CN112462075A - 一种碱性磷酸酶标记amh抗体结合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医疗诊断技术领域，公开了一种碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物及其制备方法和应用。本发明所述碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物具备式I所示结构。本发明所述碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物通过Traut’s Reagent和Sulfo‑SMCC为“桥梁”将碱性磷酸酶和AMH抗体连接在一起，所获的酶标抗体在37℃加速试验条件下的稳定性更高，在放置10天后，发光值偏差控制在5％以内，可应用于AMH的化学发光免疫分析法的试剂盒中；
Description
技术领域
本发明涉及医疗诊断技术领域，具体的说是涉及一种碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物及其制备方法和应用。
背景技术
目前认为抗缪勒氏管激素(AMH)是评估卵巢储备功能的最好的指标之一，而女性卵巢储备功能的检测可以对女性生育能力进行评估。AMH对***(PCOS)、卵巢早衰、儿童性发育异常的诊断、辅助生殖技术(ART)中的应用中有重要意义。
目前对AMH检测常用方法有酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)、化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay，CLIA)，CLIA法较ELISA法检测更为快速，且灵敏度、线性、稳定性更好。
在专利CN109444437A中，基于一种还原方法标记发光指示物的缪勒氏管激素测定试剂盒，其具有极佳的稳定性，37℃下8天的稳定性，测试浓度分别为20ng/mL，0.8ng/mL，发光值总体分别下降了6.2％，10.1％。然而在抗缪勒氏管激素化学发光检测试剂盒中，追求更佳的稳定性是普遍的需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物及其制备方法，使所述结合物在37℃加速试验环境下稳定性更高；
本发明的另外一个发明目的在于提供上述碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物在制备检测AMH试剂盒中的应用。
本发明的另外一个目的在于提供上述试剂盒的制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物，具备式I所示结构：
其中，R-NH为碱性磷酸酶，Antibody-NH为AMH抗体。
本发明还同时提供了式I所示碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物的制备方法，包括：
步骤1、碱性磷酸酶与Traut’s Reagent室温反应生成改性的碱性磷酸酶；
步骤2、AMH抗体用Sulfo-SMCC在室温下活化，生成活化后的AMH抗体，然后与步骤1生成的改性的碱性磷酸酶反应，生成式I结构的碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物；
作为优选，步骤1中所述碱性磷酸酶与Traut’s Reagent质量比(5-20)：1；在本发明具体实施方式中，所述碱性磷酸酶与Traut’s Reagent质量比10：1；
作为优选，步骤2中所述AMH抗体与Sulfo-SMCC质量比(5-20)：1；在本发明具体实施方式中，所述AMH抗体与Sulfo-SMCC质量比10：1。
本发明提供的酶标AMH抗体在37℃加速试验条件下放置10天后，基于化学发光免疫分析法进行检测，与未放置的对照相比发光值偏差控制在5％以内，相比现有专利有明显的优势。基于此，本发明提出了所述酶标AMH抗体在制备AMH检测试剂盒中的应用。作为优选，所述试剂盒为化学发光免疫分析法试剂盒。
依据应用，本发明提供了一种AMH化学发光免疫分析法试剂盒，其酶标抗体为本发明所述酶标AMH抗体。
作为优选，所述试剂盒还包括：磁珠工作液和/或样品处理液。
由以上技术方案可知，本发明所述碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物通过Traut’sReagent和Sulfo-SMCC为“桥梁”将碱性磷酸酶和AMH抗体连接在一起，所获的酶标抗体在37℃加速试验条件下的稳定性更高，在放置10天后，发光值偏差控制在5％以内，可应用于AMH的化学发光免疫分析法的试剂盒中。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物及其制备方法和应用已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物及其制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物及其制备方法和应用做进一步说明。
实施例1：制备本发明碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物
1、碱性磷酸酶的改性和纯化
取100ug碱性磷酸酶(可选范围50-200ug，最优100ug)，加入5uL 2mg/mL Traut’sReagent(2-亚氨基硫烷盐酸盐)溶液，混匀室温反应1小时，加入1uL1M甘氨酸溶液反应10分钟，用脱盐柱进行脱盐纯化。碱性磷酸酶与Traut’s Reagent质量比10：1，碱性磷酸酶与甘氨酸质量比1：0.75。
其中，甘氨酸有氨基基团会与过量的Traut’s Reagent(2-亚氨基硫烷盐酸盐)溶液反应，生成的结合物会经过脱盐柱去掉。
2、AMH抗体的活化和纯化
取100ug AMH抗体(可选范围50-200ug，最优100ug)加入5uL 2mg/mL Sulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)溶液，涡旋混匀室温反应1小时，加入1uL甘氨酸溶液反应10分钟，用脱盐柱进行脱盐纯化。AMH抗体与Sulfo-SMCC质量比10：1，AMH抗体与甘氨酸质量比1：0.75。
3、活化AMH抗体与碱性磷酸酶的偶联以及封闭
将活化的AMH抗体与改性的碱性磷酸酶涡旋混匀，室温反应1小时，加入10uL10mg/mL的N-乙基马来酰亚胺，涡旋混匀室温反应半小时，加入10uL10mg/mL的乙醇胺涡旋混匀室温反应半小时，用脱盐柱脱盐纯化得到纯化后的酶标记产物，加入100uL pH7.4的PBS(50mM PB 150mM NaCl)缓冲液(可选80-240uL，最优100uL)，加入等体积甘油保存在-20℃。碱性磷酸酶与N-乙基马来酰亚胺质量比1：1，碱性磷酸酶与乙醇胺质量比1：1，加入缓冲液的酶标记产物与甘油体积比为1：1。
其中，N-乙基马来酰亚胺与活化后的碱性磷酸酶的巯基反应，封闭巯基；乙醇胺与多余的N-乙基马来酰亚胺和活化的AMH抗体反应，终止活化的AMH抗体的偶联。
实施例2：AMH化学发光免疫分析试剂盒
1、AMH检测试剂盒(化学发光法)酶标工作液配制：将实施例1的碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物，用PBS缓冲液配制成酶标工作液，添加0.5％Pc300和0.5％Tw-20。
2、将上述酶标工作液搭配AMH检测试剂盒(化学发光法)另外两个试剂组分：磁珠工作液以及样本处理液组成试剂盒。磁珠工作液包含：磁珠包被AMH抗体(优选单克隆抗体)、pH7.4的Tris(50mM)缓冲液、0.5％Pc300、0.5％Tw-20。样本处理液包含：pH7.4的PBS(50mM PB 150mM NaCl)缓冲液、0.5％Pc300、0.5％Tw-20。
实施例3：37℃加速试验
将实施例2酶标工作液放入37℃恒温恒湿(40-60％相对湿度)培养箱，进行加速稳定性实验，放入前以及连续10天检测发光值(配合实施例1其他组分)，对比37℃加速稳定性的偏差。
检测过程：将样本在全自动化学发光免疫分析仪上进行(夹心化学发光免疫分析法)，其检验原理如下：
第一步：将样本与包被着抗AMH单克隆抗体的超顺磁性微粒(磁珠)、样本处理液以及抗AMH单克隆抗体-碱性磷酸酶标记物添加到反应管中，经过孵育，样本中AMH和包被在磁珠上的抗AMH单克隆抗体结合，同时抗AMH单克隆抗体-碱性磷酸酶标记物与样本中AMH另一位点结合，形成抗原抗体夹心免疫复合物。反应完成后，通过清洗步骤洗去未结合的物质。
第二步：将化学发光底物液(APS-5)添加到反应管中，发光底物被碱性磷酸酶分解，产生化学发光，由广电倍增管对反应所产生的光子数进行测量，所产生的光子数与样本内AMH的浓度成正比，通过检测仪的定标曲线计算得到样本中AMH的浓度。结果见表1和表2；
表1 未放置37℃加速的检测结果
| 样本浓度 | 发光值1 | 发光值2 | 发光值3 | 发光值4 | 发光值5 | 平均值 |
| 0.8ng/mL | 22332.2 | 23150.9 | 22112.5 | 22899.4 | 22766.4 | 22652 |
| 20ng/mL | 669244.3 | 671713.3 | 670322.2 | 668729.9 | 670218.0 | 670046 |
表2 放置37℃加速的检测结果
| 样本浓度 | 发光值1 | 发光值2 | 发光值3 | 发光值4 | 发光值5 | 平均值 | 偏差 |
| 0.8ng/mL | 21157.8 | 22125.0 | 21428.5 | 21915.6 | 21854.3 | 21696 | -4.22％ |
| 20ng/mL | 644843.1 | 640836.0 | 639324.1 | 647281.4 | 651007.4 | 644658 | -3.79％ |
综合表1和表2结果可以看出，采用本发明提供的酶标抗体可以明显提高在37℃加速试验条件下的稳定性，经过加速试验后发光值偏差控制在5％以内，优于同类产品的稳定性。
以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。
Claims (8)
1.一种碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物，其特征在于，具备式I所示结构：
其中，R-NH为碱性磷酸酶，Antibody-NH为AMH抗体。
2.式I所示碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1、碱性磷酸酶与Traut’s Reagent室温反应生成改性的碱性磷酸酶；
步骤2、AMH抗体用Sulfo-SMCC在室温下活化，生成活化后的AMH抗体，然后与步骤1生成的改性的碱性磷酸酶反应，生成式I结构的碱性磷酸酶标记AMH抗体结合物；
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤1中所述碱性磷酸酶与Traut’sReagent质量比(5-20)：1。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤2中所述AMH抗体与Sulfo-SMCC质量比(5-20)：1。
5.权利要求1所述酶标AMH抗体在制备AMH检测试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述试剂盒为化学发光免疫分析法试剂盒。
7.一种AMH化学发光免疫分析法试剂盒，其特征在于，酶标抗体为权利要求1所述酶标AMH抗体。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，还包括：磁珠工作液和/或样品处理液。
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