CN112400016A - 用于检测dna的试剂盒与方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供一种用于检测DNA的试剂盒与方法。具体来说，本公开涉及基于基因芯片的用于检测DNA样品的试剂盒、用于所述试剂盒的信号放大***、以及试剂盒的使用方法。本公开在测定待测DNA片段时，先通过测试***外部的生物转化过程来使得待测物统一化，这样芯片的底物只对应于统一标准物。由此，统一的芯片和底物可以检测多个目标物，同时芯片的制备简单化，并且避免了不同底物的交叉污染。与此同时，所述试剂盒含有信号放大***，采用该信号放大***检测DNA时，检测灵敏度更高。

Description

用于检测DNA的试剂盒与方法
技术领域
本公开涉及一种用于DNA样品的检测试剂盒，用于所述检测试剂盒的信号放大***、以及对于DNA样品的检测方法。具体来说，本公开涉及基于基因芯片的用于DNA样品检测的试剂盒、用于所述试剂盒的信号放大***、以及试剂盒的使用方法。
背景技术
DNA芯片又叫做基因芯片(gene chip)或基因微阵列(microarray)，寡核酸芯片，或DNA微阵列，它是通过微阵列技术将高密度DNA片段阵列以一定的排列方式使其附着在玻璃、尼龙等材料上面。DNA芯片技术就是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。通俗地说，基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)有规律地排列固定于2c㎡的硅片、玻片等支持物上，构成一个二维的DNA探针阵列，与电子计算机上的电子芯片十分相似所以被称为基因芯片。
利用固定的载体来捕获和检测疾病标记物是现代诊断检测常用的方法。然而，现有方案主要是通过对应特异结合的探测芯片来检测多种疾病目标物，该芯片和底物必须对应于目标检测物。这样会造成同时检测多个目标物时，一块芯片上必须同时种植多种底物。这样的缺点就是芯片的制备过程很繁琐，不易于控制，而且也可能会出现相邻芯片的底物相互污染的现象，最终导致检测结果不准确或不稳定。
在DNA检测过程中，现有技术主要通过以下两种途径：(1)模板扩增技术，它通过扩增靶序列来提高敏感性；(2)信号放大***，它通过放大信号强度来提高敏感性，它反应迅速，简便易行，没有模板扩增的干扰因素。
然而，许多与疾病相关的生命物质(如特定蛋白质、酶、糖等分子或分子团，在疾病检测中称为标记物)在活体中的含量低不易被检测。
与此同时，考虑到几乎所有的药物代谢酶都具有遗传多态性，并且绝大多数药物代谢酶的多态性是一种单核苷酸多态性(SNP)，是由于同一基因位点上具有多个等位基因引起的。等位基因编码的代谢酶具有不同的药物代谢能力，这对治疗的个体反应和药物毒副作用都产生重要影响。因此，通过检测药物代谢酶是否存在突变，进而预测药物的治疗效果，对于个性化医疗同样具有十分重要的作用。
因此，很多放大的方法被提出来以增加DNA突变或SNP检测的灵敏度。但是，现有的方法主要是针对测试***中的放大效应，不存在前置的信号中转***，同时其放大效率相对较低。
发明内容
发明要解决的问题
本公开的一个目的在于，为了克服上述现有技术的不足之处，而提供一种新的DNA样品的检测试剂盒，该试剂盒可利用统一的芯片和底物检测多个目标物，避免了不同底物的交叉污染。
在一个实施方式中，本公开还提供了利用上述试剂盒对DNA样品进行检测的方法。
本公开的另一个目的在于，为了克服上述现有技术的不足之处，提供一种用于DNA样品检测的试剂盒和方法，所述试剂盒含有信号放大***，采用该信号放大***检测DNA时，检测灵敏度更高。
用于解决问题的方案
为实现上述目的，本公开采取的技术方案如下。
在一个技术方案中，本公开涉及一种DNA样品的检测试剂盒，所述DNA样品的检测试剂盒包括捕获探针、中转物和终端信号物、未经修饰的固相载体和经亲和物质M5修饰的磁珠；其中，
所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针含有与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段，所述部分核苷酸序列B1含有待测位点；
所述中转物和终端信号物均为DNA片段，所述中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对，所述中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1互补配对；和
所述试剂盒还包括带有底物的芯片，所述底物为DNA片段，所述底物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C2互补配对；和/或所述试剂盒还包括信号转换物，所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对；
其中，所述终端信号物或信号转换物上标记有亲和物质M6，亲和物质M6与亲和物质M5之间具有亲和力。
在上述方案的一个具体的实施方式中，Tm1为所述捕获探针与所述待测DNA片段的部分核苷酸序列B1结合碱基对分离时的温度；Tm2为所述中转物的核苷酸序列L1与所述待测DNA片段的部分核苷酸序列B2结合碱基对分离时的温度；Tm3为所述中转物的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1结合碱基对分离时的温度；Tm4为所述终端信号物的部分核苷酸序列C3与所述信号转换物结合碱基对分离时的温度；其特征在于，在Tm1、Tm2、Tm3、Tm4中，Tm3的数值最低。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述试剂盒包括带有底物的芯片时，所述终端信号物的部分核苷酸序列C2的长度长于终端信号物的部分核苷酸序列C1的长度；所述试剂盒包括信号转换物时，所述终端信号物的部分核苷酸序列C3的长度长于终端信号物的部分核苷酸序列C1的长度。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针中与部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段的长度为6～20bp。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述捕获探针中与部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段的长度为10～15bp。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述捕获探针上带有能增强碱基配对的结合力的修饰物。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述修饰物为PNA、LNA、MNA、ANA、TNA、CeNA、GNA、XNA、HNA、INA、BNA中的至少一种。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述未经修饰的固相载体为磁珠、或者由玻璃或尼龙构成的微粒。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述亲和物质M5为氨基、聚赖氨酸、巯基、牛血清蛋白、亲和素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺胶。
在一个优选的实施方式中，所述亲和物质M5为链霉亲和素，所述亲和物质M6为生物素。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述芯片中的固相载体包括选自Al2O3、玻璃、聚合物和尼龙的组中的至少一种。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述终端信号物的部分核苷酸序列C1的长度为10～15bp；所述终端信号物的部分核苷酸序列C2的长度为16～60bp；所述终端信号物的部分核苷酸序列C3的长度为16～60bp。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述终端信号物的部分核苷酸序列C2的长度为25～60bp；所述终端信号物的部分核苷酸序列C3的长度为25～60bp。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述试剂盒包括带有底物的芯片时，底物中与核苷酸序列C2互补配对的核苷酸序列的长度长于底物中剩余的核苷酸序列的长度。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述DNA样品来自人体的血液。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述DNA样品中待测DNA片段为带有突变位点的DNA片段。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述DNA样品中待测DNA片段为含有G380R突变位点的FGFR3基因片段。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述DNA样品中待测DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述中转物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述终端信号物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述信号转换物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述底物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述DNA样品中待测DNA片段为含有G681A位点的CYP2C19基因片段。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述DNA样品中待测DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述中转物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述终端信号物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述信号转换物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述底物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在上述方案的一个具体的实施方式中，还包括待测DNA片段的标准溶液。
在一个优选的实施方式中，所述检测试剂盒还包括杂交液和清洗液。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述洗脱液含有去离子甲酰胺、2×SSC、5×Denhard's，SDS和去离子水；所述清洗液含有Tris-Citric、NaCl和Tween20。
在另一个技术方案中，本公开还涉及检测DNA样品的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将捕获探针偶联于未经修饰的固相载体上；
(2)将偶联了捕获探针的固相载体和DNA样品中待测DNA片段加至杂交液中，使捕获探针与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1杂交；反应完后，分离出偶联了待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(3)将步骤(2)分离得到的固相载体与中转物加至杂交液中，使中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2杂交；反应完后，分离出偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(4)将步骤(3)分离得到的固相载体与终端信号物加至杂交液中，使中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1杂交；反应完后，分离出偶联了终端信号物、中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(5)将步骤(4)分离得到的固相载体和信号转换物加至杂交液中，使信号转换物与终端信号物的部分核苷酸序列C3杂交，形成终端信号物与信号转换物的复合体，并分离出偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(6)通过终端信号物或信号转换物上标记的亲和物质M6，将所得复合体偶联于经亲和物质M5修饰的磁珠上，形成信号磁珠；
(7)检测信号磁珠的信号量，计算DNA样品中待测DNA片段的含量；其中，
所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针含有与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段；
所述部分核苷酸序列B1含有待测位点；
所述中转物和终端信号物均为DNA片段，所述中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对；
所述中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1互补配对；
所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述步骤(5)和步骤(6)之间还包括以下步骤(5a)：将终端信号物与信号转换物的复合体与带有底物的芯片反应，使底物与终端信号物的部分核苷酸序列C2杂交，得到芯片、底物、终端信号物与信号转换物的复合体；其中，
所述底物为DNA片段，所述底物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C2互补配对；
所述芯片还含有磁传感器。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中，分离出固相载体后，分别采用清洗液清洗固相载体。
在另一个技术方案中，本公开还涉及检测DNA样品的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将捕获探针偶联于未经修饰的固相载体上；
(2)将偶联了捕获探针的固相载体和DNA样品中待测DNA片段加至杂交液中，使捕获探针与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1杂交；反应完后，分离出偶联了待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(3)将步骤(2)分离得到的固相载体与中转物加至杂交液中，使中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2杂交；反应完后，分离出偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(4)将步骤(3)分离得到的固相载体与终端信号物加至杂交液中，使中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1杂交；反应完后，分离出偶联了终端信号物、中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；清洗未结合的终端信号物后，固相载体经过适当的温度处理，使终端信号物从固相载体上脱离下来进入溶液，去除偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(5)将步骤(4)得到的含有终端信号物的溶液与带有底物的芯片反应，使底物与终端信号物的部分核苷酸序列C2杂交，形成芯片、底物与终端信号物的复合体；
(6)通过终端信号物上标记的亲和物质M6，将所得复合体偶联于经亲和物质M5修饰的磁珠上，形成信号磁珠；
(7)检测信号磁珠的信号量，计算DNA样品中待测DNA片段的含量；其中，
所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针含有与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段；
所述部分核苷酸序列B1含有待测位点；
所述中转物和终端信号物均为DNA片段，所述中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对；
所述中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1互补配对；
所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对；
所述底物为DNA片段，所述底物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C2互补配对；
所述芯片还含有磁传感器。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述步骤(2)和步骤(3)中，分离出固相载体后，分别采用清洗液清洗固相载体。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述步骤(2)中，反应的温度为45℃，反应的时间为20分钟；所述步骤(3)和步骤(4)中，反应的温度均为25℃，反应的时间均为20分钟。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述步骤(7)中，采用磁信号检测设备检测信号磁珠的信号量；其中所述设备是可以选自由霍尔元件，磁阻效应元件(磁阻传感器)组成的组中至少一种，所述磁阻效应元件可以选自GMR传感器(巨磁阻传感器)和TMR传感器(隧道磁阻传感器)。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述DNA样品中待测DNA片段的获取方法为：采集人体的血液，提取血液中的DNA，再将提取的DNA片段化。
在上述方案的一个具体的实施方式中，通过酶切法或超声法将提取的DNA片段化。
在另一个技术方案中，本公开涉及一种DNA样品的检测试剂盒，所述DNA样品的检测试剂盒包括捕获探针、初级信号放大物和次级信号放大物、未经修饰的固相载体、经亲和物质M5修饰的磁珠和信号转换物；其中，
所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针含有与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段，所述部分核苷酸序列B1含有待测位点；
所述初级信号放大物包括第一中转物，所述第一中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对；所述第一中转物的另一端的核苷酸序列L2含有m1个核苷酸片段L3；
所述次级信号放大物包括第一终端信号物，所述第一终端信号物含有核苷酸序列C1和核苷酸序列C2，核苷酸序列C2含有n1个与信号转换物的部分或全部DNA片段互补配对的核苷酸序列C3；
所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对；
所述终端信号物或信号转换物上标记有亲和物质M6，亲和物质M6与亲和物质M5之间具有亲和力；
所述核苷酸片段L3与所述核苷酸序列C1互补配对；
m1和n1均为正整数。
在上述方案的一个具体的实施方式中，任选地，m1和n1不同时为1。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述第一中转物的核苷酸序列L2的末端修饰有亲和物质M2；所述初级信号放大物还包括亲和物质M1和第二中转物；所述第二中转物含有m2个核苷酸片段L3，m2为正整数；所述第二中转物的5’末端和/或3’末端修饰有亲和物质M2；所述亲和物质M2与亲和物质M1之间具有亲和力；所述第一中转物和第二中转物通过亲和物质M2连接于亲和物质M1上。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述第一终端信号物的末端修饰有亲和物质M4；所述次级信号放大物还包括亲和物质M3和第二终端信号物，所述第二终端信号物含有n2个核苷酸序列C3，n2为正整数；所述第二终端信号物的5’末端和/或3’末端修饰有亲和物质M4；所述亲和物质M3与亲和物质M4之间具有亲和力；所述第一终端信号物和第二终端信号物通过亲和物质M4连接于所述亲和物质M3上。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述m1＝5，和/或所述n1＝2。
在另一个技术方案中，本公开涉及一种DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品的检测试剂盒包括捕获探针、初级信号放大物和次级信号放大物、未经修饰的固相载体、经亲和物质M5修饰的磁珠和信号转换物；其中，
所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针含有与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段，所述部分核苷酸序列B1含有待测位点；
所述初级信号放大物包括第一中转物，所述第一中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对；所述第一中转物的另一端的核苷酸序列L2含有m1个核苷酸片段L3；
所述次级信号放大物包括第一终端信号物，所述第一终端信号物含有核苷酸序列C1和核苷酸序列C2，核苷酸序列C2含有n1个与信号转换物的部分或全部DNA片段互补配对的核苷酸序列C3；
所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对；和
所述第一中转物的核苷酸序列L2的末端修饰有亲和物质M2；所述初级信号放大物还包括亲和物质M1和第二中转物；所述第二中转物含有m2个核苷酸片段L3；所述第二中转物的5’末端和/或3’末端修饰有亲和物质M2；所述亲和物质M2与亲和物质M1之间具有亲和力，所述第一中转物和第二中转物通过亲和物质M2连接于亲和物质M1上；或者，所述第一终端信号物的末端修饰有亲和物质M4；所述次级信号放大物还包括亲和物质M3和第二终端信号物，所述第二终端信号物含有n2个核苷酸序列C3；所述第二终端信号物的5’末端和/或3’末端修饰有亲和物质M4；所述亲和物质M3与亲和物质M4之间具有亲和力，所述第一终端信号物和第二终端信号物通过亲和物质M4连接于所述亲和物质M3上；
所述终端信号物或信号转换物上标记有亲和物质M6，亲和物质M6与亲和物质M5之间具有亲和力；
所述核苷酸片段L3与所述核苷酸序列C1互补配对；
m1和n1均为正整数；m2和n2均为正整数；
任选的，m1和n1同时为1。
在前述技术方案的一个具体的实施方式中，Tm1为捕获探针与待测DNA片段的核苷酸序列B1结合碱基对分离时的温度；Tm2为初级信号放大物的核苷酸序列L1与待测DNA片段的核苷酸序列B2结合碱基对分离时的温度；Tm3为初级信号放大物的核苷酸序列L3与次级信号放大物的核苷酸序列C1结合碱基对分离时的温度；Tm4为次级信号放大物的核苷酸序列C3与信号转换物结合碱基对分离时的温度；其特征在于，在Tm1、Tm2、Tm3、Tm4中，Tm3的数值最低。
在前述技术方案的一个具体的实施方式中，所述试剂盒还包括带有底物的芯片，所述底物为DNA片段，所述第一终端信号物还含有核苷酸序列C4，所述底物的部分或全部片段与核苷酸序列C4互补配对。
在前述技术方案的一个具体的实施方式中，所述第二中转物的核苷酸序列与所述第一中转物的另一端的核苷酸序列L2相同。
在前述技术方案的一个具体的实施方式中，所述第二终端信号物的核苷酸序列与所述第一终端信号物的核苷酸序列C2相同。
在前述技术方案的一个具体的实施方式中，所述亲和物质M1或M3或M5为氨基、聚赖氨酸、巯基、牛血清蛋白、亲和素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺胶。
在一个优选的实施方式中，所述亲和物质M1为链霉亲和素，所述亲和物质M2为生物素；或者所述亲和物质M3为链霉亲和素，所述亲和物质M4为生物素；或者所述亲和物质M5为链霉亲和素，所述亲和物质M6为生物素。
在前述技术方案的一个具体的实施方式中，所述核苷酸序列C3的长度长于核苷酸序列C1的长度。
在前述技术方案的一个具体的实施方式中，所述核苷酸序列C3的长度为16～60bp，所述核苷酸序列C1的长度为10～15bp。
在一个优选的实施方式中，所述核苷酸序列C3的长度为25～60bp。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述核苷酸序列C4的长度长于核苷酸序列C1的长度。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述核苷酸序列C4的长度为16～60bp，所述核苷酸序列C1的长度为10～15bp。
在一个优选的实施方式中，所述核苷酸序列C4的长度为25～60bp。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述底物中与核苷酸序列C4互补配对的核苷酸序列的长度长于底物中剩余的核苷酸序列的长度。
在前述技术方案的一个具体的实施方式中，所述芯片中的固相载体包括选自Al2O3、玻璃、聚合物和尼龙的组中的至少一种。
在前述技术方案的一个具体的实施方式中，所述DNA样品来自人体的血液。
在前述技术方案的一个具体的实施方式中，所述DNA样品中待测DNA片段为带有突变位点的DNA片段。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述DNA样品中待测DNA片段为含有G380R突变位点的FGFR3基因片段。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述DNA样品中待测DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；所述中转物的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；所述终端信号物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；所述信号转换物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；所述底物的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述DNA样品中待测DNA片段为含有G681A位点的CYP2C19基因片段。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述DNA样品中待测DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；所述中转物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；所述终端信号物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；所述信号转换物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；所述底物的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
在上述方案的一个具体的实施方式中，还包括待测DNA片段的标准溶液；优选的，所述检测试剂盒还包括杂交液和清洗液。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述洗脱液含有去离子甲酰胺、2×SSC、5×Denhard's，SDS和去离子水；所述清洗液含有Tris-Citric、NaCl和Tween20。
在另一个技术方案中，本公开涉及使用DNA样品的检测试剂盒检测DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将捕获探针偶联于未经修饰的固相载体上；
(2)将偶联了捕获探针的固相载体和DNA样品中待测DNA片段加至杂交液中，使捕获探针与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1杂交；反应完后，分离出偶联了待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(3)将步骤(2)分离得到的固相载体与初级信号放大物加至杂交液中，使第一中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2杂交；反应完后，分离出偶联了初级信号放大物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(4)将步骤(3)分离得到的固相载体与次级信号放大物加至杂交液中，使初级信号放大物中的核苷酸序列L3与次级信号放大物中的的核苷酸序列C1杂交；反应完后，分离出偶联了次级信号放大物、初级信号放大物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(5)将步骤(4)分离得到的固相载体和信号转换物加至杂交液中，使信号转换物与次级信号放大物的核苷酸序列C3杂交，形成次级信号放大物与信号转换物的复合体，并分离出偶联了初级信号放大物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(6)通过信号转换物上修饰的亲和物质M6，将所得复合体偶联于经亲和物质M5修饰的磁珠上，形成信号磁珠；
(7)检测信号磁珠的信号量，计算DNA样品中待测DNA片段的含量。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述步骤(5)和步骤(6)之间还包括以下步骤(5a)：将次级信号放大物与信号转换物的复合体与带有底物的芯片反应，使底物与第一终端信号物中的核苷酸序列C4杂交，得到芯片、底物、次级信号放大物与信号转换物的复合体。
在另一个技术方案中，本公开还提供一种前述试剂盒在制备用于疾病标记物的检测、药物的治疗效果和/或药物的治疗的副作用大小的预测的试剂盒中的用途。
发明的效果
在一个实施方式中，本公开在测定待测DNA片段时，先通过测试***外部的生物转化过程来使得待测物统一化，这样芯片的底物只对应于统一标准物。由此，统一的芯片和底物可以检测多个目标物，同时芯片的制备简单化，并且避免了不同底物的交叉污染。
在另一个实施方式中，本公开通过在初级信号放大物上设计至少一个与次级信号放大物中核苷酸序列C1互补配对的序列，以将多个次级信号放大物杂交于初级信号放大物上；进一步通过在次级信号放大物上设计至少一个与信号转换物互补配对的核苷酸序列，以将多个信号转换物杂交于次级信号放大物。由此，在相同量待测DNA片段的情况下，得到次级信号放大物与信号转换物的复合物会扩大很多倍，最终的测试信号也成倍扩大，故测定的灵敏度会随之提高多倍。
在另一个实施方式中，本公开在中转物(第一中转物和第二中转物)或终端信号物(第一终端信号物和第二终端信号物)的末端修饰亲和物质，利用亲和物质之间的高度亲和力，一分子待测DNA片段可以间接结合多个次级信号放大物，使得次级信号放大物与信号转换物的复合物扩大多倍，最终的测试信号也成倍扩大，从而进一步提高了灵敏度。
附图说明
图1为本公开实施例1中检测DNA样品的方法的原理图。
图2为本公开实施例1中FGFR3基因G380R突变位点检测的核苷酸序列结果图。
图3为本公开实施例3中检测DNA样品的方法的原理图。
图4为本公开实施例3中序列的结构示意图；
图5为本公开采用实施例3信号放大***检测DNA的原理图；
图6为本公开实施例4中序列的结构示意图；
图7为本公开实施例5中序列的结构示意图；
图8为本公开实施例5中初级信号放大物的结构示意图。
具体实施方式
定义
在本公开的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
现有技术中，检测多种疾病目标物时，主要是利用对应特异结合的探测芯片，芯片和底物必须对应于目标检测物。这样芯片的制备过程很繁琐，不易于控制，而且也可能会出现相邻芯片的底物相互污染的现象，最终导致检测结果不准确或不稳定。
为了克服这些缺点，在一个技术方案中，本公开提供了一种DNA样品的检测试剂盒，其包括捕获探针、中转物和终端信号物、未经修饰的固相载体和经亲和物质M5修饰的磁珠；所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针含有与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段，所述部分核苷酸序列B1含有待测位点；所述中转物和终端信号物均为DNA片段，所述中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对，所述中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1互补配对；
所述试剂盒还包括带有底物的芯片，所述底物为DNA片段，所述底物的部分或全部片段E1与终端信号物的部分核苷酸序列C2互补配对；和/或所述试剂盒还包括信号转换物，所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对；
所述终端信号物或信号转换物上标记有亲和物质M6，亲和物质M6与亲和物质M5之间具有亲和力。
在如上所述的技术方案中，本公开DNA样品的检测试剂盒，其检测原理如图1所示。图1中，Tm表示结合碱基对分离时的温度，Tm越高，结合的2个序列的结合力越大，就越稳定。Tm1为捕获探针与待测DNA片段的核苷酸序列B1结合碱基对分离时的温度；Tm2为中转物的核苷酸序列L1与待测DNA片段的核苷酸序列B2结合碱基对分离时的温度；Tm3为中转物的核苷酸序列L2与终端信号物的核苷酸序列C1结合碱基对分离时的温度；Tm4为终端信号物的核苷酸序列C3与信号转换物结合碱基对分离时的温度。在Tm1、Tm2、Tm3、Tm4中，Tm3最小(例如：Tm4≈Tm1≈Tm2>Tm3)，这样在一定的温度下(例如65℃)可以实现只有核苷酸序列L2与终端信号物的核苷酸序列C1的结合碱基断开。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，本公开的检测原理具体为：利用特异设计的捕获探针与DNA样品中待测DNA片段杂交，从而捕获待测DNA片段；再通过中转物和终端信号物将捕获探针与待测DNA片段的杂交物转化为统一设计的探测信号；探测信号通过设定的条件脱离复合体，进入测试***；最后，通过亲和物质M5和亲和物质M6之间的高度亲和力，将探测信号结合于磁珠上，并检测磁珠的信号。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，本公开的检测试剂盒，其解决了芯片制备繁琐、相邻芯片底物污染的问题；同时也利于工艺过程的可控性。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，本公开的试剂盒可用于DNA样品的检测。
在一个技术方案中，本公开提供一种用于DNA检测的信号放大***，所述放大***包括：捕获探针、初级信号放大物和次级信号放大物；所述捕获探针、初级信号放大物和次级信号放大物均为DNA片段。
在另一个技术方案中，本公开还提供一种DNA样品的检测试剂盒，所述DNA样品的检测试剂盒包括捕获探针、初级信号放大物和次级信号放大物、未经修饰的固相载体、经亲和物质M5修饰的磁珠和信号转换物；其中，
所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针含有与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段，所述部分核苷酸序列B1含有待测位点；所述初级信号放大物包括第一中转物，所述第一中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对；所述第一中转物的另一端的核苷酸序列L2含有m1个核苷酸片段L3；所述次级信号放大物包括第一终端信号物，所述第一终端信号物含有核苷酸序列C1和核苷酸序列C2，核苷酸序列C2含有n1个与信号转换物的部分或全部DNA片段互补配对的核苷酸序列C3；所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对；所述终端信号物或信号转换物上标记有亲和物质M6，亲和物质M6与亲和物质M5之间具有亲和力；所述核苷酸片段L3与所述核苷酸序列C1互补配对；m1和n1均为正整数。
在上述技术方案的一个优选实施方式中，m1和n1不同时为1。
在另一个技术方案中，本公开还提供一种DNA样品的检测试剂盒，所述DNA样品的检测试剂盒包括捕获探针、初级信号放大物和次级信号放大物、未经修饰的固相载体、经亲和物质M5修饰的磁珠和信号转换物；其中，所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针含有与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段，所述部分核苷酸序列B1含有待测位点；所述初级信号放大物包括第一中转物，所述第一中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对；所述第一中转物的另一端的核苷酸序列L2含有m1个核苷酸片段L3；所述次级信号放大物包括第一终端信号物，所述第一终端信号物含有核苷酸序列C1和核苷酸序列C2，核苷酸序列C2含有n1个与信号转换物的部分或全部DNA片段互补配对的核苷酸序列C3；所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，所述第一中转物的核苷酸序列L2的末端修饰有亲和物质M2；所述初级信号放大物还包括亲和物质M1和第二中转物；所述第二中转物含有m2个核苷酸片段L3；所述第二中转物的5’末端和/或3’末端修饰有亲和物质M2；所述亲和物质M2与亲和物质M1之间具有亲和力，所述第一中转物和第二中转物通过亲和物质M2连接于亲和物质M1上。
在上述技术方案的另一个具体实施方式中，所述第一终端信号物的末端修饰有亲和物质M4；所述次级信号放大物还包括亲和物质M3和第二终端信号物，所述第二终端信号物含有n2个核苷酸序列C3；所述第二终端信号物的5’末端和/或3’末端修饰有亲和物质M4；所述亲和物质M3与亲和物质M4之间具有亲和力，所述第一终端信号物和第二终端信号物通过亲和物质M4连接于所述亲和物质M3上；所述终端信号物或信号转换物上标记有亲和物质M6，亲和物质M6与亲和物质M5之间具有亲和力；所述核苷酸片段L3与所述核苷酸序列C1互补配对；m1和n1均为正整数；m2和n2均为正整数。
在上述技术方案的一个优选实施方式中，m1和n1同时为1。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，通过在序列末端修饰亲和物质M2，并将亲和物质M2均连接于M1，这样一个初级信号放大物上可以连接一个第一中转物和至少一个第二中转物，初级信号放大物上所连接的核苷酸片段L3将增多，从而连接更多的第一终端信号物。例如，当亲和物质M1为链霉亲和素，亲和物质M2为生物素时，一分子链霉亲和素能与4分子生物素连接，故第二中转物的一个末端修饰亲和物质M2时，初级信号放大物含有1个第一中转物和3个第二中转物，其上含有(m1+3m2)个核苷酸片段L3。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，信号转换物是与检测信号物(例如磁珠)连接的核苷酸片段。捕获探针与待测DNA片段中核苷酸序列B1互补配对，从而将待测DNA片段捕获；第一中转物通过核苷酸片段L1与待测DNA片段中核苷酸序列B2互补配对，同时通过核苷酸片段L3与第一终端信号物的核苷酸序列C1互补配对；第一终端信号物的核苷酸序列C3与信号转换物互补配对。当第一中转物含有两个或多个核苷酸片段L3时，一分子待测DNA片段将连接两个或多个第一终端信号物，从而所连接的信号转换物也成倍扩大。
在上述技术方案的另一个具体实施方式中，当第一终端信号物含有两个或多个核苷酸序列C3时，所连接的信号转换物也成倍扩大。由此可见，当第一中转物含有m1核苷酸片段L3，第一终端信号物仅含1个核苷酸序列C3时，信号会放大m1倍；当第一中转物仅含1核苷酸片段L3时，第一终端信号物仅含有n1个核苷酸序列C3时，信号会放大n1倍；当第一中转物含有m1核苷酸片段L3，第一终端信号物仅含有n1个核苷酸序列C3时，信号会放大m1×n1倍。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，所述第一中转物的另一端的核苷酸序列L2中，若m1大于1，任意两个相邻的核苷酸片段L3之间可以不含有核苷酸，也可以含有若干个核苷酸，例如1个、2个、3个……核苷酸；所述第一终端信号物的核苷酸序列C2中，若n1大于1，任意两个相邻的核苷酸片段C3之间可以不含有核苷酸，也可以含有若干个核苷酸，例如1个、2个、3个……核苷酸。
在上述技术方案的一个优选实施方式中，所述第一中转物的核苷酸序列L2的末端修饰有亲和物质M2；所述初级信号放大物还包括亲和物质M1和第二中转物；所述第二中转物含有m2个核苷酸片段L3，m2为正整数；所述第二中转物的5’末端和/或3’末端修饰有亲和物质M2；所述亲和物质M2与亲和物质M1之间具有亲和力；所述第一中转物和第二中转物通过亲和物质M2连接于亲和物质M1上。
在上述技术方案的另一个具体实施方式中，通过在序列末端修饰亲和物质M2，并将亲和物质M2均连接于M1，这样一个初级信号放大物上可以连接一个第一中转物和至少一个第二中转物，初级信号放大物上所连接的核苷酸片段L3将增多，从而连接更多的第一终端信号物。例如，当亲和物质M1为链霉亲和素，亲和物质M2为生物素时，一分子链霉亲和素能与4分子生物素连接，故第二中转物的一个末端修饰亲和物质M2时，初级信号放大物含有1个第一中转物和3个第二中转物，其上含有(m1+3m2)个核苷酸片段L3。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，所述第二中转物的核苷酸序列与所述第一中转物的另一端的核苷酸序列L2相同。此时，当第二中转物的一个末端修饰亲和物质M2时，初级信号放大物上连接的核苷酸片段L3较不经亲和物质修饰时扩大了4倍，故总信号会放大4m1n1倍；第二中转物的两个末端修饰亲和物质M2时，总信号会放大(3X-1)m1n1/2倍，X表示连接的级数。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，所述第一终端信号物的末端修饰有亲和物质M4；所述次级信号放大物还包括亲和物质M3和第二终端信号物，所述第二终端信号物含有n2个核苷酸序列C3，n2为正整数；所述第二终端信号物的5’末端和/或3’末端修饰有亲和物质M4；所述亲和物质M3与亲和物质M4之间具有亲和力；所述第一终端信号物和第二终端信号物通过亲和物质M4连接于所述亲和物质M3上。
在上述技术方案的另一个具体实施方式中，通过在第一终端信号物和第二终端信号物的末端修饰亲和物质M4，并将亲和物质M4均连接于M3，这样第一终端信号物上的核苷酸序列C3增多，从而连接更多的信号转换物。例如，当亲和物质M3为链霉亲和素，亲和物质M4为生物素时，一分子链霉亲和素能与4分子生物素连接，故第二终端信号物的一个末端修饰亲和物质M4时，次级信号放大物含有1个第一终端信号物和3个第二终端信号物，其上含有(n1+3n2)个核苷酸片段L3。此时，次级信号放大物上连接的核苷酸片段C3较不经亲和物质修饰时扩大了4倍，故总信号会放大4m1n1倍。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，所述第二终端信号物的核苷酸序列与所述第一终端信号物的核苷酸序列C2相同。此时，当第二终端信号物的一个末端修饰亲和物质M4时，较不经亲和修饰时信号放大了4倍。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，所述m1＝5，和/或所述n1＝2。当m1＝5时，信号放大5倍；当n1＝2时，信号放大2倍；当m1＝5，n1＝2时，信号放大10倍。
在一个技术方案中，本公开通过在中转物(第一中转物和第二中转物)或终端信号物(第一终端信号物和第二终端信号物)的末端修饰亲和物质，利用亲和物质之间的高度亲和力，一分子待测DNA片段可以间接结合多个次级信号放大物，使得次级信号放大物与信号转换物的复合物扩大多倍，最终的测试信号也成倍扩大，从而进一步提高了灵敏度。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，所述第二中转物的核苷酸序列与所述第一中转物的另一端的核苷酸序列L2相同。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，所述第二终端信号物的核苷酸序列与所述第一终端信号物的核苷酸序列C2相同。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，捕获探针中与部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段的长度若太短，则二者结合的稳定性差；虽然该DNA片段的长度越长，其与部分核苷酸序列B1结合的稳定性越高，但若其过长，则难以区分野生型基因和突变型基因。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，所述捕获探针中与部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段的长度为6～20bp。例如，捕获探针中与部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段的长度以是6bp、8bp、10bp、12bp、16bp、18bp、20bp等。
在上述技术方案的一个优选实施方式中，所述捕获探针中与部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段的长度为10～15bp。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，为了提高捕获探针与待测DNA片段杂交物的稳定性，所述捕获探针上带有能增强碱基配对的结合力的修饰物。通过修饰物，更有利于区分野生型基因和突变型基因。
在上述技术方案的一个优选实施方式中，所述修饰物为PNA、LNA、MNA、ANA、TNA、CeNA、GNA、XNA、HNA、INA、BNA中的至少一种。当然，修饰物并不限于所述物质，本领域的技术人员可根据常规选择其他增强碱基配对的结合力的修饰物。
另外，本公开还提供了一种用于DNA检测的试剂盒，其包括上述信号放大***，还包括未经修饰的固相载体、经亲和物质M5修饰的磁珠和信号转换物；所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部DNA片段与核苷酸序列C3互补配对，所述信号转换物上修饰有亲和物质M6，所述亲和物质M5与亲和物质M6之间具有亲和力。
在一个技术方案中，本公开的试剂盒的检测原理如图3所示。图3中，Tm表示结合碱基对分离时的温度，Tm越高，结合的2个序列的结合力越大，就越稳定。Tm1为捕获探针与待测DNA片段的核苷酸序列B1结合碱基对分离时的温度；Tm2为初级信号放大物的核苷酸序列L1与待测DNA片段的核苷酸序列B2结合碱基对分离时的温度；Tm3为初级信号放大物的核苷酸序列L3与次级信号放大物的核苷酸序列C1结合碱基对分离时的温度；Tm4为次级信号放大物的核苷酸序列C3与信号转换物结合碱基对分离时的温度。在Tm1、Tm2、Tm3、Tm4中，Tm3最小(例如：Tm4≈Tm1≈Tm2>Tm3)，这样在一定的温度下(例如65℃)可以实现只有核苷酸序列L3与次级信号放大物的核苷酸序列C1的结合碱基断开。
在一个技术方案中，本公开的检测原理具体为：利用特异设计的捕获探针与DNA样品中待测DNA片段杂交，从而捕获待测DNA片段；再通过初级信号放大物和次级信号放大物将捕获探针与待测DNA片段的杂交物转化为统一设计的探测信号；探测信号通过设定的条件脱离复合体，进入测试***；最后，通过亲和物质之间的高度亲和力，将探测信号结合于磁珠上，并检测磁珠的信号。更重要的是，本公开的检测试剂盒利用了本公开的信号放大***，其灵敏度大幅度提升。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，所述经亲和物质M1和亲和物质M2是一对具有特异性结合作用(即亲和作用)的物质，当亲和物质M1确定时，可依据亲和作用选择对应的亲和物质M2；当亲和物质M2确定时，可依据亲和作用选择对应的亲和物质M1。例如所述亲和物质M1优选但不限于氨基、聚赖氨酸、巯基、牛血清蛋白、亲和素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺胶。更优选地，所述亲和物质M1为链霉亲和素，所述亲和物质M2为生物素。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，所述经亲和物质M3和亲和物质M4是一对具有特异性结合作用(即亲和作用)的物质，当亲和物质M3确定时，可依据亲和作用选择对应的亲和物质M4；当亲和物质M4确定时，亦可依据亲和作用选择对应的亲和物质M3。例如所述亲和物质M3优选但不限于氨基、聚赖氨酸、巯基、牛血清蛋白、亲和素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺胶。更优选地，所述亲和物质M3为链霉亲和素，所述亲和物质M4为生物素。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，当试剂盒包括信号转换物时，亲和物质M6可标记于终端信号物上，也可以标记于信号转换物上；当试剂盒不包括信号转换物时，亲和物质M6标记于终端信号物上。其中，所述经亲和物质M5和亲和物质M6是一对具有特异性结合作用(即亲和作用)的物质，当亲和物质M5确定时，可依据亲和作用选择对应的亲和物质M6；当亲和物质M6确定时，亦可依据亲和作用选择对应的亲和物质M5。例如，所述亲和物质M5可优选但不限于氨基、聚赖氨酸、巯基、牛血清蛋白、亲和素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺胶。当亲和物质M5为亲和素时，亲和物质M6为生物素。更优选地，所述亲和物质M5为链霉亲和素，所述亲和物质M6为生物素。
作为本公开所述检测试剂盒的优选实施方式，所述未经修饰的固相载体为磁珠、或者由玻璃或尼龙构成的微粒。更优选地，所述未经修饰的固相载体为磁珠。
作为本公开所述检测试剂盒的优选实施方式，所述芯片中的载体选自无机材料或聚合物材料(例如玻璃，尼龙)。需说明的是，芯片中的固相载体不能选用磁珠。这是因为使用本公开的试剂盒时，芯片是与终端信号物连接的，终端信号物还会直接或间接与信号磁珠(经亲和物质M5修饰的磁珠)连接，如果芯片中的固相载体选用磁珠，它会干扰信号磁珠的信号，从而导致DNA样品测定结果不准确。
在一个特定的实施方案中，芯片中的固相载体，例如无机材料或聚合物材料，具有一层或多层，例如两层，三层或四层。
在一个具体的实施方案中，芯片中的固相载体具有三层。具体而言，连接至底物的上层包含以下成分中的至少一种：磷酸，硅烷偶联剂或可连接至底物的其他成分；固相载体的中层覆盖有Al2O3；固相载体的下层包含GMR传感器。
在一个具体的实施方式中，为了使得终端信号物与底物或信号转换物之间的结合较终端信号物与中转物之间的结合更稳定，便于终端信号物与中转物脱离，所述试剂盒包括带有底物的芯片时，所述终端信号物的部分核苷酸序列C2的长度长于终端信号物的部分核苷酸序列C1的长度；所述试剂盒包括信号转换物时，所述终端信号物的部分核苷酸序列C3的长度长于终端信号物的部分核苷酸序列C1的长度。通过上述方式，可以使得片段L2和片段C1脱离，而其它片段之间不脱离，进而将用于检测的目的片段和其它片段分离。
作为本公开所述DNA检测试剂盒的优选实施方式，所述终端信号物的部分核苷酸序列C1的长度为10～15bp；所述终端信号物的部分核苷酸序列C2的长度为16～60bp；所述终端信号物的部分核苷酸序列C3的长度为16～60bp。
作为本公开所述检测试剂盒的更优选实施方式，所述终端信号物的部分核苷酸序列C2的长度为25～60bp；所述终端信号物的部分核苷酸序列C3的长度为25～60bp。
考虑到碱基直接结合的稳定性，所述试剂盒包括带有底物的芯片时，底物中与核苷酸序列C2互补配对的核苷酸序列(图1中的核苷酸序列E1)的长度长于底物中剩余的核苷酸序列(图1中的核苷酸序列E2)的长度。
作为本公开所述检测试剂盒的优选实施方式，所述DNA样品来自人体的血液。
在上述技术方案的一个优选的具体实施方式中，本公开适用于疾病标记物的检测，例如基因突变。
作为本公开所述检测试剂盒的优选实施方式，所述DNA样品中待测DNA片段为带有突变位点的DNA片段。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，研究发现，成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3)跨膜区突变会导致软骨发育不全(achondroplasia，ACH)。目前，国外以及中国台湾地区报道的突变97％以上于FGFR3基因第10外显子的1138位核苷酸。其中95％为G到A的碱基转换，其余为G到C的颠换。两种突变都导致FGFR3第380位甘氨酸由精氨酸取代(G380R)。
作为本公开所述检测试剂盒的一种具体实施方式，所述DNA样品中待测DNA片段为含有G380R突变位点的FGFR3基因片段。
在前述具体的实施方式中，所述DNA样品中待测DNA片段的核苷酸序列为如下序列：
所述DNA样品中待测DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述中转物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述终端信号物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述信号转换物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述底物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在另一个优选的实施方式中，本公开适用于SNP位点的检测，例如CYP2C19*2(G681A)的检测。
在上述技术方案的一个具体实施方式中，研究发现，CYP2C19参与氯吡格雷活性代谢产物和中间代谢产物的形成。CYP2C19基因具有遗传多样性，使得人群出现快代谢型(EM)、中间代谢型(IM)及慢代谢型(PM)三种表型。氯吡格雷活性代谢物的药代动力学和抗血小板作用随着CYP2C19基因型的不同而有差异，CYP2C19*2(G681A)是中国人群中最常见的遗传变异类型，其会导致转录蛋白的剪切突变，进而使得酶活性丧失，使得人群中出现慢代谢(PM)的表型。CYP2C19慢代谢型(PM)患者应用常规剂量的氯吡格雷后体内活性代谢物生产减少，对血小板的抑制作用下降。也就是说，具有慢代谢(PM)表型的患者，在常规剂量治疗下，心血管事件率较中间代谢型(IM)患者上升，因此，可以考虑使用其他抗血小板药物或调整氯吡格雷的用药剂量。
与此同时，经由CYP2C19酶代谢的常用药物至少还包括：丙戊酸、安定、苯妥英钠、***、氟西汀、阿米替林、曲米帕明、磷酸酰胺、***、氯胍、利福平、兰索拉唑、奈非那韦。因此，只要通过CYP2C19酶代谢的药物，都有必要进行CYP2C19基因检测，以提高治疗效果并降低毒副反应。
作为本公开所述检测试剂盒的一种具体实施方式，所述DNA样品中待测DNA片段为含有G681A位点的CYP2C19基因片段。
因此，在一个技术方案中，本公开涉及的方法和产品可以用于药物的治疗效果和/或副作用大小的预测。
在另一个技术方案中，本公开涉及的方法和产品可以针对治疗方案的选择，提供相应的参考依据。
在一个具体的实施方式中，如果通过上述试剂盒检测到患者存在CYP2C19*2(G681A)，则提示医生需要考虑使用其他抗血小板药物或调整氯吡格雷的用药剂量。
在前述具体的实施方式中，所述DNA样品中待测DNA片段的核苷酸序列为如下序列：
所述DNA样品中待测DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述中转物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述终端信号物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述信号转换物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述底物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述试剂盒还包括待测DNA片段的标准溶液。通过待测DNA片段的标准溶液，可以得到关于信号磁珠的信号量与待测DNA片段的标准曲线，从而对DNA样品中待测DNA片段进行定量分析。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述试剂盒还包括杂交液和清洗液。
在上述方案的一个具体的实施方式中，所述洗脱液含有去离子甲酰胺、2×SSC、5×Denhard's，SDS和去离子水；所述清洗液含有Tris-Citric、NaCl和Tween20。
在一个技术方案中，本公开还提供了采用上述试剂盒检测DNA样品的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将捕获探针偶联于未经修饰的固相载体上；
(2)将偶联了捕获探针的固相载体和DNA样品中待测DNA片段加至杂交液中，使捕获探针与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1杂交；反应完后，分离出偶联了待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(3)将步骤(2)分离得到的固相载体与中转物加至杂交液中，使中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2杂交；反应完后，分离出偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(4)将步骤(3)分离得到的固相载体与终端信号物加至杂交液中，使中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1杂交；反应完后，分离出偶联了终端信号物、中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(5)将步骤(4)分离得到的固相载体和信号转换物加至杂交液中，使信号转换物与终端信号物的部分核苷酸序列C3杂交，形成终端信号物与信号转换物的复合体，并分离出偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(6)通过终端信号物或信号转换物上标记的亲和物质M6，将所得复合体偶联于经亲和物质M5修饰的磁珠上，形成信号磁珠；
(7)检测信号磁珠的信号量，计算DNA样品中待测DNA片段的含量。
当本公开的试剂盒中存在信号转换物，可采用上述方法测定DNA样品。需说明的是，本公开的检测方法，检测时可采用磁传感器、GMR传感器，也可采用TMR传感器。
作为本公开所述检测DNA样品的方法的一种具体实施方式，所述步骤(5)和步骤(6)之间还包括以下步骤(5a)：将终端信号物与信号转换物的复合体与带有底物的芯片反应，使底物与终端信号物的部分核苷酸序列C2杂交，得到芯片、底物、终端信号物与信号转换物的复合体。
作为本公开所述检测DNA样品的方法的一种具体实施方式，所述步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中，分离出固相载体后，分别采用清洗液清洗固相载体。
在另一个技术方案中，本公开还提供了采用上述试剂盒检测DNA样品的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将捕获探针偶联于未经修饰的固相载体上；
(2)将偶联了捕获探针的固相载体和DNA样品中待测DNA片段加至杂交液中，使捕获探针与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1杂交；反应完后，分离出偶联了待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(3)将步骤(2)分离得到的固相载体与中转物加至杂交液中，使中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2杂交；反应完后，分离出偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(4)将步骤(3)分离得到的固相载体与终端信号物加至杂交液中，使中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1杂交；反应完后，分离出偶联了终端信号物、中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；清洗未结合的终端信号物后，固相载体经过适当的温度处理，使终端信号物从固相载体上脱离下来进入溶液，去除偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(5)将步骤(4)得到的含有终端信号物的溶液与带有底物的芯片反应，使底物与终端信号物的部分核苷酸序列C2杂交，形成芯片、底物与终端信号物的复合体；
(6)通过终端信号物上标记的亲和物质M6，将所得复合体偶联于经亲和物质M5修饰的磁珠上，形成信号磁珠；
(7)检测信号磁珠的信号量，计算DNA样品中待测DNA片段的含量。
当本公开的试剂盒中不存在信号转换物，可采用上述方法测定DNA样品。在不存在信号转换物时，需先经过适当的温度处理，将终端信号物分离，再与底物反应。其中，适当的温度须保证终端信号物与中转物的结合碱基对分离，而待测DNA片段与中转物和捕获探针之间的结合碱基对不分离即可，例如适当的温度可选择65℃。
作为本公开所述检测DNA样品的方法的优选实施方式，所述步骤(2)和步骤(3)，分离出固相载体后，分别采用清洗液清洗固相载体。
作为本公开所述检测DNA样品的方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，反应的温度为45℃，反应的时间为20分钟；所述步骤(3)和步骤(4)中，反应的温度均为25℃，反应的时间均为20分钟。
在另一个技术方案中，本公开还提供了采用上述试剂盒检测DNA的方法，其包括以下步骤：
(1)将捕获探针偶联于未经修饰的固相载体上；
(2)将偶联了捕获探针的固相载体和DNA样品中待测DNA片段加至杂交液中，使捕获探针与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1杂交；反应完后，分离出偶联了待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(3)将步骤(2)分离得到的固相载体与初级信号放大物加至杂交液中，使第一中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2杂交；反应完后，分离出偶联了初级信号放大物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(4)将步骤(3)分离得到的固相载体与次级信号放大物加至杂交液中，使初级信号放大物中的核苷酸序列L3与次级信号放大物中的的核苷酸序列C1杂交；反应完后，分离出偶联了次级信号放大物、初级信号放大物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(5)将步骤(4)分离得到的固相载体和信号转换物加至杂交液中，使信号转换物与次级信号放大物的核苷酸序列C3杂交，形成次级信号放大物与信号转换物的复合体，并分离出偶联了初级信号放大物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(6)通过信号转换物上修饰的亲和物质M6，将所得复合体偶联于经亲和物质M5修饰的磁珠上，形成信号磁珠；
(7)检测信号磁珠的信号量，计算DNA样品中待测DNA片段的含量。
需说明的是，本公开的检测方法，包括采用用于检测磁信号的设备。该设备是可以选自由霍尔元件，磁阻效应元件(磁阻传感器)组成的组中至少一种，所述磁阻效应元件可以选自GMR传感器(巨磁阻传感器)和TMR传感器(隧道磁阻传感器)。
作为本公开所述检测DNA的方法的优选实施方式，所述步骤(5)和步骤(6)之间还包括以下步骤(5a)：将次级信号放大物与信号转换物的复合体与带有底物的芯片反应，使底物与第一终端信号物中的核苷酸序列C4杂交，得到芯片、底物、次级信号放大物与信号转换物的复合体。
作为本公开所述检测DNA的方法的优选实施方式，所述步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中，分离出固相载体后，分别采用清洗液清洗固相载体。
作为本公开所述检测DNA的方法的优选实施方式，所述步骤(7)中，采用磁信号检测设备检测信号磁珠的信号量。
作为本公开所述检测DNA的方法的优选实施方式，所述DNA样品中待测DNA片段的获取方法为：采集人体的血液，提取血液中的DNA，再将提取的DNA片段化。
作为本公开所述检测DNA的方法的更优选实施方式，通过酶切法或超声法将提取的DNA片段化。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
实施例中采用的所有试剂，除非另有强调，否则均可以通过商业途径购买获得。
实施例1
本实施例用于检测FGFR3基因第10外显子的1138位核苷酸G到C的突变(G380R)，本实施例的检测试剂盒包括：捕获探针、中转物、终端信号物、信号转换物、未经修饰的磁珠、经亲和物质M5修饰的磁珠、带有底物的玻璃芯片、待测DNA片段的标准溶液、杂交液和清洗液。
本实施例中，待测DNA片段的核苷酸序列为：5'-CTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACCGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTGCGCAGCCCCCCCAAGAAAGGCCT-3'(如SEQ ID NO:1所示)；所述捕获探针的核苷酸序列为：5'-AGCCCACCCGGTAGCTGAGG-3'(如SEQ ID NO:2所示)；所述中转物的核苷酸序列为：5'-ACACACTGCCCGCCTCGTCAGCCTC GTC TCT GTG TCG TGC-3'(如SEQ ID NO:3所示)；所述终端信号物的核苷酸序列为：5‘-CACACACGAGACGCAGACGCCGAGCACAGACGAGCAGCACGACACAGAGACGCAGCACCGAC-3'(如SEQ ID NO:4所示)；所述信号转换物的核苷酸序列为：5'-GTCTGTGCTCGGCGTCTGCGTCTCGTGTGTGCTGCGTGGCGT GTG TGT GC-3‘(如SEQ ID NO:5所示)；所述底物的核苷酸序列为：5'-GT CGGTGCTGCGTCTCTGTGTCGTGCTGCT-3‘(如SEQ ID NO:6所示)。
上述核苷酸的序列如图2所示，待测DNA片段的部分核苷酸序列B1中第11个核苷酸为突变位点，捕获探针与待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对；中转物的一端的核苷酸序列L1与待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对，中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1互补配对；信号转换物的部分片段D1与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对；底物与终端信号物的部分核苷酸序列C2互补配对。
其中，捕获探针经LNA修饰，终端信号物上标记有生物素；亲和物质M5为链霉亲和素；杂交液含有下述组分：50％去离子甲酰胺，2×SSC，5×Denhard's，2％SDS和去离子水；清洗液含有下述组分：50mM Tris-Citric acid(pH6.0),0.5M NaCl和0.01％Tween20。
采用本实施例所述试剂盒检测FGFR3基因G380R突变的方法为：
(1)采集人体的血液，提取血液中的DNA，再通过酶切将提取的DNA片段化，得到待测DNA片段；
(2)将捕获探针偶联于未经修饰的磁珠(转移用)上，后用磁铁吸附磁珠，弃废液，清洗未吸附的捕获探针，得到偶联了捕获探针的磁珠；
(3)将10pmol偶联了捕获探针的磁珠和DNA样品中待测DNA片段加至50μl杂交液中，于45℃反应20分钟，使捕获探针与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1杂交；反应完后，磁铁吸出磁珠，得到偶联了待测DNA片段和捕获探针的磁珠，在100μl清洗液中清洗磁珠；
(4)将步骤(3)得到的磁珠与10pmol中转物加至50μl杂交液中，于25℃反应20分钟，使中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2杂交；反应完后，磁铁吸出磁珠，得到偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的磁珠，在100μl清洗液中清洗磁珠；
(5)将步骤(4)得到的磁珠与10pmol终端信号物加至50μl杂交液中，于25℃反应20分钟，使中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1杂交；反应完后，磁铁吸出磁珠，得到偶联了终端信号物、中转物、待测DNA片段和捕获探针的磁珠，在100μl清洗液中清洗磁珠；
(6)将步骤(5)分离得到的磁珠和信号转换物加至杂交液中，使信号转换物与终端信号物的部分核苷酸序列C3杂交，形成终端信号物与信号转换物的复合体进入溶液，磁铁吸附磁珠，分离出偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的磁珠；小心吸取含有复合体的溶液待用；
(7)将含有终端信号物与信号转换物的复合体的溶液与带有底物的玻璃芯片反应，使底物与终端信号物的部分核苷酸序列C2杂交，得到含有芯片、底物、终端信号物与信号转换物复合体的溶液；
(8)通过终端信号物上标记的生物素，将所得复合体偶联于经链霉亲和素修饰的磁珠上，形成信号磁珠；
(9)检测信号磁珠的信号量，计算DNA样品中待测DNA片段的含量。
需说明的是，上述检测FGFR3基因G380R突变的方法中，生物素也可以不标记于终端信号物上，而标记于信号转换物。此外，如果省略上述步骤(7)也可以检测FGFR3基因G380R突变；或者，按照本实施例将生物素标记于终端信号物上，省略步骤(6)，在步骤(5)后，将终端信号物从磁珠上分离下来，再将分离得到的含有终端信号物的溶液与带有底物的玻璃芯片按照步骤(7)～(9)操作，仍可以检测FGFR3基因G380R突变。当然，省略相应的操作步骤时，试剂盒可省略相应的物质。
实施例2
本实施例用于检测所述DNA样品中的CYP2C19基因片段，是否含有G681A突变。本实施例的检测试剂盒包括：捕获探针、中转物、终端信号物、信号转换物、未经修饰的磁珠、经亲和物质M5修饰的磁珠、带有底物的玻璃芯片、待测DNA片段的标准溶液、杂交液和清洗液。
本实施例中，待测DNA片段的核苷酸序列为：5'-AATTACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCGGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAG-3'(如SEQ ID NO:7所示)；所述捕获探针的核苷酸序列为：5'-TATGGGTTCCCGGGAAATAAT-3'(如SEQ ID NO:8所示)；所述中转物的核苷酸序列为：5'-GGTATAGATACAATATGCCAAGCTCTGGTTGGTCTCTGTGTCGTGC-3'(如SEQ ID NO:9所示)；所述终端信号物的核苷酸序列为：5‘-CACACACGAGACGCAGACGCCGAGCACAGACGAGCAGCACGACACAGAGACGCAGCACCGAC-3'(如SEQ ID NO:10所示)；所述信号转换物的核苷酸序列为：5'-GTCTGTGCTCGGCGTCTGCGTCTCGTGTGTGCTGCGTGGCGTGTGTGTGC-3‘(如SEQ ID NO:11所示)；所述底物的核苷酸序列为：5'-GTCGGTGCTGCGTCTCTGTGTCGTGCTGCT-3‘(如SEQ ID NO:12所示)。
实施例2的实验过程和实施例1相比，除了其采用的具体DNA的序列存在部分不同之外，其它实验方案和实验条件和实施例1相同。
实施例3
本实施例用于检测FGFR3基因第10外显子的1138位核苷酸G到C的突变(G380R)，本实施例的检测试剂盒包括信号放大***，所述信号放大***包括捕获探针、初级信号放大物和次级信号放大物。
其中，待测DNA片段的核苷酸序列为：5'-CTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACCGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTGCGCAGCCCCCCCAAGAAAGGCCT-3'(如SEQ ID NO:13所示)；所述捕获探针的核苷酸序列为：5'-AGCCCACCCGGTAGCTGAGG-3'(如SEQ ID NO:14所示)，捕获探针中第10个碱基与待测突变位点结合；初级信号放大物为第一中转物，第一中转物的核苷酸序列为：5'-ACACACTGCCCGCCTCGTCAGCCTC GTC TCT GTG TCG TGCATCG GTC TCT GTG TCGTGCATCGGTC TCT GTG TCG TGCATCGGTC TCT GTG TCG TGCATCG GTC TCT GTG TCG TGC-3'(如SEQ ID NO:15所示)；次级信号放大物为第一终端信号物，第一终端信号物的核苷酸序列为：5‘-CACACACGAGACGCAGACGCCGAGCACAGACATCGCACACACGAGACGCAGACGCCGAGCACAGACGAGCAGCACGACACAGAGACGCAGCACCGAC-3'(如SEQ ID NO:16所示)。
如图4所示，捕获探针与待测DNA片段中核苷酸序列B1互补配对，核苷酸B1序列中第11个碱基为待测位点；第一中转物的一端的核苷酸序列L1与待测DNA片段的核苷酸序列B2互补配对；第一中转物的另一端的核苷酸序列(第一中转物中除核苷酸序列L1之外的核苷酸序列)含有5个核苷酸片段L3；第一终端信号物含有核苷酸序列C1和核苷酸序列C2，核苷酸序列C2含有2个与信号转换物的部分DNA片段互补配对的核苷酸序列C3；核苷酸片段L3与所述核苷酸序列C1互补配对。
采用上述信号放大***，信号放大5×2＝10倍。
本实施例用于FGFR3基因G380R检测的试剂盒，其包括上述信号放大***，还包括未经修饰的磁珠、经链霉亲和素修饰的磁珠、信号转换物和带有底物的玻璃芯片；所述信号转换物和底物均为DNA片段，所述信号转换物的核苷酸序列为：5'-GTCTGTGCTCGGCGTCTGCGTCTCGTGTGTGCTGCGTGGCGT GTG TGT GC-3'(如SEQ ID NO:17所示)，信号转换物上标记有生物素；所述底物的核苷酸序列为：5'-GTCGGTGCTGCGTCTCTGTGTCGTGCTGCT-3’(如SEQ ID NO:18所示)；如图4所示，信号转换物的部分DNA片段D1与第一终端信号物的核苷酸序列C3互补配对，底物与第一终端信号物的核苷酸序列C4互补配对。
本实施例用于FGFR3基因G380R检测的方法为：
(1)采集人体的血液，提取血液中的DNA，再通过酶切将提取的DNA片段化，得到待测DNA片段；
(2)将捕获探针偶联于未经修饰的磁珠(转移用)上，后用磁铁吸附磁珠，弃废液，清洗未吸附的捕获探针，得到偶联了捕获探针的磁珠；
(3)将偶联了捕获探针的磁珠和DNA样品中待测DNA片段加至50μl杂交液中，于45℃反应20分钟，使捕获探针与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1杂交；反应完后，磁铁吸出磁珠，得到偶联了待测DNA片段和捕获探针的磁珠，在100μl清洗液中清洗磁珠；
(4)将步骤(3)得到的磁珠与初级信号放大物加至50μl杂交液中，于25℃反应20分钟，使初级信号放大物的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2杂交；反应完后，磁铁吸出磁珠，得到偶联了初级信号放大物、待测DNA片段和捕获探针的磁珠，在100μl清洗液中清洗磁珠；
(5)将步骤(4)得到的磁珠与次级信号放大物加至50μl杂交液中，于25℃反应20分钟，使初级信号放大物的核苷酸序列L3与次级信号放大物的核苷酸序列C1杂交；反应完后，磁铁吸出磁珠，得到偶联了次级信号放大物、初级信号放大物、待测DNA片段和捕获探针的磁珠，在100μl清洗液中清洗磁珠；
(6)将步骤(5)分离得到的磁珠和信号转换物加至杂交液中，使信号转换物与次级信号放大物的核苷酸序列C3杂交，形成次级信号放大物与信号转换物的复合体进入溶液，磁铁吸附磁珠，分离出偶联了初级信号放大物、待测DNA片段和捕获探针的磁珠；小心吸取含有复合体的溶液待用；
(7)将含有次级信号放大物与信号转换物的复合体的溶液与带有底物的玻璃芯片反应，使底物与次级信号放大物的核苷酸序列C4杂交，得到含有玻璃芯片、底物、次级信号放大物与信号转换物复合体的溶液；
(8)通过信号转换物上标记的生物素，将所得复合体偶联于经链霉亲和素修饰的磁珠上，形成信号磁珠；
(9)检测信号磁珠的信号量，计算DNA样品中待测DNA片段的含量。
采用本实施例信号放大***检测DNA的原理图如图5所示。图5中，A表示捕获探针，B表示待测DNA片段，L表示初级信号放大物，C表示次级信号放大物，D表示信号转换物，S表示信号(例如：经链霉亲和素修饰的磁珠)。
实施例4(对比例)
本实施例用于检测FGFR3基因第10外显子的1138位核苷酸G到C的突变(G380R)，本实施例的检测试剂盒包括信号放大***，所述信号放大***包括捕获探针、初级信号放大物和次级信号放大物。
其中，待测DNA片段与捕获探针同实施例3；初级信号放大物由第一中转物、第二中转物和链霉亲和素组成，第一中转物的核苷酸序列为：5'-ACACACTGCCCGCCTCGTCAGCCTCGTC TCT GTG TCG TGC-biotin(如SEQ ID NO:19所示)，第一中转物的3'端修饰有生物素；第二中转物的核苷酸序列为：5’-GTC TCT GTG TCG TGC-biotin(如SEQ ID NO:20所示)，第二中转物的3'端修饰有生物素；初级信号放大物中，1分子第一中转物和3分子第二中转物通过生物素连接于链霉亲和素上；次级信号放大物为第一终端信号物，第一终端信号物的核苷酸序列为：5‘-CACACACGAGACGCAGACGCCGAGCACAGACGAGCAGCACGACACAGAGACGCAGCACCGAC-3'(如SEQ ID NO:21所示)。
如图6所示；第一中转物的一端的核苷酸序列L1与待测DNA片段的核苷酸序列B2互补配对；第一终端信号物含有核苷酸序列C1和核苷酸序列C3，核苷酸序列C3与信号转换物的部分DNA片段互补配对；第一中转物和第二中转物中核苷酸片段L3与所述核苷酸序列C1互补配对。
采用上述信号放大***，信号放大4倍。
本实施例用于FGFR3基因G380R检测的试剂盒，其包括上述信号放大***，还包括未经修饰的磁珠、经链霉亲和素修饰的磁珠、信号转换物和带有底物的玻璃芯片；所述信号转换物和底物均同实施例3。
本实施例用于FGFR3基因G380R检测的方法同实施例3。
实施例5
本实施例用于检测FGFR3基因第10外显子的1138位核苷酸G到C的突变(G380R)，本实施例的检测试剂盒包括信号放大***，所述信号放大***包括捕获探针、初级信号放大物和次级信号放大物。
本实施例与实施例4的不同之处在仅于：第一中转物的核苷酸序列为：5'-ACACACTGCCCGCCTCGTCAGCCTCGTCTCTGTGTCGTGCATCGGTCTCTGTGTCGTGCATCGGTCTCTGTGTCGTGCATCGGTCTCTGTGTCGTGCATCGGTCTCTGTGTCGTGC-biotin(如SEQ ID NO:15所示)；第二中转物的核苷酸序列为：5’-GTCTCTGTGTCGTGCATCGGTCTCTGTGTCGTGCATCGGTCTCTGTGTCGTGCATCGGTCTCTGTGTCGTGCATCGGTCTCTGTGTCGTGC-biotin(如SEQ ID NO:22所示)。如图7所示，第一中转物的一端的核苷酸序列L1与待测DNA片段的核苷酸序列B2互补配对；第一中转物的另一端的核苷酸序列L2(第一中转物中除核苷酸序列L1之外的核苷酸序列)含有5个核苷酸片段L3；第二中转物含有5个核苷酸片段L3。本实施例初级信号放大物的结构示意图如图8所示。
采用上述信号放大***，信号放大4×5＝20倍。
本实施例用于FGFR3基因G380R检测的试剂盒除第一中转物和第二中转物外，其他均同实施例4，本实施例用于FGFR3基因G380R检测的方法同实施例3。
实施例6
本实施例用于FGFR3基因G380R检测的信号放大***，其与实施例5的不同之处在仅于：第二中转物的两端均修饰有生物素。以X表示连接的级数，若只存在第一中转物时，X为1；当第一中转物通过1个链霉亲和素连接3个第二中转物时，X为2；当各第二中转物通过1个链霉亲和素分部连接3个第二中转物时，X为3，依此类推……此时，初级信号放大物中，1分子第一中转物和(3X-3)/2分子第二中转物通过生物素连接于链霉亲和素上,其中，链霉亲和素的数量为第二中转物的1/3。采用本实施例的信号放大***，信号可放大(3X-1)*5*1/2倍。
本实施例用于FGFR3基因G380R检测的试剂盒除第二中转物外，其他均同实施例5，本实施例用于FGFR3基因G380R检测的方法同实施例3。
实施例7
本实施例用于检测所述DNA样品的CYP2C19基因片段中，是否含有G681A突变。本实施例的检测试剂盒包括信号放大***，所述信号放大***包括捕获探针、初级信号放大物和次级信号放大物。
本实施例和实施例3相比，仅在于待测DNA片段和具体采用的DNA捕获探针、初级信号放大物和次级信号放大物的具体序列有所区别，其它实验条件完全相同。
本实施例中采用的具体试剂中，待测DNA片段的核苷酸序列为：5’-AATTACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGT TTTCTCTTAGATATGCAATA ATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCGGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGA AAGTGATATT TTGGAGAAAG-3’(如SEQ ID NO:23所示)；所述捕获探针的核苷酸序列为：5'-TATGGGTTC CCGGGAAATA AT-3'(如SEQ ID NO:24所示)，捕获探针中第10个碱基与待测突变位点结合；初级信号放大物为第一中转物，第一中转物的核苷酸序列为：5'-GGTATAGATACAATAT GCCAAGCTCT GGTTG GTC TCT GTG TCG TGCATCG GTC TCT GTG TCG TGCATCGGTC TCT GTG TCG TGCATCG GTC TCT GTG TCG TGCATCG GTC TCT GTG TCG TGC-3'(如SEQID NO:25所示)；次级信号放大物为第一终端信号物，第一终端信号物的核苷酸序列为：5‘-CACACACGAGACGCAGACGCCGAGCACAGAC ATCGCACACACGAGACGCAGACGCCGAGCACAGACGAGCAGCACGACACAGAGACGCAGCACCG AC-3'(如SEQ ID NO:26所示)。
本实施例用于检测所述DNA样品的CYP2C19基因片段中，是否含有G681A突变的试剂盒，其包括上述信号放大***，还可以包括未经修饰的磁珠、经链霉亲和素修饰的磁珠、信号转换物和带有底物的玻璃芯片。其中，所述信号转换物和底物均为DNA片段，所述信号转换物的核苷酸序列为：5'-GTC TGT GCT CGG CGT CTG CGT CTC GTG TGT GCT GCG TGGCGT GTG TGT GC-3'(如SEQ ID NO:27所示)，信号转换物上标记有生物素；所述底物的核苷酸序列为：5'-GTCGGTGCTGCGTCTCTGTGTCGTGCTGCT-3'(如SEQ ID NO:28所示)。
实施例8(效果例)
本效果例证明了实施例1的实验结果，并且比较了实验试剂盒和对比试剂盒检测的灵敏度。
其中，实验试剂盒与实施例3试剂盒的区别仅在于：第一终端信号物的核苷酸序列为：5‘-CACACACGAGACGCAGACGCCGAGCACAGACGAGCAGCACGACACAGAGACGCAGCACCGAC-3'(如SEQID NO:21所示)，且本效果例中，生物素标记于第一终端信号物上。也就是说，对比试剂盒和本公开实施例3所采用的试剂盒相比，其扩大倍数理论上应当为5×1＝5倍。
对比试剂盒与实验试剂盒的区别仅在于：第一中转物的核苷酸序列为：5'-ACACACTGCCCGCCTCGTCAGCCTC GTC TCT GTG TCG TGC-3'(如SEQ ID NO:19所示)。也就是说，对比试剂盒和本公开实施例1所采用的试剂盒相同。
本效果例先采用对比试剂盒制作标准曲线，具体步骤为：
1.5管实验组：将10pmol与磁珠结合的捕获探针(Bead-AM1)分别与1pmol、5pmol、10pmol、50pmol、100pmol的待测DNA片段(BM1)于杂交液中反应，分别得到不等量的Bead-AM1-BM1(与磁珠结合的捕获探针、待测DNA片段的复合物)；
分别向Bead-AM1-BM1中加入50pmol对比检测试剂盒中的第一中转物(normal P0(L))，于杂交液中反应，得到Bead-AM1-BM1-L(与磁珠结合的捕获探针、待测DNA片段、第一中转物的复合物)；
分别向Bead-AM1-BM1-L加入50pmol结合了生物素的第一终端信号物(C/biotin)，于杂交液中反应，得到Bead-AM1-BM1-L-C/biotin(与磁珠结合的捕获探针、待测DNA片段、第一中转物、第一终端信号物的复合物)
测试bead(磁珠)上C/biotin的量来输出不同BM1浓度梯度的信号梯度，作标准曲线；测试结果如表2所示。
然后，采用实验试剂盒进行比较，具体步骤为：
1.1管实验组，将10pmol Bead-AM1与1pmol BM1于杂交液中反应，得到Bead-AM1-BM1；
向Bead-AM1-BM1加入50pmol本公开检测试剂盒中的第一中转物(new P0(L1))，于杂交液中反应，得到Bead-AM1-BM1-L1；
向Bead-AM1-BM1-L1中加入50pmol C/biotin，于杂交液中反应，得到Bead-AM1-BM1-L1-C/biotin，测试bead上C/biotin的量来输出通过L1放大的BM1信号，测试结果如表2所示。
本效果例中，上述标准曲线制作以及采用实验试剂盒进行对比过程中，所涉及物质的用量如表1所示。本效果例的测试结果如表2所示。
表1
Figure GDA0002905194380000411
表2
1 2 3 4 5 6
BM1 1P 5 10 50 100 1
OD 16.87 19.23 21.09 21.36 22.59 19.25
其中，管1-5为对照组，用于制作标准曲线。管6为实验组，用于实验效果对比。
由表2可见，管1-5可以呈现出良好的线性关系，证明实施例1所涉及的试剂盒可以用于基因突变的检测。
与此同时，由表2可见，由于管6的OD值和管2的OD值几乎相同，进而可以直接用于比较。也就是说，采用实验试剂盒，待测DNA片段(BM1)的浓度为1pmol的检测结果与采用对比试剂盒，待测DNA片段(BM1)的浓度为5pmol的检测结果是一致的。因此，采用实验试剂盒时，灵敏度提升5倍。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> TDK株式会社
<120> 用于检测DNA的试剂盒与方法
<130> 2716-1926082IB
<150> CN201810666114.8
<151> 2018-06-26
<150> CN201810666467.8
<151> 2018-06-26
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 150
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
ctttgcagcc gaggaggagc tggtggaggc tgacgaggcg ggcagtgtgt atgcaggcat 60
cctcagctac cgggtgggct tcttcctgtt catcctggtg gtggcggctg tgacgctctg 120
ccgcctgcgc agccccccca agaaaggcct 150
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcccacccg gtagctgagg 20
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acacactgcc cgcctcgtca gcctcgtctc tgtgtcgtgc 40
<210> 4
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cacacacgag acgcagacgc cgagcacaga cgagcagcac gacacagaga cgcagcaccg 60
ac 62
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtctgtgctc ggcgtctgcg tctcgtgtgt gctgcgtggc gtgtgtgtgc 50
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtcggtgctg cgtctctgtg tcgtgctgct 30
<210> 7
<211> 180
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
aattacaacc agagcttggc atattgtatc tataccttta ttaaatgctt ttaatttaat 60
aaattattgt tttctcttag atatgcaata attttcccac tatcattgat tatttcccgg 120
gaacccataa caaattactt aaaaaccttg cttttatgga aagtgatatt ttggagaaag 180
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tatgggttcc cgggaaataa t 21
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggtatagata caatatgcca agctctggtt ggtctctgtg tcgtgc 46
<210> 10
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cacacacgag acgcagacgc cgagcacaga cgagcagcac gacacagaga cgcagcaccg 60
ac 62
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gtctgtgctc ggcgtctgcg tctcgtgtgt gctgcgtggc gtgtgtgtgc 50
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtcggtgctg cgtctctgtg tcgtgctgct 30
<210> 13
<211> 150
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
ctttgcagcc gaggaggagc tggtggaggc tgacgaggcg ggcagtgtgt atgcaggcat 60
cctcagctac cgggtgggct tcttcctgtt catcctggtg gtggcggctg tgacgctctg 120
ccgcctgcgc agccccccca agaaaggcct 150
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
agcccacccg gtagctgagg 20
<210> 15
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
acacactgcc cgcctcgtca gcctcgtctc tgtgtcgtgc atcggtctct gtgtcgtgca 60
tcggtctctg tgtcgtgcat cggtctctgt gtcgtgcatc ggtctctgtg tcgtgc 116
<210> 16
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cacacacgag acgcagacgc cgagcacaga catcgcacac acgagacgca gacgccgagc 60
acagacgagc agcacgacac agagacgcag caccgac 97
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gtctgtgctc ggcgtctgcg tctcgtgtgt gctgcgtggc gtgtgtgtgc 50
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gtcggtgctg cgtctctgtg tcgtgctgct 30
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acacactgcc cgcctcgtca gcctcgtctc tgtgtcgtgc 40
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gtctctgtgt cgtgc 15
<210> 21
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cacacacgag acgcagacgc cgagcacaga cgagcagcac gacacagaga cgcagcaccg 60
ac 62
<210> 22
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gtctctgtgt cgtgcatcgg tctctgtgtc gtgcatcggt ctctgtgtcg tgcatcggtc 60
tctgtgtcgt gcatcggtct ctgtgtcgtg c 91
<210> 23
<211> 180
<212> DNA
<213> 智人
<400> 23
aattacaacc agagcttggc atattgtatc tataccttta ttaaatgctt ttaatttaat 60
aaattattgt tttctcttag atatgcaata attttcccac tatcattgat tatttcccgg 120
gaacccataa caaattactt aaaaaccttg cttttatgga aagtgatatt ttggagaaag 180
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tatgggttcc cgggaaataa t 21
<210> 25
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ggtatagata caatatgcca agctctggtt ggtctctgtg tcgtgcatcg gtctctgtgt 60
cgtgcatcgg tctctgtgtc gtgcatcggt ctctgtgtcg tgcatcggtc tctgtgtcgt 120
gc 122
<210> 26
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cacacacgag acgcagacgc cgagcacaga catcgcacac acgagacgca gacgccgagc 60
acagacgagc agcacgacac agagacgcag caccgac 97
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gtctgtgctc ggcgtctgcg tctcgtgtgt gctgcgtggc gtgtgtgtgc 50
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gtcggtgctg cgtctctgtg tcgtgctgct 30

Claims (57)

1.一种DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品的检测试剂盒包括捕获探针、中转物和终端信号物、未经修饰的固相载体和经亲和物质M5修饰的磁珠；其中，
所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针含有与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段，所述部分核苷酸序列B1含有待测位点；
所述中转物和终端信号物均为DNA片段，所述中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对，所述中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1互补配对；和
所述试剂盒还包括带有底物的芯片，所述底物为DNA片段，所述底物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C2互补配对；和/或所述试剂盒还包括信号转换物，所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对；
其中，所述终端信号物或信号转换物上标记有亲和物质M6，亲和物质M6与亲和物质M5之间具有亲和力。
2.如权利要求1所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，Tm1为所述捕获探针与所述待测DNA片段的部分核苷酸序列B1结合碱基对分离时的温度；Tm2为所述中转物的核苷酸序列L1与所述待测DNA片段的部分核苷酸序列B2结合碱基对分离时的温度；Tm3为所述中转物的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1结合碱基对分离时的温度；Tm4为所述终端信号物的部分核苷酸序列C3与所述信号转换物结合碱基对分离时的温度；其特征在于，在Tm1、Tm2、Tm3、Tm4中，Tm3的数值最低。
3.如权利要求1所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括带有底物的芯片时，所述终端信号物的部分核苷酸序列C2的长度长于终端信号物的部分核苷酸序列C1的长度；所述试剂盒包括信号转换物时，所述终端信号物的部分核苷酸序列C3的长度长于终端信号物的部分核苷酸序列C1的长度。
4.如权利要求1所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针中与部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段的长度为6～20bp。
5.如权利要求4所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针中与部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段的长度为10～15bp。
6.如权利要求1～5任一项所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针上带有能增强碱基配对的结合力的修饰物。
7.如权利要求6所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述修饰物为PNA、LNA、MNA、ANA、TNA、CeNA、GNA、XNA、HNA、INA、BNA中的至少一种。
8.如权利要求1所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述未经修饰的固相载体为磁珠或者由玻璃或尼龙构成的微粒。
9.如权利要求1所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述亲和物质M5为氨基、聚赖氨酸、巯基、牛血清蛋白、亲和素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺胶；优选的，所述亲和物质M5为链霉亲和素，所述亲和物质M6为生物素。
10.如权利要求1所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述芯片中的固相载体包括选自Al2O3、玻璃、聚合物和尼龙的组中的至少一种。
11.如权利要求1所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述终端信号物的部分核苷酸序列C1的长度为10～15bp；所述终端信号物的部分核苷酸序列C2的长度为16～60bp；所述终端信号物的部分核苷酸序列C3的长度为16～60bp。
12.如权利要求1所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述终端信号物的部分核苷酸序列C2的长度为25～60bp；所述终端信号物的部分核苷酸序列C3的长度为25～60bp。
13.如权利要求1所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括带有底物的芯片时，底物中与核苷酸序列C2互补配对的核苷酸序列的长度长于底物中剩余的核苷酸序列的长度。
14.如权利要求1所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品来自人体的血液。
15.如权利要求1或14所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品中待测DNA片段为带有突变位点的DNA片段。
16.如权利要求15所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品中待测DNA片段为含有G380R突变位点的FGFR3基因片段。
17.如权利要求16所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品中待测DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述中转物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述终端信号物的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示；所述信号转换物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述底物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
18.如权利要求15所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品中待测DNA片段为含有G681A位点的CYP2C19基因片段。
19.如权利要求18所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品中待测DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述中转物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述终端信号物的核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示；所述信号转换物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述底物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
20.如权利要求1所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，还包括待测DNA片段的标准溶液；优选的，所述检测试剂盒还包括杂交液和清洗液。
21.如权利要求19所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述杂交液含有去离子甲酰胺、2×SSC、5×Denhard's，SDS和去离子水；所述清洗液含有Tris-Citric、NaCl和Tween20。
22.检测DNA样品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将捕获探针偶联于未经修饰的固相载体上；
(2)将偶联了捕获探针的固相载体和DNA样品中待测DNA片段加至杂交液中，使捕获探针与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1杂交；反应完后，分离出偶联了待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(3)将步骤(2)分离得到的固相载体与中转物加至杂交液中，使中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2杂交；反应完后，分离出偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(4)将步骤(3)分离得到的固相载体与终端信号物加至杂交液中，使中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1杂交；反应完后，分离出偶联了终端信号物、中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(5)将步骤(4)分离得到的固相载体和信号转换物加至杂交液中，使信号转换物与终端信号物的部分核苷酸序列C3杂交，形成终端信号物与信号转换物的复合体，并分离出偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(6)通过终端信号物或信号转换物上标记的亲和物质M6，将所得复合体偶联于经亲和物质M5修饰的磁珠上，形成信号磁珠；
(7)检测信号磁珠的信号量，计算DNA样品中待测DNA片段的含量；其中，
所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针含有与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段；
所述部分核苷酸序列B1含有待测位点；
所述中转物和终端信号物均为DNA片段，所述中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对；
所述中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1互补配对；
所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对。
23.如权利要求22所述的检测DNA样品的方法，其特征在于，所述步骤(5)和步骤(6)之间还包括步骤(5a)，所述步骤(5a)包括将终端信号物与信号转换物的复合体与带有底物的芯片反应，使底物与终端信号物的部分核苷酸序列C2杂交，得到芯片、底物、终端信号物与信号转换物的复合体；其中，
所述底物为DNA片段，所述底物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C2互补配对；
所述芯片还含有磁传感器。
24.如权利要求22所述的检测DNA样品的方法，其特征在于，所述步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中，分离出固相载体后，分别采用清洗液清洗固相载体。
25.检测DNA样品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将捕获探针偶联于未经修饰的固相载体上；
(2)将偶联了捕获探针的固相载体和DNA样品中待测DNA片段加至杂交液中，使捕获探针与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1杂交；反应完后，分离出偶联了待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(3)将步骤(2)分离得到的固相载体与中转物加至杂交液中，使中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2杂交；反应完后，分离出偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(4)将步骤(3)分离得到的固相载体与终端信号物加至杂交液中，使中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1杂交；反应完后，分离出偶联了终端信号物、中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；清洗未结合的终端信号物后，固相载体经过适当的温度处理，使终端信号物从固相载体上脱离下来进入溶液，去除偶联了中转物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(5)将步骤(4)得到的含有终端信号物的溶液与带有底物的芯片反应，使底物与终端信号物的部分核苷酸序列C2杂交，形成芯片、底物与终端信号物的复合体；
(6)通过终端信号物上标记的亲和物质M6，将所得复合体偶联于经亲和物质M5修饰的磁珠上，形成信号磁珠；
(7)检测信号磁珠的信号量，计算DNA样品中待测DNA片段的含量；其中，
所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针含有与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段；
所述部分核苷酸序列B1含有待测位点；
所述中转物和终端信号物均为DNA片段，所述中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对；
所述中转物的另一端的核苷酸序列L2与终端信号物的部分核苷酸序列C1互补配对；
所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对；
所述底物为DNA片段，所述底物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C2互补配对；
所述芯片还含有磁传感器。
26.如权利要求25所述的检测DNA样品的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中，分离出固相载体后，分别采用清洗液清洗固相载体。
27.如权利要求22或25所述的检测DNA样品的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应的温度为45℃，反应的时间为20分钟；所述步骤(3)和步骤(4)中，反应的温度均为25℃，反应的时间均为20分钟。
28.如权利要求22或25所述的检测DNA样品的方法，其特征在于，所述步骤(7)中，采用磁信号检测设备检测信号磁珠的信号量；
其中所述设备是可以选自由霍尔元件，磁阻效应元件(磁阻传感器)组成的组中的至少一种，所述磁阻效应元件可以选自GMR传感器(巨磁阻传感器)和TMR传感器(隧道磁阻传感器)。
29.如权利要求22或25所述的检测DNA样品的方法，其特征在于，所述DNA样品中待测DNA片段的获取方法为：采集人体的血液，提取血液中的DNA，再将提取的DNA片段化。
30.如权利要求29所述的检测DNA样品的方法，其特征在于，通过酶切法或超声法将提取的DNA片段化。
31.一种DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品的检测试剂盒包括捕获探针、初级信号放大物和次级信号放大物、未经修饰的固相载体、经亲和物质M5修饰的磁珠和信号转换物；其中，
所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针含有与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段，所述部分核苷酸序列B1含有待测位点；
所述初级信号放大物包括第一中转物，所述第一中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对；所述第一中转物的另一端的核苷酸序列L2含有m1个核苷酸片段L3；
所述次级信号放大物包括第一终端信号物，所述第一终端信号物含有核苷酸序列C1和核苷酸序列C2，核苷酸序列C2含有n1个与信号转换物的部分或全部DNA片段互补配对的核苷酸序列C3；
所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对；
所述终端信号物或信号转换物上标记有亲和物质M6，亲和物质M6与亲和物质M5之间具有亲和力；
所述核苷酸片段L3与所述核苷酸序列C1互补配对；
m1和n1均为正整数；
任选的，m1和n1不同时为1。
32.如权利要求31所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，所述第一中转物的核苷酸序列L2的末端修饰有亲和物质M2；所述初级信号放大物还包括亲和物质M1和第二中转物；所述第二中转物含有m2个核苷酸片段L3，m2为正整数；所述第二中转物的5’末端和/或3’末端修饰有亲和物质M2；所述亲和物质M2与亲和物质M1之间具有亲和力；所述第一中转物和第二中转物通过亲和物质M2连接于亲和物质M1上。
33.如权利要求31所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，所述第一终端信号物的末端修饰有亲和物质M4；所述次级信号放大物还包括亲和物质M3和第二终端信号物，所述第二终端信号物含有n2个核苷酸序列C3，n2为正整数；所述第二终端信号物的5’末端和/或3’末端修饰有亲和物质M4；所述亲和物质M3与亲和物质M4之间具有亲和力；所述第一终端信号物和第二终端信号物通过亲和物质M4连接于所述亲和物质M3上。
34.如权利要求31所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，所述m1＝5，和/或所述n1＝2。
35.一种DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品的检测试剂盒包括捕获探针、初级信号放大物和次级信号放大物、未经修饰的固相载体、经亲和物质M5修饰的磁珠和信号转换物；其中，
所述捕获探针为DNA片段，所述捕获探针含有与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B1互补配对的DNA片段，所述部分核苷酸序列B1含有待测位点；
所述初级信号放大物包括第一中转物，所述第一中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸序列B2互补配对；所述第一中转物的另一端的核苷酸序列L2含有m1个核苷酸片段L3；
所述次级信号放大物包括第一终端信号物，所述第一终端信号物含有核苷酸序列C1和核苷酸序列C2，核苷酸序列C2含有n1个与信号转换物的部分或全部DNA片段互补配对的核苷酸序列C3；
所述信号转换物为DNA片段，所述信号转换物的部分或全部片段与终端信号物的部分核苷酸序列C3互补配对；和
所述第一中转物的核苷酸序列L2的末端修饰有亲和物质M2；所述初级信号放大物还包括亲和物质M1和第二中转物；所述第二中转物含有m2个核苷酸片段L3；所述第二中转物的5’末端和/或3’末端修饰有亲和物质M2；所述亲和物质M2与亲和物质M1之间具有亲和力，所述第一中转物和第二中转物通过亲和物质M2连接于亲和物质M1上；或者，所述第一终端信号物的末端修饰有亲和物质M4；所述次级信号放大物还包括亲和物质M3和第二终端信号物，所述第二终端信号物含有n2个核苷酸序列C3；所述第二终端信号物的5’末端和/或3’末端修饰有亲和物质M4；所述亲和物质M3与亲和物质M4之间具有亲和力，所述第一终端信号物和第二终端信号物通过亲和物质M4连接于所述亲和物质M3上；
所述终端信号物或信号转换物上标记有亲和物质M6，亲和物质M6与亲和物质M5之间具有亲和力；
所述核苷酸片段L3与所述核苷酸序列C1互补配对；
m1和n1均为正整数；m2和n2均为正整数；
任选的，m1和n1同时为1。
36.如权利要求31或35所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，Tm1为捕获探针与待测DNA片段的核苷酸序列B1结合碱基对分离时的温度；Tm2为初级信号放大物的核苷酸序列L1与待测DNA片段的核苷酸序列B2结合碱基对分离时的温度；Tm3为初级信号放大物的核苷酸序列L3与次级信号放大物的核苷酸序列C1结合碱基对分离时的温度；Tm4为次级信号放大物的核苷酸序列C3与信号转换物结合碱基对分离时的温度；其特征在于，在Tm1、Tm2、Tm3、Tm4中，Tm3的数值最低。
37.如权利要求31或35所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括带有底物的芯片，所述底物为DNA片段，所述第一终端信号物还含有核苷酸序列C4，所述底物的部分或全部片段与核苷酸序列C4互补配对。
38.如权利要求31或35所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，所述第二中转物的核苷酸序列与所述第一中转物的另一端的核苷酸序列L2相同。
39.如权利要求31或35所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，所述第二终端信号物的核苷酸序列与所述第一终端信号物的核苷酸序列C2相同。
40.如权利要求32-33或35任一项所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，所述亲和物质M1或M3或M5选自氨基、聚赖氨酸、巯基、牛血清蛋白、亲和素、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺胶；优选的，所述亲和物质M1为链霉亲和素，所述亲和物质M2为生物素；或者所述亲和物质M3为链霉亲和素，所述亲和物质M4为生物素；或者所述亲和物质M5为链霉亲和素，所述亲和物质M6为生物素。
41.如权利要求31或35所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，所述核苷酸序列C3的长度长于核苷酸序列C1的长度。
42.如权利要求31或35所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，所述核苷酸序列C3的长度为16～60bp，所述核苷酸序列C1的长度为10～15bp；优选的，所述核苷酸序列C3的长度为25～60bp。
43.如权利要求37所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，所述核苷酸序列C4的长度长于核苷酸序列C1的长度。
44.如权利要求37所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，所述核苷酸序列C4的长度为16～60bp，所述核苷酸序列C1的长度为10～15bp；优选的，所述核苷酸序列C4的长度为25～60bp。
45.如权利要求37所述的DNA样品的检测试剂盒，其中，所述底物中与核苷酸序列C4互补配对的核苷酸序列的长度长于底物中剩余的核苷酸序列的长度。
46.如权利要求31或35所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述芯片中的固相载体包括选自Al2O3、玻璃、聚合物和尼龙的组中的至少一种。
47.如权利要求31或35所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品来自人体的血液。
48.如权利要求31或35所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品中待测DNA片段为带有突变位点的DNA片段。
49.如权利要求48所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品中待测DNA片段为含有G380R突变位点的FGFR3基因片段。
50.如权利要求49所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品中待测DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；所述中转物的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；所述终端信号物的核苷酸序列如SEQID NO:16所示；所述信号转换物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；所述底物的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
51.如权利要求48所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品中待测DNA片段为含有G681A位点的CYP2C19基因片段。
52.如权利要求51所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA样品中待测DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；所述中转物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；所述终端信号物的核苷酸序列如SEQID NO:22所示；所述信号转换物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；所述底物的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
53.如权利要求48所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，还包括待测DNA片段的标准溶液；优选的，所述检测试剂盒还包括杂交液和清洗液。
54.如权利要求53所述的DNA样品的检测试剂盒，其特征在于，所述杂交液含有去离子甲酰胺、2×SSC、5×Denhard's，SDS和去离子水；所述清洗液含有Tris-Citric、NaCl和Tween20。
55.采用权利要31或35所述的DNA样品的检测试剂盒检测DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将捕获探针偶联于未经修饰的固相载体上；
(2)将偶联了捕获探针的固相载体和DNA样品中待测DNA片段加至杂交液中，使捕获探针与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸B1杂交；反应完后，分离出偶联了待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(3)将步骤(2)分离得到的固相载体与初级信号放大物加至杂交液中，使第一中转物的一端的核苷酸序列L1与DNA样品中待测DNA片段的部分核苷酸B2杂交；反应完后，分离出偶联了初级信号放大物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(4)将步骤(3)分离得到的固相载体与次级信号放大物加至杂交液中，使初级信号放大物中的核苷酸序列L3与次级信号放大物中的的核苷酸序列C1杂交；反应完后，分离出偶联了次级信号放大物、初级信号放大物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(5)将步骤(4)分离得到的固相载体和信号转换物加至杂交液中，使信号转换物与次级信号放大物的核苷酸序列C3杂交，形成次级信号放大物与信号转换物的复合体，并分离出偶联了初级信号放大物、待测DNA片段和捕获探针的固相载体；
(6)通过信号转换物上标记的亲和物质M6，将所得复合体偶联于经亲和物质M5修饰的磁珠上，形成信号磁珠；
(7)检测信号磁珠的信号量，计算DNA样品中待测DNA片段的含量。
56.如权利要求55所述的检测DNA的方法，其特征在于，所述步骤(5)和步骤(6)之间还包括步骤(5a)，所述步骤(5a)包括将次级信号放大物与信号转换物的复合体与带有底物的芯片反应，使底物与第一终端信号物中的核苷酸序列C4杂交，得到芯片、底物、次级信号放大物与信号转换物的复合体。
57.如权利要求1-21或31-54任一项所述的试剂盒在制备用于疾病标记物的检测、药物的治疗效果和/或药物的治疗的副作用的预测的试剂盒中的用途。
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