CN112410404A - 一种开启型双光子核酸探针及其在fish中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种开启型双光子核酸探针及其在FISH中的应用，选取8.0ml即50.0mmol的化合物1和18.1g即100mmol的化合物2悬浮于20ml的1，2‑二氯苯中，得混合物，该混合物在100‑120℃下搅拌反应14‑16h，待反应溶液冷却至20‑25℃，向反应混合物中加入了300ml的二氯甲烷，得悬浮物，本发明涉及核酸探针技术领域。该开启型双光子核酸探针及其在FISH中的应用，具备不错的激发波长通透性和荧光信号控制性能，同时还具有显色性强、光稳定性好等特点，实现了深层组织或器官中DNA的特异性双光子成像，与此同时，它还可以在不改变染料核心共轭结构的前提下对该荧光核酸探针进行改造，从而可以进一步开发为相应的生理、病理学研究用生物检测探针。

Description

一种开启型双光子核酸探针及其在FISH中的应用

技术领域

本发明涉及核酸探针技术领域，具体为一种开启型双光子核酸探针及其在FISH中的应用。

背景技术

DNA的空间结构即DNA与蛋白质或RNA之间的动态相互作用调节着遗传功能的输出，例如，基因组的亚核定位可以调节基因表达、异染色质形成和DNA复制。因此，探索细胞内DNA的时空调控，对于理解多种生理环境下的动态变化，验证核酸分布与生理性能之间的关系具有重要意义。通常，通过荧光原位杂交研究特定亚细胞区域中感兴趣的DNA的定位。尽管这些技术看起来简单有效，但它们需要标本固定，而且只适用于原位可视化。为了在活细胞中显示特定的基因组位点经常应用荧光标记的DNA结合蛋白。不幸的是，当未结合荧光团或FP自由扩散时，存在显著的荧光背景，并且可能影响DNA的定位、稳定性和行为方式。为了更高的信噪比，需要每个目标有数十个基序重复。尽管有这些局限性，这些***已经被广泛认可并应用于细胞成像。为了降低信号背景并提供更多的生命信息，人们设计了许多成像方法，如分子信标、GFP重组和猝灭自连接等。这些方法由于具有观察内源核酸的自然生理环境而具有极大的优越性。然而，这些方法都没有应用于研究体内或组织中的核酸动力学。针对现有方法存在的可用性低、序列设计限制、反应性或构象变化响应慢、背景荧光强度高或荧光可逆性低等问题，出现了一种新型荧光可控探针，被称为激子控制杂交敏感的荧光寡核苷酸探针。尽管有这些优点，但由于可见光的渗透性有限，该探针仅适用于薄组织切片的成像，不满足监测深层组织或器官中的基因组信息。

双光子激发荧光显微镜(TPM)与传统的单光子激发技术相比，具有光损伤小、光漂白少、检测灵敏度高的优点。在TP中，较长波长的激发光也可以减少细胞损伤。这项技术还可以减少离焦辐射。尽管双光子技术在组织器官成像中有上面的优势，目前的荧光探针并不能特异性地展示器官中的靶核酸。因此，在组织器官中靶核酸成像检测方面，依然缺乏优良的核酸探针。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种开启型双光子核酸探针及其在FISH中的应用，解决了现有的荧光探针不能特异性地展示器官中靶核酸的问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种开启型双光子核酸探针，其制备方法具体包括以下步骤：

S1、含苯乙基青色素的制备：

a1、选取8.0ml即50.0mmol的化合物1和18.1g即100mmol的化合物2悬浮于20ml的1，2-二氯苯中，得混合物，该混合物在100-120℃下搅拌反应14-16h，待反应溶液冷却至20-25℃，向反应混合物中加入了300ml的二氯甲烷，得悬浮物，合成的悬浮液在20-25℃下停留2-2.2h，产生的沉淀经过过滤，用二氯甲烷洗涤，减压干燥，得到白色粉末状化合物3，其反应式如(1)所示：

a2、选取a1中制备的1020mg即3.00mmol的化合物3和521mg即3.50mmol的化合物4悬浮于30ml的乙酸酐中，得悬浮液，所得悬浮液在100-120℃下搅拌反应30-35min，将10ml蒸馏水缓慢加入反应混合物中，再在100-120℃下搅拌26-30min，溶剂蒸发后，在残渣中加入丙酮100ml，沉淀经过过滤，用丙酮洗涤，减压干燥得到紫色粉末状化合物D，其反应式如(2)所示：

S2、可双光子激发的杂交敏感荧光核酸探针的制备：

b1、选取4.6mg即40μmole的N-羟基琥珀酰亚胺和7.7mg即40μmole的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐添加到a2中制备的20μmole的合成染料D的DMF溶液中，20-25℃搅拌14-16h，反应混合物与DNA寡聚物被用于下一个反应没有进一步净化；

b2、采用DNA/RNA合成仪和用传统的磷酰胺法合成DNA寡聚物，用商业上可用的dA、dG、dC、dT和二氨基修饰核苷dU对应的磷酰胺进行偶联合成核酸探针，合成的DNA用28％的氨水于50-55℃下裂解4.6-5h，利用真空离心法除去反应混合物中的氨水后用HPLC纯化相应的核酸产物，柱子为5-ODA-H反向柱，洗脱缓冲液为0.1M的pH7.0TEAA缓冲液，洗脱梯度为持续26-30min，5％-40％的现性梯度，流速为3ml/min；

b3、将染料D的琥珀酰亚胺酯的DMF溶液和溶有活性氨基核酸的碳酸钠缓冲液混合并于23-25℃条件下反应1.5-1.7h，将反应混合物溶于乙醇，于-20℃条件下高速离心18-20min，然后除去上清，将残余固体溶于少量水，然后用0.45um的滤膜过滤，用HPLC纯化相应的核酸偶联产物，柱子为5-ODA-H反向柱，洗脱缓冲液为0.1M的pH7.0 TEAA缓冲液，洗脱梯度为持续27-30min，5％-40％的现性梯度，流速为3ml/min。

优选的，所述步骤b3中碳酸钠缓冲液的pH值为9。

优选的，所述步骤b3中荧光核酸探针的浓度用紫外分光光度计测量，荧光核酸探针分子量用MALDI-TOF质谱仪进行表征。

优选的，所述开启型双光子核酸探针在对细胞系标记进行荧光成像中的应用，所述细胞系优选Hela细胞。

优选的，所述开启型双光子核酸探针在对器官标记进行荧光成像中的应用，所述器官优选小鼠胚胎脑。

优选的，所述开启型双光子核酸探针在FISH中的应用。

有益效果

本发明提供了一种开启型双光子核酸探针及其在FISH中的应用。与现有技术相比具备以下有益效果：

1、本发明制备的开启型双光子核酸探针具备不错的激发波长通透性和荧光信号控制性能，同时还具有显色性强、光稳定性好等特点，实现了深层组织或器官中DNA的特异性双光子成像，与此同时，它还可以在不改变染料核心共轭结构的前提下对该荧光核酸探针进行改造，从而可以进一步开发为相应的生理、病理学研究用生物检测探针。

2、利用本发明所述的开启型双光子核酸探针标记后的双光子荧光图像显示，核酸探针进入细胞后经双光子激发可以特异性的在靶核酸处呈现处明亮绿色荧光，证明了本发明所述的开启型双光子核酸探针具有优良的杂交敏感显色性能和双光子荧光成像特性。

3、本发明制备的开启型双光子核酸探针信噪比很高，探针杂交后不需要洗涤步骤就可以识别靶点的信号，制作方法特别简便快速。

附图说明

图1为本发明核酸探针的结构图；

图2为荧光核酸探针5’-d(TTTTTTDTTTTTT)-3’杂交前后的吸收光谱；

图3为荧光核酸探针5’-d(TTTTTTDTTTTTT)-3’与互补DNA杂交前后的激发光谱和发射光谱；

图4为荧光核酸探针5’-d(TACCAGDCACCAT)-3’与互补DNA杂交前后的激发光谱和发射光谱；

图5为荧光核酸探针5’-d(TTTTTTDTTTTTT)-3’与互补RNA杂交前后的激发光谱和发射光谱；

图6为荧光核酸探针5’-d(TACCAGDCACCAT)-3’与互补RNA杂交前后的激发光谱和发射光谱；

图7为荧光核酸探针5’-mUmUmUmUmUmUDmUmUmUmUmUmU-3’与互补DNA杂交前后的激发光谱和发射光谱；

图8为荧光核酸探针5’-mUmUmUmUmUmUDmUmUmUmUmUmU-3’与互补RNA杂交前后的激发光谱和发射光谱；

图9为荧光核酸探针5’-d(TTTTTTDTTTTTT)-3’与互补DNA杂交后的圆二色光谱；

图10为基于免洗涤双光子荧光原位杂交法的端粒成像照片；

图11为免洗涤双光子荧光原位杂交和常规荧光原位杂交的共定位成像照片；

图12为基于免洗涤双光子荧光原位杂交的离体鼠胚胎脑组织内端粒的成像照片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-10，本发明提供三种技术方案：一种开启型双光子核酸探针的制备方法，具体包括以下实施例：

实施例1

S1、含苯乙基青色素的制备：

a1、选取8.0ml即50.0mmol的化合物1和18.1g即100mmol的化合物2悬浮于20ml的1，2-二氯苯中，得混合物，该混合物在100℃下搅拌反应14h，待反应溶液冷却至20℃，向反应混合物中加入了300ml的二氯甲烷，得悬浮物，合成的悬浮液在20℃下停留2h，产生的沉淀经过过滤，用二氯甲烷洗涤，减压干燥，得到白色粉末状化合物3，其反应式如(1)所示：

a2、选取a1中制备的1020mg即3.00mmol的化合物3和521mg即3.50mmol的化合物4悬浮于30ml的乙酸酐中，得悬浮液，所得悬浮液在100℃下搅拌反应30min，将10ml蒸馏水缓慢加入反应混合物中，再在100℃下搅拌26min，溶剂蒸发后，在残渣中加入丙酮100ml，沉淀经过过滤，用丙酮洗涤，减压干燥得到紫色粉末状化合物D，其反应式如(2)所示：

S2、可双光子激发的杂交敏感荧光核酸探针的制备：

b1、选取4.6mg即40μmole的N-羟基琥珀酰亚胺和7.7mg即40μmole的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐添加到a2中制备的20μmole的合成染料D的DMF溶液中，20℃搅拌14h，反应混合物与DNA寡聚物被用于下一个反应没有进一步净化；

b2、采用DNA/RNA合成仪和用传统的磷酰胺法合成DNA寡聚物，用商业上可用的dA、dG、dC、dT和二氨基修饰核苷dU对应的磷酰胺进行偶联合成核酸探针，合成的DNA用28％的氨水于50℃下裂解4.6h，利用真空离心法除去反应混合物中的氨水后用HPLC纯化相应的核酸产物，柱子为5-ODA-H反向柱，洗脱缓冲液为0.1M的pH7.0TEAA缓冲液，洗脱梯度为持续26min，5％-40％的现性梯度，流速为3ml/min；

b3、将染料D的琥珀酰亚胺酯的DMF溶液和溶有活性氨基核酸的碳酸钠缓冲液混合并于23℃条件下反应1.5h，碳酸钠缓冲液的pH值为9，将反应混合物溶于乙醇，于-20℃条件下高速离心18min，然后除去上清，将残余固体溶于少量水，然后用0.45um的滤膜过滤，用HPLC纯化相应的核酸偶联产物，柱子为5-ODA-H反向柱，洗脱缓冲液为0.1M的pH7.0 TEAA缓冲液，洗脱梯度为持续27min，5％-40％的现性梯度，流速为3ml/min。

实施例2

S1、含苯乙基青色素的制备：

a1、选取8.0ml即50.0mmol的化合物1和18.1g即100mmol的化合物2悬浮于20ml的1，2-二氯苯中，得混合物，该混合物在110℃下搅拌反应15h，待反应溶液冷却至23℃，向反应混合物中加入了300ml的二氯甲烷，得悬浮物，合成的悬浮液在23℃下停留2.1h，产生的沉淀经过过滤，用二氯甲烷洗涤，减压干燥，得到白色粉末状化合物3，其反应式如(1)所示：

a2、选取a1中制备的1020mg即3.00mmol的化合物3和521mg即3.50mmol的化合物4悬浮于30ml的乙酸酐中，得悬浮液，所得悬浮液在110℃下搅拌反应33min，将10ml蒸馏水缓慢加入反应混合物中，再在110℃下搅拌28min，溶剂蒸发后，在残渣中加入丙酮100ml，沉淀经过过滤，用丙酮洗涤，减压干燥得到紫色粉末状化合物D，其反应式如(2)所示：

S2、可双光子激发的杂交敏感荧光核酸探针的制备：

b1、选取4.6mg即40μmole的N-羟基琥珀酰亚胺和7.7mg即40μmole的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐添加到a2中制备的20μmole的合成染料D的DMF溶液中，23℃搅拌15h，反应混合物与DNA寡聚物被用于下一个反应没有进一步净化；

b2、采用DNA/RNA合成仪和用传统的磷酰胺法合成DNA寡聚物，用商业上可用的dA、dG、dC、dT和二氨基修饰核苷dU对应的磷酰胺进行偶联合成核酸探针，合成的DNA用28％的氨水于52℃下裂解4.8h，利用真空离心法除去反应混合物中的氨水后用HPLC纯化相应的核酸产物，柱子为5-ODA-H反向柱，洗脱缓冲液为0.1M的pH7.0TEAA缓冲液，洗脱梯度为持续28min，5％-40％的现性梯度，流速为3ml/min；

b3、将染料D的琥珀酰亚胺酯的DMF溶液和溶有活性氨基核酸的碳酸钠缓冲液混合并于24℃条件下反应1.6h，碳酸钠缓冲液的pH值为9，将反应混合物溶于乙醇，于-20℃条件下高速离心19min，然后除去上清，将残余固体溶于少量水，然后用0.45um的滤膜过滤，用HPLC纯化相应的核酸偶联产物，柱子为5-ODA-H反向柱，洗脱缓冲液为0.1M的pH7.0 TEAA缓冲液，洗脱梯度为持续29min，5％-40％的现性梯度，流速为3ml/min。

实施例3

S1、含苯乙基青色素的制备：

a1、选取8.0ml即50.0mmol的化合物1和18.1g即100mmol的化合物2悬浮于20ml的1，2-二氯苯中，得混合物，该混合物在120℃下搅拌反应16h，待反应溶液冷却至25℃，向反应混合物中加入了300ml的二氯甲烷，得悬浮物，合成的悬浮液在25℃下停留2.2h，产生的沉淀经过过滤，用二氯甲烷洗涤，减压干燥，得到白色粉末状化合物3，其反应式如(1)所示：

a2、选取a1中制备的1020mg即3.00mmol的化合物3和521mg即3.50mmol的化合物4悬浮于30ml的乙酸酐中，得悬浮液，所得悬浮液在120℃下搅拌反应35min，将10ml蒸馏水缓慢加入反应混合物中，再在120℃下搅拌30min，溶剂蒸发后，在残渣中加入丙酮100ml，沉淀经过过滤，用丙酮洗涤，减压干燥得到紫色粉末状化合物D，其反应式如(2)所示：

S2、可双光子激发的杂交敏感荧光核酸探针的制备：

b1、选取4.6mg即40μmole的N-羟基琥珀酰亚胺和7.7mg即40μmole的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐添加到a2中制备的20μmole的合成染料D的DMF溶液中，25℃搅拌16h，反应混合物与DNA寡聚物被用于下一个反应没有进一步净化；

b2、采用DNA/RNA合成仪和用传统的磷酰胺法合成DNA寡聚物，用商业上可用的dA、dG、dC、dT和二氨基修饰核苷dU对应的磷酰胺进行偶联合成核酸探针，合成的DNA用28％的氨水于55℃下裂解5h，利用真空离心法除去反应混合物中的氨水后用HPLC纯化相应的核酸产物，柱子为5-ODA-H反向柱，洗脱缓冲液为0.1M的pH7.0TEAA缓冲液，洗脱梯度为持续30min，5％-40％的现性梯度，流速为3ml/min；

b3、将染料D的琥珀酰亚胺酯的DMF溶液和溶有活性氨基核酸的碳酸钠缓冲液混合并于25℃条件下反应1.7h，碳酸钠缓冲液的pH值为9，将反应混合物溶于乙醇，于-20℃条件下高速离心20min，然后除去上清，将残余固体溶于少量水，然后用0.45um的滤膜过滤，用HPLC纯化相应的核酸偶联产物，柱子为5-ODA-H反向柱，洗脱缓冲液为0.1M的pH7.0 TEAA缓冲液，洗脱梯度为持续30min，5％-40％的现性梯度，流速为3ml/min。

探针吸收光谱、激发光谱、发射光谱和圆二色光谱研究：

上述制备所得的荧光核酸探针(图1)的可见紫外吸收光谱、激发光谱、发射光谱和圆二色光谱检测，模拟生理条件，以下各项实验均在pH7.0条件下进行(PBS缓冲液)，核酸探针和互补核酸的浓度均采用1uM实施，在与互补DNA链杂交之前和之后，研究了用双染料D标记的DNA探针的吸收和发射(图2、图3和图4)，将探针加入到互补核酸溶液中后，立即观察到荧光发射，而在非杂交状态下发射被抑制，吸收光谱可用来证实了荧光控制的机制，与杂交后的探针相比，非杂交探针的吸收带出现了蓝移，这种蓝移表明，由于染料D的H聚集导致激发态***并且只允许向更高的能级跃迁，该激发态会迅速转移到较低的能级，但从这个能级到基态的路径不是发射的，非杂交态染料的激子相互作用抑制了荧光的发射，而与靶核酸杂交后，随着聚合体的解离，发射强度会大大增强；

当靶为RNA时，通过激子相互作用控制荧光发射也很明显((图5和图6)，荧光在与互补的RNA链杂交时表现出吸收带的移动和荧光强度的转换，接下来，测量了以2'-OMe RNA为骨架的荧光核酸探针与互补DNA或RNA链杂交前后的吸收、激发和发射光谱(图7和图8)，2’-OM-RNA探针的吸收光谱显示杂交后最大峰出现红移，2'-OMeRNA探针与DNA杂交后，其强发射强度与DNA探针相近，与相应的DNA探针相比，2'-OMeRNA探针在与互补RNA杂交时显示出更好的荧光比率，这应该归因于2'-OMeRNA与互补RNA序列的结合能力比类似的DNA寡核苷酸更紧密，因此，将糖基从氢原子改性为甲氧基并不能抑制探针中染料的激子相互作用对荧光的控制，对RNA成像具有更好的荧光控制作用；

荧光核酸探针的荧光控制是因为探针上的染料D嵌入到了杂交后的核酸双链，这一假设进一步得到了杂交后探针的圆二色性(CD)数据的证实(图9)，在CD光谱中，可以观察到450-550nm范围内的诱导CD峰，这是染料嵌入双链核酸的特征信号。

免洗涤荧光原位杂交：

由于新型荧光核酸探针的高荧光信噪比，可以避免繁琐和耗时的洗涤步骤，为了比较杂交敏感探针与传统FISH探针的性能，合成并应用了Telo-FAM和Telo-D对端粒进行了并行实验(图10)，试验得知，在无洗涤步骤时，Telo-FAM仅仅显示噪声，端粒定位模式无法识别，而Telo-D显示分散的荧光点，使用Telo-D荧光探针时，无论洗涤步骤是否进行，都观察到特征性荧光分布模式。

免洗涤共定位荧光原位杂交：

为了测试免洗涤荧光信号的特异性，我们将互补端粒探针Telo-FAM-L和Telo-D引入固定的MEF7细胞，Telo-FAM-L原位杂交采用了具有严格洗涤的传统FISH方案，而Telo-D是一种不经洗涤的简单FISH方案(图11)，在将Telo-D与传统FISH方案中的Telo-FAM-L联合应用后，检测到共定位的FISH信号，表明免洗涤荧光原位杂交的Telo-D信号来自端粒杂交。

离体鼠胚胎脑组织的荧光原位杂交：

一种快速、可靠的检测深部组织基因组序列的方法将有助于诊断，为了探讨新的双光子杂交敏感荧光探针在组织切片中应用于双光子激发FISH成像的可能性，在成年小鼠脑切片中引入了一种简单的1030nm双光子激发的FISH方法，我们在双光子显微镜下发现了脑切片不同深度的荧光点位置的变化(图12)，在所定义的区域内，还观察到特征性的端粒分布模式，因此，基于双染料D修饰探针的免洗涤荧光原位杂交也适用于组织切片中的DNA成像。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种开启型双光子核酸探针，其特征在于：其制备方法具体包括以下步骤：

S1、含苯乙基青色素的制备：

a1、选取8.0ml即50.0mmol的化合物1和18.1g即100mmol的化合物2悬浮于20ml的1，2-二氯苯中，得混合物，该混合物在100-120℃下搅拌反应14-16h，待反应溶液冷却至20-25℃，向反应混合物中加入了300ml的二氯甲烷，得悬浮物，合成的悬浮液在20-25℃下停留2-2.2h，产生的沉淀经过过滤，用二氯甲烷洗涤，减压干燥，得到白色粉末状化合物3，其反应式如(1)所示：

a2、选取a1中制备的1020mg即3.00mmol的化合物3和521mg即3.50mmol的化合物4悬浮于30ml的乙酸酐中，得悬浮液，所得悬浮液在100-120℃下搅拌反应30-35min，将10ml蒸馏水缓慢加入反应混合物中，再在100-120℃下搅拌26-30min，溶剂蒸发后，在残渣中加入丙酮100ml，沉淀经过过滤，用丙酮洗涤，减压干燥得到紫色粉末状化合物D，其反应式如(2)所示：

S2、可双光子激发的杂交敏感荧光核酸探针的制备：

b1、选取4.6mg即40μmole的N-羟基琥珀酰亚胺和7.7mg即40μmole的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐添加到a2中制备的20μmole的合成染料D的DMF溶液中，20-25℃搅拌14-16h，反应混合物与DNA寡聚物被用于下一个反应没有进一步净化；

b2、采用DNA/RNA合成仪和用传统的磷酰胺法合成DNA寡聚物，用商业上可用的dA、dG、dC、dT和二氨基修饰核苷dU对应的磷酰胺进行偶联合成核酸探针，合成的DNA用28％的氨水于50-55℃下裂解4.6-5h，利用真空离心法除去反应混合物中的氨水后用HPLC纯化相应的核酸产物，柱子为5-ODA-H反向柱，洗脱缓冲液为0.1M的pH7.0TEAA缓冲液，洗脱梯度为持续26-30min，5％-40％的现性梯度，流速为3ml/min；

b3、将染料D的琥珀酰亚胺酯的DMF溶液和溶有活性氨基核酸的碳酸钠缓冲液混合并于23-25℃条件下反应1.5-1.7h，将反应混合物溶于乙醇，于-20℃条件下高速离心18-20min，然后除去上清，将残余固体溶于少量水，然后用0.45um的滤膜过滤，用HPLC纯化相应的核酸偶联产物，柱子为5-ODA-H反向柱，洗脱缓冲液为0.1M的pH7.0 TEAA缓冲液，洗脱梯度为持续27-30min，5％-40％的现性梯度，流速为3ml/min。

2.根据权利要求1所述的一种开启型双光子核酸探针，其特征在于：所述步骤b3中碳酸钠缓冲液的pH值为9。

3.根据权利要求1所述的一种开启型双光子核酸探针，其特征在于：所述步骤b3中荧光核酸探针的浓度用紫外分光光度计测量，荧光核酸探针分子量用MALDI-TOF质谱仪进行表征。

4.根据权利要求1所述的一种开启型双光子核酸探针，其特征在于：所述开启型双光子核酸探针在对细胞系标记进行荧光成像中的应用，所述细胞系优选Hela细胞。

5.根据权利要求1所述的一种开启型双光子核酸探针，其特征在于：所述开启型双光子核酸探针在对器官标记进行荧光成像中的应用，所述器官优选小鼠胚胎脑。

6.根据权利要求1所述的一种开启型双光子核酸探针，其特征在于：所述开启型双光子核酸探针在FISH中的应用。

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