CN112424329A - 用于细胞成像、分析和测量的***和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于各种类型生物细胞的精确、高效和高通量成像、测量和分析以获得如细胞计数、细胞尺寸、细胞浓度、细胞亚群、细胞形态、细胞活力等信息的新型样品室、样品分析单元、多孔板、成像和分析***以及方法。
Description
优先权要求和相关专利申请
本申请要求2018年2月21日提交的美国临时申请序列号62/633,520、2018年5月18日提交的美国临时申请序列号62/673,204和2019年2月1日提交的美国临时申请序列号62/800,353的优先权权益，这些临时申请中的每一个的全部内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明总的涉及生物样品的测量和分析。更特别地，本发明涉及用于各种类型生物细胞的精确、高效和高通量成像、测量和分析的新型样品室、样品分析单元、多孔板、其***和方法，例如，细胞计数、细胞尺寸、细胞浓度、细胞亚群、细胞形态和细胞活力测量。
背景技术
医学诊断和生物医学研究领域的一个重要方面涉及通过生物样品如血液、脊髓液、细胞培养物和尿液的测试来检测、鉴定、定量和表征各种感兴趣的细胞和生物分子。医疗保健提供者和生物医学研究人员会常规地分析这样的生物样品的微观呈现、细胞计数以及细胞和生物分子的浓度。
例如，在临床实践中，各种血细胞如血红细胞和血白细胞的浓度可给出关于患者健康状况的关键信息。细胞计数是进行基于细胞的测定的重要参数。它被用来确定细胞培养的合适接种密度、基于蛋白质的测定的标准化或者确定下游测定如流式细胞术所需的细胞数。
传统上，细胞计数是在光学显微镜下用血细胞计数器手动进行的。在最近的十年中，自动细胞计数器已可得到并在生物学实验室中获得普及。这些细胞计数器主要用于单个样品检测并且需要操作员移动来向仪器中更换一次性载玻片。尽管该技术通过减少操作时间和操作员相关的变化而比手动计数有了重大改进，但当需要分析大量的样品时，它仍然需要大量时间。
在细胞疗法中，例如，细胞计数被用于控制施用给患者的细胞的剂量。细胞活力测量，即测量和计算死细胞和活细胞的分数，在分子生物学研究和临床诊断中都可能很重要。例如，细胞疗法研究和开发以及制造通常需要对来自小鼠或人类的10个或更多样品进行计数。由于对每个样品计数细胞需要1至2分钟，故50个人类外周血单核细胞(PBMC)样品大约需要1.5小时。ViCell或Cedex等仪器通过设备内置的液体处理***使样品制备步骤自动化。然而，每个样本仍需要2至3分钟，因此可能无法提供足够的节省时间的好处。
因此，持续需要允许对各种生物样品进行精确、高效和高通量成像、测量和分析的新型和改进的方法。
发明内容
本发明提供了适用于细胞计数、浓度、亚群、形态、活力、细胞周期、表面标记物等的高效、精确和高通量测量的独特设计的样品室、样品分析单元、多孔板和特殊配置的细胞计数***。多孔板被设计用于处理各种细胞类型和不同体积的样品以自动、精确地捕获和分析细胞图像。本发明尤其针对高通量细胞计数和基于细胞的测定。
在一个方面，本发明总的涉及一种样品分析单元。该样品分析单元包括：(a)用于制备用于分析的液体样品的混合孔；和(b)与混合孔空间邻近设置而在其间没有流体连通的样品室。样品室包括：(i)用于将用于分析的液体样品引入到样品室的入口；(ii)成像孔，其具有用于容留液体样品以便观察或分析的成像室和光学透明的窗口，其中所述成像室与所述入口流体连通，所述窗口适于观察或分析成像室内的液体样品；和(iii)用于空气逸出或液体样品流出的出口，其中所述出口与所述成像室流体连通。所述成像室的特征在于横贯光学透明窗口的至少一部分的高度均匀。混合孔和样品室一起形成样品分析单元。
在另一个方面，本发明总的涉及一种用于样品制备和分析的多孔板。所述板包括：(a)用于制备用于分析的液体样品的混合孔；和(b)与混合孔空间邻近设置而在其间没有流体连通的样品室。样品室包括：(i)用于将用于分析的液体样品引入到样品室的第一(或入口)孔；(ii)包括成像室的第二(或成像)孔，所述成像室用于容留液体样品以便观察或分析；和(iii)用于空气逸出或液体样品流出的第三(或出口)孔。成像室与第一(或入口)孔流体连通并具有适于观察或分析成像室内的液体样品的光学透明窗口。成像室的特征在于横贯光学透明窗口的至少一部分的高度均匀。第三(或出口)孔与成像室流体连通。混合孔和样品室一起形成多孔板的单元。
在还另一个方面，本发明总的涉及一种用于分析生物样品的***，其中所述***包括本文公开的多孔板。
在还另一个方面，本发明总的涉及一种用于制备和分析样品的方法。所述方法包括：在本文公开的多孔板的混合孔中制备用于分析的液体样品；将制备好的液体样品引入到样品室的第一(或入口)孔中，由此液体样品流动以填满第二(或成像)孔的成像室并流到样品室的第三(或出口)孔；和经由第二(或成像)孔的光学透明窗口分析液体样品。
在还另一个方面，本发明总的涉及一种样品室。所述样品室包括用于引入用于分析的液体样品的入口、成像孔和用于空气逸出或液体样品流出的出口。成像孔包括用于容留液体样品以便观察或分析的成像室和光学透明的窗口，其中所述成像室与所述入口流体连通，所述窗口适于观察或分析成像室内的液体样品。成像室的特征在于横贯光学透明窗口的至少一部分的高度均匀。所述出口与成像室流体连通。
在还另一个方面，本发明总的涉及一种样品分析单元、一种多孔板或一种包括本文公开的样品室的设备。
在还另一个方面，本发明总的涉及一种用于制备和分析样品的方法。所述方法包括：将液体样品引入到本文公开的样品室的入口中，由此液体样品流动以填满成像室并流到样品室的出口；和经由成像室的光学透明窗口分析液体样品。
附图说明
图1A-1C示意了根据本发明的一个实施方案的示例性细胞计数板。
图2A-2B示意了在添加细胞并与细胞混合之前具有染色剂(包括染料或标记物)(呈干燥形式)的混合孔的一个实施方案。
图3A-3B示意了填充有样品的示例性计数室，其中样品占据了入口孔、成像室和出口孔。
图4A-4B示意了具有由顶壁(天花板)和底壁(地板)之间的距离限定的均匀(A)或不均匀(B)深度(或高度)的示例性成像室。
图5A-5B示意了在成像室的底壁(地板)上具有参考标记物的示例性成像室。
图6A-6B示意了其中两个(A)或四个(B)单元共享一个共用的混合孔的示例性细胞计数板单元。
图7A-7B示出了一种实施本发明的某些方面的示例性***(A)，某些部件示意在(B)中。
图8A-8B示出了用一种示例性***在明场下获得的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的示例性图像(A)和数据(B)。
图9A-9B示出了用一种示例性***在明场下获得的活的CHO细胞和死的CHO细胞的示例性图像(A)和数据(B)。
图10A-10B示出了用一种示例性***在明场和绿色/红色荧光下获得的活的和死的外周血单核细胞(PBMC)的示例性图像(A)和数据(B)。
图11A-11B示出了用一种示例性***在明场和红色/绿色荧光下获得的活的和死的Jurkat细胞的示例性图像(A)和数据(B)。
具体实施方式
本发明的特征在于适用于细胞计数、浓度、亚群、形态、活力、细胞周期、表面标记物等的高效、精确和高通量测量的独特设计的样品室、样品分析单元、多孔板和细胞计数***。本发明的一个关键特征在于多孔板处理多种细胞类型和不同体积的样品并自动且精确地捕获和分析细胞图像的能力。
本发明的另一个关键特征在于实现高通量细胞计数和基于细胞的测定的***和方法。例如，根据本发明的一个实施方案，96孔板能够同时对24个样品进行自动细胞计数和分析。
图1A和图1B示意了本发明的一个示例性细胞计数板10，其由24组四孔单元组成，总共96个孔。如图1C中所示，每个单元100具有四个孔，包括用于混合细胞与染色剂(包括染料或标记物)的混合孔110和计数室120，计数室120由用于引入样品的入口孔(或引入端口)130、具有细胞成像室的成像孔140和出口孔(或空气逸出端口)150组成。
一起，所示意的示例性板10具有总共24个混合孔和24个计数室，允许同时分析和测量24个样品。细胞和染色剂混合孔110允许在经由入口孔130将样品引入到计数室120之前混合细胞与染色剂。图2A和图2B示出了在添加细胞并与细胞混合之前具有染色剂(呈干燥形式)的混合孔。在将细胞与染色剂混合之后，通过移液器(例如，单通道或多通道移液器)或液体处理器将样品转移到相应的入口孔130中。
图3A和图3B描绘了填充有样品的计数室120，其中样品占据了入口孔130、成像室145和出口孔150。室中的空气经由出口孔150离开成像室145。允许细胞在成像室145中沉降，观察、成像和/或测量可在这里进行。例如，可让细胞样品在成像室145中形成单层，在这里它们可通过显微镜可视化，使用明场、蓝色、绿色、红色和远红色荧光成像或分析。
如图4A中所示，成像室145通常具有由顶壁(天花板)146和底壁(地板)147之间的距离限定的均匀深度(或高度)。可在制造过程中控制成像室145的深度以具有任何合适的值，例如对于细菌、酵母菌或血小板，小于20μm，而对于球状体和胰岛细胞，至多1mm。应指出，成像室145可配置为具有两个或更多个具有不同深度(或高度)的区段或隔室，如图4B中所示意。
如图5A和图5B中所描绘，可在成像室145的顶壁(天花板)和/或底壁(地板)壁上提供参考对象170如计数网格、位置或自动聚焦标记。
在另一个实施方案中，如图6A中所示意，两个单元100和200共享一个共用的混合孔110。共享一个共用的混合孔的单元的数目可以是任何合适的数目，例如3或4个。图6B描绘了其中在四个单元之间共享一个共用的混合孔110的稍后配置(即，一个混合孔设置有四个计数室)。每个计数室可具有相同或不同的深度。
在某些实施方案中，单元100可还包括样品存储孔180和/或另外的混合孔190。
本发明的一个重要特征在于可容纳宽范围的样品体积而不影响测量精度。细胞计数板允许精确的细胞浓度测量和其他分析，而与用户吸移到样品入口孔中的体积无关，这为样品制备和处理提供了更大的灵活性。例如，通过吸移50μL至200μL之间的任何量的细胞样品，所得测量结果将保持一致(即，不受使用的实际样品体积影响)。
本发明的一个重要特征在于高通量细胞计数器仪器和相关软件。图7A中描绘了这样的***的一个实例。如图7B中所描绘，该示例性***对落射荧光通道采用透射明场通道、五个激发滤光器(375、475、530、540、630nm)和六个发射滤光器(450、525、600、610LP、660、695)。它还使用无限远校正光学物镜来实现高分辨率高质量成像。该示例性***允许X-Y-Z运动来成像和分析在标准微孔板(6-1536孔)、T25和T75烧瓶以及玻璃和腔室载玻片中的细胞。它将明场分析(锥虫蓝)的细胞计数时间改善至24个样品/分钟，并且将荧光分析(吖啶橙和碘化丙啶)的细胞计数时间改善至24个样品/3分钟。
另外，可将该仪器与液体处理器集成在一起以执行全自动的高通量细胞计数过程。
该示例性***由设计用于对不同的易耗品类型如本文公开的细胞计数板、6-1536孔的标准微孔板、载玻片、T75、T25烧瓶、腔室载玻片等进行成像和分析的软件构建。其可用来测量细胞浓度、细胞尺寸和形态如周长、圆形度、面积、长/短轴、紧密度、伸长率、偏心率、球形度、凸度、长宽比、坚固性。其可为基于荧光的测定法测量荧光强度。额外的附加件用于实现全自动化以与板处理器、液体处理器集成来进行高通量细胞计数和分析。
该软件分析捕获的图像以确定细胞浓度、细胞尺寸和形态、荧光标记群体百分数，如活力(吖啶橙、碘化丙啶(PI)、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst、7-氨基放线菌素D(7AAD)、Sytox Green、Sytox Red、DRAQ5/7、核绿/红/蓝/远红、锥虫蓝等)；转导效率(绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、mCherry、蓝色荧光蛋白(BFP)、mCardinal、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)等)；凋亡(膜联蛋白V-FITC、-PE和PI、或半胱天冬酶3/7)；自噬(LC3II-FITC、-GFP)；细胞周期(PI、Hoechst、DAPI、BrdU(溴脱氧尿苷)、EdU(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷))；衰老(Beta-Gal-Green)；生命力(钙黄绿素AM、CFDA-AM(5-羧基荧光素二乙酸酯乙酰氧基甲酯)、FDA(荧光素二乙酸酯)、CFDA)；ROS；线粒体电位与健康；表面标记物染色和细胞内染色。
根据本发明的***可设计为执行针对肿瘤学、免疫肿瘤学、病毒学、细胞疗法、细胞系发育、再生医学(干细胞研究)、酿造科学和可再生能源的测定。其可用来分析细胞系(NCI-60癌细胞等)、原代细胞(PBMC、脾细胞、白细胞分离术、单采、胸腺细胞)、干细胞、血小板、血红细胞、酵母菌、和藻类、CHO细胞等。该***可用来执行测定如细胞生长和增殖、活力、激活引起的细胞尺寸变化、转导效率、凋亡、自噬、细胞周期、衰老、ROS、线粒体电位和健康、表面标记物群体分析、细胞内染色群体分析等。
另外，***可根据尺寸、形态或荧光标记确定群体百分数。通过使用明场或任何其他荧光通道识别总细胞计数，可通过基于尺寸、形态或荧光标记比较细胞计数的数目或目标细胞群体的浓度来确定群体的比率。
在一个方面，本发明总的涉及一种样品分析单元。该样品分析单元包括：(a)用于制备用于分析的液体样品的混合孔；和(b)与混合孔空间邻近设置而在其间没有流体连通的样品室。样品室包括：(i)用于将用于分析的液体样品引入到样品室的入口；(ii)成像孔，其具有用于容留液体样品以便观察或分析的成像室和光学透明的窗口，其中所述成像室与所述入口流体连通，所述窗口适于观察或分析成像室内的液体样品；和(iii)用于空气逸出或液体样品流出的出口，其中所述出口与所述成像室流体连通。所述成像室的特征在于横贯光学透明窗口的至少一部分的高度均匀。混合孔和样品室一起形成样品分析单元。
在某些实施方案中，样品室包括：(ii)两个或更多个成像孔，每个成像孔具有用于容留液体样品以便观察或分析的成像室，其中所述成像室与所述入口流体连通；光学透明的窗口，所述窗口适于观察或分析所述成像室内的液体样品；和两个或更多个相应的用于空气逸出或液体样品流出的出口，每个出口与相应的成像室流体连通。所述成像室的特征在于横贯光学透明窗口的至少一部分的高度均匀。
在某些实施方案中，样品室包括一个入口、两个成像孔和两个出口。在某些实施方案中，样品室包括一个入口、四个成像孔和四个出口。
在样品分析单元的某些实施方案中，混合孔配置为具有约1μL至约500μL(例如，约1μL至约300μL、约1μL至约200μL、约1μL至约100μL、约1μL至约50μL、约1μL至约20μL、约1μL至约10μL、约10μL至约500μL、约50μL至约500μL、约100μL至约500μL、约10μL至约50μL、约50μL至约100μL、约20μL至约100μL、约50μL至约200μL)的容积。
在样品分析单元的某些实施方案中，样品室配置为具有约1μL至约500μL(例如，约1μL至约300μL、约1μL至约200μL、约1μL至约100μL、约1μL至约50μL、约1μL至约20μL、约1μL至约10μL、约10μL至约500μL、约50μL至约500μL、约100μL至约500μL、约10μL至约50μL、约50μL至约100μL、约20μL至约100μL、约50μL至约200μL)的容积。
在样品分析单元的某些实施方案中，成像室配置为具有约0.2μL至约10μL(例如，约0.2μL至约5μL、约0.2μL至约2μL、约0.2μL至约1μL、约0.2μL至约0.5μL、约0.5μL至约10μL、约1μL至约10μL、约2μL至约10μL、约5μL至约10μL、约0.5μL至约2μL、约2μL至约5μL)的容积。
在样品分析单元的某些实施方案中，成像室具有顶壁(天花板)和底壁(地板)并在其间有着均匀的高度(或深度)。
在样品分析单元的某些实施方案中，成像室具有顶壁(天花板)和底壁(地板)并在其间有着不均匀的高度(或深度)。
在样品分析单元的某些实施方案中，成像室包括顶壁(天花板)的第一部分和底壁(地板)的第一部分并在其间提供第一高度(或深度)，以及顶壁的第二部分和底壁(地板)的第二部分并在其间提供第二高度(或深度)。
样品分析单元中的成像室的高度可以是任何合适的值，例如，在约1μm至约1mm(例如，约1μm至约0.5mm、约1μm至约0.1mm、约1μm至约50μm、约1μm至约20μm、约1μm至约10μm、约5μm至约1mm、约10μm至约1mm、约0.1mm至约1mm、约0.5mm至约1mm、约2μm至约10μm、约10μm至约0.1mm)的范围内。
在某些实施方案中，所述高度在约1μm至约20μm(例如，约1μm至约5μm、约5μm至约10μm、约10μm至约15μm、约15μm至约20μm)的范围内。在某些实施方案中，所述高度在约20μm至约1mm(例如，约20μm至约0.1mm、约0.1mm至约0.5mm、约0.5mm至约1mm)的范围内。
在样品分析单元中的成像室的某些实施方案中，顶壁(天花板)和/或底壁(地板)具有一个或多个标记，例如，作为计数网格，以供参考或供自动聚焦。
在样品分析单元的某些实施方案中，成像室上的所述一个或多个标记具有在约0.1μm至约1mm(例如，约0.1μm至约1mm、约1μm至约1mm、约10μm至约1mm、约0.1mm至约1mm、约0.1μm至约0.1mm、约0.1μm至约10μm、约0.1μm至约1μm、约1μm至约10μm、约1μm至约25μm、约10μm至约0.1mm)的范围内的单元标记。在某些实施方案中，所述一个或多个标记具有在约1μm至约25μm(例如，约1μm至约5μm、约5μm至约10μm、约10μm至约25μm)的范围内的单元标记。
在样品分析单元的某些实施方案中，第一(或入口)孔在操作过程中对环境大气(例如，环境压力)开放。
在样品分析单元的某些实施方案中，第一(或入口)孔在操作过程中对环境大气(例如，环境压力)关闭。
在样品分析单元的某些实施方案中，第三(或出口)孔在操作过程中对环境大气(例如，环境压力)开放。
在样品分析单元的某些实施方案中，第三(或出口)孔在操作过程中对环境大气(例如，环境压力)关闭。
在样品分析单元的某些实施方案中，混合孔在其底部上具有呈干燥形式的染色剂。
在另一个方面，本发明总的涉及一种用于样品制备和分析的多孔板。所述板包括：(a)用于制备用于分析的液体样品的混合孔；和(b)与混合孔空间邻近设置而在其间没有流体连通的样品室。样品室包括：(i)用于将用于分析的液体样品引入到样品室的第一(或入口)孔；(ii)包括成像室的第二(或成像)孔，所述成像室用于容留液体样品以便观察或分析；和(iii)用于空气逸出或液体样品流出的第三(或出口)孔。成像室与第一(或入口)孔流体连通并具有适于观察或分析成像室内的液体样品的光学透明窗口。成像室的特征在于横贯光学透明窗口的至少一部分的高度均匀。第三(或出口)孔与成像室流体连通。混合孔和样品室一起形成多孔板的单元。
在某些实施方案中，多孔板由2个或更多个(例如，4、8、16、32、64、96个或更多个)多孔单元组成。在某些实施方案中，多孔板由96个或更多个(例如，192、384个或更多个)多孔单元组成。在某些实施方案中，多孔板由384个或更多个多孔单元组成。
应指出，在本发明的一个方面，具有混合孔、样品入口、成像区域和空气/流体出口的样品分析单元可被制造在各种基材如生物分子筛选学会(SBS)板、塑料或玻璃基材上。
在多孔板的某些实施方案中，样品室还包括：两个或更多个第二(或成像)孔和两个或更多个相应的用于空气逸出或液体样品流出的第三(或出口)孔。每个第二(或成像)孔包括用于容留液体样品以便观察或分析的成像室，其中所述成像室与第一(或入口)孔流体连通。每个第二(或成像)孔还包括光学透明的窗口，该窗口适于观察或分析所述成像室内的液体样品。成像室的特征在于横贯光学透明窗口的至少一部分的高度均匀。每个第三(或出口)孔与相应的成像室流体连通。
在某些实施方案中，样品室包括一个第一(或入口)孔、两个第二(或成像)孔和两个第三(或出口)孔。
在某些实施方案中，样品室包括一个第一(或入口)孔、四个第二(或成像)孔和四个第三(或出口)孔。
在多孔板的某些实施方案中，混合孔配置为具有约1μL至约500μL(例如，约1μL至约300μL、约1μL至约200μL、约1μL至约100μL、约1μL至约50μL、约1μL至约20μL、约1μL至约10μL、约10μL至约500μL、约50μL至约500μL、约100μL至约500μL、约10μL至约50μL、约50μL至约100μL、约20μL至约100μL、约50μL至约200μL)的容积。
在多孔板的某些实施方案中，样品室配置为具有约1μL至约500μL(例如，约1μL至约300μL、约1μL至约200μL、约1μL至约100μL、约1μL至约50μL、约1μL至约20μL、约1μL至约10μL、约10μL至约500μL、约50μL至约500μL、约100μL至约500μL、约10μL至约50μL、约50μL至约100μL、约20μL至约100μL、约50μL至约200μL)的容积。
在多孔板的某些实施方案中，成像室配置为具有约0.2μL至约10μL(例如，约0.2μL至约5μL、约0.2μL至约2μL、约0.2μL至约1μL、约0.2μL至约0.5μL、约0.5μL至约10μL、约1μL至约10μL、约2μL至约10μL、约5μL至约10μL、约0.5μL至约2μL、约2μL至约5μL)的容积。
在多孔板的某些实施方案中，成像室具有顶壁(天花板)和底壁(地板)并在其间有着均匀的高度(或深度)。
在多孔板的某些实施方案中，成像室具有顶壁(天花板)和底壁(地板)并在其间有着不均匀的高度(或深度)。
在多孔板的某些实施方案中，成像室包括顶壁(天花板)的第一部分和底壁(地板)的第一部分并在其间提供第一高度(或深度)，以及顶壁(天花板)的第二部分和底壁(地板)的第二部分并在其间提供第二高度(或深度)。
多孔板的成像室的高度可以是任何合适的值，例如在约1μm至约1mm(例如，约1μm至约0.5mm、约1μm至约0.1mm、约1μm至约50μm、约1μm至约20μm、约1μm至约10μm、约5μm至约1mm、约10μm至约1mm、约0.1mm至约1mm、约0.5mm至约1mm、约2μm至约10μm、约10μm至约0.1mm)的范围内。
在某些实施方案中，所述高度在约1μm至约20μm(例如，约1μm至约5μm、约5μm至约10μm、约10μm至约15μm、约15μm至约20μm)的范围内。在某些实施方案中，所述高度在约20μm至约1mm(例如，约20μm至约0.1mm、约0.1mm至约0.5mm、约0.5mm至约1mm)的范围内。
在成像室的某些实施方案中，顶壁(天花板)和/或底壁(地板)具有一个或多个标记，例如，作为计数网格，以供参考或供自动聚焦。
在某些实施方案中，所述一个或多个标记具有在约0.1μm至约1mm(例如，约0.1μm至约1mm、约1μm至约1mm、约10μm至约1mm、约0.1mm至约1mm、约0.1μm至约0.1mm、约0.1μm至约10μm、约0.1μm至约1μm、约1μm至约10μm、约1μm至约25μm、约10μm至约0.1mm)的范围内的单元标记。
在某些实施方案中，所述一个或多个标记具有在约1μm至约25μm(例如，约1μm至约5μm、约5μm至约10μm、约10μm至约25μm)的范围内的单元标记。
在多孔板的某些实施方案中，第一(或入口)孔在操作过程中对环境大气(例如，环境压力)开放。
在多孔板的某些实施方案中，第一(或入口)孔在操作过程中对环境大气(例如，环境压力)关闭。
在多孔板的某些实施方案中，第三(或出口)孔在操作过程中对环境大气(例如，环境压力)开放。
在多孔板的某些实施方案中，第三(或出口)孔在操作过程中对环境大气(例如，环境压力)关闭。
在多孔板的某些实施方案中，混合孔在其底部上具有呈干燥形式的染色剂。
在还另一个方面，本发明总的涉及一种用于分析生物样品的***，其中所述***包括本文公开的多孔板。
在某些实施方案中，所述***还包括：至少一个荧光光源；至少一个明场光源；至少一个用于使荧光光束和/或明场光束的光束变窄的光学***；检测设备；和计算单元。
在某些实施方案中，所述***包括两个或更多个荧光光源。
在某些实施方案中，所述***包括两个或更多个明场光源。
在还另一个方面，本发明总的涉及一种用于制备和分析样品的方法。所述方法包括：在本文公开的多孔板的混合孔中制备用于分析的液体样品；将制备好的液体样品引入到样品室的第一(或入口)孔中，由此液体样品流动以填满第二(或成像)孔的成像室并流到样品室的第三(或出口)孔；和经由第二(或成像)孔的光学透明窗口分析液体样品。
在某些实施方案中，液体样品具有选自以下的细胞：血红细胞、细菌、酵母菌、血小板、干细胞、胰岛细胞、藻类、原代细胞(PBMC、脾细胞、白细胞分离术、单采、胸腺细胞)、脾细胞、单采样品、和癌细胞(NCI-60细胞系)、中国仓鼠卵巢(CHO)和Jurkat细胞。
在所述方法的某些实施方案中，制备用于分析的液体样品包括将样品与染色剂(包括染料或标记物)混合。
在所述方法的某些实施方案中，染色剂选自吖啶橙、碘化丙啶、DAPI、Hoechst、7AAD、Sytox Green、Sytox Red、DRAQ5/7、核绿/红/蓝/远红、锥虫蓝、GFP、RFP、mCherry、BFP、mCardinal、YFP、CFP、膜联蛋白V-FITC、-PE和PI、半胱天冬酶3/7和别藻蓝蛋白(APC)。
在所述方法的某些实施方案中，分析液体样品包括获得液体样品的荧光和/或明场图像。
在所述方法的某些实施方案中，分析液体样品包括使用两个或更多个荧光光源获得液体样品的荧光图像。
在所述方法的某些实施方案中，分析液体样品包括使用两个或更多个明场光源获得液体样品的明场图像。
在某些实施方案中，所述方法包括同时对2个或更多个(例如，4、8、16个或更多个)样品进行样品制备、引入和/或分析。在某些实施方案中，所述方法包括同时对24个或更多个(例如，32、48、64个或更多个)样品进行样品制备、引入和/或分析。在某些实施方案中，所述方法包括同时对96个或更多个样品进行样品制备、引入和/或分析。在某些实施方案中，所述方法包括同时对384个或更多个样品进行样品制备、引入和/或分析。
在所述方法的某些实施方案中，分析液体样品包括获得液体样品中的计数数目、浓度、尺寸、形态、转导效率、凋亡、活力、细胞周期、细胞群体的表面标记和/或细胞群体比率中的一个或多个。
在所述方法的某些实施方案中，分析液体样品包括获得液体样品中荧光标记细胞群体的百分数或分数。
在所述方法的某些实施方案中，引入到样品室的第一(或入口)孔中的液体样品具有约20μL至约300μL(例如，约20μL至约100μL、约20μL至约50μL、约30μL至约300μL、约50μL至约300μL、约100μL至约300μL、约50μL至约100μL)之间的体积。
在所述方法的某些实施方案中，引入到样品室的第一(或入口)孔中的液体样品具有约50μL至约200μL(例如，约50μL至约100μL、约100μL至约150μL、约150μL至约200μL)之间的体积。
在还另一个方面，本发明总的涉及一种样品室。所述样品室包括用于引入用于分析的液体样品的入口、成像孔和用于空气逸出或液体样品流出的出口。成像孔包括用于容留液体样品以便观察或分析的成像室和光学透明的窗口，其中所述成像室与所述入口流体连通，所述窗口适于观察或分析成像室内的液体样品。成像室的特征在于横贯光学透明窗口的至少一部分的高度均匀。所述出口与成像室流体连通。
在样品室的某些实施方案中，成像室配置为具有约0.2μL至约10μL(例如，约0.2μL至约5μL、约0.2μL至约2μL、约0.2μL至约1μL、约0.2μL至约0.5μL、约0.5μL至约10μL、约1μL至约10μL、约2μL至约10μL、约5μL至约10μL、约0.5μL至约2μL、约2μL至约5μL)的容积。
在样品室的某些实施方案中，成像室包括顶壁和底壁并在其间有着均匀的高度(或深度)。在样品室的某些实施方案中，成像室包括顶壁和底壁并在其间有着不均匀的高度(或深度)。
在某些实施方案中，成像室包括顶壁的第一部分和底壁的第一部分并在其间提供第一高度(或深度)，以及顶壁的第二部分和底壁的第二部分并在其间提供第二高度(或深度)。在样品室的某些实施方案中，所述高度在约1μm至约1mm(例如，约1μm至约0.5mm、约1μm至约0.1mm、约1μm至约50μm、约1μm至约20μm、约1μm至约10μm、约5μm至约1mm、约10μm至约1mm、约0.1mm至约1mm、约0.5mm至约1mm、约2μm至约10μm、约10μm至约0.1mm)的范围内。
在样品室的某些实施方案中，所述高度在约1μm至约20μm(例如，约1μm至约5μm、约5μm至约10μm、约10μm至约15μm、约15μm至约20μm)的范围内。
在某些实施方案中，所述高度在约20μm至约1mm(例如，约20μm至约0.1mm、约0.1mm至约0.5mm、约0.5mm至约1mm)的范围内。在样品室的某些实施方案中，所述高度在约20μm至约1mm(例如，约20μm至约0.1mm、约0.1mm至约0.5mm、约0.5mm至约1mm)的范围内。
在样品室的某些实施方案中，成像室的顶壁(天花板)和/或底壁(地板)具有一个或多个标记，例如，作为计数网格，以供参考或供自动聚焦。
在某些实施方案中，所述一个或多个标记具有在约0.1μm至约1mm(例如，约0.1μm至约1mm、约1μm至约1mm、约10μm至约1mm、约0.1mm至约1mm、约0.1μm至约0.1mm、约0.1μm至约10μm、约0.1μm至约1μm、约1μm至约10μm、约1μm至约25μm、约10μm至约0.1mm)的范围内的单元标记。
在某些实施方案中，所述一个或多个标记具有在约1μm至约25μm(例如，约1μm至约5μm、约5μm至约10μm、约10μm至约25μm)的范围内的单元标记。
在样品室的某些实施方案中，入口在操作过程中对环境大气(例如，环境压力)开放。
在样品室的某些实施方案中，入口在操作过程中对环境大气(例如，环境压力)关闭。
在样品室的某些实施方案中，出口在操作过程中对环境大气(例如，环境压力)开放。
在样品室的某些实施方案中，出口在操作过程中对环境大气(例如，环境压力)关闭。
在还另一个方面，本发明总的涉及一种样品分析单元、一种多孔板或一种包括本文公开的样品室的设备。
在还另一个方面，本发明总的涉及一种用于制备和分析样品的方法。所述方法包括：将液体样品引入到本文公开的样品室的入口中，由此液体样品流动以填满成像室并流到样品室的出口；和经由成像室的光学透明窗口分析液体样品。
在某些实施方案中，所述方法还包括在将液体样品引入到样品室的入口中之前制备用于分析的液体样品。
在还另一个方面，本发明总的涉及一种用于分析生物样品的***，其中所述***包括本文公开的样品室。
在某些实施方案中，所述***还包括：至少一个荧光光源；至少一个明场光源；至少一个用于使荧光光束和/或明场光束的光束变窄的光学***；检测设备；和计算单元。
在某些实施方案中，所述***包括两个或更多个荧光光源。在某些实施方案中，所述***包括两个或更多个明场光源。
以下实施例旨在示意本发明的实施而不以任何方式进行限制。
实施例
已构建了示例性的***并用来验证用锥虫蓝染色的CHO细胞、用AOPI染色的PBMC和用AOPI染色的Jurkat细胞的计数。其用来验证该示例性***的细胞计数、细胞尺寸和活力测量及能力。
用手动移液进行CHO细胞计数
在补充了1X Glutamax和1X HT补充剂的CD CHO培养基(Gibco)中，于37℃和5％的CO2下培养CHO细胞。从烧瓶收集CHO细胞并倒入一次性槽中。使用多通道移液器(12-通道)向细胞计数板的样品引入端口中吸移50μL CHO细胞。重复该过程以填充所有24个计数室。然后使用示例性***来在每个计数室处使用明场成像并直接计数CHO细胞的数目，然后将其自动转换并输出细胞浓度作为结果以及输出细胞尺寸(图8A和8B)。
使用锥虫蓝和手动移液进行CHO细胞计数和活力测量
在补充了1X Glutamax和1X HT补充剂的CD CHO培养基(Gibco)中，于37℃和5％的CO2下培养CHO细胞。从烧瓶收集CHO细胞并倒入一次性槽中。使用多通道移液器(12-通道)向细胞计数板的混合孔中吸移50μL CHO细胞。接下来，也将锥虫蓝染色剂吸移到混合孔中使其与细胞的比率为1:1。向样品引入端口中吸移50μL经染色的CHO细胞。重复该过程以填充所有24个计数室。然后使用示例性***来在每个计数室处使用明场成像并直接计数活的CHO细胞和死的CHO细胞的数目，然后将其自动转换并输出细胞浓度、细胞尺寸和活力作为结果(图9A和9B)。
使用AOPI和液体处理器进行PBMC计数和活力测量
从患者采集PBMC并倒入一次性槽中。使用液体处理器将50μL PBMC与50μL AOPI混合在一个槽中。接下来，液体处理器吸出50μL经染色的PBMC并吸移到样品引入端口中。重复该过程以填充所有24个计数室。然后使用示例性***来在每个计数室处使用明场和绿色/红色荧光成像并直接计数活的和死的PBMC的数目，然后将其自动转换并输出细胞浓度、细胞尺寸和活力作为结果(图10A和10B)。
使用AOPI和液体处理器进行Jurkat细胞计数和活力测量
在补充了10％FBS和1％Pen/Strept的RPMI(Gibco)中，于37℃和5％的CO2下培养Jurkat细胞。收集Jurkat细胞并通过液体处理器吸出。使用液体处理器将50μL Jurkat细胞与50μL AOPI在细胞计数板上于混合孔中混合。接下来，液体处理器吸出50μL经染色的Jurkat细胞并吸移到样品引入端口中。重复该过程以填充所有24个计数室。然后使用示例性***来在每个计数室处使用明场和绿色/红色荧光成像并直接计数活的和死的Jurkat细胞的数目，然后将其自动转换并输出细胞浓度、尺寸和活力作为结果(图11A和11B)。
本文参考附图在优选的实施方案中描述了申请人的公开，在附图中，类似的数字表示相同或相似的要素。在整个说明书中提及的“一个实施方案(one embodiment)”、“实施方案(an embodiment)”或类似语言意思是结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书中出现的表述“在一个实施方案中”、“在实施方案中”和类似语言可以但不一定都指同一个实施方案。
在一个或多个实施方案中，可以任何合适的方式组合申请人的公开的所述特征、结构或特性。在本文的描述中，列举了许多具体细节来提供对本发明实施方案的透彻理解。然而，相关领域技术人员应认识到，可在没有一个或多个特定细节的情况下或者用其他方法、部件、材料等的情况下实施申请人的组合物和/或方法。在其他实例中，未详细示出或描述公知的结构、材料或操作以避免混淆本公开的方面。
在本说明书和附随的权利要求书中，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确指出除外。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本公开的实践或测试中，但现在描述了优选的方法和材料。除了所公开的特定顺序外，可以逻辑上可能的任何顺序执行本文叙述的方法。
通过引用并入
本公开中已参考和引用了其他文件，如专利、专利申请、专利公开、期刊、书籍、论文、网页内容。出于所有目的，所有这样的文件据此全文以引用方式并入本文。据称以引用方式并入本文但与本文明确阐述的现有定义、声明或其他公开材料相冲突的任何材料或其部分仅在不使所并入的材料与本公开材料之间发生冲突的程度下并入。在发生冲突的情况下，以有利于本公开作为优选公开地解决冲突。
等同物
代表性实施例旨在帮助示意本发明，而不旨在也不应解释为限制本发明的范围。实际上，除了本文示出和描述的那些外，根据本文件的全部内容，包括实施例及对本文包含的科学和专利文献的提及，本发明的各种修改及其许多其他实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。实施例含重要的附加信息、例证和指导，其可以其各种实施方案及其等同物适应于本发明的实施。
Claims (64)
1.一种样品分析单元，所述样品分析单元包括：
(a)用于制备用于分析的液体样品的混合孔；和
(b)与所述混合孔空间邻近设置而在其间没有流体连通的样品室，所述样品室包括：
(i)用于将所述用于分析的液体样品引入到所述样品室的入口；
(ii)成像孔，所述成像孔包括：
用于容留所述液体样品以便观察或分析的成像室，其中所述成像室与所述入口流体连通；
光学透明的窗口，所述窗口适于观察或分析所述成像室内的所述液体样品，
其中所述成像室的特征在于横贯所述光学透明窗口的至少一部分的高度均匀；和
(iii)用于空气逸出或所述液体样品流出的出口，其中所述出口与所述成像室流体连通，
其中所述混合孔和所述样品室一起形成所述样品分析单元。
2.根据权利要求1所述的样品分析单元，其中所述样品室包括：
(ii)两个或更多个成像孔，每个成像孔包括
用于容留所述液体样品以便观察或分析的成像室，其中所述成像室与所述入口流体连通；
光学透明的窗口，所述窗口适于观察或分析所述成像室内的所述液体样品，
其中所述成像室的特征在于横贯所述光学透明窗口的至少一部分的高度均匀；和
(iii)两个或更多个相应的用于空气逸出或所述液体样品流出的出口，每个出口与相应的成像室流体连通。
3.根据权利要求1或2所述的样品分析单元，其中所述样品室包括一个入口、两个成像孔和两个出口。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的样品分析单元，其中所述样品室包括一个入口、四个成像孔和四个出口。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的样品分析单元，其中所述混合孔配置为具有约1μL至约500μL的容积。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的样品分析单元，其中所述样品室配置为具有约1μL至约500μL的容积。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的样品分析单元，其中所述成像室配置为具有约0.2μL至约10μL的容积。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的样品分析单元，其中所述成像室包括顶壁和底壁并在其间有着均匀的高度(或深度)。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的样品分析单元，其中所述成像室包括顶壁和底壁并在其间有着不均匀的高度(或深度)。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的样品分析单元，其中所述成像室包括所述顶壁的第一部分和所述底壁的第一部分并在其间提供第一高度(或深度)，以及所述顶壁的第二部分和所述底壁的第二部分并在其间提供第二高度(或深度)。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的样品分析单元，其中所述高度在约1μm至约1mm的范围内。
12.根据权利要求11所述的样品分析单元，其中所述高度在约1μm至约20μm的范围内。
13.根据权利要求11所述的样品分析单元，其中所述高度在约20μm至约1mm的范围内。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的样品分析单元，其中所述成像室的所述顶壁和/或所述底壁包括一个或多个标记以计数网格、参考或自动聚焦。
15.根据权利要求14所述的样品分析单元，其中所述一个或多个标记具有在约0.1μm至约1mm的范围内的单元标记。
16.根据权利要求15所述的样品分析单元，其中所述一个或多个标记具有在约1μm至约25μm的范围内的单元标记。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的样品分析单元，其中所述入口在操作过程中对环境大气或压力开放。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的样品分析单元，其中所述出口在操作过程中对环境大气或压力开放。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的样品分析单元，其中所述混合孔包括在其上提供呈干燥形式的染色剂的底。
20.一种多孔板或设备，所述多孔板或设备包括根据权利要求1-19中任一项所述的样品分析单元。
21.一种用于样品制备和分析的多孔板，所述多孔板包括：
(a)用于制备用于分析的液体样品的混合孔；和
(b)与所述混合孔空间邻近设置而在其间没有流体连通的样品室，所述样品室包括：
(i)用于将所述用于分析的液体样品引入到所述样品室的第一(或入口)孔；
(ii)包括以下的第二(或成像)孔：
用于容留所述液体样品以便观察或分析的成像室，其中所述成像室与所述第一(或入口)孔流体连通；
光学透明的窗口，所述窗口适于观察或分析所述成像室内的所述液体样品，
其中所述成像室的特征在于横贯所述光学透明窗口的至少一部分的高度均匀；和
(iii)用于空气逸出或所述液体样品流出的第三(或出口)孔，其中所述第三(或出口)孔与所述成像室流体连通，
其中所述混合孔和所述样品室一起形成所述多孔板的单元。
22.根据权利要求21所述的多孔板，所述多孔板包括2个或更多个所述多孔单元。
23.根据权利要求21所述的多孔板，所述多孔板包括96个或更多个所述多孔单元。
24.根据权利要求21所述的多孔板，所述多孔板包括384个或更多个所述多孔单元。
25.一种用于分析生物样品的***，所述***包括根据权利要求1-24中任一项所述的样品分析单元或多孔板。
26.根据权利要求25所述的***，所述***还包括：
至少一个荧光光源；
至少一个明场光源；
至少一个用于使荧光光束和/或明场光束的光束变窄的光学***；
检测设备；和
计算单元。
27.根据权利要求25或26所述的***，所述***包括两个或更多个荧光光源。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的***，所述***包括两个或更多个明场光源。
29.一种用于制备和分析样品的方法，所述方法包括：
在根据权利要求1-24中任一项所述的混合孔中制备用于分析的液体样品；
将所述制备好的液体样品引入到所述样品室的所述第一(或入口)孔中，由此所述液体样品流动以填满所述第二(或成像)孔的所述成像室并流到所述样品室的所述第三(或出口)孔；和
经由所述第二(或成像)孔的所述光学透明窗口分析所述液体样品。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述液体样品包含选自以下的细胞：血红细胞、细菌、酵母菌、血小板、干细胞、胰岛细胞、藻类、原代细胞(PBMC、脾细胞、白细胞分离术、单采、胸腺细胞)、脾细胞、单采样品、CHO细胞和癌细胞(NCI-60细胞系)。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中制备用于分析的液体样品包括将样品与染色剂混合。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述染色剂选自吖啶橙、碘化丙啶、DAPI、Hoechst、7AAD、Sytox Green、Sytox Red、DRAQ5/7、核绿/红/蓝/远红、锥虫蓝、GFP、RFP、mCherry、BFP、mCardinal、YFP、CFP、膜联蛋白V-FITC、-PE和PI、半胱天冬酶3/7和APC。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的方法，其中分析所述液体样品包括获得所述液体样品的荧光和/或明场图像。
34.根据权利要求29-33中任一项所述的方法，其中分析所述液体样品包括使用两个或更多个荧光光源获得所述液体样品的荧光图像。
35.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其中分析所述液体样品包括使用两个或更多个明场光源获得所述液体样品的明场图像。
36.根据权利要求29-35中任一项所述的方法，所述方法包括同时对2个或更多个样品进行样品制备、引入和/或分析。
37.根据权利要求36所述的方法，所述方法包括同时对24个或更多个样品进行样品制备、引入和/或分析。
38.根据权利要求37所述的方法，所述方法包括同时对96个或更多个样品进行样品制备、引入和/或分析。
39.根据权利要求38所述的方法，所述方法包括同时对384个或更多个样品进行样品制备、引入和/或分析。
40.根据权利要求29-39中任一项所述的方法，其中分析所述液体样品包括获得所述液体样品中的计数数目、浓度、尺寸、形态、转导效率、凋亡、活力、细胞周期、细胞群体的表面标记和/或细胞群体比率中的一个或多个。
41.根据权利要求29-39中任一项所述的方法，其中分析所述液体样品包括获得所述液体样品中荧光标记细胞群体的百分数或分数。
42.根据权利要求29-39中任一项所述的方法，其中所述引入到所述样品室的所述第一(或入口)孔中的液体样品具有约20μL至约300μL的体积。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述引入到所述样品室的所述第一(或入口)孔中的液体样品具有约50μL至约200μL的体积。
44.根据权利要求29-43中任一项所述的方法，其中所述液体样品的分析结果不受引入到所述样品室中的液体样品的影响。
45.一种样品室，所述样品室包括：
用于引入用于分析的液体样品的入口；
包括以下的成像孔：
用于容留所述液体样品以便观察或分析的成像室，其中所述成像室与所述入口流体连通；
光学透明的窗口，所述窗口适于观察或分析所述成像室内的所述液体样品，
其中所述成像室的特征在于横贯所述光学透明窗口的至少一部分的高度均匀；和
用于空气逸出或所述液体样品流出的出口，其中所述出口与所述成像室流体连通。
46.根据权利要求45所述的样品室，其中所述成像室配置有具有约0.2μL至约10μL的体积。
47.根据权利要求45或46所述的样品室，其中所述成像室包括顶壁和底壁并在其间有着均匀的高度(或深度)。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的样品室，其中所述成像室包括顶壁和底壁并在其间有着不均匀的高度(或深度)。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的样品室，其中所述成像室包括所述顶壁的第一部分和所述底壁的第一部分并在其间提供第一高度(或深度)，以及所述顶壁的第二部分和所述底壁的第二部分并在其间提供第二高度(或深度)。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的样品室，其中所述高度在约1μm至约1mm的范围内。
51.根据权利要求50所述的样品室，其中所述高度在约1μm至约20μm的范围内。
52.根据权利要求50所述的样品室，其中所述高度在约20μm至约1mm的范围内。
53.根据权利要求45-52中任一项所述的样品室，其中所述成像室的所述顶壁和/或所述底壁包括一个或多个标记以计数网格、参考或自动聚焦。
54.根据权利要求53所述的样品室，其中所述一个或多个标记具有在约0.1μm至约1mm的范围内的单元标记。
55.根据权利要求54所述的样品室，其中所述一个或多个标记具有在约1μm至约25μm的范围内的单元标记。
56.根据权利要求45-55中任一项所述的样品室，其中所述入口在操作过程中对环境大气或压力开放。
57.根据权利要求45-56中任一项所述的样品室，其中所述出口在操作过程中对环境大气或压力开放。
58.包括根据权利要求45-57中任一项所述的样品室的样品分析单元、多孔板或设备。
59.一种用于制备和分析样品的方法，所述方法包括：
将液体样品引入到根据权利要求45-57中任一项所述的样品室的入口中，由此所述液体样品流动以填满所述成像室并流到所述样品室的所述出口；和
经由所述成像室的所述光学透明窗口分析所述液体样品。
60.根据权利要求59所述的方法，所述方法还包括在将所述液体样品引入到所述样品室的所述入口中之前，制备用于分析的液体样品。
61.一种用于分析生物样品的***，所述***包括根据权利要求45-57中任一项所述的样品室。
62.根据权利要求61所述的***，所述***还包括：
至少一个荧光光源；
至少一个明场光源；
至少一个用于使荧光光束和/或明场光束的光束变窄的光学***；
检测设备；和
计算单元。
63.根据权利要求61或62所述的***，所述***包括两个或更多个荧光光源。
64.根据权利要求61-63中任一项所述的***，所述***包括两个或更多个明场光源。
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