CN112444590B - 一种五倍子药材的uplc指纹图谱的构建方法、通过该方法构建的指纹图谱及其应用 - Google Patents

一种五倍子药材的uplc指纹图谱的构建方法、通过该方法构建的指纹图谱及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种五倍子药材的UPLC指纹图谱的构建方法、通过该方法构建的指纹图谱及其应用。其包括下列步骤：1)制备五倍子药材的多个供试品溶液以及指标性成分的对照品溶液；2)将步骤1)中制备的供试品溶液以及对照品溶液分别进行超高效液相色谱分析，得到相应的超高效液相色谱图；测定多批五倍子药材，并进行分析比较，得到其共有峰的超高效液相色谱指纹图谱。本发明可实现对整个五倍子药材内在品质的把控，为五倍子药材的内在质量控制提供新的分析手段。

Description

一种五倍子药材的UPLC指纹图谱的构建方法、通过该方法构 建的指纹图谱及其应用
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及一种五倍子药材的超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱的构建方法，通过该方法构建的指纹图谱，以及该指纹图谱的应用。
背景技术
五倍子为漆树科植物Rhus chinensis Mill.、青麸杨Rhus potaninii Maxim.或红麸杨Rhus punjabensis Stew.var.sinica(Diels)Rehd.et Wils.叶上的虫瘿，主要由五倍子蚜Melaphis chinensis(Bell)Baker寄生而形成，别名百虫仓、木附子等。五倍子的分布十分的广泛，大多集中于长江以南地区，贵州、四川等地是五倍子的主要产地。
五倍子秋季采摘，置沸水中略煮或蒸至表面成灰色，杀死其中的蚜虫，取出，干燥。按照外形不同，五倍子主要分为“肚倍”和“角倍”。“肚倍”呈长圆形或纺锤形囊状，长2.5～9cm，直径1.5～4cm。角倍呈菱形，具有不规则的钝角状分枝，柔毛较明显，壁较薄。五倍子性酸、涩，寒。归肺、大肠、肾经。五倍子具有敛肺降火，涩肠止泻，敛汗，止血，收湿敛疮的功效。主要用于肺虚久咳，肺热痰嗽，久泻久痢，自汗盗汗，消渴，便血痔血，外伤出血，痈肿疮毒，皮肤湿烂等症。现代药理研究表明五倍子具有止泻、抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗衰老和降血糖等药理作用(韩建军,宁娜.五倍子药理作用的研究进展[J].淮海医药,2015,33(04):415-416)，临床主要应用于小儿科及妇科等方面。
目前研究表明五倍子的化学成分主要包括鞣质(又称单宁酸、鞣酸)、五倍子酸、五倍子油(包括油酸、亚油酸、亚麻酸、月桂酸)等，此外还含有铜、锌、铁、钙等微量元素(谷竹义.五倍子化合物的分离与鉴定[D].沈阳,辽宁师范大学,2012；李春远,丁唯嘉.五倍子化学成分研究[J].中草药,2008,39(08):1129-1132)。其中以鞣质的含量最高，可达70％，因五倍子盛产于我国，国际上又将五倍子鞣质称为中国鞣质(章怀奋,刘志武,等.五倍子配方颗粒中鞣质含量比较[J].临床医药实践,2002,21(9):691-693)。
五倍子是我国的森林特产物，目前已报道的有十几种，商品五倍子有肚倍类、角倍类、倍花类等，质量相差较大，因此导致商品药材质量良莠不齐，1985年出版的《中华人民共和国药典》列出了常见的角倍和肚倍两种，但目前关于五倍子的研究多集中在肚倍药材，对角倍药材的研究较少。因此，建立一种全面、快速、客观评价其内在质量的方法至关重要。
中药指纹图谱或指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，能够***、整体、专属地表征中药的内在特征，可用于评价中药材、中药制剂以及半成品的质量，是对中药整体质量控制的有效手段，已被世界卫生组织所接受。
目前为止，关于五倍子药材对于更能揭示其内在质量的指纹图谱研究较少。郭小瑞等以HPLC法建立五倍子药材指纹图谱(郭小瑞,李里,孙哲.五倍子HPLC指纹图谱研究[J].中国药房,2013,24(27):2546-2547)，以甲醇-1％醋酸溶液为流动相，在280nm波长下，同时对14批不同来源的药材进行检测，以没食子酸峰为内参比峰，共标定了五倍子药材指纹图谱中14个共有峰，l4批样品中有12批的相似度在0.900以上，为推荐品；有2批小于0.900，为非推荐品；陈红等利用UPLC Waters超高效液相色谱仪(陈红,龙远德,张丹.五倍子指纹图谱研究[J].华西药学杂志,2010,25(03):373-374)，Waters Symmetry ShieldC18(150mm×3.9mm，5μm)色谱柱，以乙腈(含0.1％三氟乙酸)-水(含0.1％三氟乙酸)溶液为流动相，在280nm波长下，测定3批五倍子原料药材、3批半成品、3批成品的特征峰，采用夹角余弦测定五倍子药材、半成品及成品的相似度，试验证实夹角余弦计算法具有较高的计算准确度和精密度，且十分简便快捷，各批样品与对照模式的夹角余弦值均大于0.9，具有良好的相关性。CN104198574A公开了五倍子的双重指纹图谱质量控制方法，其采用ICP-MS法测定每一来源的五倍子药材的无机元素，得到ICP-MS分析数据，建立五倍子药材无机元素的指纹图谱，然后采用HPLC法测定每一来源的五倍子药材的有机成分，建立五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱，之后综合分析五倍子药材无机元素的指纹图谱及聚类分析与五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱及聚类分析来评价五倍子药材的质量。
这些研究主要采用HPLC进行检测，检测时间长达120min及以上，检测时间长，有机溶剂使用过多，对环境污染严重，仅有的一篇关于五倍子指纹图谱UPLC的检测研究，仅只研究了3批原料药，不具有代表性，并且色谱峰分离度不甚理想，不能全面地揭示五倍子药材的内在质量。
因此，有必要建立寻找一种专属性强、稳定性高、重复性好的五倍子药材的内在质量的控制的新的分析手段，使其不仅适用于肚倍药材，也适用于角倍药材，以达到鉴别不同产地、不同来源五倍子药材的目的。
发明内容
发明要解决的问题
为了解决现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种五倍子药材的超高效液相色谱指纹图谱的构建方法，通过该方法构建的指纹图谱，该指纹图谱在五倍子药材以及含五倍子药材的制剂的质量检测中的应用。本发明的构建方法使五倍子药材的质量控制从原来的某几个成分的含量测定或少数几个共有峰的测定，上升到对整个五倍子药材内在品质的把控，能够较全面地反应五倍子药材的特征，为五倍子药材的内在质量控制提供新的分析手段，并达到鉴别不同产地、不同来源五倍子药材的目的。
用于解决问题的方案
在一个技术方案中，本发明提供了一种五倍子药材的超高效液相色谱指纹图谱的构建方法，其包括下列步骤：
1)制备五倍子药材的多个供试品溶液以及指标性成分的对照品溶液；
2)将步骤1)中制备的供试品溶液以及对照品溶液分别进行超高效液相色谱分析，得到相应的超高效液相色谱图；测定多批比如7批以上五倍子药材，并进行分析比较，得到其共有峰的超高效液相色谱指纹图谱。
在一个实施方式中，所述指标性成分选自没食子酸、没食子酸酯、五没食子酸酰基葡萄糖中的至少一种，进一步优选的所述指标性成分为没食子酸。
在另一个实施方式中，本发明的构建方法还包括步骤3)采用液质联用技术，按照步骤2)的超高效液相色谱条件，采集质谱数据，对其共有峰进行归属。
在另一个实施方式中，步骤1)供试品溶液的制备包括取五倍子药材，加溶剂提取，摇匀，过滤，取续滤液。
在另一个实施方式中，所述溶剂为甲醇、水、体积浓度为30-70％甲醇水溶液或30-70％乙醇水溶液。
在另一个实施方式中，提取时间为15-60min，优选地提取时间为60min。
在另一个实施方式中，提取方式为超声处理或振摇提取或加热回流，优选地提取方式为超声处理。
在另一个实施方式中，步骤2)中所述超高效液相色谱分析的条件如下：采用反相色谱柱，优选地所述反相色谱柱为Water ACQUITY BEH Shield RP18色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.05-0.2体积％磷酸水溶液或水为流动相B，进行梯度洗脱，优选地，流动相B选自0.1体积％磷酸水溶液。
在另一个实施方式中，所述梯度洗脱的程序如下：
0min→15min→20min→25min→35min→45min→55min→56min，流动相A：10％→30％→31％→33％→38％→45％→63％→10％。流动相的百分比为体积百分比，流动相A和流动相B的体积百分比之和为100％。
在另一个实施方式中，色谱柱的柱温为20-30℃；流动相的流速为0.25-0.35ml/min，优选的流速为0.28～0.32ml/min；检测波长为273nm或280nm。
在另一个实施方式中，步骤1)制备肚倍药材的多个供试品溶液，步骤2)得到的包含14个共有峰的超高效液相色谱指纹图谱，以峰2没食子酸为参照峰，其相对保留时间分别为：峰1:0.67(±5％)、峰2：1.00(±5％)、峰3：2.42(±5％)、峰4：3.54(±5％)、峰5：4.37(±5％)、峰6：5.17(±5％)、峰7：5.52(±5％)、峰8：6.84(±5％)、峰9：7.69(±5％)、峰10：8.35(±5％)、峰11：10.28(±5％)、峰12：10.78(±5％)、峰13：11.61(±5％)、峰14：14.29(±5％)。进一步地，所述14个共有峰中，峰2为没食子酸、峰3为没食子酸甲酯、峰14为五没食子酸酰基葡萄糖。
在另一个实施方式中，步骤1)制备角倍药材的多个供试品溶液，步骤2)得到的包含10个共有峰的超高效液相色谱指纹图谱，以峰2没食子酸为参照峰，其相对保留时间分别为：峰1:0.66(±5％)、峰2：1.00(±5％)、峰3：2.34(±5％)、峰4：3.43(±5％)、峰5：5.00(±5％)、峰6：5.29(±5％)、峰7：6.55(±5％)、峰8：7.95(±5％)、峰9：9.69(±5％)、峰10：13.52(±5％)。进一步地，所述10个共有峰中，峰2为没食子酸、峰3为没食子酸甲酯，峰10为五没食子酸酰基葡萄糖。
在另一个技术方案中，本发明提供了一种五倍子药材的超高效液相色谱指纹图谱，其通过根据本发明所述的构建方法而获得。
在一个实施方案中，本发明提供了一种肚倍药材的超高效液相色谱指纹图谱，其包含14个共有峰。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种角倍药材的超高效液相色谱指纹图谱，其包含10个共有峰。
在另一个技术方案中，本发明还提供了根据本发明上述超高效液相色谱指纹图谱在五倍子药材以及含五倍子药材的制剂的检测中的应用。
在一个实施方案中，上述应用中所述检测包括鉴别药材的真伪、评价药材的质量以及分析药材的来源和产地。通过将待测药材的超高效液相色谱图与上述五倍子药材的超高效液相色谱特征谱图进行比对。
在另一个实施方式中，上述应用中，对于17批肚倍药材进行检测，相似度在0.940以上，具体地相似度分别为0.959，0.953，0.960，0.993，0.993，0.993，0.987，0.972，0.972，0.979，0.975，0.942，0.948，0.970，0.974，0.971，0.973。
在另一个实施方式中，上述应用中，对于7批角肚药材进行检测，相似度在0.920以上，具体地相似度分别为0.951，0.945，0.948，0.936，0.920，0.947，0.955。
发明的效果
本发明通过采用超高效液相色谱法，并对色谱条件进行合理控制，共确定了肚倍药材14个共有峰，角倍药材10个共有峰，构成了五倍子药材指纹图谱的全貌，使五倍子药材的质量控制从原来的某几个成分的含量测定或少数几个共有峰的测定，上升到对整个五倍子药材内在品质的把控，能够比较全面地反应五倍子药材的特征，避免了单一或少数几个峰测定的缺陷，为五倍子药材的内在质量控制提供新的分析手段，达到鉴别不同产地、不同来源五倍子药材的目的。
本发明方法简单，重现性好，准确可靠，便于操作，相比于HPLC来说，节约时间，溶剂消耗量少，对环境污染小。
附图说明
图1为全波长扫描下肚倍药材的3D UPLC色谱图。
图2为273nm和280nm波长条件下肚倍药材的UPLC色谱图。
图3为不同提取溶剂条件下肚倍药材的UPLC色谱图。
图4为不同提取方式下肚倍药材的UPLC色谱图。
图5为不同提取时间下肚倍药材的UPLC色谱图。
图6为17批肚倍药材UPLC叠加图谱。
图7为7批角倍药材UPLC叠加图谱。
图8为对照品的UPLC指纹图谱，其中：峰2没食子酸，峰3为没食子酸甲酯，峰14为五没食子酸酰基葡萄糖(肚倍药材)。
图9为对照品的UPLC指纹图谱，其中：峰2没食子酸，峰3为没食子酸甲酯，峰10为五没食子酸酰基葡萄糖(角倍药材)。
图10为肚倍药材的UPLC整体性色谱图。
图11为不同色谱柱条件下肚倍药材的UPLC色谱图。
图12为不同柱温条件下肚倍药材的UPLC色谱图。
图13为不同流速条件下肚倍药材的UPLC色谱图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
应当理解，在本申请说明书和附加的权利要求书中用到的单数形式的冠词“一”(对应于英文“a”、“an”和“the”)包括复数的对象，除非文中另外明确地规定。
本说明书中，所提及的“一个或一些具体/优选的实施方式/方案”、“另一个或另一些具体/优选的实施方式/方案”、“一个或另一个实施方式/方案”、“一个或另一个技术方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。
本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或***、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本发明提供了一种五倍子药材的UPLC指纹图谱的构建方法，其包括下列步骤：
1)制备五倍子药材的多个供试品溶液以及指标性成分的对照品溶液；
2)将步骤1)中制备的供试品溶液以及对照品溶液分别进行超高效液相色谱分析，得到相应的超高效液相色谱图；测定多批如7批以上五倍子药材，并进行分析比较，得到其共有峰的超高效液相色谱指纹图谱。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤1)中的五倍子药材可选自肚倍药材、角倍药材、倍花类药材中的至少一种，优选选自肚倍药材。虽然上述五倍子药材中特征性成分的色谱峰的峰位及峰面积略有不同，但主要的共有峰已可清晰辨认，因此上述三个品种均适用于本发明中UPLC指纹图谱的构建方法。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤1)供试品溶液的制备包括取五倍子药材，加溶剂提取。此外，上述制备过程还包括供试品药材的粉碎、过筛、称量、定容以及提取后摇匀、过滤、取续滤液的步骤。根据五倍子药材的化学成分的溶解度，本发明优选的溶剂包括甲醇、水、体积浓度为30-70％甲醇水溶液或30-70％乙醇水溶液，所述百分数为体积百分数。进一步优选地，溶剂为甲醇以获得更高的提取效率。在一项或多项优选的实施方案中，五倍子药材与溶剂的质量体积比为1g：80～160ml，优选地质量体积比为1g：100～130ml，更优选为1g：125ml以实现提取充分且满足检测的浓度要求。
除了提取溶剂以外，不同的提取方式也会影响药材的提取效果。在本发明的具体实施方案中，上述提取选自超声处理或振摇提取或加热回流中的任意一种。在一项优选的实施方案中，上述提取为超声提取，具有效率高、时间短、温度低、适应性广等优点。所述超声的功率为200～300W，优选地功率为250W；所述超声的频率为30～50kHz，更优选为40KHz。
此外，提取时间也会影响药材的提取效果。在本发明的具体实施方案中，当上述提取为超声提取时，提取时间为15～60min，进一步优选的提取时间为30～60min，优选地考虑到检验周期和提取充分等因素，提取时间为60min。
在本发明的一个实施方案中，步骤1)中的指标性成分选自没食子酸、没食子酸酯、五没食子酸酰基葡萄糖中的至少一种。本领域技术热可以任意选择上述三种指标性成分中的一种或多种作为对照品，用于构建本发明中五倍子药材的UPLC指纹图谱。进一步优选的所述指标性成分为没食子酸。没食子酸亦称“五倍子酸”、“棓酸”。学名“3,4,5-三羟基苯甲酸”。分子式C7H6O5。
在本发明的具体实施方案中，步骤1)中的对照品溶液的制备包括溶剂溶解步骤，优选甲醇溶解的步骤。此外，上述制备还包括对照品的称量、定容、过滤等相关步骤。
在本发明的具体实施方案中，上述构建方法的步骤2)中的超高效液相色谱分析的条件如下：采用反相色谱柱，以甲醇-磷酸水溶液或水作为流动相进行梯度洗脱，流速为0.25～0.35mL/min，柱温为20～30℃，以实现较好的分离效果。
在一项优选的实施方案中，上述反向色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶作为填料，优选Water ACQUITY BEH Shield RP18色谱柱。本发明比较了四种不同的色谱柱：分别是：Waters ACQUITY BEH Shield RP18(100×2.1mm，1.7μm)(Ser.No：01733805218321)、Waters ACQUITY BEH Shield RP18(100×2.1mm，1.7μm)(Ser.No：01733805218379)、Waters ACQUITY
Figure BDA0002187802370000071
BEH C18(Waters,100×2.1mm,1.7μm)、ACQUITY
Figure BDA0002187802370000072
T3(Waters,100×2.1mm,1.6μm)四根色谱柱对五倍子药材特征图谱耐用性的影响，结果表明相比较Water ACQUITY BEH Shield RP18色谱柱(100×2.1mm，1.7μm)，采用其他型号色谱柱，易出现包峰现象。
在一项优选的实施方案中，以体积百分比计，上述磷酸水溶液中磷酸的占比为0.05％～0.2％。在一项更优选的实施方案中，以体积百分比计，上述磷酸水溶液中磷酸的占比为0.1％。
在一项优选的实施方案中，上述梯度洗脱的程序如表1所示，流动相A和流动相B的体积百分比之和为100％：
表1梯度洗脱表
Figure BDA0002187802370000073
Figure BDA0002187802370000081
取本发明的供试品溶液，按照上表进行梯度洗脱，记录190～400nm范围内的吸收光谱。本发明发现，对于五倍子药材而言，在273nm或280nm波长下，五倍子药材样品溶液各色谱峰的响应较好，优选检测波长为273nm。
在本发明的具体实施方式中，在步骤2)中分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪中。
在本发明的一个实施方式中，供试品溶液为肚倍药材的溶液，步骤2)测试多批比如17批肚倍药材，得到相应的超高效液相色谱图，将其导入国家药典委员会颁发的“中药色谱指纹图谱相似度评价***”，以中位数生成对照指纹图谱，经多点校正后生成肚倍药材UPLC指纹图谱共有模式，其中包含14个共有峰，以2号峰(峰2)没食子酸作为参照峰，其相对保留时间分别为：峰1:0.67(±5％)、峰2：1.00(±5％)、峰3：2.42(±5％)、峰4：3.54(±5％)、峰5：4.37(±5％)、峰6：5.17(±5％)、峰7：5.52(±5％)、峰8：6.84(±5％)、峰9：7.69(±5％)、峰10：8.35(±5％)、峰11：10.28(±5％)、峰12：10.78(±5％)、峰13：11.61(±5％)、峰14：14.29(±5％)。对多批肚倍药材的超高效液相色谱图进行叠加，考察色谱峰相似度的一致性，进行相似度评价。结果显示均大于0.900以上，14个共有峰在各肚倍药材样品中均能稳定出现，且吻合度较好。在本发明的一个具体实施方式中，对于17批肚倍药材进行检测，相似度在0.940以上，具体地相似度分别为0.959，0.953，0.960，0.993，0.993，0.993，0.987，0.972，0.972，0.979，0.975，0.942，0.948，0.970，0.974，0.971，0.973。
在本发明的另一个实施方式中，供试品溶液为角倍药材的溶液，步骤2)测试多批比如7批角倍药材，得到相应的超高效液相色谱图，将其导入国家药典委员会颁发的“中药色谱指纹图谱相似度评价***”，以中位数生成对照指纹图谱，经多点校正后生成角倍药材UPLC指纹图谱共有模式，其中包含10个共有峰，以2号峰(峰2)没食子酸作为参照峰，其相对保留时间分别为：峰1:0.66(±5％)、峰2：1.00(±5％)、峰3：2.34(±5％)、峰4：3.43(±5％)、峰5：5.00(±5％)、峰6：5.29(±5％)、峰7：6.55(±5％)、峰8：7.95(±5％)、峰9：9.69(±5％)、峰10：13.52(±5％)。对多批角倍药材的超高效液相色谱图进行叠加，考察色谱峰相似度的一致性，进行相似度评价。结果显示均大于0.900以上，10个共有峰在各角倍药材样品中均能稳定出现，且吻合度较好。在本发明的一个具体实施方式中，对于7批角肚药材进行检测，相似度在0.920以上，具体地相似度分别为0.951，0.945，0.948，0.936，0.920，0.947，0.955。
在本发明的另一个实施方式中，本发明的构建方法还包括步骤3)采用液质联用技术，按照步骤2)的超高效液相色谱条件，采集高分辨质谱数据，结合同位素分析推测五倍子药材中化合物的分子式，结合文献和相关对照品比对，对其共有峰进行归属。
本发明质谱检测的条件为：离子源为电喷雾离子源ESI，干燥气温度为200-400℃，优选为300℃，流量为1-20L/min，优选为8L/min，雾化器压力为10-100psi，优选为35psi；正离子模式下毛细管电压4000V，负离子模式下毛细管电压3500V，毛细管出口电压175V，锥孔电压65V；采用高分辨模式进行数据采集，质荷比采集范围m/z 100～2000，采样速度1spectra/s，采样时间1000ms/spectra；负离子采用TFANH4(112.985587)和HP-0921(1033.988109)进行质量数实时校准，正离子采用嘌呤(121.050873)和HP-0921(922.009798)进行质量数实时校准，雾化压力5psi。
在本发明的一个具体实施方式中，发现针对肚倍药材的超高效液相色谱图中，峰2、峰3、峰14的保留时间及紫外光谱分别与参照物中没食子酸、没食子酸甲酯、五没食子酸酰基葡萄糖，故供试品指纹图谱中峰2、峰3、峰14分别鉴定为没食子酸、没食子酸甲酯、五没食子酸酰基葡萄糖。此外，采用液质联用还指认了11个共有峰。本发明发现针对角倍药材的超高效液相色谱图中，峰2、峰3、峰10的保留时间及紫外光谱分别与参照物中没食子酸、没食子酸甲酯、五没食子酸酰基葡萄糖，故供试品指纹图谱中峰2、峰3、峰10分别鉴定为没食子酸、没食子酸甲酯、五没食子酸酰基葡萄糖。此外，采用液质联用还指认了7个共有峰。
采用本发明的构建方法精密度良好、重复性良好，供试品溶液至少在12小时内稳定。
在另一个技术方案中，本发明提供了一种五倍子药材的超高效液相色谱指纹图谱，其通过根据本发明所述的构建方法而获得。在一个实施方案中，本发明提供了一种肚倍药材的超高效液相色谱指纹图谱，其包含14个共有峰。在另一个实施方案中，本发明提供了一种角倍药材的超高效液相色谱指纹图谱，其包含10个共有峰。
在另一个技术方案中，本发明还提供了根据本发明上述超高效液相色谱指纹图谱在五倍子药材以及含五倍子药材的制剂的检测中的应用。
在一个实施方案中，上述应用中所述检测包括鉴别药材的真伪、评价药材的质量以及分析药材的来源和产地。通过将待测药材的超高效液相色谱图与上述五倍子药材的超高效液相色谱特征谱图进行比对。
以下将结合具体的实施例来进一步阐述本发明中的技术方案。本领域技术人员容易理解的是，下列实施例中所描述的具体实验条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当且不会被理解为用于限制本发明。在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围之内。此外，除非另有说明，下列实施例中所使用的仪器、材料、试剂等均可通过常规商业手段获得。
实施例一：五倍子药材UPLC指纹图谱的构建
1.仪器、试剂与样品：
Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪(Waters公司)；Empower 3工作站(Waters公司)；Agilent G6530Accurate-Mass Q-TOF质谱联用仪(Agilent公司)；AgilentMass Hunter Workstation数据采集及定性分析软件(Agilent公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；KQ-250B超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；纯水***(Sartorius公司)；AS165W型离心机(亚速旺(上海)商贸有限公司)。甲醇(色谱纯，ThermoFisher公司)；水为超纯水；磷酸(色谱纯，aladdin公司)；其它试剂均为分析纯。
没食子酸对照品购自中国食品药品检定研究院，编号为110831-201605。没食子酸甲酯对照品、五没食子酸酰基葡萄糖对照品购自上海诗丹德生物技术有限公司，编号分别为6313、3367。五倍子药材分别采集于主产地陕西、四川、重庆、湖北、贵州地区，经江阴市天江药业有限公司鉴定漆树科植物Rhus chinensis Mill.、青麸杨Rhus potaninii Maxim.或红麸杨Rhus punjabensis Stew.var.sinica(Diels)Rehd.et Wils.叶上的虫瘿，符合《中国药典》2015年版五倍子项下的各项规定，共计24批。
2.对照品溶液的制备：
取没食子酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。分别取没食子酸甲酯、五没食子酸酰基葡萄糖对照品适量，精密称定，加甲醇制成分别制成浓度为0.020mg/ml、0.150mg/ml的溶液，即得。
3.供试品溶液的制备：
将五倍子药材粉末(过四号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.色谱条件的确定：
4.1检测波长的确定
取上述供试品溶液，按照前述表1进行梯度洗脱，记录190～400nm范围内的吸收光谱。
结果如图1及图2所示，在273nm或280nm波长下，五倍子药材样品溶液，各色谱峰的响应较好，参照中国药典含量测定检测波长，选择273nm为检测波长。
4.2流动相的优化
选择甲醇-0.1％磷酸为流动相。
色谱条件最终确定为：用Acquity UPLC BEH Shield RP18(100×2.1mm，1.7μm)色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表1的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速为0.30ml/min；检测波长为273nm。
4.3供试品溶液的制备
(1)提取溶剂的考察
分别考察了不同提取溶剂对五倍子药材指纹图谱的影响，选取30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、乙醇、水作为提取溶剂，通过暂时指认的14个色谱峰总峰面积/称样量及色谱图来比较不同提取溶剂指纹图谱。
按“4.2”项下色谱条件进样，得到五倍子药材指纹图谱不同提取溶剂考察结果见表2，图3。
表2五倍子药材指纹图谱提取溶剂考察(峰面积/称样量)
Figure BDA0002187802370000111
结果如图3，以甲醇为提取溶剂时，色谱峰1～14的提取效率均较高，因此选择甲醇作为提取溶剂。
(2)提取方式的考察
分别考察了不同提取方式对五倍子药材指纹图谱的影响，选取超声处理、加热回流、振摇提取为提取方式，通过暂时指认的14个色谱峰总峰面积/称样量及色谱图比较不同提取方式指纹图谱结果。
取五倍子药材粉末(过四号筛)约0.2g，平行三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)、加热回流、振摇提取60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
按“4.2”项下色谱条件进样，得到五倍子药材指纹图谱不同提取方式考察结果见表3，图4。
表3五倍子药材指纹图谱提取方式考察(峰面积/称样量)
Figure BDA0002187802370000121
结果如图4，采用三种处理方式所得的色谱峰数目一致，超声处理方式的提取效率稍高，因此选择超声处理作为供试液提取方式。
(3)提取时间的考察
分别考察了不同提取时间对五倍子药材指纹图谱的影响，选取考察15分钟、30分钟、45分钟和60分钟四个不同提取时间，通过暂时指认的10个色谱峰总峰面积/称样量及色谱图比较不同提取时间指纹图谱结果。
取五倍子药材粉末(过四号筛)约0.2g，平行四份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试液。按“4.2”项下色谱条件进样，得到五倍子药材指纹图谱不同提取时间考察结果见表4，图5。
表4五倍子药材指纹图谱提取时间考察(峰面积/称样量)
Figure BDA0002187802370000122
结果如图5，不同提取时间下样品色谱峰数目一致，但提取时间为60min时各峰的提取效率最高，因此提取时间定为60分钟。
5指纹图谱的建立
5.1分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪。
5.2肚倍药材相似度评价采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012.0版本)”对17批肚倍药材样品指纹图谱进行叠加见图6，考察色谱峰相似度的一致性，进行相似度评价，结果见表5，结果显示均大于0.900以上，说明样品指纹图谱与对照图谱的相似度较高，14个共有峰在各样品中均能稳定出现，且吻合度较好，因此该图谱可作为五倍子药材的指纹图谱。
表5 17批药材(肚倍)相似度评价结果
Figure BDA0002187802370000131
5.3角倍药材相似度评价采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012.0版本)”对7批角倍药材样品特征图谱进行叠加见图7，考察色谱峰相似度的一致性，进行相似度评价，结果见表6，结果显示均大于0.900以上，说明样品指纹图谱与对照图谱的相似度较高，10个共有峰在各样品中均能稳定出现，且吻合度较好，因此该图谱可作为五倍子药材的指纹图谱。
表6 7批药材(角倍)相似度评价结果
Figure BDA0002187802370000132
6共有峰的归属及特征峰的确定
用液质联用技术，按照五倍子药材(肚倍)指纹图谱的液相色谱条件，采集高分辨质谱数据，结合同位数分析推测五倍子药材中化合物的分子式，结合参考文献和相关对照品比对，对其共有峰进行归属。其中峰2、峰3、峰14的保留时间及紫外光谱分别与参照物中没食子酸、没食子酸甲酯、五没食子酸酰基葡萄糖，故供试品指纹图谱中峰2、峰3、峰14分别鉴定为没食子酸、没食子酸甲酯、五没食子酸酰基葡萄糖，见图8。此外，采用液质联用指认了11个共有峰，结果见表7。
用液质联用技术，按照五倍子药材(角倍)指纹图谱的液相色谱条件，采集高分辨质谱数据，结合同位数分析推测五倍子药材中化合物的分子式，结合参考文献和相关对照品比对，对其共有峰进行归属。其中峰2、峰3、峰10的保留时间及紫外光谱分别与参照物中没食子酸、没食子酸甲酯、五没食子酸酰基葡萄糖，故供试品指纹图谱中峰2、峰3、峰10分别鉴定为没食子酸、没食子酸甲酯、五没食子酸酰基葡萄糖，见图9。此外，采用液质联用指认了7个共有峰，结果见表8。
表7其他色谱峰液质分析结果(肚倍药材)
Figure BDA0002187802370000141
Figure BDA0002187802370000151
表8其他色谱峰液质分析结果(角倍药材)
Figure BDA0002187802370000152
实施例二指纹图谱构建方法的方法学验证
(1)整体性考察
在相同的色谱条件上，保持同一梯度，洗脱时间延长一倍，记录色谱图，100分钟后无明显色谱峰流出，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则，结果见图10。
(2)精密度考察
取实施例1中同一供试品溶液，连续进样6次，用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.990，结果参见表8，表明仪器方法稳定，精密度良好。
表9精密度结果
Figure BDA0002187802370000161
(3)重复性考察
取实施例1中同一批次五倍子药材粉末，精密称取6份，按实施例1供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，结果参见表9，表明所述构建方法重复性良好。
表10重复性结果
Figure BDA0002187802370000162
(4)稳定性考察
取实施例1中同一供试品溶液，分别于0,2,4,6,8,10,12h进样分析，用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.990，结果参见表10，表明供试品溶液至少在12小时内稳定。
表11稳定性结果
Figure BDA0002187802370000171
注：表11中WDX0H-WDH12H，分别代表稳定性0小时～稳定性12小时
(5)耐用性考察
1)不同色谱柱的考察
比较了4种色谱柱，分别是：Waters ACQUITY BEH Shield RP18(100×2.1mm，1.7μm)(Ser.No：01733805218321)、Waters ACQUITY BEH Shield RP18(100×2.1mm，1.7μm)(Ser.No：01733805218379)、Waters ACQUITY
Figure BDA0002187802370000173
BEH C18(Waters,100×2.1mm,1.7μm)、ACQUITY
Figure BDA0002187802370000172
CORTECS T3(Waters,100×2.1mm,1.6μm)四根色谱柱对五倍子药材特征图谱耐用性的影响
结果见图11，表明采用其他型号色谱柱，易出现包峰现象，因此建议本发明采用型号为Waters ACQUITY BEH Shield RP18(100×2.1mm，1.7μm)超高效液相色谱柱。
2)不同温度考察
采用Waters ACQUITY BEH Shield RP18(100×2.1mm，1.7μm)色谱柱，分别考察了柱温为20℃、25℃和30℃时的样品分离效果。
结果见图12，柱温为20℃、25℃、30℃时样品分离效果较好。
3)不同流速考察
采用Waters ACQUITY BEH Shield RP18(100×2.1mm，1.7μm)色谱柱，分别考察了流速为0.28ml/min、0.30ml/min及0.32ml/min时样品分离效果。
结果见图13，流速为0.28ml/min、0.30ml/min、0.32ml/min时，样品均能得到较好的分离。
以上实施例仅用于阐明本发明的若干实施方案，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明的范围产生任何限制。应当明确的是，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种五倍子药材的超高效液相色谱指纹图谱的构建方法，其包括下列步骤：
1)制备五倍子药材的多个供试品溶液以及指标性成分的对照品溶液；所述指标性成分为没食子酸、没食子酸甲酯、五没食子酸酰基葡萄糖；所述供试品溶液的制备包括取五倍子药材，加甲醇提取；
2)将步骤1)中制备的供试品溶液以及对照品溶液分别进行超高效液相色谱分析，得到相应的超高效液相色谱图；测定多批五倍子药材，并进行分析比较，得到其共有峰的超高效液相色谱指纹图谱；
所述超高效液相色谱分析的条件如下：采用Water ACQUITY BEH Shield RP18色谱柱,粒径为1.7μm；以甲醇为流动相A，以0.05体积％-0.2体积％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为273nm或280nm；所述梯度洗脱的程序如下：
0min→15min→20min→25min→35min→45min→55min→56min，流动相A：10％→30％→31％→33％→38％→45％→63％→10％。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：
所述方法还包括步骤3)采用液质联用技术，按照步骤2)的超高效液相色谱条件，采集质谱数据，对其共有峰进行归属。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：
步骤1)供试品溶液的制备中提取时间为15-60min。
4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：步骤1)供试品溶液的制备中提取方式为超声处理或振摇提取或加热回流。
5.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：
所述流动相B选自0.1体积％磷酸水溶液。
6.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：
所述超高效液相色谱分析的条件还包括柱温为20-30℃；流速为0.25-0.35ml/min。
7.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：
步骤1)制备肚倍药材的多个供试品溶液，步骤2)得到的包含14个共有峰的超高效液相色谱指纹图谱，以峰2没食子酸为参照峰，各峰相对保留时间应在规定值的±5％之内，各峰的规定值分别为：峰1:0.67、峰2：1.00、峰3：2.42、峰4：3.54、峰5：4.37、峰6：5.17、峰7：5.52、峰8：6.84、峰9：7.69、峰10：8.35、峰11：10.28、峰12：10.78、峰13：11.61、峰14：14.29。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：
所述14个共有峰中，峰2为没食子酸、峰3为没食子酸甲酯、峰14为五没食子酸酰基葡萄糖。
9.根据权利要求1或2任一项所述的构建方法，其特征在于：
步骤1)制备角倍药材的多个供试品溶液，步骤2)得到的包含10个共有峰的超高效液相色谱指纹图谱，以峰2没食子酸为参照峰，各峰相对保留时间应在规定值的±5％之内，各峰的规定值分别为：峰1:0.66、峰2：1.00、峰3：2.34、峰4：3.43、峰5：5.00、峰6：5.29、峰7：6.55、峰8：7.95、峰9：9.69、峰10：13.52。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于：所述10个共有峰中，峰2为没食子酸、峰3为没食子酸甲酯，峰10为五没食子酸酰基葡萄糖。
11.根据权利要求1～10任一项所述的构建方法获得的五倍子药材的超高效液相色谱指纹图谱在五倍子药材以及含五倍子药材的制剂的检测中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用 ，其特征在于，对于17批肚倍药材进行检测，相似度在0.940以上；对于7批角肚药材进行检测，相似度在0.920以上。
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