CN112442473A - 一种禽大肠杆菌疫苗株 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种禽大肠杆菌疫苗株，是在筛选获得了一种新型的禽致病性大肠杆菌O78的基础上，通过去除aroA基因制备的弱毒株。本发明提供的禽大肠杆菌疫苗株，是将保藏编号为CCTCC M 2020382的禽致病性大肠杆菌(Escherichia coli)YBO78株的aroA基因进行缺失后制备的。本发明所提供的大肠杆菌疫苗YBO78‑1株可以通过传统的方法进行使用，比如通过经济易操作的喷雾和饮用水进行大规模的施用，也可以通过肌肉注射或其他的方式进行施用。

Description

一种禽大肠杆菌疫苗株

技术领域

本发明属于兽医生物制品技术领域，具体涉及一种禽大肠杆菌疫苗株。

背景技术

禽大肠杆菌病是一种经济上重要的传染病家禽疾病，病原是禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)。APEC通常存在于家禽和野生鸟类肠道和其他黏膜的表面，包含有O1、O2、O78、O8和O35等血清型，其中O78血清型是临床分离中最常见的血清型。家禽中大肠杆菌感染最严重的表现是败血病，通常始于原发性支原体或病毒感染后的上呼吸道感染，导致渗入血液和内脏，最终引起心包炎、肝炎、空气囊炎和输卵管炎等疾病。

禽大肠杆菌病发病时间快、死亡率高，目前养殖业中主要使用抗生素治疗细菌感染性疾病。但是在动物机体中长期使用低于治疗剂量的抗生素能大大加速耐药细菌的出现，如果耐药菌一旦在养殖动物中大范围传播，将使养殖动物成为很大的耐药基因储藏库。因此通过疫苗来预防，利用非抗生素方法防控APEC将是未来发展的必然趋势，其中接种疫苗是有效防控禽大肠杆菌病发生和流行、减少禽产品污染及保证食品安全的重要途径。但是目前大肠杆菌疫苗多为灭活疫苗，制备成油乳剂疫苗和氢氧化铝胶疫苗，油乳疫苗副反应大，氢氧化铝胶疫苗免疫效果差，在市场中大肠杆菌灭活疫苗的使用效果均不理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种禽大肠杆菌疫苗株，是在筛选获得了一种新型的禽致病性大肠杆菌O78的基础上，通过去除aroA基因制备的弱毒株。该弱毒株保持了流行毒株大肠杆菌O78株所具备的天然的免疫原性，同时毒性明显致弱，能用于制备活疫苗。

本发明提供的禽大肠杆菌疫苗株，是将保藏编号为CCTCC M 2020382的禽致病性大肠杆菌(Escherichia coli)YBO78株的aroA基因进行缺失后制备的；

YBO78株于2020年7月31日保藏在位于武汉市武昌珞珈山的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020382。

本发明所提供的疫苗株用于制备疫苗；

所述的疫苗，优选为活疫苗。

本发明所提供的大肠杆菌疫苗YBO78-1株可以通过传统的方法进行使用，比如通过经济易操作的喷雾和饮用水进行大规模的施用，也可以通过肌肉注射或其他的方式进行施用。

附图说明

图1：PCR鉴定大肠杆菌O78和O78 aroA基因敲除株图。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如A newlogic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli(zhang etal.,Nature genetics 1998)，Rapid modification of bacterial artificialchromosomes by ET-recombination(Muyrers et al.,Nucleic acids research 1993)中所记载的方法。

细菌的aroA基因编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶的合成，该酶对于细菌芳香族氨基酸等芳香族化合物的合成代谢具有十分重要的意义，该基因缺失后会阻断细菌体内的芳香族生物合成途径。

Red/ET同源重组技术来源于lamda噬菌体，可以用于大肠杆菌基因组的基因敲除、***、点突变等，利用Red/ET同源重组技术构建致病性大肠杆菌aroA基因缺失株，在其生物学特性和致病力基础上评估该基因缺失菌株作为疫苗候选株的潜力。

本发明所提供的禽大肠杆菌YBO78是从青岛某大型鸡场大肠杆菌发病鸡器官组织中筛选培养获得的一株强毒株；YBO78-1是通过Red/ET同源重组***得到的O78株aroA基因缺失株，导致毒力减弱，使用该菌来制备活疫苗，从而对鸡提供更完善的免疫保护。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：菌株的分离纯化及理化性质分析

1)2018年6月山东某个鸡养殖场发生了严重的大肠杆菌疫情，通过采集病死鸡的器官心脏、肝脏、脾脏等，置于采样袋中密封，带回实验室置于4℃冰盒保存备用。

2)把收集的鸡器官研磨后涂在显色培养基上，显示不同颜色的菌株，每3个显示不同颜色的菌株作为一组接种到LB液体培养基进行扩大培养，10000rpm离心收集菌体，然后把菌体用0.5％无菌的PBS重悬，用比浊法将菌株的细菌浓度定为1×10⁷CFU/ml。

3)强毒分离实验：

将分离得到的菌株分别在普通肉汤培养基中37培养24h，分别按菌数1.0x10⁶/ml配成菌液，把40只1日龄的鸡随机分成4组，每组10只，每组鸡腹腔注射一种血清型菌株的菌液0.2ml/只，对照组注射0.2ml/只普通肉汤，接种后隔离器中观察72h，记录鸡的死亡数并从其肝和脾中分离细菌，然后把存活的鸡解剖观察病变情况(表1)。

表1：大肠杆菌O1、O2、O78攻击1日龄鸡实验表

药物名称	O1	O2	O78
				死亡数	7	8	10
存活数	3	2	0

4)使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌的DNA，利用16S rRNA细菌鉴定的通用引物1492F(5-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3)和27F(5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3)进行高保真PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳回收后切取目的条带、产物送到上海生工生物有限公司测序，并对测序结果进行NCBI blast分析，其中16S rRNA序列如下(SEQ ID NO:1)：

TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAAGCTTGCTTCTTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGCATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCTGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCGTCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCACACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTCGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGC。

确定分离的菌为大肠杆菌，然后利用血清型检测证实所筛选的菌株为大肠杆菌01、O2、O78三种血清型的禽致病性大肠杆菌。实验结果分离到的血清型为O78的大肠杆菌为强毒株，命名大肠杆菌YBO78。YBO78株于2020年7月31日保藏在位于武汉市武昌珞珈山的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020382。

5)药物敏感试验

药敏试验采用纸片法，将培养好的菌株用生理盐水稀释为1×10¹⁰CFU/ml后，吸取0.1ml菌液均匀涂布于营养琼脂培养基上；用无菌镊子夹取药敏纸片贴于平板(6张/板，相隔不少于3cm)，置于37℃培养24h后观察结果，用游标卡尺测量抑菌圈大小(表2)。药物敏感性实验表明YBO78株对卡那霉素和氯霉素敏感，而对阿莫西林、链霉素、头孢咪唑等抗生素具有耐药性。

表2：分离出的YBO78药物敏感性实验表

注：药敏试验判断标准：Φ抑菌圈直径，Ф＞19mm为高度敏感，15mm≤Ф≤19mm为中度敏感，Ф＜15mm为耐药。

实施例2：禽大肠杆菌YBO78的aroA基因的敲除和检测

1)根据NCBI GenBank上禽大肠杆菌O78的aroA基因序列，设计测序引物(表3)，PCR扩增临床分离株YBO78 aroA基因，测序鉴定。

表3：测序引物的序列信息表

上游测序引物	下游测序引物
		O78-seq-F1	O78-seq-R1
O78-seq-F2	O78-seq-R2
		O78-seq-F3	O78-seq-R3

2)根据测序结果设计aroA基因敲除的引物(表4)。

表4：aroA基因敲除的引物序列表

3)构建重组质粒pSC101-BAD-gbaA-cm，测序正确后电转到大肠杆菌YBO78菌中。

4)***糖诱导，把卡那霉素基因盒loxp-kan-loxp电转到大肠杆菌YBO78中置换aroA基因，涂在卡那霉素抗性平板上。筛选阳性克隆，提取基因组，PCR，测序鉴定。挑取正确的单克隆命名为O78-loxp-kan-loxp。

5)把重组质粒pSC101-BAD-cre-cm电转进O78-loxp-kan-loxp菌中，涂在氯霉素平板上。

6)加入1mM***糖诱导cre酶的表达，cre酶识别卡那基因盒两侧的loxp位点，从而删除中间的kan基因，过夜培养后涂在无抗的平板上，挑取单克隆提基因组检测。

7)通过PCR特异性检测以及DNA测序结果，验证大肠杆菌aroA缺失株是否构建成功。

8)测序验证正确的菌株进行多次传代，取性状稳定的为待筛选的疫苗株，命名为YBO78-1(图1)。

YBO78-1株于2020年7月31日保藏在位于武汉市武昌珞珈山的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020383。

实施例4：YBO78-1株的生物安全性评价

首先将大肠杆菌YBO78-1株划线接种到无抗LB固体平板培养基上，37℃培养过夜培养，然后挑选单个菌落到接种到50ml无抗LB液体培养基，放置在小型振荡器中，37℃，200rpm培养过夜后，10000rpm离心1min后收集沉淀，沉淀用无菌PBS进行重悬，把菌悬液进行活菌计数，准备进行后续的动物注射感染实验。

选取30日龄的SPF鸡25只，随机分为5组，每组5只。将YBO78-1菌液稀释为1.0×10⁸CFU/ml、2.0×10⁸CFU/ml、4.0×10⁸CFU/ml、8.0×10⁸CFU/ml四种不同的梯度，分别接种5只试验SPF 1.0ml/只，另外1组注射分离的野生YBO78株1.0ml作为对照。

隔离器中观察14天，记录临床发病情况。结果表明注射分离的对照组野生YBO78株的SPF鸡在24小时内有一只鸡死亡，剩余四只鸡在72小时内全部死亡；而实验组1.0×10⁸CFU/ml、2.0×10⁸CFU/ml、4.0×10⁸CFU/ml、8.0×10⁸CFU/ml四种不同浓度均未导致SPF鸡发病(表5)。

表5：禽大肠杆菌YBO78-1株的毒力检测实验表

上述结果表明，禽大肠杆菌YBO78-1株的菌数即使达到8.0×10⁸CFU也没有引起鸡的发病，而对照组的注射量为1.0×10⁸CFU时引起鸡发病，并且全部死亡，表明本发明所筛选的菌株YBO78-1具有很好的生物安全性。

实施例5：使用禽大肠杆菌YBO78-1株制备疫苗

1)制备活疫苗：

把禽大肠杆菌YBO78-1划线于改良马丁平板上，37℃静置培养20-24h，取出备用。从上培养好的平板菌种中，挑取2-3个菌落于试管液体培养基中，倾斜45°固定在摇床中，37℃，200rpm震荡培养过夜(12-16h)，取出备用。按2％的比例，将上培养的菌液接种于三角瓶培养基中(挡板三角瓶，300ml/瓶)，各培养1瓶。37℃，200rpm震荡培养5h，取出菌液。按菌液:保护剂为9:1的比例加入冻干保护剂，冻干保存菌种，对冻干菌种进行活菌计数，用改良马丁肉汤稀释后，1ml/羽。

2)疫苗的免疫效果

将30日龄的SPF鸡随机分成四组，每组10只；其中实验组共30只，对照组10只。分别用YBO78-1疫苗株肌肉注射30只SPF鸡，对照组肌肉注射生理盐水，隔离器中饲养观察14天，然后分别对实验组和对照组用野生型O78进行攻毒实验。

隔离器中饲养观察14天，记录各组试验鸡的发病和死亡情况。实验结果如下表6所示。

表6：使用YBO78-1疫苗株免疫效果数据表

上述实验结果表明，本发明的YBO78-1株制备的疫苗能对野生YBO78株的感染提供完全的保护，该组实验动物未表现任何临床症状，也无死亡现象。

为了检测YBO78-1疫苗株对不同血清型的大肠杆菌交叉免疫效力，分别把SPF鸡用YBO78-1疫苗株制备的疫苗免疫后分别用O1、O2、O8和O35等血清型的大肠杆菌进行攻毒保护实验，隔离器中饲养观察14天，记录各组试验鸡的发病和死亡情况。实验结果如下表7所示。

表7：使用YBO78-1疫苗株交叉免疫效果数据表

组别	攻毒途径	攻毒数量(只)	存活数量(只)	存活率(％)
					O1	肌肉注射	10	8	80
O2	肌肉注射	10	9	90
					O8	肌肉注射	10	9	90
O35	肌肉注射	10	9	90

上述实验结果表明，本发明的YBO78-1株制备的疫苗能对市场上分离到的大肠杆菌O1、O2、O8和O35菌株的感染提供较好的交叉保护。

为了检测YBO78-1疫苗株接种方式是否影响免疫效果，分别选择肌肉注射、喷雾、饮水三种接种方式进行疫苗免疫，14天后用野生株O78进行攻毒实验，隔离器中饲养观察14天，记录各组试验鸡的发病和死亡情况。实验结果如下表8所示。

表8：使用YBO78-1疫苗株不同接种方式的免疫效果数据表

组别	攻毒数量(只)	存活数量(只)	存活率(％)
				肌肉注射	10	10	100
喷雾	10	10	100
				饮水	10	10	100

上述实验结果表明，本发明的YBO78-1株制备的疫苗株可以使用肌肉注射、喷雾和饮水三种接种方式，均能对野生YBO78株的感染提供完全的保护，该组实验动物未表现任何临床症状，也无死亡现象。

为了评价本发明的YBO78-1疫苗株与国内外市场现售的大肠杆菌疫苗免疫效果，以硕腾公司的大肠杆菌疫苗

E.coli为对照组进行比较。分别用YBO78-1疫苗株和

E.coli对SPF鸡进行免疫，14天后用野生株O78进行攻毒实验，隔离器中饲养观察14天，记录各组试验鸡的发病和死亡情况。实验结果如下表9所示。

表9：使用YBO78-1疫苗株与

E.coli免疫效果数据表

上述实验结果表明，本发明的YBO78-1株制备的疫苗株和市售的疫苗

E.coli均能对野生YBO78株的感染提供保护，疫苗

E.coli无法提供完全的保护(9/10)，但是本发明的YBO78-1制备的疫苗株能够提供完全的保护(10/10)，并且该组实验动物未表现任何临床症状，也无死亡现象。

综上所述，本发明所人工改造的禽大肠杆菌YBO78-1株，具有良好的免疫原性，做成活疫苗免疫动物发现，该疫苗对鸡只安全，能够诱导产生较高的中和抗体，并且能够保护当前流行的大肠杆菌O78和O1等血清型强毒株的攻击，产生理想的保护效果，有广阔的应用前景。

序列表

<110> 青岛易邦生物工程有限公司

<120> 一种禽大肠杆菌疫苗株

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcagtcgaa cggtaacagg aagcaagctt gcttcttcgc tgacgagtgg cggacgggtg 60

agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg gggataacta ctggaaacgg tagctaatac 120

cgcataacgt cgcaagacca aagaggggga ccttcgggcc tcttgccatc gcatgtgccc 180

agatgggatt agctagtagg tggggtaacg gctcacctag gcgacgatcc ctagctggtc 240

tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc 300

agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt gtatgaagaa 360

ggccttcggg ttgtaaagta ctttctgcgg ggaggaaggg agtaaagtta atacctttgc 420

tcattgacgt tacccgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata 480

cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggtttgtta 540

agtcagatgt gaaatccccg ggctcaacct gggaactgcg tctgatactg gcaagcttga 600

gtctcgtaga ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa atgcgtagag atctggagga 660

ataccggtgg cgaaggcggc cccctggacg aagactgacg ctcaggtgcg aaagcgtggg 720

gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcga cttggaggtt 780

gtgcccttga ggcgtggctt ccggagctaa cgcgttaagt cgaccgcctg gggagtacgg 840

ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccaca caagcggtgg agcatgtggt 900

ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tggtcttgac atccacagaa ctttccagag 960

atggattggt gccttcggga actgtgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020

tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tatcctttgt tgccagcggt 1080

ccggccggga actcaaagga gactgccagt gataaactgg aggaaggtgg ggatgacgtc 1140

aagtcatcat ggcccttacg accagggcta cacacgtgct acaatggcgc atacaaagag 1200

aagcgacctc gcgagagcaa gcggacctca taaagtgcgt cgtagtccgg attggagtct 1260

gcaactcgac tccatgaagt cggaatcgct cgtaatcgtg gatcagaatg ccacggtgaa 1320

tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt gcaaaagaag 1380

taggtagctt aaccttcggg agggcgc 1407

Claims (4)

1.一种禽大肠杆菌疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是将保藏编号为CCTCCM2020382的禽致病性大肠杆菌的aroA基因进行缺失后制备的。

2.如权利要求1所述的禽大肠杆菌疫苗株，其特征在于，所述的保藏编号为CCTCCM2020382的禽致病性大肠杆菌为大肠杆菌YBO78株。

3.权利要求1所述的禽大肠杆菌疫苗株在制备疫苗中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为为活疫苗。

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