CN112457412A

CN112457412A - 一种人工电子传递***及其在促进p450酶羟基化反应中的应用

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Publication number: CN112457412A
Application number: CN202011345378.7A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 柯霞; 张博; 马斌祥; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN112457412B

Abstract

本发明公开了一种人工电子传递***及其在促进P450酶羟基化反应中的应用。所述人工电子传递***，包括不动杆菌(Acinetobacter sp.)的铁氧还蛋白还原酶FdR和铁氧还蛋白Fdx，且铁氧还蛋白还原酶FdR和铁氧还蛋白Fdx之间通过一段富含丙氨酸的多肽linkerⅠ连接制成FdR‑linkerⅠ‑Fdx形式的融合蛋白，本发明通过构建分子内部的递氢***，获得了较为高效的电子传递效率，部分解决了P450单加氧酶催化反应中电子传递效率较低导致的整体催化速率较低的问题，该电子传递***耦合CYP51、VDH等P450酶后，电子传递的耦合效率提升2‑10倍以上。

Description

一种人工电子传递***及其在促进P450酶羟基化反应中的应用

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种人工电子传递***及其在促进P450酶羟基化反应中的应用。

背景技术

甾体药物被广泛用于抗炎、抗癌、抗过敏以及避孕药等治疗，是未来全球药物市场上最具有影响力的药物种类之一。甾体母核的羟基化反应是赋予甾体特殊生理药理活性的重要方式之一，在甾体工业上常见的反应有C7α、C9α、C11α、C11β、C16α、C17α羟基化等反应。然而这些选择性羟基化反应的完成对于传统的化学合成工艺是巨大的挑战。多种微生物来源的酶(大多数为P540家族的单加氧酶)被鉴定并证实能够催化甾体母核上多个位点选择性生物转化，为甾体类药物高效合成提供了可靠的途径。负责催化C1-脱氢，C3-酮基化、C5α-羟化，C14α-去甲基、C5β-脱氢、C27-羟化等。

由细胞色素P450单加氧酶介导的微生物转化是甾体工业上生产药物中间体的最重要手段之一。利用微生物转化法合成甾体化合物，专一性强，立体选择性较高，并且副产物少，弥补了化学合成法的不足之处；同时，微生物转化条件温和，步骤简单，避免了大量有机溶剂和化工原料的使用，因此微生物转化过程是一个环境友好型绿色过程。但细胞色素P450单加氧酶催化过程需要特定的电子传递链组分进行协同递氢，从而实现氧化还原反应过程中有效的电子传递，最终将氧原子中的电子传递至P450单加氧酶的亚铁红素结构域中，实现底物氧化，但在该过程中，P450酶电子传递体系的低效性往往成为整个反应的限速步骤。已有研究证实，细菌来源的Class I家族还原酶，包括含有黄素腺嘌呤二核苷酸FAD及铁硫簇结构[Fe-S]的铁氧还蛋白还原酶，被鉴定为P450酶的有效电子传递链的递氢组分。电子开始于还原型辅酶NAD(P)H，经由FAD或者FMN传递给黄素氧还蛋白/铁氧还蛋白还原酶/细胞色素P450还原酶，再由铁硫簇中心传递给P450酶活性中心的亚铁血红素结构域，还原分子氧(O2)，将其中一个氧原子加入底物中，完成单加氧反应。

针对疏水性强，分子量相对较大的甾体化合物，如维生素D3或者羊毛甾醇等，其在细胞内外的跨膜转运往往受阻，无法依赖完整的全细胞催化体系实现底物转化，因此限制了该类甾体化合物的应用潜力。构建以体外多酶反应体系为依托的人工电子传递***实现P450单加氧酶对甾体化合物的选择性氧化能够打破以细胞为单位的催化反应限制。但是，P450酶催化过程由于电子传递效率低，需要不断提供还原型辅酶实现单加氧反应过程中的氢质子，低效的电子传递***往往成为限制P450酶催化反应的限制因素。例如，由CYP51催化的羊毛甾醇C14位去甲基反应，是P450酶级联氧化的另外一种典型反应。CYP51能够选择性对甾体母核C14位甲基进行连续的羟基化为代表的氧化脱氢过程，该级联氧化过程过程需要提供大量还原型辅酶NADPH提供氢质子，并需要高效的电子传递链协同递氢才能够实现，具体如图1所示。此外，在级联氧化过程中，，需要持续提供还原型辅酶如NAD(P)H，因此，辅酶再生***的构建是提高甾体羟基化过程的另外一个重要内容。通过搭建电子传递链及辅酶再生途径，为P450酶所催化的氧化过程提供充足的还原力及耦合的递氢***，并通过建立体外多酶***实现疏水性甾体化合物的选择性羟基化反应，对推动甾体化合物生物转化及高效合成应用具有重要应用价值。

发明内容

本发明提供了一种体外多酶耦合的人工电子传递***，包括递氢组分及辅酶循环***，其中递氢组分包括铁氧还蛋白还原酶(ferredoxin reductase，FdR)，铁氧还蛋白(ferredoxin，Fdx)，并进一步通过短链多肽融合方法构建了分子内电子传递***，提高了电子传递链的耦合效率。在此基础上，构建了包含递氢组分基辅酶循环***的基因工程菌以及人工电子传递***及相关基因工程菌在催化羊毛甾醇C14α去甲基反应及维生素D3的C25羟基化反应的应用。本发明不仅为细胞色素P450酶羟基化反应筛选了适配性的递氢***，并通过富含丙氨酸的短链构建P450酶与递氢组分的融合蛋白，建立分子内部的递氢协同***，显著提高了电子传递催化效率；此外在体外多酶***中，通过耦合葡萄糖脱氢酶，建立了辅酶循环***，推动了细胞色素P450酶催化输水性底物VD3、羊毛甾醇的选择性羟基化及去甲基化等级联氧化反应，突破了全细胞催化反应对底物自由运输的限制，在该体系下，产物得率显著提高。

具体技术方案如下：

一种人工电子传递***，包括不动杆菌(Acinetobacter sp.)的铁氧还蛋白还原酶FdR和铁氧还蛋白Fdx，且铁氧还蛋白还原酶FdR和铁氧还蛋白Fdx之间通过一段富含丙氨酸的多肽linkerⅠ连接制成FdR-linkerⅠ-Fdx形式的融合蛋白，

所述铁氧还蛋白还原酶FdR的氨基酸序列对应NCBI登录号为BAE78451.1，所述铁氧还蛋白Fdx的氨基酸序列对应NCBI登录号为BAE78453.1，富含丙氨酸的多肽linkerⅠ的氨基酸序列为以下一种：

(1)ATRAEAVGAGSAAAAGCPVAHGASEA；

(2)MRKRRRAKRRRKPWARFX；

(3)AAGTASTCQSAKKVRKKAHAVA；

(4)STEQSAKEAPAETLGAFR。

本发明提供了一种分子内耦合的人工电子传递***，本发明利用来源于不动杆菌(Acinetobacter sp.OC4)的铁氧还蛋白还原酶(ferredoxin reductase，FdR，NCBI登录号为BAE78451.1)，来源于不动杆菌(Acinetobacter sp.OC4)的铁氧还蛋白还原酶(ferredoxin，Fdx，NCBI登录号为BAE78453.1)，两者进一步通过一段富集丙氨酸的短链多肽连接，构建了适用于P450单加氧酶的分子内递氢组分，通过融合蛋白的构建，电子传递效率显著提高。

本发明又提供了所述人工电子传递***在促进P450酶催化甾体羟基化反应中的应用。

本发明还提供了一种P450酶催化甾体羟基化反应的方法，利用所述人工电子传递***进行催化反应。

优选的，催化反应体系中包括P450酶，P450酶通过多肽linkerⅡ与FdR-linkerⅠ-Fdx连接制成P450酶-linkerⅡ-FdR-linkerⅠ-Fdx形式的融合蛋白。

更优选的，linkerⅡ的氨基酸序列为以下一种：

(5)ATRAEAVGAGSAAAAGCPVAHGASEA；

(6)ARAAESGPACGGKRAAGVA；

(7)MSGAVATTAKGVVRAHGAAVS；

(8)AAVDAKASAGEAPAETLRGAFR。

优选的，催化反应体系中使用的P450酶为维生素D3羟化酶Vdh或羊毛甾醇C14去甲基酶CYP51。更优选的，维生素D3羟化酶Vdh的氨基酸序列对应NCBI登录号OSY34502.1；羊毛甾醇C14去甲基酶CYP51的氨基酸序列对应NCBI登录号WP_007536596。

催化反应体系中使用的P450酶为羊毛甾醇C14去甲基酶CYP51时，通过催化羊毛甾醇C-14位的选择性去甲基从而合成产物4，4-二甲基-胆甾-8，14，24三烯醇。

催化反应体系中使用的P450酶为维生素D3羟化酶Vdh时，通过催化维生素D3的C25选择性去甲基从而合成C25(OH)VD3。

优选的，催化反应体系中还包括葡萄糖脱氢酶GDH，氨基酸序列对应NCBI登录号为BAB96699.1。

本发明还提供了一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因融合表达P450酶-linkerⅡ-FdR-linkerⅠ-Fdx形式的融合蛋白，其中，

铁氧还蛋白还原酶FdR的氨基酸序列对应NCBI登录号为BAE78451.1，铁氧还蛋白Fdx的氨基酸序列对应NCBI登录号为BAE78453.1，linkerⅠ的氨基酸序列为以下一种：

(1)ATRAEAVGAGSAAAAGCPVAHGASEA；

(2)MRKRRRAKRRRKPWARFX；

(3)AAGTASTCQSAKKVRKKAHAVA；

(4)STEQSAKEAPAETLGAFR；

linkerⅡ的氨基酸序列为以下一种：

(5)ATRAEAVGAGSAAAAGCPVAHGASEA；

(6)ARAAESGPACGGKRAAGVA；

(7)MSGAVATTAKGVVRAHGAAVS；

(8)AAVDAKASAGEAPAETLRGAFR。

优选的，所述的基因工程菌中，P450酶为维生素D3羟化酶Vdh或羊毛甾醇C14去甲基酶CYP51，

维生素D3羟化酶Vdh的氨基酸序列对应NCBI登录号OSY34502.1；

羊毛甾醇C14去甲基酶CYP51的氨基酸序列对应NCBI登录号WP_007536596。

优选的，所述的基因工程菌，目的基因还包括用于表达葡萄糖脱氢酶GDH的基因，葡萄糖脱氢酶GDH的氨基酸序列对应NCBI登录号为BAB96699.1。

基因工程菌中各基因或多肽片段所对应的基因序列可以根据氨基酸序列针对特定宿主细胞进行密码子优化后获得。

本发明还提供了上述基因工程菌在催化甾体化合物羟基化反应中的应用，具体包括催化羊毛甾醇C14去甲基反应及维生素D3的C25羟基化反应。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过构建分子内部的递氢***，获得了较为高效的电子传递效率，部分解决了P450单加氧酶催化反应中电子传递效率较低导致的整体催化速率较低的问题，该电子传递***耦合CYP51、VDH等P450酶后，电子传递的耦合效率提升2-10倍以上。

(2)建立的体外多酶反应体系，解决了部分大分子量输水性甾体无法在细胞膜上转运的局限，克服了以细胞为单元的催化体系。此外，结合辅酶耦合***，P450单加氧反应中的还原力实现了高效循环，底物转换效率及产物得率获得了提升，反应24h后，100μmolVD3的转换率达到30％以上，100μmol羊毛甾醇转化率达到50％以上，较原有***有较大幅度提升。

附图说明

图1为RtCYP51催化羊毛甾醇C14去甲基的反应中级联氧化反应的过程示意图。

图2为实施例5中利用该套人工电子传递***耦合葡萄糖脱氢酶催化维生素D3的C25羟基化合成活性25(OH)VD3的反应示意图。

具体实施方式

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

上游基因工程操作所用试剂：本发明实施例中使用的一步克隆试剂盒均购自Vazyme，南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli BL21(DE3)、质粒pET28b，pETDuet等购自上海生工；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂、引物合成与基因测序工作由杭州擎科生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

下述实施例中，电子传递链的镍柱亲和纯化过程如下：

将重组菌株于LB培养基中诱导培养20h后，离心收集菌体，超声破碎获得上清液，随后将粗酶液通过镍柱进行纯化。首先对镍柱进行再生处理，重新挂上镍离子后，用PBS平衡镍柱，上样50-100mL粗酶液，用PBS洗去毫无结合能力的杂蛋白，接着再用低浓度缓冲液去除结合能力较弱的杂蛋白；加入高浓度咪唑的磷酸盐缓冲液后，高浓度咪唑代替蛋白中的His标签结合到镍柱上，洗脱下来的溶液即为纯酶液。

实施例1：表达载体和工程菌的构建

(1)递氢组分的重组表达***的构建

从NCBI获得对应的氨基酸序列，针对大肠杆菌的密码子偏好优化，合成碱基序列，分别如下：来源于不动杆菌(Acinetobacter sp.OC4)的铁氧还蛋白还原酶(ferredoxinreductase，FdR，氨基酸序列NCBI登录号为BAE78451.1)，来源于不动杆菌(Acinetobactersp.OC4)的铁氧还蛋白还原酶(ferredoxin，Fdx，氨基酸序列NCBI登录号为BAE78453.1)大肠杆菌属(Escherichia coli)K-12substr.MG1655的铁氧还蛋白酶FdR2(氨基酸序列NCBI登录号为NP_418359.1)，黄素氧还蛋白Fld(氨基酸序列NCBI登录号为WP_000807750.1)的氨基酸序列。

表1 递氢组分蛋白的引物设计

引物	序列(5’-3’)
		引物1：FdR	GGAGATATACCATGGGCCAAACCATTG
引物2：FdR	CAATGGTTTGGCCCATGGTATATCTCC
		引物3：FdR2	GGAGATATACCATGGGCGCTGACTGGGTTAC
引物4：FdR2	GTAACCCAGTCAGCGCCCATGGTATATCTCC
		引物5：Fdx	CATGCCATGGGTCAGATTACTTTCATTGCAC
引物6：Fdx	CCGCTCGAGATGGTGCATCTGGAATTCCGGCAGGTG
		引物7：Fld	CATGCCATGGGCGCTGAAATCGGTATCTTCGTTGG
引物8：Fld	CCGCTCGAGAGACAGCAGGGTACCCCACTGTTC

以pET28b质粒为表达载体，构建重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-FdR：利用表1中引物1，2，以目的基因核酸序列为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得铁氧还蛋白还原酶FdR的基因序列，测序后利用NcoI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET28b进行连接，构建表达载体/pET28b-FdR。以此为参照，分别构建表达载体/pET28b-FdR2，pET28b-Fdx，pET28b-Fld。

重组大肠杆菌的获得：首先将储藏于-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞在0℃冰浴10min，然后在超净台内加入5μL的质粒pET28b-FdR、pET28b-Fdx。0℃冰浴30min，42℃水浴中热击90s，0℃冰浴2min，加入600μL的LB培养基，在37℃、200rpm摇床培养1h；涂布于含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-FdR，BL21(DE3)/pET28b-Fdx。利用相同的方法，获得其他递氢组分的BL21(DE3)/pET28b-FdR2，BL21(DE3)/pET28b-Fld。

(2)重组大肠杆菌P450酶递氢组分的诱导表达

含P450酶电子递氢组分蛋白的湿菌体：分别获得的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-FdR，BL21(DE3)/pET28b-Fdx接种至含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，22℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH7.2、20mM磷酸盐缓冲液(PB)洗涤两次，即获得含P450酶递氢组分蛋白的重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-FdR，E.coli BL21(DE3)/pET28b-Fdx的湿菌体；将湿菌体加入pH 7.2、100mM的PBS中重悬，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液。

实施例2：多酶融合的人工电子传递链的构建与筛选

(1)电子传递链中递氢组分活力评价

使用细胞色素C为电子受体评价偶联活力，具体操作方法如下：

称取44.2mg的细胞色素C(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS：9007-43-6)溶于1mL PBS溶液中，配备成50mM的细胞色素C溶液，-20℃保存。按照表2的比例，添加P450酶的不同递氢组分，记录样品在550nm处3min内吸光值的变化。结果如表2所示：

表2 不同电子传递组分的偶联活力比较：

表2结果显示，在1∶1(V∶V)的添加比例下，两种组分的偶联活力都达到最高值。因此可以考虑设计短肽linker片段实现两个递氢组分的融合表达。此外，FdR-Fdx的活力较高，因此后续研究选择FdR-Fdx组分作为研究对象。

(2)递氢组分融合短肽片段linker的筛选及双酶融合的人工电子传递链构建

为提高P450酶的电子传递效率，构建分子内协同递氢过程，尝试利用短链linkerⅠ融合的方法构建人工电子传递***，具体操作方法如下：选择了不同的linkerⅠ序列(不同长度及氨基酸排序)，利用引物1、引物2克隆E.coli BL21(DE3)/pET28b-FdR，利用引物5、引物6克隆E.coli BL21(DE3)/pET28b-Fdx中Fdx序列，并将同源臂分别添加到基因特异性正/反向扩增引物序列的5’端，以此对带有同源臂的linkerⅠ利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，将消化模板后的PCR产物用DNA回收纯化试剂盒进行纯化回收，并分别测出核酸浓度，得到带有Fdx-linkerⅠ-FdR的融合序列，并进一步通过一步克隆法将串联序列***至质粒pETDuet-1上。按照实施例2步骤(1)的方法评价融合不同linkerⅠ电子传递***的耦合效率，其中，以下序列的***提高了电子组分的偶联活力。如表3列出了部分电子偶联活力较高的融合序列所示：

表3 不同电子传递组分的偶联活力比较：

结果如表3所示，利用linker1对Fdx-FdR进行融合表达，在相同的反应体系下，电子传递的偶联活力提高了50％以上。

(3)P450酶分子内电子传递***的构建

基于以上结果，选择Fdx-linker1-FdR为较为高效的P450酶递氢组分，作为后续构建的基础。为进一步提高电子传递效率，尝试进一步利用短链融合的策略，构建P450酶分子内递氢***。作为优选，选取红球菌属(Rhodococcus triatomae sp.)来源的CYP51(氨基酸序列NCBI登录号为WP_007536596)，或来源于自养无枝酸菌(Pseudonocardiaautotrophica)维生素D3羟化酶Vdh(氨基酸序列NCBI登录号为OSY34502.1)为融合表达的P450酶，构建多酶融合的分子内递氢***。

以pET28b质粒为表达载体，构建重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-CYP51及E.coli BL21(DE3)/pET28b-Vdh。以目的基因核酸序列为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，利用引物9、10克隆CYP51，测序后利用一步法构建表达载体/pET28b-CYP51。以此为参照，分别构建表达载体/pET28b-Vdh(利用引物11、12)。

引物9：5’-ATGGGTCCGATGGCTCTG-3’；

引物10：5’-AGCGCTACGAGGGCC-3’；

引物11：5’-ATGGGTCCTATGGCTCTGAC-3’；

引物12：5’-AGCGCTACGCGGGCCCATAG-3’。

设计融合短肽序列，具体如linker 5-8所示，由上海生工合成，带有linkerⅡ序列的同源臂分别添加到P450酶及融合的递氢蛋白组分Fdx-FdR正/反向扩增引物序列的5’端，以此对带有同源臂的linkerⅡ利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，将消化模板后的PCR产物用DNA回收纯化试剂盒进行纯化回收，并分别测出核酸浓度，得到带有CYP51-linkerⅡ-Fdx-linker1-FdR和Vhd-linkerⅡ-Fdx-linker1-FdR融合序列，进一步利用一步法克隆将融合片段***至pETDuet-1质粒上，分别获得pETDuet-1-CYP51-linkerⅡ-Fdx-linker1-FdR和pETDuet-1-Vdh-linkerⅡ-Fdx-linker1-FdR质粒。

(4)不同电子传递***与P450酶耦合效率的评价

加入辅酶NAD(P)H后，通过比较添加P450酶对辅酶NADPH在340nm吸光值的变化速率判断该多酶体系中电子传递链与P450酶的耦合效率。反应体系如表4、表5所示。

表4 CYP51电子传递体系

电子传递***(180μl)	PBS/羊毛甾醇	NAD(P)H	总体积
				CYP51-linkerⅡ-Fdx-linker1-FdR	10μl(200μM)	10μl(100μM)	200μl

注：粗酶液进行10倍稀释，配置4mM羊毛甾醇，并添加2mg/mL的DLPC(二月桂酰基卵磷脂)作为助溶剂；配置辅酶母液的浓度为2mM；PBS浓度为100mM，pH＝7.2。

表5 Vdh电子传递体系

电子传递***(180μl)	PBS/维生素D3	NAD(P)H	总体积
				Vdh-linkerⅡ-Fdx-linker1-FdR	10μl(200μM)	10μl(100μM)	200μl

注：粗酶液进行10倍稀释，配置4mM羊毛甾醇，并添加2mg/mL的DLPC作为助溶剂；配置辅酶母液的浓度为2mM；PBS浓度为100mM，pH＝7.2。

表6 不同电子传递组分的偶联活力比较：

实验结果如表6所示，在外源添加底物羊毛甾醇后，辅酶NADPH在340nm的吸光值显著降低，反应初始(60s)，OD₃₄₀的降低速率在不同的电子传递***中差别较大，其中CYP51-linker8-FdR-linker1-Fdx的下降速率最大，为0.40min^-1，提示该分子内部的电子耦合效率最高。利用同样的方法，检测了Vdh酶的协同递氢组分与其耦合效果，在含有Vdh-linker8-FdR-linker1-Fdx的反应体系中，加入底物维生素D3后，反应初始(20s内)，NADPH在340nm的吸光值显著降低，OD₃₄₀下降速率为0.94min^-1。结果提示，融合短肽中linker8的效果最佳。因此，选择linker 8短肽融合的P450酶电子传递组分作为后续的研究。融合蛋白CYP51-linker8-Fdx-linker1-FdR简写为CYP51-Fdx-FdR；融合蛋白Vdh-linker8-Fdx-linker1-FdR简写为Vdh-Fdx-FdR。

实施例3：具有葡萄糖脱氢酶辅酶再生***的人工电子传递***的构建

(1)E.coli BL21(DE3)/pET28b-GDH重组质粒的构建。

作为疏水性甾体化合物，其分子量大无法进行细胞质膜运输，但常规的辅酶循环***依赖全细胞辅酶循环进行。为了进一步降低工业化生产成本，克服甾体化合物细胞质膜转运的障碍，进一步尝试利用葡萄糖-葡萄糖脱氢酶构建体外辅酶NAD(P)H循环***。采用一步克隆法将克隆葡萄糖脱氢酶GDH(氨基酸序列NCBI登录号为BAB96699.1，基因序列的NCBI登录号：KM817194.1)，利用引物13，引物14克隆葡萄糖脱氢酶，利用限制性内切酶NcoI及HindIII连接到表达载体pET28b的多克隆位点上，且该葡萄糖脱氢酶为NADPH/NADH双辅酶特异性的脱氢酶，以便适用于不同辅酶依赖的电子传递***的需求。

引物13：5’-ATGGCTATTA ACAAC-3’；

引物14：5’-TTAACGTCATCCGGCAG-3’；

(2)重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pETDuet-1-CYP51-Fdx-FdR/pET28b-GDH双质粒***的构建。

将质粒pET28b-GDH导入重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDue1-CYP51-Fdx--FdR细胞中，利用kan(100μg/mL)筛选压力筛选阳性克隆子，具体操作过程请参照实施例1步骤(1)，获得双质粒表达的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pETDuet-1-CYP51-Fdx-FdR/pET28b-GDH。

(3)重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pETDuet-1-Vdh-Fdx-FdR/pET28b-GDH双质粒***的构建。

将质粒pET28b-GDH导入重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDue1-Vdh-Fdx-FdR细胞中，利用kan(100μg/mL)筛选压力筛选阳性克隆子，具体操作过程请参照实施例1步骤(1)，获得双质粒表达的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pETDuet-1-Vdh-Fdx-FdR/pET28b-GDH。

(4)重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet1-P450-FdR-Fdx/pET28b-GDH的诱导表达及粗酶液制备。

含P450酶-电子传递链及葡萄糖脱氢酶的重组细胞及其粗酶液的获得：分别将实施例2获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet1-CYP51-Fdx-FdR/pET28b-GDH及E.coli BL21(DE3)/pETDuet1-Vdh-Fdx-FdR/GDH接种至含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，22℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PB)洗涤两次，即获得含P450酶-电子传递链及葡萄糖脱氢酶的重组菌株湿菌体；将湿菌体加入pH 7.2、100mM的PBS中重悬，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液。

实施例4：人工电子传递***在羊毛甾醇C14去甲基催化反应中的应用

羊毛甾醇属于脂溶性大分子，难溶于水，异源表达的菌种难以进行体外转化。构建pETDuet-CYP51-Fdx-FdR及GDH的体外多酶级联氧化体系，能够实现羊毛甾醇C-14位的选择性去甲基，合成产物4，4-二甲基-胆甾-8，14，24三烯醇，具体反应步骤如图1所示。具体操作步骤如下：

(1)重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet1-CYP51-Fdx-FdR/GDH的诱导表达重组菌诱导表达方法见实施例3步骤(3)。

(2)体外转化反应体系的建立：重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet1-CYP51-Fdx-FdR/GDH的重组细胞收集后，将湿菌体加入pH 7.2、100mM的PBS中重悬，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液。

以分子内CYP51-Fdx-FdR及辅酶循环的GDH为基础，建立体外多酶去甲基化的反应体系，具体包括：羊毛甾醇母液浓度为4mM(1.707mg/mL)，加入2mg/mL DLPC作为助溶剂，反应终浓度为200μM。NADPH母液浓度为50mM，终浓度为2mM，辅助底物葡萄糖终浓度为1M。以上溶剂均由PBS(100mM，pH＝7.2)配制。反应时先添加酶液，CYP51-Fdx-FdR的添加酶浓度为10μM，在30℃摇床预热5min，最后加入50mM辅酶NADPH启动反应，用纱布封口(反应需要氧气)，振荡转速180rpm。反应12h后，加入10mL乙酸乙酯终止反应，振荡混匀，静置，用分液漏斗分离，再在反应液中添加10mL乙酸乙酯重复上述步骤萃取底物与产物。将萃取液置于通风厨内，用电吹风机吹风以挥发干。

(3)反应产物检测及转化效率分析

使用HP-5MS柱进行气质色谱仪进行检测，具体参数如下：

(a)195℃保持1min，10℃/min升至300℃，保持10min，总运行时间21.5min。加热器300℃，H2流量40mL/min，空气流量450mL/min，尾气流量(N2)：250mL/min，溶剂延迟6min；

(b)衍生化过程：在挥干的底物和产物中加入500μL的三氟乙酰胺(购自sigma公司，货号144657MSDS)，5μL三甲基氯硅烷(购自sigma公司，385529MSDAS)，于60℃烘箱衍生化30min(密封，防止衍生化试剂与水接触)，衍生化结束可直接用于气质色谱仪进行检测。

(c)定量方法：定量方法：使用相同的色谱条件测定羊毛甾醇标准品的标准溶液，绘制浓度-峰面积标准曲线，对萃取液中的产物进行定量。对于羊毛甾醇C14去甲基反应，通过气质分析所得的碎片峰比对，获得产物峰，计算产物得率，具体结果如表7所示：

表7 不同电子传递***产物得率比较

不同电子传递链组分	产物得率(％)
		CYP51、FdR、Fdx单组分<sup>a</sup>	12.1
CYP51-Fdx-FdR	34.2
		CYP51-Fdx-FdR/GDH	52.6

注：^aCYP51、FdR、Fdx单组分体系中，CYP51、FdR、Fdx蛋白组分的摩尔比例为1∶1∶1，摩尔浓度为10μM。

实施例5：人工电子传递***在维生素D3选择性羟化合成25(OH)VD3催化反应中的应用

图2为利用本实施例中人工电子传递***耦合葡萄糖脱氢酶催化维生素D3的C25羟基化合成活性25(OH)VD3的反应示意图。

构建pETDuet1-Vdh-Fdx-FdR及GDH的体外多酶级联氧化体系，能够实现维生素D3的C25选择性去甲基，合成C25(OH)VD3。具体操作步骤如下：

(1)重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet1-Vdh-Fdx-FdR/GDH的诱导表达

重组菌诱导表达方法见实施例3步骤(3)。

(2)体外转化反应体系的建立：重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet1-Vdh-Fdx-FdR/GDH的重组细胞收集后，将湿菌体加入pH 7.2、100mM的PBS中重悬，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液。

(3)以分子内Vdh-Fdx-FdR及葡萄糖脱氢酶(GDH)为基础，建立体外多酶VD3羟化的反应体系，具体包括：维生素D3母液浓度为2mM，加入2mg/mL DLPC作为助溶剂，反应终浓度为100μM。NADH母液浓度为50mM，终浓度为2mM，辅助底物葡萄糖终浓度为1M。以上溶剂均由PBS(100mM，pH＝7.2)配制。反应时先添加酶液与底物，Vdh51-Fdx-FdR的终浓度为10μM，在30℃摇床预热5min，最后加入辅酶NADH启动反应，用纱布封口(反应需要氧气)，振荡转速180rpm。反应12h后，加入10mL乙酸乙酯终止反应，振荡混匀，静置，用分液漏斗分离，再在反应液中添加10mL乙酸乙酯重复上述步骤萃取底物与产物。将萃取液置于通风厨内，用电吹风机挥发干。

(4)产物得率分析

本实验采用日本ODS-H80反相色谱硅胶柱，紫外检测波长为265nm，柱温为40℃，流速为1ml/min。流动相甲醇：水＝9∶1。定量方法：使用相同的色谱条件测定活性维生素25(OH)D3标准品的溶液，绘制浓度-峰面积标，对萃取液中的产物进行定量，结果如表8所示。

表8 不同电子传递***产物得率比较

不同电子传递链组分	产物得率(％)
		Vdh、FdR、Fdx单组分<sup>a</sup>	5.2
Vdh-Fdx-FdR	17.6
		Vdh-Fdx-FdR/GDH	32.7

注：^aVdh、FdR、Fdx单组分体系中，Vdh、FdR、Fdx蛋白组分的摩尔比例为1∶1∶1，摩尔浓度为10μM。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种人工电子传递***及其在促进P450酶羟基化反应中的应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggagatatac catgggccaa accattg 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caatggtttg gcccatggta tatctcc 27

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggagatatac catgggcgct gactgggtta c 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtaacccagt cagcgcccat ggtatatctc c 31

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catgccatgg gtcagattac tttcattgca c 31

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgctcgaga tggtgcatct ggaattccgg caggtg 36

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

catgccatgg gcgctgaaat cggtatcttc gttgg 35

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgctcgaga gacagcaggg taccccactg ttc 33

<210> 9

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Thr Arg Ala Glu Ala Val Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly

1 5 10 15

Cys Pro Val Ala His Gly Ala Ser Glu Ala

20 25

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Arg Lys Arg Arg Arg Ala Lys Arg Arg Arg Lys Pro Trp Ala Arg

1 5 10 15

Phe Xaa

<210> 11

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ala Ala Gly Thr Ala Ser Thr Cys Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys

1 5 10 15

Lys Ala His Ala Val Ala

20

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ser Thr Glu Gln Ser Ala Lys Glu Ala Pro Ala Glu Thr Leu Gly Ala

1 5 10 15

Phe Arg

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgggtccga tggctctg 18

<210> 14

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agcgctacga gggcc 15

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgggtccta tggctctgac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agcgctacgc gggcccatag 20

<210> 17

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Ala Thr Arg Ala Glu Ala Val Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly

1 5 10 15

Cys Pro Val Ala His Gly Ala Ser Glu Ala

20 25

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Ala Arg Ala Ala Glu Ser Gly Pro Ala Cys Gly Gly Lys Arg Ala Ala

1 5 10 15

Gly Val Ala

<210> 19

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Met Ser Gly Ala Val Ala Thr Thr Ala Lys Gly Val Val Arg Ala His

1 5 10 15

Gly Ala Ala Val Ser

20

<210> 20

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Ala Ala Val Asp Ala Lys Ala Ser Ala Gly Glu Ala Pro Ala Glu Thr

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Phe Arg

20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggccatggat gggttataat tc 22

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggaagctttc aaccacggcc 20

Claims

1.一种人工电子传递***，其特征在于，包括不动杆菌(Acinetobacter sp.)的铁氧还蛋白还原酶FdR和铁氧还蛋白Fdx，且铁氧还蛋白还原酶FdR和铁氧还蛋白Fdx之间通过一段富含丙氨酸的多肽linkerⅠ连接制成FdR-linkerⅠ-Fdx形式的融合蛋白，

所述铁氧还蛋白还原酶FdR的氨基酸序列对应NCBI登录号为BAE78451.1，所述铁氧还蛋白Fdx的氨基酸序列对应NCBI登录号为BAE78453.1，多肽linkerⅠ的氨基酸序列为以下一种：

(1)ATRAEAVGAGSAAAAGCPVAHGASEA；

(2)MRKRRRAKRRRKPWARFX；

(3)AAGTASTCQSAKKVRKKAHAVA；

(4)STEQSAKEAPAETLGAFR。

2.如权利要求1所述人工电子传递***在促进P450酶羟基化反应中的应用。

3.一种P450酶羟基化反应的方法，其特征在于，利用如权利要求1所述人工电子传递***进行催化反应。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，催化反应体系中包括P450酶，P450酶通过多肽linkerⅡ与FdR-linkerⅠ-Fdx连接制成P450酶-linkerⅡ-FdR-linkerⅠ-Fdx形式的融合蛋白。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，linkerⅡ的氨基酸序列为以下一种：

(5)ATRAEAVGAGSAAAAGCPVAHGASEA；

(6)ARAAESGPACGGKRAAGVA；

(7)MSGAVATTAKGVVRAHGAAVS；

(8)AAVDAKASAGEAPAETLRGAFR。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，催化反应体系中使用的P450酶为维生素D3羟化酶Vdh或羊毛甾醇C14去甲基酶CYP51，

催化反应体系中使用的P450酶为羊毛甾醇C14去甲基酶CYP51时，通过催化羊毛甾醇C-14位的选择性去甲基从而合成产物4，4-二甲基-胆甾-8，14，24三烯醇；

催化反应体系中使用的P450酶为维生素D3羟化酶Vdh时，通过催化维生素D3的C25选择性去甲基从而合成C25(OH)VD3；

维生素D3羟化酶Vdh的氨基酸序列对应NCBI登录号OSY34502.1；

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，催化反应体系中还包括葡萄糖脱氢酶GDH，氨基酸序列对应NCBI登录号为BAB96699.1。

8.一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因融合表达P450酶-linkerⅡ-FdR-linkerⅠ-Fdx形式的融合蛋白，其中，

(1)ATRAEAVGAGSAAAAGCPVAHGASEA；

(2)MRKRRRAKRRRKPWARFX；

(3)AAGTASTCQSAKKVRKKAHAVA；

(4)STEQSAKEAPAETLGAFR；

linkerⅡ的氨基酸序列为以下一种：

(5)ATRAEAVGAGSAAAAGCPVAHGASEA；

(6)ARAAESGPACGGKRAAGVA；

(7)MSGAVATTAKGVVRAHGAAVS；

(8)AAVDAKASAGEAPAETLRGAFR。

9.如权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，P450酶为维生素D3羟化酶Vdh或羊毛甾醇C14去甲基酶CYP51，

维生素D3羟化酶Vdh的氨基酸序列对应NCBI登录号OSY34502.1；

10.如权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，目的基因还包括用于表达葡萄糖脱氢酶GDH的基因，葡萄糖脱氢酶GDH的氨基酸序列对应NCBI登录号为BAB96699.1。