养温度23-26℃。
所述步骤d中的成苗培养基配方为1/2MS+0.2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA +6.5g/L琼脂+15g/L蔗糖，该成苗培养基的pH=5.8-6.0；所述步骤d中的鳞茎培养基的配方为：MS+0.1mg/LNAA +6.5g/L琼脂+60g/L蔗糖。
所述步骤e中的筛选培养基的配方为：MS+0.1mg/LNAA+4g/LNaCL +6.5g/L琼脂+60g/L。
所述步骤e中的耐盐百合新品系进行扩繁培养的过程为：对筛选出的耐盐百合鳞茎，分株进行扩繁，扩繁到一定量后，低温解除休眠即可下地种植观察；扩繁培养基为：MS+0.1mg/LNAA +1mg/L6-BA +6.5g/L琼脂+60g/L蔗糖，扩繁培养基的pH=5.8-6.0。
本发明相比现有技术有如下优点：
本发明提供的利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，其目的就是克服现有百合耐盐品种选育困难，而提供一种全新的在盐环境培养条件下进行定向诱变而选育出耐盐百合新品系的方法，该方法过程操作简单、可操作性强且利用诱变效率高，有效的解决了耐盐百合新品种培育过程中耐盐资源少、杂交育种困难等难题，为耐盐百合新品种的培育提供关键性技术支持，短时间内可极大丰富耐盐百合种质资源，能够加快耐盐百合新品系的培育。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，该方法步骤如下：
a、诱导百合胚性愈伤组织
把百合鳞片用流水冲洗0.5-2小时；用75%的酒精浸泡30-40s后放入0.1%-0.2%的升汞中7-9min，再用无菌水冲洗4-6次，然后把鳞片切成0.5cm*0.5cm的小块，凹面朝上放置于诱导愈伤培养基上培养；培养条件为暗培养、培养温度为23-26℃、培养时间为50-60d，诱导出淡黄色愈伤颗粒出现，备用；诱导愈伤培养基为：MS+5mg/L2,4-D+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，该培养基的pH=5.8-6.0；
b、配置耐盐诱变培养基
提前做好MS+5mg/L2,4-D+2g/LNaCL+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖的诱变培养基，该诱变培养基的pH=5.8-6.0；诱变培养基经高温灭菌后，使诱变培养基保持50℃以上即液体状态；穿上防辐射工作服和带上防毒面具在无菌通风橱内用一次性过滤器（直径为0.22µm）添加EMS（甲基黄酸乙酯）母液，配置出耐盐诱变培养基：MS+5mg/L2,4-D+2g/LNaCL+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖+0.5%EMS，配好后分装备用；
c、愈伤组织耐盐诱变
把步骤a中备用的愈伤组织，在无菌条件下切成黄豆大小(0.2cm*0.2cm)，放置于含EMS试剂的耐盐诱变培养基上进行耐盐诱变，培养条件为光暗培养时间10h/14h、培养温度23-26℃，培养至少40d后观察耐盐诱变培养基中的愈伤组织的存活率，一般为25%-35%；
d、诱导成苗
把耐盐诱变存活的愈伤组织接种到成苗培养基上，成苗培养基配方为1/2MS+0.2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA +6.5g/L琼脂+15g/L蔗糖，该成苗培养基的pH=5.8-6.0；40d后，将愈伤组织上长出的百合小鳞茎，转到鳞茎培养基上，鳞茎培养基的配方为：MS+0.1mg/LNAA +6.5g/L琼脂+60g/L蔗糖，50-55d后长出直径为0.1cm-0.5cm的百合小鳞茎备用；
e、耐盐筛选
把培养好的直径为0.1cm-0.5cm的百合小鳞茎转接到筛选培养基上进行耐盐筛选培养，筛选培养基的配方为：MS+0.1mg/LNAA+4g/LNaCL +6.5g/L琼脂+60g/L，35-40d后筛选出可以正常生长的耐盐百合鳞茎即为耐盐百合新品系；
f、耐盐百合新品系扩繁
对筛选出的耐盐百合鳞茎，分株进行扩繁，扩繁到一定量后，低温解除休眠即可下地种植观察；扩繁培养基为：MS+0.1mg/LNAA +1mg/L6-BA +6.5g/L琼脂+60g/L蔗糖，扩繁培养基的pH=5.8-6.0。
下面通过具体实施例对本发明提供的利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法作进一步的说明。
实施例一 品种“索邦（sorbonne）”
利用EMS试剂诱变进行耐盐索邦百合新品系选育的方法步骤如下：
a、诱导百合胚性愈伤组织
把索邦百合鳞片用流水冲洗1.5小时；用75%的酒精浸泡30-40s后放入0.2%的升汞中7-9min，再用无菌水冲洗4-6次，然后把鳞片切成0.5cm*0.5cm的小块，凹面朝上放置于诱导愈伤培养基上培养；培养条件为暗培养、培养温度为23-26℃、培养时间为50-60d，诱导出淡黄色愈伤颗粒出现，备用；诱导愈伤培养基为：MS+5mg/L2,4-D+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，该培养基的pH=5.8；
b、配置耐盐诱变培养基
提前做好MS+5mg/L2,4-D+2g/LNaCL+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖的诱变培养基，该诱变培养基的pH=5.8；诱变培养基经高温灭菌后，使诱变培养基保持50℃以上即液体状态；穿上防辐射工作服和带上防毒面具在无菌通风橱内用一次性过滤器（直径为0.22µm）添加EMS（甲基黄酸乙酯）母液，配置出耐盐诱变培养基：MS+5mg/L2,4-D+2g/LNaCL+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖+0.5%EMS，配好后分装备用；
c、愈伤组织耐盐诱变
把步骤a中备用的愈伤组织，在无菌条件下切成0.2cm*0.2cm大小，放置于含EMS试剂的耐盐诱变培养基上进行耐盐诱变，培养条件为光暗培养时间10h/14h、培养温度23-26℃，培养45d后观察耐盐诱变培养基中的愈伤组织的存活率为34%；
d、诱导成苗
把耐盐诱变存活的愈伤组织接种到成苗培养基上，成苗培养基配方为1/2MS+0.2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA +6.5g/L琼脂+15g/L蔗糖，该成苗培养基的pH=5.8，40d后，将愈伤组织上长出的百合小鳞茎，转到鳞茎培养基上，鳞茎培养基的配方为：MS+0.1mg/LNAA +6.5g/L琼脂+60g/L蔗糖，55d后长出直径为0.1cm-0.5cm的百合小鳞茎备用；
e、耐盐筛选
把培养好的直径为0.1cm-0.5cm的百合小鳞茎转接到筛选培养基上进行耐盐筛选培养，筛选培养基的配方为：MS+0.1mg/LNAA+4g/LNaCL +6.5g/L琼脂+60g/L，35d后筛选出可以正常生长的耐盐百合鳞茎即为耐盐百合新品系；
f、耐盐百合新品系扩繁
对筛选出的耐盐百合鳞茎，分株进行扩繁，扩繁到一定量后，低温解除休眠即可下地种植观察；扩繁培养基为：MS+0.1mg/LNAA +1mg/L6-BA +6.5g/L琼脂+60g/L蔗糖，扩繁培养基的pH=5.8。
实施例二 品种“木门(concad’or)”
利用EMS试剂诱变进行耐盐木门百合新品系选育的方法步骤如下：
a、诱导百合胚性愈伤组织
把木门百合鳞片用流水冲洗0.5-2小时；用75%的酒精浸泡30-40s后放入0.1%-0.2%的升汞中7-9min，再用无菌水冲洗4-6次，然后把鳞片切成0.5cm*0.5cm的小块，凹面朝上放置于诱导愈伤培养基上培养；培养条件为暗培养、培养温度为23-26℃、培养时间为50-60d，诱导出淡黄色愈伤颗粒出现，备用；诱导愈伤培养基为：MS+5mg/L2,4-D+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖，该培养基的pH=5.9；
b、配置耐盐诱变培养基
提前做好MS+5mg/L2,4-D+2g/LNaCL+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖的诱变培养基，该诱变培养基的pH=5.9；诱变培养基经高温灭菌后，使诱变培养基保持50℃以上即液体状态；穿上防辐射工作服和带上防毒面具在无菌通风橱内用一次性过滤器（直径为0.22µm）添加EMS（甲基黄酸乙酯）母液，配置出耐盐诱变培养基：MS+5mg/L2,4-D+2g/LNaCL+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖+0.5%EMS，配好后分装备用；
c、愈伤组织耐盐诱变
把步骤a中备用的愈伤组织，在无菌条件下切成0.2cm*0.2cm大小，放置于含EMS试剂的耐盐诱变培养基上进行耐盐诱变，培养条件为光暗培养时间10h/14h、培养温度23-26℃，培养40d后观察耐盐诱变培养基中的愈伤组织的存活率为31%；
d、诱导成苗
把耐盐诱变存活的愈伤组织接种到成苗培养基上，成苗培养基配方为1/2MS+0.2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA +6.5g/L琼脂+15g/L蔗糖，该成苗培养基的pH=5.9，40d后，将愈伤组织上长出的百合小鳞茎，转到鳞茎培养基上，鳞茎培养基的配方为：MS+0.1mg/LNAA +6.5g/L琼脂+60g/L蔗糖，50d后长出直径为0.1cm-0.5cm的百合小鳞茎备用；
e、耐盐筛选
把培养好的直径为0.1cm-0.5cm的百合小鳞茎转接到筛选培养基上进行耐盐筛选培养，筛选培养基的配方为：MS+0.1mg/LNAA+4g/LNaCL +6.5g/L琼脂+60g/L，38d后筛选出可以正常生长的耐盐百合鳞茎即为耐盐百合新品系；
f、耐盐百合新品系扩繁
对筛选出的耐盐百合鳞茎，分株进行扩繁，扩繁到一定量后，低温解除休眠即可下地种植观察；扩繁培养基为：MS+0.1mg/LNAA +1mg/L6-BA +6.5g/L琼脂+60g/L蔗糖，扩繁培养基的pH=5.9。
本发明提供的利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，其目的就是克服现有百合耐盐品种选育困难，而提供一种全新的在盐环境培养条件下进行定向诱变而选育出耐盐百合新品系的方法，该方法过程操作简单、可操作性强且利用诱变效率高，有效的解决了耐盐百合新品种培育过程中耐盐资源少、杂交育种困难等难题，为耐盐百合新品种的培育提供关键性技术支持，短时间内可极大丰富耐盐百合种质资源，能够加快耐盐百合新品系的培育。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，其特征在于：该方法步骤如下：
a、诱导百合胚性愈伤组织：把百合鳞片放置于诱导愈伤培养基上诱导出淡黄色愈伤颗粒出现，备用；
b、配置耐盐诱变培养基：配置耐盐诱变培养基：MS+5mg/L2,4-D+2g/LNaCL+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖+0.5%EMS，配好后分装备用；
c、愈伤组织耐盐诱变：把步骤a中备用的愈伤组织，放置于步骤b配置出的含EMS试剂的耐盐诱变培养基上，进行耐盐诱变；
d、诱导成苗：把耐盐诱变存活的愈伤组织接种到成苗培养基上培养，愈伤组织上长出的百合小鳞茎转到鳞茎培养基上继续培养，待长出直径为0.1cm-0.5cm的百合小鳞茎备用；
e、耐盐筛选：把培养好的直径为0.1cm-0.5cm的百合小鳞茎转接到筛选培养基上进行耐盐筛选培养，筛选培养基的配方为：MS+0.1mg/LNAA+4g/LNaCL +6.5g/L琼脂+60g/L，35-40d后筛选出正常生长的耐盐百合鳞茎即为耐盐百合新品系。
2.根据权利要求1所述的利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，其特征在于：所述步骤a中的百合鳞片处理过程为：把百合鳞片用流水冲洗0.5-2小时；用75%的酒精浸泡30-40s后放入0.1%-0.2%的升汞中7-9min，再用无菌水冲洗4-6次，然后把鳞片切成小块并凹面朝上放置于诱导愈伤培养基上诱导培养。
3.根据权利要求2所述的利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，其特征在于：所述小块的尺寸为0.5cm*0.5cm。
4.根据权利要求1所述的利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，其特征在于：所述步骤a中的百合鳞片培养条件为：暗培养、培养温度为23-26℃、培养时间为50-60d。
5.根据权利要求1所述的利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，其特征在于：所述步骤b中的耐盐诱变培养基的配置方法为：先做好MS+5mg/L2,4-D+2g/LNaCL+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖的诱变培养基，该诱变培养基的pH=5.8-6.0；诱变培养基经高温灭菌后，使诱变培养基保持50℃以上即液体状态；在无菌通风橱内添加EMS母液，配置出耐盐诱变培养基：MS+5mg/L2,4-D+2g/LNaCL+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖+0.5%EMS，配好后分装备用。
6.根据权利要求5所述的利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，其特征在于：添加EMS母液的过程需要穿上防辐射工作服和带上防毒面具，并采用直径为0.22µm的一次性过滤器添加EMS母液。
7.根据权利要求1所述的利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，其特征在于：所述步骤c中的愈伤组织需要先在无菌条件下切成黄豆大小，再放置于含EMS试剂的耐盐诱变培养基上进行耐盐诱变，培养条件为光暗培养时间10h/14h、培养温度23-26℃。
8.根据权利要求1所述的利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，其特征在于：所述步骤d中的成苗培养基配方为1/2MS+0.2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA +6.5g/L琼脂+15g/L蔗糖，该成苗培养基的pH=5.8-6.0；所述步骤d中的鳞茎培养基的配方为：MS+0.1mg/LNAA+6.5g/L琼脂+60g/L蔗糖。
9.根据权利要求1所述的利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，其特征在于：所述步骤e中的筛选培养基的配方为：MS+0.1mg/LNAA+4g/LNaCL +6.5g/L琼脂+60g/L。
10.根据权利要求1所述的利用EMS试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法，其特征在于：所述步骤e中的耐盐百合新品系进行扩繁培养的过程为：对筛选出的耐盐百合鳞茎，分株进行扩繁，扩繁到一定量后，低温解除休眠即可下地种植观察；扩繁培养基为：MS+0.1mg/LNAA +1mg/L6-BA +6.5g/L琼脂+60g/L蔗糖，扩繁培养基的pH=5.8-6.0。
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