CN112424596B - 生物膜磷酸肌醇的分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种能够在不将磷酸肌醇进行脱酰基化的情况下分离磷酸肌醇的异构体的生物膜磷酸肌醇的分离方法。此分离方法至少包括分离步骤，在包括分离管柱的超临界流体色谱仪的分析流路中注入包含多种磷酸肌醇的试样，所述分离管柱在内部填充有包含β‑环糊精的分离介质，且利用超临界流体色谱法来将所述多种磷酸肌醇相互分离。

Description

生物膜磷酸肌醇的分离方法
技术领域
本发明涉及一种生物膜磷酸肌醇的分离方法，所述生物膜磷酸肌醇是磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)的肌醇(inositol)环的3,4,5位羟基受到磷酸化的磷脂质。
背景技术
如图1所示，磷酸肌醇(phosphoinositide)(以下，PIPs)中，存在受到磷酸化的数量或位置彼此不同的PI(3)P、PI(4)P、PI(5)P、PI(3,4)P2、PI(3,5)P2、PI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3这7种。
在二酰基甘油(diacyl glycerol，DG)相同的情况下，PI(3)P、PI(4)P、PI(5)P这3种、PI(3,4)P2、PI(3,5)P2、PI(4,5)P2这3种分别为异构体且具有相同的质量，因此为了将7种PIPs各别地定量，而需要利用色谱法来分离所述异构体。
然而，利用色谱法来分离PIPs的异构体的方法并未确立。因此，迄今为止，采用不将PIPs的异构体分离而一起定量的方法、或将PIPs的二酰基甘油切断(脱酰基化)而使用肌醇环部分来分离异构体的方法(参照非专利文献1、非专利文献2)。
[现有技术文献]
[非专利文献]
非专利文献1：《使用质谱仪的肌醇磷脂质的一齐定量分析法的开发》，中西广树、佐佐木纯子、佐佐木雄彦等人，脂质生物化学研究，第54卷第88页～第89页，2012年
非专利文献2：《用于微量脂质成分测定的质谱技术的现状》，田口良、中西广树，实验医学第28卷第20期(增刊)，2010年
发明内容
[发明所要解决的问题]
不将PIPs的异构体分离而一起定量的方法中，将PI(3)P、PI(4)P、PI(5)P设为PIP1，将PI(3,4)P2、PI(3,5)P2、PI(4,5)P2设为PIP2，对二酰基甘油(DG)的不同种类进行定量。因此，无法对每种异构体进行定量。
另外，将PIPs进行脱酰基化而使用肌醇环部分来分离异构体的方法中，能够对每个肌醇环部分进行定量，另一方面，无法获得与DG相关的信息。
本发明的目的在于提供一种能够在不将PIPs进行脱酰基化的情况下分离PIPs的异构体的分离方法。
[解决问题的技术手段]
本发明者们发现，通过超临界流体色谱法，能够在不进行脱酰基化的情况下分离PIPs的异构体，所述超临界流体色谱法使用如下分离管柱，即，填充有在载体上结合有β-环糊精的分离介质的分离管柱。认为其原因在于，在分子形状识别能力比液相色谱法高的超临界色谱法中，通过使用包含β-环糊精的介质来作为分离介质，而如图4所示，对PIPs发挥疏水性相互作用、氢键合、包合、静电性相互作用等多种作用，迄今为止难以分离的非脱酰基化状态的PIPs的异构体相互分离。此外，图4的R1是包含烷基及极性基的间隔物。
即，本发明的PIPs的分离方法包括分离步骤，在包括分离管柱的超临界流体色谱仪的分析流路中注入包含多种PIPs的试样，所述分离管柱在内部填充有包含β-环糊精的分离介质，且利用超临界流体色谱法来将所述多种PIPs相互分离。
因此，本发明的分离方法适合于包含PIPs的多种异构体的试样的分离。
所谓所述多种异构体，是指PI(3)P、PI(4)P、PI(5)P、PI(3,4)P2、PI(3,5)P2、PI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3中的任一者。
优选为在所述分离步骤之前包括衍生化步骤，利用三甲基硅烷基-重氮甲烷，将试样中所含的所述多种PIPs的磷酸基进行衍生化；且在所述分离步骤之后包括检测步骤，利用质谱仪来分别检测由所述分离管柱所分离的所述多种PIPs。如此一来，能够利用质谱仪，对包含经过分离管柱而分离的异构体的各PIPs进行定量分析，所述分离管柱在内部填充有包含β-环糊精的分离介质，因此能够实现试样中所含的多种PIPs的各别定量。
在所述分离步骤中，能够将甲酸甲醇水溶液用作改性剂。
[发明的效果]
本发明的PIPs的分离方法包括如下分离步骤，即，在包括分离管柱的超临界流体色谱仪的分析流路中注入包含多种PIPs的试样，所述分离管柱在内部填充有包含β-环糊精的分离介质，且利用超临界流体色谱法来将所述多种PIPs相互分离，故而能够在不进行脱酰基化的情况下分离PIPs的异构体。
附图说明
图1是表示磷脂酰肌醇及各PIPs的结构的结构式。
图2是表示超临界流体色谱仪的结构的流路结构图。
图3是表示PIPs的分离方法的一实施例的流程图。
图4是用以对包含β-环糊精的分离介质与PIPs之间的相互作用加以说明的图。
图5是以利用所述实施例的分离方法而获得的质谱仪的信号为基础的色谱图的一例。
符号的说明
2：分析流路
4、6、15：送液泵
8：试样注入部
10：分离管柱
12：背压控制器(BPR)
14：质谱仪(MS)
具体实施方式
以下，参照图式，对本发明的PIPs的分离方法的一实施例加以说明。
所述实施例的分离方法是使用超临界流体色谱仪(Supercritical FluidChromatograph)(以下，SFC)来实施。此实施例中使用的SFC如图2所示，包括：送液泵4、送液泵6，用以在分析流路2中输送二氧化碳与改性剂；试样注入部8，用以在二氧化碳与改性剂的混合流体所流通的分析流路2中注入试样；分离管柱10，用以将通过试样注入部8而注入的试样进行分离；背压控制器(Back Pressure Regulator，BPR)12，以至少在分离管柱10中流通的二氧化碳成为超临界状态的方式，将分析流路2内的压力控制为预定压力；泵15，输送用以灵敏度良好地进行检测的补给；以及质谱仪(Mass Spectrometry，MS)14，设置于BPR12的后段侧。
虽省略图示，但分离管柱10收纳于管柱烘箱内，固定地控制为所设定的温度。分离管柱10填充有能够包合有机物的环糊精结合于二氧化硅载体上的分离介质，例如，能够使用信和化工股份有限公司制造的奥创(ULTRON)AF-HILIC-CD。
为了能够利用所述SFC来对包含多种PIPs的试样进行分离分析，而将试样中的PIPs的磷酸基进行衍生化，成为能够利用MS 14来检测各PIPs的状态。
衍生化的处理例如能够通过以下(1)～(5)的次序来进行。
(1)在包含PIPs的试样溶液中添加2M的三甲基硅烷基-重氮甲烷己烷溶液。
(2)将添加有2M的三甲基硅烷基-重氮甲烷己烷溶液的试样溶液在室温下放置一定时间(例如10分钟)，进行衍生化反应。
(3)在氮气环境下向试样溶液中添加冰乙酸，使衍生化反应停止。
(4)将预定的洗涤液(例如氯仿：甲醇：水＝8：4：3的混合液)添加至试样溶液中并混合后，进行离心分离而回收下层。也可将同样的洗涤反复进行多次。最后在试样溶液中添加甲醇：水＝9：1的溶液。
(5)在氮气环境下使试样溶液干燥凝固。然后，在试样中添加预定量的甲醇，利用超声波使其溶解。进而将预定量的水添加至试样中。
如上所述的PIPs的衍生化公开于论文“《利用质谱法的细胞与组织中的PtdInsP3分子种类的定量(Quantification of PtdInsP3 molecular species in cells andtissues by mass spectrometry)》，乔纳森·克拉克(Jonathan CLark)、凯伦·E·安德森(Karen E Anderson)、维罗妮克·朱文(Veronique Juvin)、特雷弗·S·史密斯(Trevor SSmith)、弗雷德里克·卡普(Fredrik Karpe)、迈克尔·J·O·韦克兰(Michael J OWakelam)、兰·R·史蒂芬斯(Len R Stephens)与菲利普·T·霍金斯(Phillip THawkins)”。
超临界流体色谱法的改性剂能够使用0.1％甲酸甲醇与水的混合液(例如甲酸甲醇：水＝97.5：2.5)。另外，能够使用包含甲酸或甲酸铵的甲醇(例如0.1％甲酸甲醇)来作为改性剂。
即，所述实施例的PIPs的分离方法如图3的流程图所示，在实施所述的衍生化处理之后(步骤S1)，通过试样注入部8将试样注入至SFC的分析流路2中(步骤S2)，利用填充有环糊精结合于二氧化硅载体上的分离介质的分离管柱10来分离PIPs的异构体(步骤S3)。进而，将在分离管柱10中分离的各PIPs依序导入至MS 14来进行检测(步骤S4)。
图5是将包含PI(3)P、PI(4)P、PI(5)P、PI(3,4)P2、PI(3,5)P2、PI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3这7种PIPs的试样，使用所述实施例的方法进行分析而获得的色谱图，横轴为时间，纵轴为信号强度。在所述分析中，使用信和化工股份有限公司制造的奥创(ULTRON)AF-HILIC-CD(内径为4.6mm，长度为250mm)作为分离管柱10，且将分离管柱10的设定温度设为4℃。另外，使用0.1％甲酸甲醇与水的混合液(例如甲酸甲醇：水＝97.5：2.5)来作为改性剂，使流动相中的改性剂浓度在0分钟～7分钟的时间带中变化为5％，在7.01分钟～10分钟的时间带中变化为30％，在10.01分钟～16分钟的时间带中变化为5％。将流动相的流量设为3mL/min，将补给的流量设为0.1mL/min，且将BPR 12的设定压力设为10MPa。
根据图5的色谱图可知，彼此为异构体的PI(3)P、PI(4)P、PI(5)P这3种、PI(3,4)P2、PI(3,5)P2、PI(4,5)P2这3种分别分离。PI(3)P、PI(4)P、PI(5)P这3种、PI(3,4)P2、PI(3,5)P2、PI(4,5)P2这3种分别具有相同的质量，但由于利用SFC来分离，故而能够利用MS 14来各别地检测各异构体并定量。
根据以上可知，能够利用包括分离管柱的SFC与MS的组合来进行7种PIPs的各别定量，所述分离管柱填充有环糊精结合于二氧化硅载体上的分离介质。

Claims (5)

1.一种生物膜磷酸肌醇的分离方法，包括分离步骤：在包括分离管柱的超临界流体色谱仪的分析流路中注入包含多种生物膜磷酸肌醇的试样，所述分离管柱在内部填充有包含β-环糊精的分离介质，且利用超临界流体色谱法来将所述多种生物膜磷酸肌醇相互分离，
其中在所述分离步骤之前包括衍生化步骤，利用三甲基硅烷基-重氮甲烷，将所述多种生物膜磷酸肌醇的磷酸基进行衍生化，且
在所述分离步骤中，使用包含甲酸或甲酸铵的甲醇用作改性剂。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其中所述多种生物膜磷酸肌醇包含生物膜磷酸肌醇的多种异构体。
3.根据权利要求2所述的分离方法，其中所述多种异构体为PI(3)P、PI(4)P、PI(5)P、PI(3,4)P2、PI(3,5)P2、PI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3中的任一者。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其中在所述分离步骤之后包括检测步骤：利用质谱仪，来分别检测由所述分离管柱所分离的所述多种生物膜磷酸肌醇。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其中在所述分离步骤中，将甲酸甲醇水溶液用作改性剂。
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