CN112391501B

CN112391501B - 鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒及伪狂犬病毒的四重pcr引物组

Info

Publication number: CN112391501B
Application number: CN202011467977.6A
Authority: CN
Inventors: 张海玲; 白雪; 廉士珍; 胡博; 张蕾; 李伟; 张东亮; 李虹晔; 李双双; 李紫仟
Original assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Current assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2040-12-14
Also published as: CN112391501A

Abstract

本发明公开了一种鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒及伪狂犬病毒的四重PCR引物组，属于兽用医疗制品技术领域。使用本发明的引物组可同时检测水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒及水貂伪狂犬病毒。本发明还公开了含有上述引物组的试剂盒并建立了相关的多重PCR检测方法。本发明建立的多重PCR检测方法简单，检测速度快且批量大、特异性好、准确性高、重复性好，可以准确、快速、高通量的进行临床样本的检测，也可应用于宠物犬、雪貂及狐狸、貉病毒病的检测。

Description

鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒及伪狂犬病毒的四重PCR引物组

技术领域

本发明涉及一种鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒、伪狂犬病毒的四重PCR引物组，还涉及含有该引物组的试剂盒及其应用，本发明属于兽用医疗制品技术领域。

背景技术

我国毛皮动物养殖业从上世纪50年代起步，90年代获得蓬勃发展，如今已成为畜牧业养殖的重要组成部分。目前，我国水貂存栏数可达5000万只，主要集中在山东、河北、吉林、辽宁、黑龙江、内蒙古等省份地区，并形成了较大的产业链。在某些地区水貂等毛皮动物养殖业甚至成为区域经济的支柱性产业。可见毛皮动物养殖业对推动“三农”经济发展，促进农村产业结构调整，增加农民就业和收入起到了重要的作用。因此，及时对上述四种疾病进行防控能够最大限度的减少上述传染病发生给水貂养殖业带来的损失，促进水貂养殖业的发展。

水貂犬瘟热是由副黏病毒科麻疹病毒属犬瘟热病毒引起的急性、热性、高度接触性传染病，其主要特征是以侵害黏膜***为主，出现双相体温升高，伴有卡他性肺炎、胃肠炎，偶有神经症状，容易继发其他细菌病毒的混合感染和二次感染，幼貂死亡率可高达80％。带毒水貂是最危险的传染源，通过眼及鼻分泌物、唾液、尿、粪便排出病毒，主要经消化道、呼吸道传染，是水貂养殖业三大疫病之一，俗称“貂瘟”。

水貂细小病毒性肠炎是由细小病毒科细小病毒属水貂细小病毒引起的急性、高度接触性传染病，是水貂养殖业三大疫病之一。不同年龄和品种的水貂均有易感性，但50～60日龄的仔貂和幼貂最为易感，幼貂的发病率为70％以上，其死亡率可达90％；成年貂的发病率为30％左右，死亡率在30％以下。患病水貂和耐过貂是该病的主要传染源，通过粪、尿、唾液排毒，经消化道和呼吸道传染给易感染的健康貂。该病全年都可发生，常呈地方性流行，一旦传入貂场，如兽医防疫卫生措施不完善，常常导致该病长期存在和周期性发生。

水貂阿留申病又称水貂浆细胞增多症(Plasmacytosis)，是农业部动物疫病病种名录中三类动物疫病、中国-丹麦进境水貂议定书中的必检疫病项目，该病由水貂阿留申病毒引起的，它可以感染任何年龄段的水貂，并且病症呈现出多样的表现形式。对患急性肺炎的新生仔貂而言，阿留申病毒几乎可以导致其100％的死亡率；而对成年水貂，该病通常引起水貂的持续感染，并表现为终生病毒血症、高蛋白血症、动脉血管炎和由病毒-抗体复合体诱导的肾小球肾炎和肝炎等。

水貂犬瘟热、水貂细小病毒性肠炎、水貂阿留申病是水貂常见传染病。其中水貂阿留申病毒感染范围广，常呈隐形感染，造成水貂消瘦、皮张毛色不佳，短小不光滑。而水貂细小病毒、犬瘟热病毒发病率高、死亡率高，对养貂业造成严重损失。近年来，从水貂体内又分离出貂源伪狂犬病毒。伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的经济动物和家畜的一种急性传染病。其特征是发热、奇痒、内脏出血、脑脊髓炎等，近年来水貂临床病例持续增加。

上述四种水貂疾病临床某些症状相似，又容易混淆或者混合感染。临床鉴别诊断困难，常用单一PCR检测方法耗时耗力，所以，建立一种同时检测四种疾病的鉴别诊断方法具有重要的实际意义和推广前景。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒、貂源伪狂犬病毒的四重PCR引物组。

本发明的目的之二在于提供一种含有上述的四重PCR引物组的试剂盒及其在鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒、伪狂犬病毒中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种鉴别水貂犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)、水貂细小病毒(又称水貂肠炎病毒，Mink Enteritis Virus，MEV)、水貂阿留申病毒(Aleutian MinkDisease Virus，AMDV)以及伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)的四重PCR引物组，所述的引物组由分别用于扩增水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒以及伪狂犬病毒基因组片段的四对引物组成，其核苷酸序列如下所示：

CDV1：5’-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3’；

CDV2：5’-CTTGAGCTTTCGACCCTTC-3’；

MEV1:5’-CAGGTGATGAATTTGCTACAGGAAC-3’；

MEV2:5’-ACAAATGGTGCATTTACATGAAGTC-3’；

ADV1：5’-CACTGGGCTTTGTTCCTT-3’；

ADV2：5’-TTACCTCTTTCCTCACCC-3’；

PRV1：5’-GTTCGTGCGCTACTCCTCCGC-3’；

PRV2：5’-AGGTCGACCACGGTGCCGTT-3’。

进一步的，本发明还提出了所述的四重PCR引物组在制备检测水貂、貉或狐来源的CDV、MEV、AMDV及PRV试剂中的应用。

更进一步的。本发明还提出了一种鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒以及伪狂犬病毒的四重PCR检测试剂盒，该试剂盒包含本发明所述的四重PCR引物组。

其中，优选的，所述的试剂盒中还含有2×Ex Taq Buffer，one step enzyme mix以及无核酸酶水。

其中，优选的，所述的四重PCR检测试剂盒PCR反应体系为：2×Ex Taq Buffer 15μL，所述的引物CDV1、CDV2、MEV1、MEV2、ADV1、ADV2、PRV1、PRV2各0.5μL，核酸模板2μL，余量用无RNA酶灭菌水补足至30μL。

其中，优选的，所述的四重PCR检测试剂盒的PCR反应程序为：45℃，30min；95℃预变性3min；94℃40s，54℃30s，72℃30s，共计34个循环；最后72℃延伸7min。

再进一步的，本发明还提出了一种鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒以及伪狂犬病毒的四重PCR检测方法，包括下列步骤：

1)使用商品化的病毒DNA/RNA提取试剂盒从样品中提取核酸；

2)以提取的核酸为模板，用本发明所述的引物组进行PCR扩增反应，获得扩增产物；

3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像***下观察结果。

其中，优选的，步骤2)中的PCR反应体系为：2×Ex Taq Buffer 15μL，引物CDV1、CDV2、MEV1、MEV2、ADV1、ADV2、PRV1、PRV2各0.5μL，核酸模板2μL，余量用无核酸酶水补足至30μL。

其中，优选的，步骤2)中的PCR反应程序：45℃，30min；95℃预变性3min；94℃40s，54℃30s，72℃30s，共计34个循环；最后72℃延伸7min。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明可以同时检测水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病度和伪狂犬病毒；操作简单，检测速度快、准确性高、特异性好、重复性好，可以准确、快速、高通量的进行分析，有利于临床实践中的推广应用。

本发明也可用于貉、狐犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒以及伪狂犬病毒的检测。

附图说明

图1为特异性试验电泳结果图；

其中：1.扩增MEV片段697bp；2.空白对照；3.扩增ADV 433bp；4.空白对照；5.扩增CDV 355bp；6.空白对照；7.扩增PRV 177bp；8.空白对照；9.混合样品；10空白对照；11.DL2000 DNA Marker；12.100bp DNA Marker

图2为敏感性试验电泳结果图；

其中：1-5.10^-1-10^-5；6.阴性对照；7.100bp DNA Marker

图3为重复性试验电泳结果图；

其中：1.100bp DNA Marker；2.阴性对照；3-6为四次重复性实验；

图4为临床样本检测结果图；

其中：1.MEV阳性；2.ADV阳性；3.CDV、PRV阳性；4.PRV阳性；5.CDV、ADV、PRV阳性；6.MEV、CDV、ADV、PRV阳性；7.阴性对照；8.DNA Marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但下述实施例不会在任何方面限制本发明的保护范围。

实施例1引物设计

根据水貂犬瘟热病毒N基因(1572bp)、水貂细小病毒VP2基因(1755bp)、水貂阿留申病毒VP2基因(1944bp)和伪狂犬病毒gH基因(2061bp)的保守序列，经过序列比对分析分别设计出一对特异性引物，用于水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒和伪狂犬病毒的基因的部分基因片段扩增。

预期扩增产物片段长度分别为335bp，697bp，433bp，177bp。引物位置及序列如下：

水貂犬瘟热病毒基因片段扩增引物位于N基因(90-424bp)：

CDV1：5’-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3’；

CDV2：5’-CTTGAGCTTTCGACCCTTC-3’；

水貂细小病毒VP2基因片段扩增引物(VP2基因555-1250bp)：

MEV1:5’-CAGGTGATGAATTTGCTACA-3’；

MEV2:5’-ACAAATGGTGCATTTACATGA-3’；

水貂阿留申病毒基因片段扩增引物(VP2基因599-1031p)：

ADV1：5’-CACTGGGCTTTGTTCCTT-3’；

ADV2：5’-TTACCTCTTTCCTCACCC-3’；

伪狂犬病毒基因片段扩增引物(糖蛋白gH基因1722-1898bp)：

PRV1：5’-GTTCGTGCGCTACTCCTCCGC-3’；

PRV2：5’-AGGTCGACCACGGTGCCGTT-3’；

以上引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例2四重PCR检测方法建立及应用

2.1特异性试验

2.1.1病毒基因组DNA/RNA的提取

水貂犬瘟热病毒(CDV)、水貂细小病毒(MEV)、水貂阿留申病毒(ADV)、伪狂犬病毒(PRV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)、水貂铜绿假单胞菌(PA)、水貂冠状病毒(CoV)按照商品化病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒操作说明书，提取病毒基因组，–80℃保存备用。

2.1.2PCR扩增反应

在0.2ml PCR管中按顺序加入灭菌水，2×Ex Taq Buffer 15μL，CDV上、下游引物、MEV上、下游引物、ADV上、下游引物，PRV上、下游引物，每条引物(浓度均为20pmol/μL)0.5μL，one step enzyme mix 1μL，核酸模板2μL，共计30μL体系。

PCR反应程序：45℃，30min；95℃预变性3min；94℃40s，53℃30s，72℃30s，共计32个循环；最后72℃延伸7min。

扩增的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳观察结果见图1，从图中可以看出CDV、MEV、ADV和PRV引物扩增的PCR产物分别是335bp、697bp、433bp和177bp左右各出现一条特异性基因片段。

2.2敏感性试验

2.2.1克隆载体构建及鉴定

将分别用实施例1中的水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒和伪狂犬病毒引物扩增的四个PCR扩增回收产物连接pM18-T克隆载体，转化DH5α感受态细胞，挑取单个菌落于氨苄青霉素抗性的LB培养基3mL，37℃摇菌12h，用商品化质粒提取试剂盒提取质粒，经PCR和酶切鉴定阳性克隆，得到的阳性克隆分别命名为CDV355、MEV732、ADV433以及PRV177。

2.2.2标准品制备

用无菌水对2.2.1中的质粒混合溶液进行十倍倍比稀释，制备成3.57×10¹⁰copies/μL到35.7copies/μL的标准质粒。应用2.1.2中的检测方法检测。将质粒稀释到同时出现四条特异性条带的最大稀释度作为检测方法的敏感度，并确定每一个质粒混合前的初始浓度，该初始浓度四种质粒混合物即为标准品，其中每一种质粒的最低拷贝数应符合以下要求，CDV355≥8.6×10^-5ng/μL，MEV732≥5.7×10^-5ng/μL，ADV433≥3.8×10^-5ng/μL，PRV177≥8.9×10^-5ng/μL。制备四种质粒混合的标准质粒，其中含CDV355质粒浓度8.6ng/μL(2.6×10⁹copies/μL)，MEV692质粒浓度5.7ng/μL(1.6×10⁹copies/μL)，ADV433质粒浓度3.8ng/μL(1.3×10⁹copies/μL)，PRV177质粒浓度8.9ng/μL(2.8×10⁹copies/μL)，混合质粒经过倍比稀释后的DNA作为模板扩增，在达到10^-5时仍然出现四条特异条带，大于该稀释度的扩不出来，此时最小浓度为CDV355≥8.6×10^-5，MEV732≥5.7×10^-5ng/μL，ADV433≥3.8×10^-5ng/μL，PRV177≥8.9×10^-5ng/μL。

2.2.4敏感性检测

将CDV₃(TCID₅₀＝10^5.1/ml)、MEV-SPM-11株(TCID₅₀＝10^5.3)、ADV(阿留申病毒抗原)、PRV(猪伪狂犬疫苗毒)取50μL混合，共计200μL体积，以混合样品提取基因组，用分光光度计测定其浓度，混合物提取基因组浓度达到30ng/μL，将混合液按照十倍倍比稀释至10^-10，用引物对进行PCR扩增，验证该RT-PCR方法的敏感性。同时以灭菌水为阴性对照，以质粒混合液标准品为阳性对照，验证该方法的敏感性，检测方法同2.1.2，结果见图2，在10^-5时扩增出明显条带。

2.3重复性试验

将CDV细胞培养液、MEV细胞陪液、ADV(阿留申抗原)、PRV(猪伪狂犬疫苗毒)取50μL混合，共计200μL体积，以混合样品提取DNA/RNA基因组，用引物对进行PCR扩增，同时以灭菌水为阴性对照，检测方法同2.1.2。多次重复试验结果证明，四重引物扩增的PCR产物仅出现4条特异条带，与预期的大小相符，重复效果良好(图3)。

2.4、临床样品检测

临床采集具有CDV、MEV、ADV、PRV疑似症状的样本进行检测，检测方法同2.1.2，结果扩增条带大小与预期大小结果一致，且没有非特异条带(图4)，同时对样本进行病毒的分离培养和鉴定，其结果与按照本发明方法得到的结果一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种鉴别水貂犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)、水貂细小病毒(又称水貂肠炎病毒，Mink Enteritis Virus，MEV)、水貂阿留申病毒(Aleutian Mink DiseaseVirus，AMDV)以及伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)的四重PCR引物组，所述的引物组由分别用于扩增水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒以及伪狂犬病毒基因组片段的四对引物组成，其核苷酸序列如下所示：

CDV1：5’-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3’；

CDV2：5’-CTTGAGCTTTCGACCCTTC-3’；

MEV1:5’-CAGGTGATGAATTTGCTACAGGAAC-3’；

MEV2:5’-ACAAATGGTGCATTTACATGAAGTC-3’；

ADV1：5’-CACTGGGCTTTGTTCCTT-3’；

ADV2：5’-TTACCTCTTTCCTCACCC-3’；

PRV1：5’-GTTCGTGCGCTACTCCTCCGC-3’；

PRV2：5’-AGGTCGACCACGGTGCCGTT-3’。

2.权利要求1所述的四重PCR引物组在制备检测水貂、貉或狐来源的CDV、MEV、AMDV及PRV试剂中的应用。

3.一种鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒以及伪狂犬病毒的四重PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求1所述的四重PCR引物组。

4.如权利要求3所述的四重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有2×ExTaq Buffer，one step enzyme mix以及灭菌水。

5.如权利要求3所述的四重PCR检测试剂盒，其特征在于，PCR反应体系为：2×Ex TaqBuffer 15μL，权利要求1所述的引物CDV1、CDV2、MEV1、MEV2、ADV1、ADV2、PRV1、PRV2各0.5μL，核酸模板2μL，余量用灭菌水补足至30μL。

6.如权利要求3所述的四重PCR检测试剂盒，其特征在于，PCR反应程序为：45℃，30min；95℃预变性3min；94℃40s，54℃30s，72℃30s，共计34个循环；最后72℃延伸7min。

7.一种鉴别水貂犬瘟热病毒、水貂细小病毒、水貂阿留申病毒以及伪狂犬病毒的四重PCR检测方法，所述的方法不用于疾病的诊断目的，其特征在于，包括下列步骤：

1)使用商品化的病毒DNA/RNA提取试剂盒从样品中提取核酸；

2)以提取的核酸为模板，用权利要求1中所述的引物组进行PCR扩增反应，获得扩增产物；

8.根据权利要求7所述的四重PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中PCR反应体系为：2×Ex Taq Buffer 15μL，引物CDV1、CDV2、MEV1、MEV2、ADV1、ADV2、PRV1、PRV2各0.5μL，核酸模板2μL，用无RNA酶灭菌水补足至30μL。

9.根据权利要求7所述的四重PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中PCR反应程序：45℃，30min；95℃预变性3min；94℃40s，54℃30s，72℃30s，共计34个循环；最后72℃延伸7min。