CN112410400A - 一种端粒酶活性检测试剂盒及端粒酶活性检测方法 - Google Patents

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CN112410400A CN201910776813.2A CN201910776813A CN112410400A CN 112410400 A CN112410400 A CN 112410400A CN 201910776813 A CN201910776813 A CN 201910776813A CN 112410400 A CN112410400 A CN 112410400A
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Abstract

本发明提供一种端粒酶活性检测试剂盒，包括端粒酶延伸体系组分、磁珠体系组分和信号酶加底物的信号生成体系，还提供使用该检测试剂盒检测样品的端粒酶活性的方法。本发明的检测试剂盒和检测方法，是一种基于磁珠‑酶体系对端粒酶活性进行可视化和便携式检测的三重模式***，结合了磁珠磁分离的优点和酶促反应信号放大的优点。通过糖苷键水解酶和磷酸酯键水解酶两种不同的酶和相应的三种不同的酶底物，可以分别通过荧光检测法、比色检测法和ATP检测法三种基于不同检测原理的方法，对同一样品同时进行平行检测，可以避免假阳性结果和假阴性结果，使检测结果更加可信，并且可以用于端粒酶活性的快速测定和单细胞水平的测定。

Description

一种端粒酶活性检测试剂盒及端粒酶活性检测方法
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种端粒酶活性检测试剂盒及使用该检测试剂盒检测待测样品中的端粒酶活性的方法。
背景技术
端粒酶能将端粒重复序列(TTAGGG)n添加到端粒的末端，对于端粒的维持和保护至关重要1-4。已发现端粒酶在大约85-90％的人类癌细胞中过表达，如膀胱癌、子宫癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、喉鳞状细胞癌5-8，而在正常组织中不存在端粒酶活性。因此，端粒酶通常被认为是人恶性肿瘤的重要生物标志物9-12。简单、快速、灵敏的端粒酶活性检测对于癌症早期诊断具有重要意义。
业界已开发了多种策略用于端粒酶活性检测。基于聚合酶链反应(PCR)的端粒重复序列扩增方案(TRAP)是最广泛使用的测定法，具有令人满意的灵敏度和特异性13-15。但是，它仍然存在一些局限，例如操作耗时、设备昂贵和存在假阳性结果。不采用酶促扩增步骤的其他方法，如电化学法、荧光法、比色测定法、表面等离子体共振法和电化学发光法，已经普遍应用于端粒酶活性检测16-19。在这些方法当中，荧光法灵敏，操作方便，适合实时检测，但荧光团易受实际样品的干扰。比色测定法肉眼可视，但受实际样品的颜色的限制。单一模式的测定法存在获得假阳性结果和假阴性结果的风险。因此，已开发了多种基于双重模式信号读出结果的检测***，以改进可靠性和准确性。为进一步简化检测过程，也已开发了一些便携式传感器，如个人血糖仪、血压计和pH计，以对端粒酶活性进行定量监测，这被称为床边检测(POCT)20-24。POCT是一种快速响应、操作容易、成本低、便携式的方法，可以针对复杂样品中的靶标进行检测，非常适合于疾病的初步诊断。
尽管端粒酶活性检测技术已取得上述进步，但仍有改进的空间。
发明内容
本发明的目的在于对现有的单一模式和双重模式的端粒酶活性检测策略进行改进，提供一种新型的用于检测端粒酶活性的三重模式，避免假阳性结果和假阴性结果，使检测结果更加可信。
本发明的目的通过如下的技术方案来实现：
在第一方面，本发明提供一种端粒酶活性检测试剂盒，该检测试剂盒包括以下组分：
(1)端粒酶延伸体系组分，包括端粒酶底物引物和dNTP，用于产生端粒重复序列；
(2)磁珠体系组分，包括磁珠、第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，该第一寡核苷酸可以与该磁珠连接，该第二寡核苷酸可以与该第一寡核苷酸至少部分地杂交，并且该第二寡核苷酸可以与该端粒重复序列至少部分地杂交；
(3)信号生成体系组分，包括信号酶和该信号酶的底物，其中该信号酶可以与该第二寡核苷酸连接。
第一寡核苷酸可以通过本领域公知的连接方式与磁珠进行连接。生物素-链霉亲和素连接体系是本领域常用的连接体系。在本发明的一些实施方案中，第一寡核苷酸与磁珠通过生物素-链霉亲和素连接体系进行连接。
在本发明的一些优选实施方案中，第一寡核苷酸为生物素修饰的第一寡核苷酸，磁珠为链霉亲和素修饰的磁珠，由此第一寡核苷酸与磁珠通过生物素-链霉亲和素连接体系进行连接。用生物素修饰第一寡核苷酸的方法和用链霉亲和素修饰磁珠的方法是本领域公知的。
本文所用的“信号酶”是指能够催化其底物而产生可检测的信号的酶，该可检测的信号可以为荧光变化信号、颜色变化信号或者ATP变化信号。荧光变化信号可以例如目视检测或者通过荧光仪检测；颜色变化信号可以例如通过比色法检测；ATP变化信号可以例如通过ATP计检测。
信号酶可以通过本领域公知的连接方式与第二寡核苷酸连接。生物素-链霉亲和素连接体系是本领域常用的连接体系。在本发明的一些实施方案中，信号酶与第二寡核苷酸通过生物素-链霉亲和素连接体系进行连接。
在本发明的一些优选实施方案中，第二寡核苷酸为生物素修饰的第二寡核苷酸，信号酶为链霉亲和素修饰的信号酶，由此第二寡核苷酸与信号酶通过生物素-链霉亲和素连接体系进行连接。用生物素修饰第二寡核苷酸的方法和用链霉亲和素修饰信号酶的方法是本领域公知的。
在本发明的一个具体实施方案中，端粒酶底物引物的序列为5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'(SEQ ID NO:1)，第一寡核苷酸的序列为5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'(SEQ ID NO:2)，第二寡核苷酸的序列为5'-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-3'(SEQID NO:3)。
在本发明的一些实施方案中，信号酶可以为糖苷键水解酶，底物可以为包含糖苷键的非荧光性荧光素衍生物。糖苷键水解酶是一类能水解底物的糖苷键的酶。在本发明的一些优选实施方案中，糖苷键水解酶为半乳糖苷酶，底物为荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)。FDG在半乳糖苷酶的催化水解下释放荧光素，从而引起荧光的变化，产生可目测或检测的荧光信号。在本发明的另一些优选实施方案中，糖苷键水解酶为纤维素酶，底物为荧光素2-β-D-纤维二糖糖苷(FCB)。FCB在纤维素酶的催化水解下释放荧光素，从而引起荧光的变化，产生可目测或检测的荧光信号。
在本发明的另一些实施方案中，信号酶可以为磷酸酯键水解酶，底物可以为包含磷酸酯键的化合物。磷酸酯键水解酶为一类能水解底物的磷酸酯键的酶。在本发明的一些优选实施方案中，磷酸酯键水解酶为碱性磷酸酶，底物为对硝基苯基磷酸酯(pNPP)。pNPP在碱性磷酸酶的催化水解下产生呈深黄色的对硝基苯酚(pNP)，从而引起颜色的变化，产生可通过比色法检测的信号。在本发明的另一些优选实施方案中，磷酸酯键水解酶为碱性磷酸酶，底物为三磷酸腺苷(ATP)。ATP在碱性磷酸酶的催化水解下产生一磷酸腺苷(AMP)，从而引起三磷酸腺苷的减少，产生可通过ATP计检测的信号。
在第二方面，本发明提供通过本发明第一方面的端粒酶活性检测试剂盒检测端粒酶活性的方法，该方法包括以下步骤：
(1)提供待测样品，使该待测样品与该端粒酶延伸反应组分进行端粒酶延伸反应，以产生该端粒重复序列；
(2)使该磁珠体系组分中的该磁珠与该第一寡核苷酸进行连接反应，以形成第一寡核苷酸官能化的磁珠，使该第一寡核苷酸官能化的磁珠与该第二寡核苷酸进行杂交反应，以形成第一寡核苷酸和第二寡核苷酸官能化的磁珠，并使该第一寡核苷酸和第二寡核苷酸官能化的磁珠与该信号酶进行连接反应，以使该信号酶与该第二寡核苷酸连接，形成第二寡核苷酸-信号酶连接物，从而形成磁珠体系-信号酶复合物；
(3)使该磁珠体系-信号酶复合物与该端粒重复序列进行竞争性杂交反应，以形成端粒重复序列-第二寡核苷酸-信号酶连接物杂交物，并形成脱除了相应的第二寡核苷酸-信号酶连接物的该磁珠体系-信号酶复合物；
(4)使该端粒重复序列-第二寡核苷酸-信号酶连接物杂交物与脱除了相应的第二寡核苷酸-信号酶连接物的该磁珠体系-信号酶复合物分离，以形成分离的端粒重复序列-第二寡核苷酸-信号酶连接物杂交物；
(5)使该分离的端粒重复序列-第二寡核苷酸-信号酶连接物杂交物与该信号酶的底物进行酶促反应，并测定该酶促反应产生的信号，其中该信号的大小反映该端粒酶活性的大小。
术语“待测样品”是指任何需要测量其中的端粒酶活性的样品，优选生物样品，例如但不限于组织细胞液、血液、体液、尿液等。该样品的获取方法是本领域公知的，例如将组织或细胞破碎获得组织细胞液，或者通过抽取的方法获得血液、体液或尿液。
端粒酶是一种能将端粒重复序列(TTAGGG)n添加到端粒的末端的酶。在步骤(1)中，包括端粒酶底物引物和dNTP的端粒酶延伸体系在端粒酶存在下，端粒酶底物引物延伸而产生端粒重复序列，这是本领域公知的，相关的反应条件也是本领域技术人员熟知的或者通过有限实验获得的，例如在反应体系中还需要加入KCl和缓冲液。
在步骤(2)中，可以通过本领域技术人员熟知的方法使磁珠体系组分中的磁珠与第一寡核苷酸进行连接反应，例如可以如第一方面所述，通过生物素-链霉亲和素连接体系使磁珠与第一寡核苷酸连接在一起，形成第一寡核苷酸官能化的磁珠。由于第二寡核苷酸可以与第一寡核苷酸至少部分地杂交，因此第一寡核苷酸官能化的磁珠可以与第二寡核苷酸进行杂交反应，形成第一寡核苷酸和第二寡核苷酸官能化的磁珠，寡核苷酸杂交反应的条件是本领域技术人员熟知的或者通过有限实验获得的。并且，可以通过本领域技术人员熟知的方法使第一寡核苷酸和第二寡核苷酸官能化的磁珠与信号酶进行连接反应，例如可以如第一方面所述，通过生物素-链霉亲和素连接体系使第一寡核苷酸和第二寡核苷酸官能化的磁珠中的第二寡核苷酸与信号酶连接在一起，形成第二寡核苷酸-信号酶连接物，从而形成磁珠体系-信号酶复合物。
应指出的是，上述步骤(1)和步骤(2)并不规定严格的先后顺序。在实际检测操作在，先进行步骤(1)再进行步骤(2)，或者先进行步骤(2)再进行步骤(1)，都是可以的。
在步骤(3)中，由于第二寡核苷酸可以与端粒重复序列至少部分地杂交，端粒重复序列将和磁珠体系-信号酶复合物中的第一寡核苷酸竞争与第二寡核苷酸的结合，即发生竞争性杂交反应，形成端粒重复序列-第二寡核苷酸-信号酶连接物杂交物，并形成脱除了相应的第二寡核苷酸-信号酶连接物的磁珠体系-信号酶复合物。进行核酸序列的竞争性杂交反应的条件是本领域技术人员熟知的或者通过有限实验获得的。
在步骤(4)中，可以通过磁力吸引磁珠体系-信号酶复合物，从而使端粒重复序列-第二寡核苷酸-信号酶连接物杂交物与脱除了相应的第二寡核苷酸-信号酶连接物的磁珠体系-信号酶复合物分离，形成分离的端粒重复序列-第二寡核苷酸-信号酶连接物杂交物。进行磁力分离的方法和条件是本领域技术人员熟知的或者通过有限实验获得的。
在步骤(5)中，分离的端粒重复序列-第二寡核苷酸-信号酶连接物杂交物中的信号酶与其底物发生酶促反应，通过测定酶促反应产生的信号的大小，可以测出待测样品中的端粒酶活性的大小。酶促反应的条件以及信号的检测方法是本领域技术人员熟知的或者通过有限实验获得的。
信号酶可以为糖苷键水解酶，相应的底物为包含糖苷键的非荧光性荧光素衍生物，酶促反应的产物为荧光素，产生的信号为荧光的变化。优选地，糖苷键水解酶为半乳糖苷酶，底物为荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷，或者糖苷键水解酶为纤维素酶，底物为荧光素2-β-D-纤维二糖糖苷。
信号酶也可以为磷酸酯键水解酶，优选地为碱性磷酸酶，底物为包含磷酸酯键的化合物。当底物为对硝基苯基磷酸酯时，信号为颜色的变化，或者当底物为三磷酸腺苷时，信号为三磷酸腺苷含量的减少。
本发明的有益效果：
本发明的端粒酶活性检测试剂盒和使用该试剂盒的端粒酶活性检测方法，是一种基于磁珠-酶体系对端粒酶活性进行可视化和便携式检测的三重模式***，结合了磁珠磁分离的优点和酶促反应信号放大的优点，可以实现单细胞水平上检测端粒酶。
尽管在使用本发明的端粒酶活性检测试剂盒检测样品的端粒酶活性的检测方法中，各个步骤中可以是采用本领域常规的反应条件进行的常规操作，但是本发明的端粒酶活性检测方法作为一个整体，其独特的创新在于，采用了一种有别于传统的单模式或双模式检测模式的三重检测模式。具体地讲，通过在同一端粒酶活性检测试剂盒中提供两种不同的信号酶，即糖苷键水解酶(例如半乳糖苷酶或纤维素酶)和磷酸酯键水解酶(例如碱性磷酸酶)，并相应地提供三种不同的底物，即非荧光性荧光素衍生物(例如荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷和荧光素2-β-D-纤维二糖糖苷)、硝基苯基磷酸酯和三磷酸腺苷，可以分别通过荧光检测法(目视检测或荧光仪检测)、比色检测法和ATP检测法(ATP计)这三种基于不同检测原理的方法，对同一样品同时进行平行检测，可以避免假阳性结果和假阴性结果，使检测结果更加可信。
而且，在同一端粒酶活性检测试剂盒中提供两种不同的酶和三种不同的底物，也提供了检测的灵活性，即可以按需要采用三重检测模式(三种底物，三种检测原理)、双重检测模式(两种底物和两种检测原理)和单一检测模式(一种底物和一种检测原理)，荧光测定、比色测定和三磷酸腺苷测定结果可以单独使用或者组合使用，以实现最佳的检测性能并使结果更具说服力。另外，如果需要，还可能设计三种以上的信号酶，更加丰富检测手段，提高检测的灵活性和便利性。
此外，本发明的端粒酶活性检测方法适于端粒酶活性的快速测定。其中，基于荧光检测法、比色检测法的端粒酶活性检测方法适合开发目视检测传感器，基于ATP检测法的端粒酶活性检测方法采用ATP计数器，携带方便，操作方便，成本低，并且具有更高的响应灵敏度，适合开发床边检测(POCT)。
附图说明
图1显示本发明的端粒酶活性检测试剂盒和使用该试剂盒的端粒酶活性检测方法的三重模式的检测原理示意图；
图2显示本发明的端粒酶活性三重检测模式的可行性的实验测试结果，其中图2A显示半乳糖苷酶(Gala)水解之前(a)和之后(b)荧光素的荧光光谱和照片；图2B显示碱性磷酸酶(ALP)水解之前(a)或之后(b)对硝基苯酚(pNP)的紫外/可见光光谱和照片；图2C显示使用ATP计读出的ATP值；
图3显示本发明的端粒酶活性三重检测模式的有效性的实验测试结果，其中图3A显示在荧光测定模式中，荧光素荧光强度与HeLa细胞数量的对数之间的线性关系，激发波长为480nm，插图显示在365nm紫外灯下不同端粒酶浓度(以细胞数量代表)的数码照片；图3B显示随着端粒酶浓度(以细胞数量代表)的增加，荧光素的荧光光谱的演变；图3C显示在比色测定模式中，A311/A400比率与HeLa细胞数量之间的线性关系，插图显示不同HeLa细胞数量的数码照片；图3D显示端粒酶浓度的增加时相应的紫外/可见光光谱；图3E显示在ATP测定模式中，ATP值与HeLa细胞数量的对数之间的线性关系；
图4显示本发明的端粒酶活性三重检测模式的可靠性的实验测试结果，其中图4A显示了在热处理对照实验中，热失活的HeLa细胞的提取物的端粒酶活性检测结果；图4B显示了在姜黄素抑制剂处理对照实验中，不同浓度的姜黄素存在时的荧光强度检测结果；
图5显示来自膀胱癌患者和正常个体的12个尿样的端粒酶活性检测结果，其中上图显示尿样的荧光测定结果，下图显示尿样的比色测定结果，尿样从左到右属于患者1至患者10和两个正常个体，所有荧光测定照片均在365nm紫外灯下拍摄。
具体实施方式
下面通过具体实施方式并结合附图对本发明作进一步详细说明。
图1显示本发明的端粒酶活性检测试剂盒和使用该试剂盒的端粒酶活性检测方法的三重模式的检测原理示意图，以下结合图1对检测原理进行简述。
磁珠(MB)用链霉亲和素(SA)进行修饰，形成链霉亲和素修饰的磁珠(MB-SA)。第一寡核苷酸序列用生物素(biotin)进行修饰，形成生物素修饰的第一寡核苷酸(bio-oligo1)。第二寡核苷酸序列用生物素(biotin)进行修饰，形成生物素修饰的第二寡核苷酸(bio-oligo 2)。第二寡核苷酸序列被设计成与第一寡核苷酸序列可以至少部分地杂交。半乳糖苷酶(Gala)用链霉亲和素(SA)进行修饰，形成链霉亲和素修饰的半乳糖苷酶(SA-Gala)。或者，碱性磷酸酶(ALP)用链霉亲和素(SA)进行修饰，形成链霉亲和素修饰的碱性磷酸酶(SA-ALP)。
使MB-SA与bio-oligo 1进行连接反应，形成第一寡核苷酸官能化的磁珠。使第一寡核苷酸官能化的磁珠与bio-oligo 2进行杂交反应，以使bio-oligo 1与bio-oligo 2杂交，形成第一寡核苷酸和第二寡核苷酸官能化的磁珠。使第一寡核苷酸和第二寡核苷酸官能化的磁珠与SA-Gala进行连接反应，以使磁珠中的第二寡核苷酸与半乳糖苷酶连接在一起，形成第二寡核苷酸-半乳糖苷酶连接物，从而形成磁珠体系-半乳糖苷酶复合物；或者，使第一寡核苷酸和第二寡核苷酸官能化的磁珠与SA-ALP进行连接反应，以使磁珠中的第二寡核苷酸与碱性磷酸酶连接在一起，形成第二寡核苷酸-碱性磷酸酶连接物，从而形成磁珠体系-碱性磷酸酶复合物。
使含有端粒酶的待测样品在端粒酶底物引物(TS引物)和dNTP存在下进行端粒酶延伸反应，形成端粒酶延伸反应产物。需要说明的是，前述的第二寡核苷酸序列也被设计成与端粒酶延伸反应产物可以至少部分地杂交。后续可采用三种模式可对待测样品中的端粒酶进行检测。
在第一种模式中，使端粒酶延伸反应产物与磁珠体系-半乳糖苷酶复合物进行竞争性杂交反应，端粒酶延伸反应产物和bio-oligo 1竞争与bio-oligo 2的结合，第二寡核苷酸-半乳糖苷酶连接物从磁珠上脱离下来，形成端粒重复序列-第二寡核苷酸-半乳糖苷酶连接物杂交物，并形成脱除了相应的第二寡核苷酸-半乳糖苷酶连接物的磁珠体系-半乳糖苷酶复合物。形成的端粒重复序列-第二寡核苷酸-半乳糖苷酶连接物杂交物的量取决于端粒酶延伸反应产物的浓度，即取决于待测样品中端粒酶的浓度。通过磁力将脱除了相应的第二寡核苷酸-半乳糖苷酶连接物的磁珠体系-半乳糖苷酶复合物与端粒重复序列-第二寡核苷酸-半乳糖苷酶连接物杂交物分离，分离出的磁珠体系可回收利用。向分离得到的端粒重复序列-第二寡核苷酸-半乳糖苷酶连接物杂交物加入荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)，半乳糖苷酶可以催化FDG形成荧光素，从而发出荧光。通过检测荧光的强度，可以反映待测样品中端粒酶的浓度。因此，此模式为荧光测定模式。
在第二种模式中，使端粒酶延伸反应产物与磁珠体系-碱性磷酸酶复合物进行竞争性杂交反应，端粒酶延伸反应产物和bio-oligo 1竞争与bio-oligo 2的结合，第二寡核苷酸-碱性磷酸酶连接物从磁珠上脱离下来，形成端粒重复序列-第二寡核苷酸-碱性磷酸酶连接物杂交物，并形成脱除了相应的第二寡核苷酸-碱性磷酸酶连接物的磁珠体系-碱性磷酸酶复合物。形成的端粒重复序列-第二寡核苷酸-碱性磷酸酶连接物杂交物的量取决于端粒酶延伸反应产物的浓度，即取决于待测样品中端粒酶的浓度。通过磁力将脱除了相应的第二寡核苷酸-碱性磷酸酶连接物的磁珠体系-碱性磷酸酶复合物与端粒重复序列-第二寡核苷酸-碱性磷酸酶连接物杂交物分离，分离出的磁珠体系可回收利用。向分离得到的端粒重复序列-第二寡核苷酸-碱性磷酸酶连接物杂交物加入对硝基苯基磷酸酯(pNPP)，碱性磷酸酶可以催化pNPP形成呈深黄色的对硝基苯酚(pNP)。通过比色测定法测定反应体系的吸光度，可以反映待测样品中端粒酶的浓度。因此，此模式为比色测定模式。
在第三种模式中，与第二种模式一样操作，分离得到的端粒重复序列-第二寡核苷酸-碱性磷酸酶连接物杂交物，然后不同的是向其中加入ATP，碱性磷酸酶可以将ATP水解成AMP，然后使用ATP计读出ATP的减少，可以反映待测样品中端粒酶的浓度。因此，此模式为ATP测定模式。
以下通过实验证明本发明的端粒酶活性检测试剂盒和使用该试剂盒的端粒酶活性检测方法的可行性、有效性、可靠性及临床适用性。
一、材料和仪器
磁珠(DynabeadsTMMyOneTM链霉亲和素C1)和ATP获自Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)。链霉亲和素修饰的β-半乳糖苷酶(SA-Gala)获自Creative Enzymes。链霉亲和素修饰的碱性磷酸酶(SA-ALP)获自Bioss Antibodies(Beijing BiosynthesisBiotechnology Co.,Ltd.)。荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)购自Sigma-Aldrich。对硝基苯基磷酸酯(pNPP)获自J&K Scientific。
端粒酶底物引物(TS引物)的序列是5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'。第一寡核苷酸的序列是5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-生物素-3'。第二寡核苷酸的序列是5'-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-生物素-3'。
尿样由深圳市第二人民医院提供。
在UV-2550分光光度计(日本岛津)上获得紫外-可见光吸收光谱。用RF-6000PC分光光度计(日本岛津)上获得荧光光谱。用GDYQ-131SA ATP生物荧光检测器(吉林大学-小天鹅)进行ATP检测。
二、实验方法
1.从培养细胞中提取端粒酶
将Hela细胞在含有10％FBS的DMEM中培养，并通过胰蛋白酶收集。将1×106个细胞转移到1.5mL EP管中，并以1000rpm离心10分钟收集细胞沉淀。用PBS(pH 7.4)洗涤细胞沉淀，再次离心，并分配到200μL冰冷的1×CHAPS裂解缓冲液中。将混合物在冰上孵育30分钟，并在4℃下以12000rpm离心20分钟。将上清液转移到新的1.5mL EP管中并储存在-80℃。
2.从尿样中提取的端粒酶
收集新鲜尿样(200mL)并在4℃下以1000rpm离心10分钟。用PBS(pH 7.4)洗涤沉淀物，并在4℃下以1800rpm离心5分钟。然后将沉淀物重悬于2mL冰冷的1×CHAPS裂解缓冲液中。在冰上孵育30分钟并在4℃以12000rpm离心20分钟后，将上清液转移到新的1.5mL EP管中并储存在-80℃。
3.端粒酶延伸反应
将得自Hela细胞或尿样的1μL端粒酶提取物和含有63mM KCl、0.04mMdNTP和200nM端粒酶底物引物(TS引物)的9μL延伸反应缓冲液在管中混合，将混合物在37℃下孵育60分钟，得到端粒酶延伸反应产物。
对于热处理对照实验，先将端粒酶提取物在95℃下热处理10分钟。对于姜黄素抑制剂处理对照实验，将姜黄素在37℃下加入到每个管中至最终浓度为0μM、200μM、500μM、1mM、10mM和50mM，持续60分钟。
4.端粒酶活性检测
(1)基于链霉亲和素缀合的β-半乳糖苷酶(SA-Gala)的端粒酶活性检测
取适量的磁珠(DynabeadsTMMyOneTM链霉亲和素C1)用400μL Tris-HCl(20mM，pH7.40，含有135mM NaCl)洗涤三次。然后，第一步，将磁珠和第一寡核苷酸(5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-生物素-3')以1:1的比例加入到400μL Tris-HCl缓冲液中，然后混合并将混合物置于37℃振荡器上30分钟。弃去液体并用400μL Tris-HCl洗涤三次。第二步，将反应产物和第二寡核苷酸(5'-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-生物素-3')以3.2:1的比例加入到400μL Tris-HCl中，然后混合并将所得混合物置于37℃振荡器上30分钟。第三步，将第二步的产物和链霉亲和素修饰的β-半乳糖苷酶(SA-Gala)以3.2:1的比例加入到400μL Tris-HCl缓冲液中，然后混合并将所得混合物置于37℃振荡器上30分钟。第四步，将第三步的反应混合物和不同浓度的端粒酶延伸反应产物加入Tris-HCl中，并将所得混合物置于37℃振荡器上保持30分钟。第五步，磁分离之后，收集上清液，分至四个管，每个管具有100μL。每管加入200μLTris-HCl，然后加入5μL FDG(15μM)并在37℃温育30分钟。最后，在480nm的激发波长和500-660nm的发射波长下收集所有荧光光谱。
(2)基于链霉亲和素缀合的碱性磷酸酶(SA-ALP)的端粒酶活性检测
对于基于SA-ALP的端粒酶活性检测，前面的步骤与基于SA-Gala的端粒酶活性检测相同，不同的是，在第三步中，将第二步的产物和SA-ALP以6.6:1的比例加入，并且在第五步中，采取两种不同的检测模式。一种检测模式是收集上清液并分至四个管，每个管100μL。每管加入500μL Tris-HCl，然后加入12μL pNPP(5mM)并在37℃温育30分钟。最后，测量紫外-可见光光谱，扫描波长范围为450至260nm。另一种检测模式是取100μL上清液并加入100μLTris-HCl使最终体积为200μL。然后加入20μL ATP(100μM)并在37℃下孵育30分钟。通过ATP生物荧光检测器测量ATP。
三、结果与讨论
1.端粒酶活性检测可行性
在基于SA-Gala的端粒酶活性检测模式中，非荧光的FDG是半乳糖苷酶最灵敏的底物之一，被半乳糖苷酶水解首先水解成FMG，然后水解成高荧光的荧光素。半乳糖苷酶介导的FDG水解之后，荧光出现增强。如图2A所示，在480nm的激发波长下，荧光素的荧光强度(曲线a)在半乳糖苷酶水解FDG后有效地增强(曲线b)。
在基于SA-ALP和pNPP的端粒酶活性检测模式中，pNPP是常用的显色底物，可以在ALP存在下产生对硝基苯酚(pNP)，pNP呈深黄色，可以通过比色测定法测定。如图2B所示，在ALP介导的pNPP水解后，A311/A400比率明显增加。
在基于SA-ALP和ATP的端粒酶活性检测模式中，如图2C所示，在存在端粒酶的情况下，ALP将ATP水解成AMP，然后使用ATP计读出ATP的减少。
图2的结果确认了本发明的基于荧光测定法、比色测定法和ATP测定法的端粒酶活性三重检测模式的可行性。
2.端粒酶活性检测有效性
通过荧光测定法、比色测定法和ATP测定法对来自Hela细胞的端粒酶提取物的端粒酶活性进行了定量检测。
图3A显示了在荧光测定模式中，在25-2500个HeLa细胞的范围内，FDG的荧光强度与细胞数的对数呈线性关系。基于3σ/S方程，检测限(LOD)为2个细胞。插图显示了具有给定浓度的端粒酶(以细胞数来代表)的荧光反应体系在365nm紫外灯下的数码照片。图3B显示了随着端粒酶浓度的增加，荧光素的荧光光谱的演变。随着HeLa细胞数量从12.5个细胞增加到2500个细胞，荧光明显增加。
图3C显示了在比色测定模式中，将A311/A400比率与12.5个至1500个HeLa细胞之间的细胞数量呈线性关系。基于3σ/S方程，检测限为8个HeLa细胞。插图显示了具有给定浓度的端粒酶(以细胞数来代表)的显色反应体系的数码照片。图3D显示了端粒酶浓度的增加时相应的紫外/可见光光谱。
图3E显示了在ATP测定模式中，在5个至1000个HeLa细胞的范围内，ATP值与HeLa细胞数的对数呈线性关系。基于3σ/S方程，检测限为1个细胞。
以上结果表明，本发明的荧光测定法、比色测定法和ATP测定法三重检测模式可以有效地在单细胞水平上检测端粒酶，并且实现端粒酶活性的准确且灵敏的定量检测。
3.端粒酶活性检测的可靠性
为了进一步确保本发明的端粒酶活性三重检测模式的可靠性，进行了热处理对照实验和姜黄素抑制剂处理对照实验。
在热处理对照实验中，研究了正常HeLa细胞提取物和95℃热失活HeLa细胞提取物。如图4A所示，没有记录到热失活HeLa细胞提取物的显著荧光增强，表明使用本发明的端粒酶活性三重检测模式测定端粒酶活性是可靠和准确的。
在姜黄素抑制剂处理对照实验中进一步测试本发明的端粒酶活性三重检测模式的可靠性。姜黄素是一种常用的端粒酶活性抑制剂。在端粒酶延伸过程中，将不同浓度的姜黄素加入到反应溶液中。如图4B所示，随着姜黄素浓度的增加，荧光素的荧光强度逐渐降低，表明姜黄素能够有效抑制端粒酶的活性，本发明的端粒酶活性三重检测模式是可靠的。
4.临床适用性
膀胱癌是第二常见的泌尿生殖***恶性肿瘤，复发率高。为了评估本发明的端粒酶活性三重检测模式在膀胱癌临床诊断中的适用性，对来自10个膀胱癌患者和2个正常个体的12个尿样进行了研究。癌症患者尿液的荧光测定值(F)、比色测定值(A311/A400)和ATP测定值(I)均显著高于健康人尿液的值(表1)。
表1.本发明的端粒酶活性三重检测模式所获得的结果与临床诊断结果的比较
Figure BDA0002175336790000111
Figure BDA0002175336790000121
aΔF＝F-F0；bΔ(A311/A400)＝A311/A400-(A311/A400)0；cΔI＝I-I0
还对这12个尿样的检测结果进行了可视化显示，如图5所示，其中上图显示尿样的荧光测定结果，下图显示尿样的比色测定结果，尿样从左到右属于患者1至患者10和两个正常个体，所有荧光测定照片均在365nm紫外灯下拍摄。
基于尿液的端粒酶活性检测方法是非侵入性检测方法，被认为是膀胱癌临床诊断中的优选方法。结果表明，本发明的端粒酶活性三重检测模式能够在复杂样品环境中检测端粒酶活性，用于膀胱癌临床诊断，具有良好的选择性和准确性。
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以上应用了具体实例对本发明进行了阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。本发明所属技术领域的技术人员依据本发明的构思，还可以做出若干简单推演、变形或替换。这些推演、变形或替换方案也落入本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
(1)端粒酶延伸体系组分，包括端粒酶底物引物和dNTP，用于产生端粒重复序列；
(2)磁珠体系组分，包括磁珠、第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸可以与所述磁珠连接，所述第二寡核苷酸可以与所述第一寡核苷酸至少部分地杂交，并且所述第二寡核苷酸可以与所述端粒重复序列至少部分地杂交；
(3)信号生成体系组分，包括信号酶和所述信号酶的底物，其中所述信号酶可以与所述第二寡核苷酸连接。
2.根据权利要求1所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述第一寡核苷酸与所述磁珠通过生物素-链霉亲和素连接体系进行连接。
3.根据权利要求2所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述第一寡核苷酸为生物素修饰的第一寡核苷酸，所述磁珠为链霉亲和素修饰的磁珠，由此所述第一寡核苷酸与所述磁珠通过生物素-链霉亲和素连接体系进行连接。
4.根据权利要求1所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述信号酶与所述第二寡核苷酸通过生物素-链霉亲和素连接体系进行连接。
5.根据权利要求4所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述第二寡核苷酸为生物素修饰的第二寡核苷酸，所述信号酶为链霉亲和素修饰的信号酶，由此所述第二寡核苷酸与所述信号酶通过生物素-链霉亲和素连接体系进行连接。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述端粒酶底物引物的序列为5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'(SEQ ID NO:1)，所述第一寡核苷酸的序列为5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'(SEQ ID NO:2)，所述第二寡核苷酸的序列为5'-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACC CTAA-3'(SEQ ID NO:3)。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述信号酶为糖苷键水解酶，所述底物为包含糖苷键的非荧光性荧光素衍生物；优选地，所述糖苷键水解酶为半乳糖苷酶，所述底物为荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷，或者所述糖苷键水解酶为纤维素酶，所述底物为荧光素2-β-D-纤维二糖糖苷。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述信号酶为磷酸酯键水解酶，所述底物为包含磷酸酯键的化合物；优选地，所述磷酸酯键水解酶为碱性磷酸酶，所述底物为对硝基苯基磷酸酯或三磷酸腺苷。
9.一种使用根据权利要求1-8中任一项所述的端粒酶活性检测试剂盒检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供待测样品，使所述待测样品与所述端粒酶延伸反应组分进行端粒酶延伸反应，以产生所述端粒重复序列；
(2)使所述磁珠体系组分中的所述磁珠与所述第一寡核苷酸进行连接反应，以形成第一寡核苷酸官能化的磁珠，使所述第一寡核苷酸官能化的磁珠与所述第二寡核苷酸进行杂交反应，以形成第一寡核苷酸和第二寡核苷酸官能化的磁珠，并使所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸官能化的磁珠与所述信号酶进行连接反应，以使所述信号酶与所述第二寡核苷酸连接，形成第二寡核苷酸-信号酶连接物，从而形成磁珠体系-信号酶复合物；
(3)使所述磁珠体系-信号酶复合物与所述端粒重复序列进行竞争性杂交反应，以形成端粒重复序列-第二寡核苷酸-信号酶连接物杂交物，并形成脱除了相应的第二寡核苷酸-信号酶连接物的所述磁珠体系-信号酶复合物；
(4)使所述端粒重复序列-第二寡核苷酸-信号酶连接物杂交物与脱除了相应的第二寡核苷酸-信号酶连接物的所述磁珠体系-信号酶复合物分离，以形成分离的端粒重复序列-第二寡核苷酸-信号酶连接物杂交物；
(5)使所述分离的端粒重复序列-第二寡核苷酸-信号酶连接物杂交物与所述信号酶的底物进行酶促反应，并测定所述酶促反应产生的信号，其中所述信号的大小反映所述端粒酶活性的大小。
10.根据权利要求9所述的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述信号酶为糖苷键水解酶，所述底物为包含糖苷键的非荧光性荧光素衍生物，所述信号为荧光的变化；或者，所述信号酶为磷酸酯键水解酶，并且当所述底物为对硝基苯基磷酸酯时，所述信号为颜色的变化，或者当所述底物为三磷酸腺苷时，所述信号为三磷酸腺苷含量的减少。
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