CN112451487B

CN112451487B - 一种姜黄素主动载药脂质体及其制备方法

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Publication number: CN112451487B
Application number: CN202011435749.0A
Authority: CN
Inventors: 刘洪卓; 周双; 何仲贵; 王永军
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2020-12-07
Filing date: 2020-12-07
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2040-12-07
Also published as: CN112451487A

Abstract

本发明涉及脂质体药物递送领域，具体涉及一种姜黄素主动载药脂质体及其制备方法。本发明所述的姜黄素主动载药脂质体，由如下成分制备得到：姜黄素、磷脂、胆固醇(Cholesterol，Chol)、金属离子盐溶液、外水相缓冲液。姜黄素与总磷脂(磷脂和胆固醇总和)的重量比是0.5‑1:10。所述的金属离子盐溶液可以铜离子或锌离子的硫酸盐、葡萄糖酸盐、或醋酸盐溶液；金属离子盐溶液中铜离子或锌离子的浓度为50‑300mM。本发明的特点是首次成功制备具有花瓣样构象的姜黄素主动载药脂质体制剂，细胞实验表明其具有更强的活性氧产生能力，更强的肿瘤细胞抑制活性；荷瘤小鼠实验表明该制剂具有显著的皮下肿瘤生长抑制以及缓解转移瘤进程的效果。

Description

一种姜黄素主动载药脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及脂质体药物递送领域，具体涉及一种姜黄素主动载药脂质体及其制备方法。

背景技术

姜黄素(Curcumin，Cur)，是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，为二酮类化合物，为橙黄色结晶粉末，味稍苦，不溶于水，在乙醇中溶解，可溶于DMSO、DMF、PEG400等溶剂。大量研究证明姜黄素有许多重要的生物学作用包括抗炎、抗凝血、抗氧化、抗血管生成和抗肿瘤活性、促进伤口愈合、降血脂防治心血管疾病和神经***退变性疾病等作用，被用于治疗肝病、消化***，感染，类风湿性关节炎等。研究表明，可以预防化学性和放射性诱导的大鼠皮肤癌、肝癌、胃癌、***癌、结肠癌及乳腺癌等的发生，同时可以抑制肿瘤的生长、侵袭和转移，具有增强放疗和化疗治疗效果。但是，因姜黄素结构不稳定、水溶性差，不能够静脉注射给药，口服给药时，因体内代谢快，半衰期极短，导致生物利用度极差。因此，需要开发姜黄素制剂及适宜的药物递送***以改善当前困境。

脂质体(liposome)是一种具有磷脂双分子层结构的药物载体，因其既能包载疏水性药物，又能装载水溶性药物而被广泛研究和应用。通常来说，难溶性药物通过被动载药的方式载在脂质体磷脂双分子层中，从而提高药物溶解度和生物利用度。姜黄素因其极低的水溶性而难以实现主动载药，现有的研究中姜黄素通常以被动载药的方式制成脂质体制剂。被动载药脂质体存在包封率载药量低、稳定性差等缺点；且通常以纳米载体装载姜黄素后，载药制剂的细胞活性会下降，从而导致动物体内药效效果一般。

发明内容

针对前述背景技术，本发明旨在提供一种姜黄素主动载药脂质体及其制备方法，以实现有效的药物递送，用于癌症及转移癌症治疗。由于姜黄素的结构中存在二酮结构，该结构可以与金属离子络合形成一种稳定的难溶性配合物。因此，本发明以金属离子为内水相，制备具有跨膜金属离子梯度的脂质体以主动装载姜黄素。研究意外发现，所制备的姜黄素脂质体相比于姜黄素在肿瘤细胞中具有更强的诱导活性氧ROS产生的能力，从而产生更强的细胞活性；且脂质载体作为结构稳定的微反应器，实现了姜黄素-金属离子复合物的有效递送，提高了药物的肿瘤蓄积，产生了更好的肿瘤抑制效果。

本发明的技术方案如下：

一种姜黄素主动载药脂质体，由如下成分制备得到：姜黄素、磷脂、胆固醇(Cholesterol，Chol)、金属离子盐溶液、外水相缓冲液。

其中，姜黄素与总磷脂(磷脂和胆固醇总和)的重量比是0.5-1:10。

上述磷脂可选用天然磷脂蛋黄卵磷脂(egg yolk lecithin，EPC)、氢化大豆卵磷脂(1-palmitoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine，HSPC)；也可选用常用合成磷脂如：二硬脂酰基磷脂酰胆碱(Distearoyl Phosphatidylcholine，DSPC)、二油酰基卵磷脂(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC)、二肉豆蔻酰基卵磷脂(Dimyristoyl Phosphatidylcholine，DMPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，POPC)、二棕榈酰基卵磷脂(DipalmitoylPhosphatidylcholine，DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DistearoylPhosphoethanolamine，DSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(Dioleoyl Phosphoethanolamine，DOPE)、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)，DPPG)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]，DSPE-PEG2000)中的一种或几种。

进一步优选的磷脂，包括氢化大豆卵磷脂(HSPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)中的一种或几种；

进一步的讲，脂质体中所包含胆固醇含量摩尔百分比为10％到45％；

进一步的讲，胆固醇的最优含量摩尔百分比为30-45％；

进一步的讲所选用的金属离子可以是铜离子或锌离子；

进一步的讲，其中可选用的金属离子盐溶液可以铜离子或锌离子的硫酸盐、葡萄糖酸盐、或醋酸盐溶液；

更进一步的讲，优选为铜离子或锌离子的醋酸盐溶液；

进一步的讲，所述的金属离子盐溶液中铜离子或锌离子的浓度为50-300mM；

更进一步的讲，所述的金属离子盐溶液中铜离子或锌离子的浓度为150-200mM。

进一步的讲，外水相缓冲液可以是含有氯化钠或者蔗糖的磷酸盐缓冲液(PBS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液；

更进一步的讲，外水相优选为含有等渗浓度的氯化钠或蔗糖的HEPES缓冲液；

更进一步的讲，外水相缓冲液的pH为5-8；

更进一步的讲，当内水相为铜离子的醋酸盐溶液时，外水相pH为5-6。

更进一步的讲，当内水相为锌离子的醋酸盐溶液时，外水相pH为6-7。

本发明所述的主动载药脂质体包括以下步骤：

(1)大单室脂质体的制备

称取处方量的磷脂、胆固醇，有机溶剂溶解，充分除去有机溶剂形成磷脂膜，加内水相金属离子盐溶液水化至磷脂膜完全脱落，通过挤出或者探头超声等方式降低脂质体粒径，使其变成粒径均一的大单室脂质体。

(2)金属离子跨膜梯度的建立

步骤(1)所得脂质体通过与含有乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)的外水相缓冲溶液进行充分交换，充分除去脂质体外部金属离子，再用含有氯化钠或者蔗糖和HEPES溶液进行充分交换，得空白脂质体。

(3)载药

将姜黄素的浓溶液加入到步骤(2)的脂质体溶液中进行孵育，一定时间后终止载药过程，并保存。

所述步骤(1)中，所述的有机溶液为：无水乙醇、氯仿、二氯甲烷中的一种或几种；

所述金属离子盐溶液可以铜离子或锌离子的硫酸盐、葡萄糖酸盐、醋酸盐溶液；

所述的金属离子盐溶液中铜离子或锌离子的浓度为50-300mM；

所述步骤(2)中，所述外水相缓冲溶液包括：含有15mM EDTA-2Na的20mM HEPES溶液和含有等渗氯化钠或蔗糖的HEPES缓冲液，其pH值依据所选应用的金属离子盐溶液而定，当铜离子盐溶液时，外水相pH值在5-6之间；当内水相为锌离子盐溶液时，外水相pH值为6-7。

所述步骤(3)中，姜黄素溶解在适量的二甲基亚砜(DMSO)或者N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，配成浓溶液。姜黄素溶液加入体积按照总体积5％计算，药物与总磷脂质量比例为0.5-1:10。

本发明的优势在：

①首次以金属离子梯度实现姜黄素主动载药脂质体的制备，在优选条件下，选用HSPC或DSPC(摩尔百分比55-70％)、胆固醇(摩尔百分比30-45％)、DSPE-PEG(摩尔百分比0-0.5％)，以醋酸铜或者醋酸锌为内水相，含有氯化钠或者蔗糖的HEPES作为外水相，当姜黄素与总磷脂为1:10时，姜黄素包封率大于95％；

②以金属离子作为内水相优势在于，铜、锌离子可以与姜黄素形成稳定的复合物，不易泄露，稳定性好；

③所制备的姜黄素脂质体具有独特的花瓣状结构，有利于姜黄素脂质体的细胞摄取，提高肿瘤组织的蓄积；

④相比于姜黄素，所制备的姜黄素脂质体在肿瘤细胞中具有更强的诱导活性氧ROS产生的能力，从而产生更强的肿瘤细胞抑制活性，尤其是姜黄素与铜离子形成的复合物，其抗肿瘤活性更强；

⑤相比于姜黄素溶液，所制备的姜黄素脂质体具有更强的肿瘤细胞抑制活性；

⑥姜黄素主动载药脂质体制剂在体内、体外均具有显著的抗肿瘤和抗转移侵袭特性，能够有效抑制肿瘤生长，有效延长荷瘤小鼠的生存期。

附图说明

图1为姜黄素主动载药脂质体原理示意图，图中M代表可以与姜黄素络合的金属离子；

图2为实施例1中相同浓度内水相盐对姜黄素粒径和包封率的影响；

其中，1为硫酸铜溶液，2为葡萄糖酸铜溶液，3为硫酸锌，4为醋酸铜，5为醋酸锌；

图3为实施例2中内水相浓度对姜黄素包封率和粒径的影响；

图4为实施例3中药脂比对包封率和粒径的影响；

图5为实施例4中外水相pH对姜黄素包封率的影响；

图6为实施例5中胆固醇含量对姜黄素包封率和粒径的影响；

图7为实施例6中两种姜黄素脂质体稳定性结果；

图8姜黄素脂质体冷冻电镜图：(a)锌离子脂质体；(b)铜离子脂质体；(c)锌-姜黄素脂质体；(d)铜-姜黄素脂质体；

图9姜黄素及其脂质体制剂在不同时间点组织分布图(上)1小时(中)4小时(下)24小时；(1)心，(2)肝，(3)脾，(4)肺，(5)肾，(6)肿瘤；

图10姜黄素脂质体在肿瘤细胞中诱导活性氧产生相对含量图，横坐标显示药物作用时间，分为2h和8h，纵坐标荧光强度反应活性氧产生的量；

图11为实施例7中姜黄素对抗皮下肿瘤药效实验肿瘤曲线图；

图12为实施例10中各组制剂体重变化图；

图13为实施例10中姜黄素脂质体制剂对抗转移性肿瘤生存曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明做进一步说明，但不作为本发明权利要求范围限制。

相关名词：

包封率(encapsulation efficiency，EE)，指脂质体内包载药物与载药时投药量的比；

计算公式：EE＝W_{inside ofl iposome}/W_{total of input} X100％

载药量(Drug loading，DL)，指脂质体内包载药物的质量占脂质体制剂总质量的比；

计算公式：DL＝W_{inside ofl iposome}/W_total X100％

药脂比(Drug：Lipid，D：L)，指药物与总脂质成分(磷脂加胆固醇)质量的比实施例1内水相盐对姜黄素脂质体粒径包封率的影响

称取68.1mg HSPC、22.8mg Chol、1.2mg DSPE-PEG2000，溶于氯仿中，37℃减压旋蒸除去有机溶剂成磷脂膜，用下表中各种金属离子盐溶液(200mM)于65℃下进行水化30min，所得粗品脂质体溶液于挤出装置中依次通过0.4、0.2、0.1μm聚碳酸酯膜，测定粒径。通过葡聚糖凝胶色谱柱交换除去脂质体外部金属离子并交换外水相为HEPES缓冲液，得空白脂质体。取姜黄素溶于DMSO中，配置20mg/mL姜黄素溶液，取50μL姜黄素溶液加入到1mL10mg/mL空白脂质体，在65℃条件下共孵育30分钟后冰浴终止载药，测定粒径和包封率，结果见图2。

结果表明：不同的内水相相盐对姜黄素的包封率影响较小，粒径影响较大，其中，醋酸盐优于其它阴离子盐溶液。

实施例2内水相浓度对姜黄素脂质体粒径和包封率得影响

按照实施例1中方法和以醋酸铜作为内水相，内水相浓度按照下表中设置，制备空白脂质体。所制得的空白脂质体与姜黄素按照药脂比1：10在65℃条件下共孵育30分钟，完成载药后冰浴终止载药，测定脂质体粒径和包封率，结果见图3。

结果表明:随着内水相浓度增加，姜黄素包封率也增加，当浓度大于200mM时，脂质体包封率有所下降，粒径也显著增加。

实施例3药脂比对脂质体粒径包封率的影响

称取68.1mg HSPC、22.8mg Chol、1.2mg DSPE-PEG2000，溶于氯仿中，37℃减压旋蒸除去有机溶剂成磷脂膜，用200mM醋酸铜溶液于65℃下进行水化30min，所得粗品脂质体溶液于挤出装置中依次通过0.4、0.2、0.1μm聚碳酸酯膜，测定粒径。通过葡聚糖凝胶色谱柱交换除去脂质体外部金属离子并交换外水相为HEPES缓冲液，得空白脂质体。取姜黄素溶于DMSO中，配置20mg/mL姜黄素溶液，取50μL姜黄素溶液加入到1mL 10mg/mL空白脂质体，在65℃条件下共孵育30分钟后冰浴终止载药，测定粒径和包封率，结果如图4。

结果表明：当药脂比大于1:10时，姜黄素包封率降低，粒径显著增加。

实施例4外水相对姜黄素脂质体包封率的影响

称取68.1mg HSPC、22.8mg Chol、1.2mg DSPE-PEG2000，溶于氯仿中，37℃减压旋蒸除去有机溶剂成磷脂膜，用200mM醋酸铜或醋酸锌溶液于65℃下进行水化30min，所得粗品脂质体溶液于挤出装置中依次通过0.4、0.2、0.1μm聚碳酸酯膜，测定粒径。通过葡聚糖凝胶色谱柱交换除去脂质体外部金属离子并交换外水相为HEPES缓冲液(pH 5.0)、HEPES缓冲液(pH 6.0)、HEPES缓冲液(pH 7.0)、HEPES缓冲液(pH 8.0)，得空白脂质体。取姜黄素溶于DMSO中，配置20mg/mL姜黄素溶液，取50μL姜黄素溶液加入到1mL 10mg/mL空白脂质体，在65℃条件下共孵育30分钟后冰浴终止载药，测定粒径和包封率。

结果表明：当内水相金属离子不同时，外水相pH对包封率和粒径产生的影响也不同。当内水相为醋酸铜时，外水相适宜pH为5-6；当内水相为醋酸锌时，外水相优选的pH为7。

实施例5胆固醇含量对姜黄素脂质体对包封率的影响

按照下表中处方称取制剂组分，溶于氯仿中，37℃减压旋蒸除去有机溶剂成磷脂膜，用200mM醋酸铜溶液于65℃下进行水化30min，所得粗品脂质体溶液于挤出装置中依次通过0.4、0.2、0.1μm聚碳酸酯膜，测定粒径。通过葡聚糖凝胶色谱柱交换除去脂质体外部金属离子并交换外水相为HEPES缓冲液(pH 5.0)，得空白脂质体。取姜黄素溶于有机溶剂中，按照药物：磷脂质量比例1：10加入到空白脂质体中，在65℃条件下共孵育30分钟后冰浴终止载药，测定粒径和包封率。

结果表明：随着胆固醇含量增加，姜黄素包封率增加，粒径逐渐降低。当胆固醇摩尔含量大于30％时，包封率不再增加。

实施例6姜黄素脂质体稳定性考察

称取68.1mg HSPC、22.8mg Chol、1.2mg DSPE-PEG2000，溶于氯仿中，37℃减压旋蒸除去有机溶剂成磷脂膜，分别用200mM醋酸铜、200mM醋酸锌溶液于65℃下进行水化30min，所得粗品脂质体溶液于挤出装置中依次通过0.4、0.2、0.1μm聚碳酸酯膜，测定粒径。通过葡聚糖凝胶色谱柱交换除去脂质体外部金属离子并交换外水相为HEPES缓冲液，得空白脂质体。取姜黄素溶于DMSO中，配置20mg/mL姜黄素溶液，取50μL姜黄素溶液加入到1mL10mg/mL空白脂质体，在65℃条件下共孵育30分钟后冰浴终止载药。将脂质体分别置于4℃、25℃长期放置，考察制剂稳定性。

结果表明：在不同温度放置6个月时间内，脂质体粒径轻微的变大，并没有显著的变化，稳定性较好。

实施例7姜黄素脂质体形态

按照实施例6制备姜黄素脂质体，通过冷冻透射电镜观察脂质体的表面和内部晶体形态，精密量取3.5μl脂质体置于R1.2/1.3 100孔碳膜栅(Cu 200目)上，快速吸去多余脂质体悬浮液并将碳膜栅冷冻于液态乙烷和甲烷的混合物中，以上操作均在Vitrobot制样机器人室内进行。使用FEI Talos F200C电子显微镜在200kV的操作电压下获得数据，图像是在36,000倍放大的电荷耦合器件上收集。最终，使用SerialEM软件对收集的数据进行处理。

通过冷冻透射电镜观察到通过铜离子或者锌离子梯度制备的姜黄素脂质体呈现出双室脂质体构象、两片或者三片花瓣状构象，脂质体内部呈现不同密度电子云结构，证明姜黄素在脂质体内部与金属离子形成复合物沉淀结构。

实施例8姜黄素脂质体细胞毒研究

将处于对数生长期的4T1细胞(乳腺癌细胞)、RM-1细胞(***癌细胞)、Panc-1细胞(胰腺癌细胞)、B16F10(黑色素瘤细胞)，分别按照每孔1000、1000、3000、5000个数目加至96孔板中，每孔体积100μL待24h细胞贴壁后，将姜黄素溶液、姜黄素-铜脂质体、姜黄素＝锌脂质体按照设定浓度加至孔板中(n＝6)，分别于二氧化碳培养箱中继续培养48h、72h后加入MTT，在培养4h后孔板中生成结晶紫，加DMSO溶解结晶紫后，在酶标仪上测定吸光度，激发波长设定490nm，测定吸光度按照如下公式计算细胞存活率：

细胞存活率＝(OD对照组-OD空白组)/(OD给药组-OD空白组)*100％

根据细胞存活率通过Graphpad软件拟合计算半数致死量IC50

结果表明：通过不同离子梯度制备的姜黄素脂质体其细胞毒性相较于姜黄素更强，以不同的金属离子载药制备的姜黄素脂质体在测试的细胞中呈现出毒性差异。

实施例9姜黄素脂质体诱导活性氧ROS效应

10⁵个细胞铺于24孔板中，培养24h后，弃去旧培养基，用培养基稀释游离姜黄素、铜离子脂质体、锌离子脂质体、姜黄素-铜脂质体、姜黄素-锌脂质体，分别处理细胞2小时、8小时。孵育过后弃去含药培养基，用20微摩尔DCFH-DA孵育细胞30分钟后通过流式细胞仪测定活性氧含量,实验结果见图10。

结果表明，随时间延长到8小时，相比于姜黄素溶液，姜黄素脂质体尤其是姜黄素-铜脂质体能够诱导产生更多的ROS，这有利于抑制肿瘤细胞的活性。

实施例10姜黄素脂质体组织分布实验

将处于对数生长期的4T1细胞按照每只鼠5×10⁶个细胞/0.2ml接种0.2ml体积于20g左右雌性balb/c小鼠右后侧，每天观察测量肿瘤体积，待肿瘤体积至200-300mm³时，将小鼠随机分为3组(n＝3)：、姜黄素溶液剂组、铜-姜黄素脂质体组、锌-姜黄素脂质体组，给药剂量为20mg/kg，给药后分别在1、4、24时处死小鼠，取组织测定各组织中姜黄素浓度。

结果表明，姜黄素脂质体肿瘤组织蓄积量明显高于姜黄素溶液，铜-姜黄素脂质体在肿瘤部位蓄积量高于锌-姜黄素脂质体。

实施例11姜黄素脂质体皮下肿瘤药效学考察

将处于对数生长期的4T1细胞按照每只鼠5×10⁶个细胞/0.2ml接种0.2ml体积于20g左右雌性balb/c小鼠右后侧，每天观察测量肿瘤体积，待肿瘤体积至100mm³时将小鼠随机分为6组(n＝6)：生理盐水组、姜黄素溶液剂组、铜离子空白脂质体组、锌离子空白脂质体组、铜-姜黄素脂质体组、锌-姜黄素脂质体组，给药剂量为20mg/kg，每三天给药一次，共给药四次。每两天称量一次体重，测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积。

肿瘤体积＝长径×短径²/2

结果表明：姜黄素脂质体抗肿瘤效果优于姜黄素游离药，对于乳腺癌肿瘤模型，铜-姜黄素脂质体表现出最好的治疗效果，优于锌-姜黄素脂质体制剂。

实施例12姜黄素脂质体对抗乳腺癌肺转移的药效学研究

将对数生长期的4T1按照每只鼠通过尾静脉注射50万个肿瘤细胞，48小时后进行给药治疗，共分为6组(n＝6)：生理盐水组、姜黄素溶液剂组、铜离子空白脂质体组、锌离子空白脂质体组、铜-姜黄素脂质体组、锌-姜黄素脂质体组，给药剂量为20mg/kg，每三天给药一次，共给药四次。记录鼠的体重和生存期。

结果表明：姜黄素脂质体制剂能够显著延长癌症转移鼠的生存期，有较好的抗转移治疗效果。

Claims

1.一种姜黄素主动载药脂质体，其特征在于，由如下成分制备得到：姜黄素、磷脂、胆固醇、金属离子盐溶液、外水相缓冲液；其中，所述的金属离子盐溶液为铜离子的醋酸盐溶液，所述的外水相缓冲液是含有氯化钠或者蔗糖的磷酸盐缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液；姜黄素与总磷脂的重量比是0.5-1:10；所述的总磷脂为磷脂和胆固醇的总和；所述胆固醇的摩尔百分含量为30-45%；外水相pH为5-6；所述的金属离子盐溶液中铜离子的浓度为150-200mM。

2.根据权利要求1所述的姜黄素主动载药脂质体，其特征在于，所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰基卵磷脂、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂、二棕榈酰基卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，DSPE-PEG2000中的一种或几种。

3.根据权利要求1或2所述的姜黄素主动载药脂质体，其特征在于，所述的姜黄素脂质体为花瓣状结构。

4.根据权利要求1所述的姜黄素主动载药脂质体的制备方法，其特征在于，

（1）大单室脂质体的制备

称取处方量的磷脂、胆固醇，有机溶剂溶解，充分除去有机溶剂形成磷脂膜，加内水相金属离子盐溶液水化至磷脂膜完全脱落，通过挤出或者探头超声等方式降低脂质体粒径，使其变成粒径均一的大单室脂质体；

（2）金属离子跨膜梯度的建立

步骤（1）所得脂质体通过与含有乙二胺四乙酸二钠的外水相缓冲溶液进行充分交换，充分除去脂质体外部金属离子，再用含有氯化钠或者蔗糖和HEPES溶液进行充分交换，得空白脂质体；

（3）载药

将姜黄素的浓溶液加入到步骤（2）的脂质体溶液中进行孵育，一定时间后终止载药过程，并保存。

5.权利要求1-3任何一项所述的姜黄素脂质体在制备诱导活性氧ROS产生的能力的药物中的应用。

6.权利要求1-3任何一项所述的姜黄素脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.权利要求1-3任何一项所述的姜黄素脂质体在制备治疗乳腺癌、***癌、胰腺癌、黑色素瘤药物中的应用。