CN112458099B - 香葱内参基因及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种香葱内参基因及其筛选方法和应用，属于分子生物学领域。选取13个候选内参基因Ac18S、Af18s、Af28s、AcActin、AfActin、AfTUA、AfTUB、AsSAND、AfMYH、AfGAPDH、AfUBQ、AfEF1a、AfCYC，利用实时荧光定量RT‑qPCR技术对其在高温胁迫处理中的表达水平进行检测，结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评价13个内参基因的稳定性，最后进行综合分析，得到高温胁迫下最适合的香葱内参基因为AfActin，为后续香葱基因表达相关的科学研究提供了参考。

Description

香葱内参基因及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及香葱内参基因及其筛选方法和应用。

背景技术

香葱，又称：葱、细香葱、北葱、火葱。拉丁文名：Allium fistulosumL.var.caespitosum Makino.百合科、葱属植物，鳞茎聚生，矩圆状卵形、狭卵形或卵状圆柱形；鳞茎外皮红褐色、***至黄白色，膜质或薄革质，不破裂。叶为中空的圆筒状，向顶端渐尖，深绿色，常略带白粉。植株小，叶极细，质地柔嫩，味清香，微辣，主要用于调味和去腥。原产于亚洲西部，在我国南方较为广泛的栽培，欧洲和亚洲的一些地方也有栽培。香葱既是日常必不可少的重要辛香调料，更是重要的参与精准扶贫、南菜北运、出口脱水蔬菜品种。

香葱性喜冷凉。在南方地区香葱周年生产情况下，高温是香葱夏秋生产中面临的最大产业瓶颈。高温环境下极易造成葱管退绿、葱尖干黄、葱白腐烂、组织老化和纤维增多、病害频发甚至绝收等现象，严重影响香葱的产量、品质和效益。针对产业需求开展香葱耐热分子机理机制研究有非常重要的理论和应用价值。

基因功能的行使是从DNA到mRNA再到蛋白的一个过程，基因表达水平一般是通过基因转录mRNA的量来衡量。因此，准确评估目标基因的表达量对研究其生物学功能意义重大。内参基因即内源性参照基因，理想上内参基因应在所有组织、细胞中均有表达，在不同环境、条件下均能稳定表达且不受任何内外因素影响。而在实际研究过程中，常用内参基因的表达在不同组织器官中、不同处理条件下、不同类型细胞中和不同发育阶段中并不绝对恒定，因此，在利用荧光定量PCR进行目的基因表达的研究时，第一步应根据不同的试验条件、试验样品筛选合适稳定的内参基因。常见的内参基因有β-actin、EF-1α、18S rRNA、28SrRNA等。目前为止，尚未见高温胁迫下香葱专用内参基因相关研究的报道。这严重制约了香葱分子育种研究进程。因此，在香葱中挖掘高度可信的内参基因十分必要。

发明内容

本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种香葱内参基因，为后续香葱基因表达相关的科学研究提供了参考。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种香葱内参基因，所述内参基因为AfActin，所述内参基因AfActin的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

还提供了一种用于扩增权利要求1所述内参基因的PCR引物，所述PCR引物的核苷酸序列是：正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3。

还提供了一种香葱内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、选择10个香葱基因和3个其他品种内参基因作为内参候选基因，其中，10个香葱基因为：Af18s、Af28s、AfActin、AfTUA、AfTUB、AfMYH、AfGAPDH、AfUBQ、AfEF1a和AfCYC；3个其他品种内参基因为：洋葱Ac18s、洋葱AcActin、大蒜AsSAND；并设计荧光定量PCR引物。

S2、提取高温胁迫处理下的“桂香葱1号”以及“AF35”的总RNA，反转录成cDNA，作为荧光定量PCR的模板，以步骤S1中设计的引物为荧光定量PCR引物，进行荧光定量PCR实验，获得荧光定量PCR数据。

S3、利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对步骤S2中获得的荧光定量PCR数据进行表达稳定性分析，筛选出稳定表达的内参基因。

优选的，高温胁迫处理条件为：白天6:00-20：00：38℃，湿度70％，光照3；晚上20:00-次日6:00，35℃，湿度65％，光照0；对照组非胁迫条件为：白天6:00-20：00：23℃，湿度70％，光照3.晚上20:00-次日6:00，20℃，湿度65％，光照0。分别于处理的0h、6h、12h、24h、48h、72h时收集香葱叶片。

优选的，采用Primer Premier3.0根据香葱转录组数据进行内参候选基因引物设计，引物长度为18～23bp，Tm值在57～62℃之间，产物大小在100～200bp之间，并在NCBI上对引物的特异性进行检测。

优选的，采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件分别计算出不同处理下内参基因的表达稳定性M值、稳定值SV值和变异系数CV/标准偏差SD值，并根据M值、SV值、CV值、SD值按从小到大对内参基因表达稳定性分别进行排序，M值、SV值、CV值、SD值均为越小对应的内参基因越稳定。

对各软件中得到的稳定性排名分别进行赋分，求几何平均值，得到综合指数排名，平均值越小即为排名越前，说明内参基因表达越稳定。

还提供了香葱内参基因在香葱基因表达分析中的应用。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

1.本发明的香葱内参基因，针对产业中香葱耐热品种开发和分子辅助育种需求，首次提出将AfActin基因作为内参基因用于香葱的基因表达，解决了香葱没有内参基因的现状。

2.本发明的香葱内参基因的筛选方法，对13个候选内参基因进行了Genorm、NormFinder和BestKeeper软件分析稳定性。对各软件中得到的稳定性排名分别进行赋分，求几何平均值，得到综合指数排名，综合分析各软件结果，成功筛选出适用的稳定内参基因。

3.本发明提出的检测引物对具有特异性，优化了PCR扩增程序，大大提高了检测效率、缩短了检测时间，提高了检测结果的可信度以及香葱基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性。

附图说明

图1为本发明实施例3中13个内参候选基因溶解曲线；

图2为本发明实施例3中13个内参候选基因Ct值分布箱型图；

图3为本发明实施例3中13个内参候选基因内参基因的平均表达稳定性M值图；

图4为本发明实施例3中最佳组合数的配对变异系数分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例与附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种香葱内参基因，所述内参基因为AfActin，所述内参基因AfActin的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2

一种内参基因AfActin的PCR扩增引物，所述PCR引物的核苷酸序列是：正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3。

实施例3

一种香葱内参基因的筛选方法，包括以下步骤：

一、材料与方法

1、试验材料

以耐热的“桂香葱1号”盆栽及不耐热的“AF35”盆栽为研究材料。

将香葱盆栽置于光照培养箱。对照组条件为：白天6:00-20：00：23℃，湿度70％，光照3.晚上20:00-次日6:00，20℃，湿度65％，光照0；高温胁迫处理组条件为：白天6:00-20：00：38℃，湿度70％，光照3.晚上20:00-次日6:00，35℃，湿度65％，光照0；分别于处理的0h、6h、12h、24h、48h、72h时收集香葱叶片，每处理10株，每个胁迫处理3次生物学重复。材料于液氮中速冻，–80℃保存备用。

2、试验方法

2.1RNA提取和cDNA合成

利用RNA提取试剂盒(康为世纪)提取各处理材料总RNA，用DNaseⅠ(NEB)进行去DNA处理，利用反转录试剂盒(Thermo)合成cDNA，–20℃保存。所有操作均按照试剂盒说明书进行。

2.2引物合成

根据转录组测序及文献分别获得的核酸序列，采用在线引物设计软件PrimerPremier3.0设计内参基因引物，引物长度为18～23bp，Tm值在57～62℃之间，产物大小在100～200bp之间，并在NCBI上对引物的特异性进行检测，详见表1。

表1.内参候选基因及其引物序列

2.3荧光定量

以香葱高温胁迫逆转录获得的cDNA为模板利用ABI 7500qPCR仪进行进行PCR。

反应体系(10μL)为1×Reaction mix2×SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN)5μL，1×QN ROX Reference Dye(Applied Biosystems instruments only)0.05μl，上游引物0.7μL，下游引物0.7μL，cDNA 1μL，ddH2O 2.55μL。

实时荧光定量PCR反应程序为：95℃变性5s；95℃延伸5s，60℃退火30s，40个循环；70～95℃熔解曲线：0.5℃5s，信号采集。

3、数据处理与内参基因稳定性评价

利用Microsoft Excel 2016处理基因的CT值，利用SPSS19.0软件进行Ct值箱型图制作，采用GeNorm和BestKeeper软件分别计算出不同处理下内参基因的表达稳定性(M值)、稳定值(SV值)和变异系数(CV)/标准偏差(SD)值，并根据M值、SV值和CV/SD值按从小到大对内参基因表达稳定性进行排序，值越小对应的内参基因越稳定。最后根据geNorm、BestKeeper软件的排序结果，计算出每个内参基因稳定性综合排序。

二、结果与分析

1、候选内参基因引物的选择

由于香葱已知的内参基因较少，因此在选择基因时，根据香葱转录组和表达谱数据，选择转录本数较高且在热胁迫处理的过程中表达稳定的基因作为候选内参基因，查询其序列进行引物合成，包括18s核糖体(18s)、28s核糖体(28s)、肌动蛋白(ACT)、β微管蛋白(TUB)、α微管蛋白(TUA)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、多聚泛素酶(UBQ)、转录延伸因子1-α(EF1α)、亲环蛋白(CYC)。同时，同时选择葱属其他作物如洋葱(Ac18S、AcActin)、大蒜的内参(AsSAND)同时进行比对。

表2.基因功能列表

2、候选内参基因引物的特异性分析

对不同热胁迫处理下香葱所有样本进行qRT-PCR得到的熔解曲线，见图1，除了Ac18S、AcActin两个洋葱内参外，其他均为单一熔解峰，验证了引物具有较强特异性。

qRT-PCR扩增效率E均在90％至100％之间，相关系数R2>0.99，结果符合qRT-PCR对引物的要求可进行下一步表达稳定性分析。

3、候选内参基因表达分析

Ct值是反映基因表达丰度的重要参数。对各处理13个候选内参基因的Ct值进行统计，见图2。13个候选内参基因的Ct值均在8.19-31.24之间，平均Ct值从高到低依次为：AfGAPDH＞Af18s＞AsSAND＞AfTUA＞Af28s＞AfMYH＞AfTUB＞AfActin＞AfEF1a＞AfCYC＞AfUBQ＞AcActin＞Ac18S，故AfGAPDH平均表达丰度最大、Ac18S平均表达丰度最小。在变化范围方面，Af18s的Ct值变化范围最小，Ac18s的Ct值变化范围最大。并且发现，从香葱转录组挑选出来的内参基因(Af系列)Ct值变化范围均小于其他同属作物的内参基因。不同内参基因在不同耐热处理的转录水平中存在较大差异，因此有必要根据不同处理进行内参筛选。

4、温度胁迫下候选内参基因的表达稳定性

4.1 geNorm软件分析

GeNorm软件用M值评估各表达稳定性，M值越小越稳定，M值越高稳定性越差。geNorm软件分析结果显示见图3，13个候选内参基因在香葱不同热胁迫处理中M值有所差异，最右边的AfEF1a、Af28s稳定性最好，而最左边的AcActin稳定性最差。根据表达稳定性高到低依次为：AfEF1a＝Af28s＜AfUBQ＜AfActin＜AfTUB＜AsSAND＜AfGAPDH＜AfMYH＜AfCYC＜AfTUA＜Af18s＜Ac18S＜AcActin。

此外，结合GeNorm软件生成内参基因的配对变异数(Vn/n+1)柱形图，选择最适合内参基因数目。选择阈值为0.15，当Vn/n+1＞0.15，表明最适合的内参基因个数是n+1个。GeNorm柱形图分析结果显示，当选择V3/4值(0.161)大于程序所推荐值0.15(图4)，最合适的内参组合基因数目是4个。所以，GeNorm软件分析结果显示香葱不同热胁迫条件下表达最稳定的基因组合是4个：AfEF1α、Af28s、AfUBQ和AfActin。

4.2 NormFinder分析

NormFinder是结合组内方差与组间方差计算候选内参基因的稳定值进行评价，其程序计算原理与geNorm相似，NormFinder结果显示SV(Stability value)值越小，内参基因表达越稳定，同时程序筛选出一个最适合的内参基因。NormFinder分析显示(表3)，在热胁迫过程中，最适合的内参基因为AfActin，表达最稳定(SV＝0.021)；AfTUA表达最不稳定(SV＝0.381)。

表3.NormFinder分析SV值

基因名称	SV值	标准误
			Ac18S	0.089	0.027
Af18s	0.354	0.084
			Af28s	0.049	0.023
AcActin	0.089	0.027
			AfActin	0.021	0.030
AfTUA	0.381	0.091
			AfTUB	0.073	0.025
AsSAND	0.130	0.035
			AfMYH	0.102	0.029
AfGAPDH	0.140	0.037
			AfUBQ	0.055	0.023
AfEF1a	0.045	0.023
			AfCYC	0.064	0.024

4.3 BestKeeper软件分析

BestKeeper主要通过比较基因CT值的标准偏差(SD)和变异系数(CV)来判断内参基因的稳定性。判定原则为相关系数(r)越大，标准偏差(SD)和变异系数(CV)越小，内参基因稳定性越好。SD值的默认阈值为1.0，低于该值即认为表达稳定；当SD＞1时，则该内参基因表达不稳定。由BestKeeper分析表可知，Af18s、AsSAND、AfMYH、AfGAPDH的SD值均小于1.0，且Af18s＜AfGAPDH＜AfMYH＜AsSAND，说明在香葱热胁迫处理下Af18s内参基因表达最稳定。

4.4综合分析

对Ge Norm和BestKeeper软件分析得到的稳定性排名求几何平均值，得到综合指数排名*(见表4)，指数越小，说明内参基因表达越稳定。

表4.综合分析

由表可见，经过综合排序13个候选内参基因在香葱热胁迫过程中中基因表达稳定性最高为AfActin，因此，选定AfActin为香葱的内参基因。

上述说明是针对本发明较佳可行试验例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 香葱内参基因及其筛选方法和应用

<141> 2020-11-17

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7411

<212> DNA

<213> AfActin

<400> 1

tcatttcgtt cctttttact cttgagaggg aaagccaata ataaacttat cagaaaacat 60

ccgacccaaa accctagttc taaaaccatc tgaatctcta tcgacatgtg gaacggcggt 120

gacccgtcat ccgctccgat agcgccccct ggaacgacgc ctcctccacc gattccgcct 180

ccaccatcgt acagtatccc ggcgtcggcc gaggaagtgg aggcgcagct ggtggagaag 240

gcgaggaagt gggaccagtt gaactccaag aggtatggcg ataagaggaa gtttgggttt 300

gttgagactc aaaaagaaga tatgccgcct gaacatgttc gcaaaatcat cagggatcat 360

ggtgacatgt catcaaagaa gtttcgtcat gacaaacgtg tataccttgg tgctttgaag 420

tttgtacctc atgcagttta taagctgctt gaaaacatgc caatgccatg ggagcaggtt 480

cgaaatgtga agatcctgta ccacataacc ggtgcaatca cttttgtgaa tgaaattcca 540

tgggttgttg aacccatata cttggctcag tggggtacaa tgtggataat gatgcgaaga 600

gaaaaaagag atagaaggca cttcaaacga atgcgttttc ctccttttga tgatgaggaa 660

cccccacttg attatgcgga caacttgtta gatgttgatc cattggaggc aatacagcta 720

gaactagacg aggaagaaga ttctgctgta tatcagtggt tttatgacca caagcctctt 780

gtaaaaacaa agcttattaa tggtcctagc tacaggaagt ggcatctttc acttcccata 840

atggcaactc ttcaccgtct agcaggacaa ttgctttctg atttgattga tcggaattac 900

ttctacctgt tcgatatgga gtcttttttc acagctaagg cattgaacat gtgtatacct 960

ggtggtccta agttcgagcc actttatcgt gatatggaga aaggggatga ggattggaat 1020

gaatttaatg acatcaataa actcattatt cgtcaaccac ttcgaacaga gtatcgaatt 1080

gcatttccac atttgtacaa caatcgacct aggaaggtaa aacttggaat ctaccacaca 1140

ccaatgatta tgtacattaa aaccgaggat cctgatttac ctgcatttta ctatgatcca 1200

ttgataaatc ctataacttc tgttaacaaa gttgatcggc gtgatagaaa aacgtttgac 1260

gaggatgatg aagatgattt tagtttacca gagggagtag aaccgctttt ggaaaataca 1320

cagctttaca ctgatactac agctgccggt atctcgttat tatttgctcc aagacctttt 1380

aatatgaggt ctggtcgtat gcgtcgagct gaagatatac ctcttgtatc agagtggttc 1440

aaggaacact gccctccttc atatccagtc aaagttcgcg tcagctacca aaaattgctg 1500

aagtgctttg tactaaatga gctacatcac agacctccaa aagcacagaa gaagaaacac 1560

ttgttcagat ctctccaagc aactaagttt ttccagacta cagaacttga ttgggcagaa 1620

gcgggtctac aagtttgtaa acagggatat aacatgctta atctcttgat tcatagaaag 1680

aatctcaact accttcacct tgactataat ttcaatctaa aaccagtaaa aacactcact 1740

acgaaagaac gtaaaaagtc tcggtttgga aatgctttcc atctctgccg tgaaattttg 1800

cgactgacaa agcttgtagt ggatgccaat atacagtttc gattgggtaa tgtggatgct 1860

tttcaattag ctgatggtct acagtataca ttttcacatg ttggtcagtt gactggaatg 1920

taccgttaca aatataggct tatgcgacaa attagaatgt gtaaagattt gaagcatcta 1980

atatactacc gattcaatac tggtccagtc ggtaaagggc caggttgtgg attttgggca 2040

cctatgtgga gagtttggtt gttcttttta cgtggtattg tgcctttgct tgaaagatgg 2100

cttggtaatt tgctggcaag gcaattcgaa ggtcgtcatt ccaaaggcgt tgctaaaact 2160

gttacaaagc aacgtgtaga aagtcatttt gacttggaac tccgagcagc tgttatgcat 2220

gatgttcttg atgcaatgcc agagggtatc aagcagaaca aagcaaggac aatcctgcag 2280

catcttagtg aagcatggcg atgttggaaa gcaaatatcc cttggaaggt tcctggatta 2340

ccagtcccta ttgagaacat gattcttaga tatgtgaagt caaaagcaga ttggtggact 2400

aatgttgcac attacaatcg tgagcgtatt agaagaggtg caacagttga taaaactgtt 2460

tgtcgaaaaa atctaggaag attgactcgg ttgtggttga aggctgagca ggaaagacaa 2520

cataactatc tcaaagatgg tccatatgtc actcctgaag aagcggtagc catctataca 2580

actactgtac attggttgga gtcaagaaaa ttctctccta ttcctttccc tcctctttca 2640

tacaagcatg acaccaaatt actcattctt gccttggaga gactaaaaga atcttacagt 2700

gttgcagtga gacttaacca gctacaaaga gaagaactag gtctgatcga gcaagcttac 2760

gacaacccac acgaagcctt atctagaata aaacgtcact tgctcacaca aagagctttc 2820

aaagaagttg gcattgagtt catggatttg tatagctatc tgattccagt atatgaaatt 2880

gagcctcttg agaaaatcac ggatgcatac cttgatcaat atctttggta tgaaggtgat 2940

aaacggcacc ttttcccgaa ttggattaaa ccagctgatt cagaaccacc gcctcttctt 3000

gtatataaat ggtgtcaagg tatcaacaat ttacaaggaa tatgggatac tggtgatggg 3060

cagtgtgttg ttatgcttca aacaaaattc gaaaaattct ttgagaagat agatttgaca 3120

atgttaaaca ggcttctccg tttggttctt gaccacaaca ttgctgacta tgtgactgct 3180

aagaacaatg tggtgttatc ttacaaggat atgagtcata caaactctta tggtctcatt 3240

agaggtctgc aatttgcttc atttgtggtt cagtactttg gccttgtgct tgatctctta 3300

cttcttgggt taactcgagc tagtgaaata gcggggccac ctcagatgcc aaatgagttc 3360

attacctatg ctgacaccaa agttgaaact aggcatccaa tcagattgta ttcacgatac 3420

attgatcgga tccatatact tttccgcttc actcatgatg aagcacgtga tctcattcag 3480

agatatctgt ctgaacatcc tgatccaaat aatgagaata tggttggtta taataacaaa 3540

aagtgttggc ctagggatgc tagaatgagg ctcatgaaac atgatgtcaa ccttggccga 3600

agtgttttct gggatatgaa gaaccgactg cctcgtagta tcaccacttt ggagtgggaa 3660

aacagcttcg tctctgttta cagcaaggat aaccctaact tgttatttag catgtgtggt 3720

ttcgaggttc gtattttacc aaagatacgg atgactcagg aagcatttag caacacaaaa 3780

gatggtgttt ggaatctgca gaacgaacag accaaagaac gaacagcaat cgctttctta 3840

cgtgttgatg atgagcacat gaaggtgttt gagaaccgtg tgaggcagat acttatgtca 3900

tcagggtcaa ctacattcac aaagattgtt aacaaatgga acactgctct cattggcctg 3960

atgacatatt ttcgtgaagc cactgtacat actcaagaat tgttagatct gttagttaaa 4020

tgtgaaaaca agattcaaac tcgtatcaag attggtttga attcaaaaat gcctagcagg 4080

tttcctcctg ttatatttta tacacccaag gaaattggag gtcttggtat gttatcgatg 4140

ggccacattt taattccaca aagcgacctt cgttacagtc agcagacaga tgttggtgta 4200

acacacttca gaagtggtat gagtcatgaa gaagatcaac ttattcctaa tttgtatcgg 4260

tacattcagc catgggagag tgaatttatc gactcgcagc gtgtgtgggc tgaatacgca 4320

ttgaagaggc aggaagctca gtcacaaaat aggcgcctga ctcttgagga tcttgaggat 4380

tcgtgggata gaggtatacc aagaatcaat actttgttcc agaaagaccg tcacacactt 4440

gcttatgaca aggggtggag agtacgtacg gatttcaagc agtaccaagt tctcaaacaa 4500

aatccatttt ggtggaccca ccagcgtcat gatggcaagt tgtggaattt gaacaactac 4560

cgtactgatg tcatccaagc attaggaggg gttgaaggga ttttagagca taccttattc 4620

aagggcacat attttccaac ttgggaaggt ctcttctggg agaaagcttc tggttttgag 4680

gagtcgatga agtataaaaa gttgaccaat gctcaaaggt ccgggttgaa tcaaatccct 4740

aatcgtcgat tcacgctatg gtggtcacct accattaatc gtgcaaatgt ttatgttgga 4800

tttcaagttc aactggatct cacgggaata tttatgcatg gaaagatccc taccctgaaa 4860

atttcattga ttcagatatt ccgtgctcat ctttggcaga aagtacatga gagtgttgtt 4920

atggatcttt gtcaagtgtt ggatcaagag ttagatgcac tggaaataga gacggtgcaa 4980

aaggagacaa ttcatccaag aaagagttac aagatgaaca gttcttgtgc tgatattctt 5040

ttatttgctt ctcatagatg gccaatgtct aaacctagcc tagttgccga gtcaaaagac 5100

gtttttgatc aaaaagctag taataaatat tggatagatg tgcaactcag gtggggagat 5160

tatgattccc atgacataga acgttacaca agggccaaat ttatggatta cacgactgac 5220

aatatgtcta tatatccatc tccaaccggt gtgatgattg gacttgatct cgcatataat 5280

ctgcactctg cttttggtaa ctggttccca gggtcaaaac ctttactggc ccaggcaatg 5340

aacaaaatta tgaagtcaaa tcctgcttta tatgttttgc gagagaggat aaggaaaggt 5400

ttgcagctgt attcatctga gcctacagaa ccatatttgt catctcaaaa ttatggagag 5460

atcttctcta atcaaatcat atggtttgtg gacgacacaa atgtgtatcg tgttactatt 5520

cacaaaacat tcgaaggaaa tctgactact aaaccaatca atggtgccat ctttatattc 5580

aatccaagaa caggacaact ttttctgaag gtcatccaca ctagtgtgtg ggcagggcaa 5640

aagcgtcttg gtcaacttgc gaagtggaaa acagcagaag aggtggctgc tctagttcgc 5700

tctcttcctc ctgaagaaca acccaagcaa attattgtaa cccgaaaggg tatgttggat 5760

ccattagagg tccatttact tgattttcca aacattgtaa tcaaaggtag tgagttgcaa 5820

cttccatttc aagcttgttt aaagatcgag aaatttggcg acttgatctt gaaggcaact 5880

gaaccacaga tggttctttt caatatctac gatgattggt tgaagagtat ctcatcgtat 5940

actgcattct ctcgtctcat tcttatacta cgtgcactgc atgtgaataa cgaaaaggct 6000

aagatgttat tgaagccaga taagacaatc gtcaccgagc cacatcatat atggccttct 6060

cttactgatg atcaatggat gaaagtggaa gttgctctta gagatcttat attatctgat 6120

tatgccaaaa agaacaatgt caatacatca gcattaacac agtctgagat tagagatatt 6180

atacttggtg ctgagataac tccgccctca caacagaggc aacaaattgc tgaaattgag 6240

aaacaggcca aagaagcaag ccagttaact gcagttacaa cgagaacaac caatgtacat 6300

ggcgatgaac tcattgtgac gacaacaagt ccatacgagc aagcatcaca caaaggaaag 6360

gctgattggc gtacaagggc tttctcagca gcaaatctgt atcttcgagt taaccacatt 6420

tatgtcaact cagatgatat caaggaaacc ggttatactt acatcatgcc caaaaacgta 6480

ttgaagaaat tcatatgcgt agcagatcta aaaactcaga tagcaggtta tttgtacggt 6540

ttaagcccac aagacaatcc tcaagtgaag gagattagat gtattgtaat ggtacctcaa 6600

tgggggactc agcaacaagt ccatcttcca tcggctcttc ctgagcatga ctttctaaat 6660

gacttggagc cattgggttg gatgcataca caacaaaatg aacttcctca gctatctcca 6720

caggacgtta caacccatgc tcgaattctc gaaaacaata agaattggga tggggagaaa 6780

tgcatcatct taacctgcag tttcactcca ggatcatgtt ctatgattgc gtataagctc 6840

acaccaaccg gttatgaatg gggtcgagcc aacaaagaca caggcagcaa tccacatggt 6900

taccttccaa ctcactatga gaaggttcaa atgctactaa gtgatcgctt cttaggcttc 6960

tacatggtac cggataatgg gccatggagc tacaatttta tgggagtgaa gcatacagtg 7020

agtatgagat atggtgtaaa gcttggaacc ccaaaagatt tctaccatga ggaacatagg 7080

ccaacacatt ttctagaatt cagcaatttg gaggaaggag ataatgcaga ggtcgatcgg 7140

gaagatacat tctcttagtt ttgtgagaag cgatgttgca tatgttttgc ttatatgtaa 7200

tgcttctgta tactgcaatg tacgagtaac tagattttgt acagaatatt tgttgcaacg 7260

tgtattcaga gttctcatgt attaatatgc gctctagatt gttggatgat gagaggtggt 7320

acaaccttgc taatgttctt tgtttctttt cactacttta ttaactactc tgttgagcaa 7380

caatattgta taagcagaaa tttagcgcgt a 7411

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Forward primer

<400> 2

cctccgaaat acgaaaaggc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Reverse primer

<400> 3

gtggtggcac ttcattacgg 20

Claims (3)

1.香葱内参基因，其特征在于，所述内参基因为AfActin，所述内参基因AfActin的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.用于扩增权利要求1所述内参基因的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物的核苷酸序列是：正向序列如SEQ ID NO.2所示；反向序列如SEQ ID NO.3。

3.权利要求1所述的香葱内参基因在香葱基因表达分析中的应用。

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