CN112391382A - 一种快速提取囊泡dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种快速提取囊泡DNA的方法，属于核酸提取技术领域。方法包括：S1、取囊泡悬液置于80‑100℃的温度下进行水浴，然后在90‑110W的功率下进行超声破碎，得到破细胞悬液；S2、向所述破细胞悬液中加入氯仿混匀，静置一段时间后离心取上清液，得到囊泡DNA。本发明的整个操作过程简单，步骤较少，所需时间不到30min，大大简化了囊泡内游离DNA的提取流程同时提高了囊泡内游离DNA的提取效率和提取纯度。

Description

一种快速提取囊泡DNA的方法
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，特别涉及一种快速提取囊泡DNA的方法。
背景技术
细胞骨架是真核细胞借以维持其基本形态的重要结构，细胞在受到外源性或内源性刺激之后会引起细胞骨架发生重排，导致细胞膜局部受力不均匀。受力异常的胞质会向胞外膨胀，进而随机包裹部分细胞内容物后以囊泡的形式释放到细胞外部，这种直径约为0.1-1μm的特殊亚细胞结构称为“细胞囊泡”。中国专利CN102302784B及其系列专利公开了使用紫外线照射肿瘤细胞或者使用化疗药物与肿瘤细胞共孵育以诱导肿瘤细胞凋亡，进而获得细胞囊泡的方法。该方法制备的细胞囊泡携带有原肿瘤细胞的生物活性分子，如DNA、RNA和蛋白质，表现出原肿瘤细胞的分子生物印记，可以有效地激活机体免疫应答。研究表明，囊泡中的DNA来自游离于细胞内的、部分降解了的机体内源性DNA，其片段长度远小于基因组DNA，集中在0.18-21kb之间，并且这些DNA所携带的基因信息在某种程度上与肿瘤细胞DNA具有一致性，对研究疾病的发生发展、早期诊断、预后、检测都具有重要的意义。而获得性质稳定、纯度高的囊泡DNA是是开展上述研究工作的先决条件。
目前，在提取囊泡DNA时，通常参考外泌体内容物的提取步骤。但是，现有的外泌体DNA提取步骤操作复杂，待提取DNA的样品首先需要在裂解液(Buffer ATL)和蛋白酶作用下裂解消化，以将DNA释放到裂解液中，然后加入Buffer AL和乙醇后，转移至柱子中过滤，使DNA被吸附在柱子的膜上，而蛋白质则不被吸附并随溶液滤出除去。柱子经Buffer GW1洗涤蛋白质和其它杂质，经Buffer GW2洗涤去除盐分，最后DNA被低盐缓冲液(Buffer AE)洗脱。完成整个操作所需时间超过1小时，提取效率低下，不适用于囊泡DNA的大规模提取。
发明内容
针对以上现有技术中囊泡DNA提取效率低的问题，本发明提供了一种快速提取囊泡DNA的方法。
为实现上述目的，本发明具体通过以下技术实现：
一种快速提取囊泡DNA的方法，包括以下步骤：
S1、取囊泡悬液置于80-100℃的温度下进行水浴，然后在90-110W的功率下进行超声破碎，得到破细胞悬液；
S2、向所述破细胞悬液中加入氯仿混匀，静置一段时间后离心取上清液，得到囊泡DNA。
进一步地，步骤S1中，在95-105W的功率下进行超声破碎。
进一步地，步骤S1中，所述超声破碎的工作模式选择间歇式的方式，所述间歇式的方式为工作1-5s、间歇1-5s，占空比为50％。
进一步地，步骤S1中，所述超声破碎的时间为2-10min。
进一步地，步骤S1中，所述水浴时间为2-10min。
进一步地，步骤S1中，所述囊泡悬液置于90℃的温度下进行水浴。
进一步地，步骤S1中，所述囊泡悬液中囊泡的浓度为3×1010-6×1010个/mL。
进一步地，所述囊泡悬液由肿瘤细胞凋亡后产生。
进一步地，步骤S2中，所述破细胞悬液与所述氯仿的体积比为1.5-5：1。
进一步地，步骤S2中，所述离心条件为：12000g离心10min。
有益效果：
1、本发明首先采用较高温度水浴，促进细胞膜变性，使细胞膜初步破裂，而后通过较低功率的超声波进一步破碎囊泡，提高了囊泡破碎率，最大限度地释放出内容物，之后以氯仿抽提除质，离心分离去除细胞膜碎片等，即可获得纯度较高的DNA。整个操作过程简单，步骤较少，所需时间不到30min左右，大大简化了囊泡内游离DNA的提取流程同时提高了囊泡内游离DNA的提取效率和提取纯度。
2、本发明不需要使用昂贵且可能供应受限的裂解试剂，水浴锅和超声破碎仪均为实验室常用仪器，操作简易，成本低，效率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例4囊泡DNA的PCR扩增检测图；
图2为本发明实施例5囊泡DNA的PCR扩增检测图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。另外，术语“包括”、“含有”、“具有”的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。如无特殊说明的，材料、设备、试剂均为市售。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、体积比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
本发明提供一种快速提取囊泡DNA的方法，包括以下步骤：
S1、取囊泡悬液置于80-100℃的温度下进行水浴，然后在90-110W的功率下进行超声破碎，得到破细胞悬液；
S2、向所述破细胞悬液中加入氯仿混匀，静置一段时间后离心取上清液，得到囊泡DNA。
其中，步骤S1中，所述囊泡悬液由肿瘤细胞凋亡后产生。诱导所述肿瘤细胞凋亡的方法为使用紫外线照射肿瘤细胞或者使用化疗药物与肿瘤细胞共孵育。
由上述方法诱导细胞凋亡获得的囊泡为胞外颗粒物，粒径小，由肿瘤细胞膜直接外翻分泌形成，囊泡所含的DNA基本都是细胞质中游离的核酸片段，且片段大小和来源较为随机。
首先采用较高温度水浴，促进细胞膜变性，使类脂、甘露聚糖、葡聚糖等成分部分分解，从而使细胞膜初步破裂，而且高温可以使囊泡包含的多种分解DNA的酶类变性进而抑制其活性甚至使其变性失活，避免DNA在提取过程中被降解，有利于得到较为完整的DNA分子，从而起到保护DNA分子的作用。其次，通过较低功率的超声波进一步处理囊泡，利用超声波的机械效应引起细胞膜结构损伤，促进囊泡的细胞膜破坏，提高囊泡破碎率，以尽可能地释放出内容物。之后通过氯仿抽提去除蛋白等杂质，然后离心分离去除细胞膜碎片和包涵体等，即可获得纯度较高的DNA。上述整个操作过程简单，步骤较少，所需时间不到30min，大大简化了囊泡内游离DNA的提取流程同时提高了囊泡内游离DNA的提取效率。
众所周知，目前在细胞DNA提取过程中，通常需要使用蛋白酶K或者各种裂解液裂解并结合高功率(大于300W)的超声波等激烈的手段破碎细胞，并结合氯仿和苯酚抽提除杂，苯酚是强的蛋白变形剂，其目的在于使蛋白变性沉淀，氯仿的目的在于使水相和有机相—苯酚相分离，以除去苯酚，但是苯酚微溶于水，后续还需要多次沉淀除杂操作以完全除去苯酚，否则苯酚残留会影响下游实验。而在本发明中，由于制备得到的囊泡作为泡状膜结构，其膜双分子层不是很稳定，高温水浴结合较低功率的超声破碎在较短的处理时间内就足以保证囊泡破裂，使内容物释放出来，更重要的是，采用上述温和手段破碎囊泡可以大大减少囊泡细胞膜的碎片化程度和降低DNA损伤，进而减少细胞膜碎片和可溶性杂质的产生，因此，后续仅采用氯仿抽提除杂即可，且氯仿不溶于水，不用进一步操作，即可以省略沉淀除杂等操作，进而大大缩短游离DNA提取的时间，提高游离DNA提取的效率，且由于操作步骤的减少和囊泡细胞膜破碎条件温和，也保证了可得到纯度和完整性高的DNA，能作为模板进行后续的PCR等实验。
细胞损伤作用的强弱与超声波强度密切相关，细胞破损度随超声波功率的增大而增大。超声波功率过小，对待提取囊泡样品中的细胞膜破损较小，无法有效释放出其内包含的游离DNA，导致DNA提取量较少，而超声波功率过大，虽然会使得细胞破碎完全以大量释放DNA，但同时会造成样品的过度剪切，容易引起细胞膜和游离DNA的碎片化，使提取到的DNA无法完全反映肿瘤细胞的特性，且造成DNA中杂质含量高。优选地，步骤S1中，在95-105W的功率下进行超声破碎，进一步优选地，所述超声破碎的功率为97.5W，在该功率条件下，细胞破碎率高，提取的DNA浓度大，纯度高，性质稳定。
优选地，步骤S1中，所述超声破碎的工作模式选择间歇式的方式，以防止局部过热引起DNA变性。更优选地，所述间歇式的方式为工作1-5s、间歇1-5s，占空比为50％。低占空比脉冲具有良好的机械效应，可缩短超声时间，进一步减少囊泡内游离DNA的损伤。
针对不同细胞的特点，设置精确的超声条件，尤其是确定科学的超声功率和超声处理的时间，能够保证非常显著的细胞膜破碎的效果。本发明中由于囊泡结构的不稳定性，在较短时间内即可保证高的细胞膜破碎率，而延长超声波的作用时间，释放出的DNA在瞬时的强大能量下易被剪切成破片或被氧化破坏，影响提取效果，因此其不适于长时间的超声处理。优选地，步骤S1中，所述超声破碎的时间为2-10min。更优选地，所述超声破碎的时间为6min。
为了提高DNA酶等酶类变性失活的效率，优选地，步骤S1中，所述水浴时间为2-10min。
优选地，步骤S1中，所述囊泡悬液置于90℃的温度下进行水浴。
优选地，步骤S1中，所述囊泡悬液中囊泡的浓度为3×1010-6×1010个/mL。囊泡悬液中囊泡的浓度对破碎率的影响较小，可根据所需提取的DNA的含量适当增加或减少囊泡数量。对于常见的实验来说，如PCR扩增、DNA测序等，3×1010-6×1010个/mL的囊泡数量可以达到良好的实验效果。
优选地，步骤S2中，所述破细胞悬液与所述氯仿的体积比为1.5-5：1。可以理解的是，随着囊泡悬液中囊泡的浓度、细胞膜破碎程度增加等导致的杂质含量的增大，可以加大氯仿的用量，以使提取的DNA中杂质含量较低。但过多的氯仿含量则一方面增加了氯仿的浪费，另一方面对DNA的纯度影响不大。
优选地，步骤S2中，所述离心条件为：12000g离心10min。在该离心条件下，可保证细胞膜碎片和包涵体等杂质完全沉降，从而与液体中的DNA分离开。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中，采用新芝JY92-IIN型超声破碎仪进行超声破碎，该仪器总功率为650W，以工作模式为工作2s、间隙2s为例。
实施例1囊泡DNA提取条件的选择
1)囊泡悬液的制备：取A549细胞来源囊泡(提取方法参见中国专利CN102302784B)，用灭菌水制成囊泡悬液，其中，囊泡悬液中囊泡的数量约为5×1010个/mL。
2)预实验：量取体积为0.3mL的囊泡悬液，加入200μL氯仿混匀，震荡20s，静置3min，之后12000g离心10min，取约50μL上清液备用。另取200μL上清液加入两倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20℃冰箱静置1h，之后12000g离心10min，弃上清，取沉淀用75％乙醇清洗后移弃上清，稍晾干后用200μL灭菌水溶解备用。利用Thermo NanoDrop 2000超微量分光光度计对备用的50μL上清液及200μL灭菌水溶解的DNA溶液进行DNA含量及纯度检测。其中，备用的上清液中DNA含量为58.1ng/μL，A260/A280比值为1.43；灭菌水溶解的DNA溶液中DNA含量为52.4ng/μL，A260/A280比值为1.61。该预实验表明制备得到的囊泡中含有高浓度的游离DNA，但游离DNA中A260/A280比值较低，含有一定量的蛋白类杂质。
3)囊泡DNA提取条件的选择：分别量取体积为0.3mL的囊泡悬液6份，分别进行下述处理：
实验组1：将囊泡悬液置于冰上，超声破碎5min(超声破碎参数为：功率97.5W，工作2s、间隙2s)，之后加入200μL氯仿，震荡20s混匀，静置3min，12000g离心10min，上清液作为样品进行检测。
实验组2：将囊泡悬液置于90℃水浴5min，之后加入200μL氯仿，震荡20s混匀，静置3min，12000g离心10min，上清液作为样品进行检测。
实验组3：向囊泡悬液加入10μL蛋白酶K，混匀后置于60℃水浴10min，之后加入500μL氯仿，震荡20s混匀，静置3min；
实验组4：将囊泡悬液置于90℃水浴5min，然后超声破碎5min(超声破碎参数为：功率97.5W，工作2s、间隙2s)，之后加入500μL氯仿，震荡20s混匀，静置3min，12000g离心10min，上清液作为样品进行检测。
实验组5：向囊泡悬液加入10μL蛋白酶K，混匀后置于60℃水浴10min，然后超声破碎5min(超声破碎参数为：功率97.5W，工作2s、间隙2s)，之后加入500μL氯仿，震荡20s混匀，静置3min，12000g离心10min，上清液作为样品进行检测。
对照组：利用外泌体DNA提取试剂盒(美基生物HiPure Exosome DNA Kit)进行DNA的提取，具体步骤为：
a)、涡旋松散囊泡悬液，加入200μL Buffer ATL或灭菌水至囊泡悬液中，用移液枪反复吸打囊泡悬液；
b)加入10μL Proteinase K、3μL Carrier RNA和200μL Buffer AL至样品中，涡旋15s混匀，56℃水浴30min；
c)加入200μL无水乙醇，涡旋15s混匀，室温静置3min；
d)短暂离心收集管壁上的液滴；
e)把DNA柱装在收集管中，转移混合液至柱子中，6000g离心30-60s；
f)倒弃流出液，把柱子装回收集管中，加入500μL Buffer GW1(已用乙醇稀释)至柱子中，6000g离心30-60s；其中，Buffer GW1使用之前，须用无水乙醇进行稀释，按瓶子标签指示；
g)倒弃滤液，把柱子重新装回收集管中，加入600μL Buffer GW2(用乙醇稀释)至柱子中，6000g离心30-60s；
h)倒弃滤液，把柱子重新装回收集管中，加入600μL Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中，6000g离心30-60s；
i)倒弃滤液，把柱子重新装回收集管中，13000g离心空柱3min以甩干柱子；
j)将柱子转移至新的1.5mL离心管中，加入50μL预热至56℃的Buffer AE至柱子的膜中央，静置3min，之后13000g离心1min，管底溶液即为所提取的DNA。
利用Thermo NanoDrop 2000超微量分光光度计对上述实验组和对照组的上清液及最后溶解的DNA溶液进行DNA含量及纯度检测，结果见表1。
表1不同条件提取的DNA含量及纯度结果
序号 囊泡悬液处理条件 DNA浓度 A260/A280
实验组1 超声破碎5min 181.3ng/μL 1.72
实验组2 90℃水浴5min 148.6ng/μL 1.54
实验组3 加入蛋白酶K，60℃水浴10min 188.4ng/μL 1.63
实验组4 90℃水浴5min，超声破碎5min 207.4ng/μL 1.76
实验组5 加入蛋白酶K，60℃水浴10min，超声破碎5min 203.6ng/μL 1.75
对照组 试剂盒提取 214.3ng/μL 1.78
由表1可知，每种不同的处理方法均能得到一定浓度和纯度的DNA溶液，与试剂盒相比，单独的超声破碎、90℃水浴破碎和蛋白酶K酶解破碎细胞膜均没办法有效破裂细胞破，使得DNA的浓度和纯度都偏低。联合多种不同的处理方法能够一定程度上提高DNA提取效率，其中，以实验组4得到的DNA浓度和纯度与试剂盒比较差异不明显，因此选择“90℃水浴5min，超声破碎5min”作为本发明的处理条件，而且水浴加热和超声破碎方式便捷，没有试剂依耐性，适于大规模提取DNA。
为了验证乙醇纯化对上清液中DNA纯度的影响，各取实验组1-5的200μL上清液加入两倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20℃冰箱静置30min，之后12000g离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇清洗，用移液枪移弃上清，稍晾干后用200μL灭菌水溶解，测定溶解液中DNA含量及纯度检测，结果见表2。
表2不同条件提取的DNA经乙醇纯化后DNA含量及纯度结果
序号 囊泡悬液处理条件 DNA浓度 A260/A280
实验组1 超声破碎5min 178.6ng/μL 1.76
实验组2 90℃水浴5min 138.3ng/μL 1.63
实验组3 加入蛋白酶K，60℃水浴10min 180.1ng/μL 1.68
实验组4 90℃水浴5min，超声破碎5min 199.8ng/μL 1.76
实验组5 加入蛋白酶K，60℃水浴10min，超声破碎5min 191.3ng/μL 1.77
对比乙醇纯化后的DNA浓度及纯度差异不大，因此在后续的实验操作中无需使用乙醇沉淀DNA以进行纯化清洗的步骤；推测一方面是由于囊泡内容物简单，氯仿抽提后的溶液中杂质对核酸的检测影响不大，另一方面本发明破碎囊泡细胞膜的方式产生的杂质较少，通过氯仿抽提和离心即可完全除去细胞膜碎片、蛋白包涵体等杂质。
实施例2超声条件的优化
1)超声时间的优化：分别量取体积为0.3mL的囊泡悬液5份，将囊泡悬液置于90℃水浴5min，然后分别超声破碎2min、4min、6min、8min、10min，超声破碎参数为：功率97.5W，工作2s、间隙2s，之后加入500μL氯仿，震荡20s混匀，静置3min，12000g离心10min，上清液作为样品进行检测DNA浓度及含量检测，检测结果见表3。
表3不同超声时间对提取的DNA含量及纯度的影响
Figure BDA0002820374370000091
Figure BDA0002820374370000101
由表3可知，随着超声时间的延长，提取的DNA含量随之增加，这是因为细胞膜破碎率提高引起囊泡内容物释放增加，但随着超声时间的进一步延长，提取的DNA含量增加不明显，反而纯度有所下降，可能原因是因为细胞破过度破碎，形成了大量的碎片化细胞膜，使得体系内可溶性杂质含量增加。因此，优选超声破碎时间为4-8min，更优选为6min。
2)超声功率的优化：分别量取体积为0.3mL的囊泡悬液5份，将囊泡悬液置于90℃水浴5min，然后在功率为90W、95W、97.5W、105W、110W条件下分别超声破碎5min，超声破碎时工作2s、间隙2s，之后加入500μL氯仿，震荡20s混匀，静置3min，12000g离心10min，上清液作为样品进行检测DNA浓度及含量检测，检测结果见表4。
表4不同超声功率对提取的DNA含量及纯度的影响
超声破碎功率 DNA浓度 A260/A280
90W 195.3ng/μL 1.75
95W 203.4ng/μL 1.76
97.5W 207.5ng/μL 1.76
105W 205.5ng/μL 1.76
110W 205.1ng/μL 1.76
由表4可知，随着超声功率的增加，提取的DNA含量和纯度的变化与超声时间的增加呈现出基本相同的变化趋势，超声功率的增加还将导致DNA碎片化，引起DNA结构变化。因此，优选超声破碎功率为95-105W。
实施例3水浴条件的优化
1)水浴时间的优化：分别量取体积为0.3mL的囊泡悬液5份，将囊泡悬液置于90℃分别水浴2min、4min、6min、8min、10min，然后分别超声破碎5min，超声破碎参数为：功率97.5W，工作2s、间隙2s，之后加入500μL氯仿，震荡20s混匀，静置3min，12000g离心10min，上清液作为样品进行检测DNA浓度及含量检测，检测结果见表5。
表5不同水浴时间对提取的DNA含量及纯度的影响
水浴时间 DNA浓度 A260/A280
2min 185.2ng/μL 1.71
4min 204.4ng/μL 1.75
6min 207.6ng/μL 1.76
8min 204.1ng/μL 1.76
10min 204.5ng/μL 1.75
由表5可知，水浴4min以上的样品所提取的DNA浓度及纯度变化不大，可能在水浴4min的时候囊泡裂解程度已经达到最佳，为了保证提取效率，同时保证囊泡能充***解，优选水浴时间为4-8min，更优选为6min。
2)水浴温度的优化：分别量取体积为0.3mL的囊泡悬液5份，将囊泡悬液分别置于85、90、95℃水浴5min，然后分别超声破碎5min，超声破碎参数为：功率97.5W，工作2s、间隙2s，之后加入500μL氯仿，震荡20s混匀，静置3min，12000g离心10min，上清液作为样品进行检测DNA浓度及含量检测，检测结果见表6。
表6不同水浴温度对提取的DNA含量及纯度的影响
水浴温度 DNA浓度 A260/A280
80℃ 194.4ng/μL 1.73
85℃ 203.8ng/μL 1.76
90℃ 206.2ng/μL 1.76
95℃ 204.1ng/μL 1.76
100℃ 203.6ng/μL 1.75
由表6可知，80、85、90、95、100℃五种水浴温度下，囊泡样品均能很好的裂解，由于100℃时沸水可能会溅至样品溶液中，为了保证囊泡的充***解，优选水浴温度为85-95℃，更优选为90℃。
实施例4 A549细胞来源囊泡DNA的提取
以上述实施例中优化后的参数提取A549细胞来源囊泡DNA，具体步骤为：
S1、取0.3mL囊泡悬液置于90℃的温度下水浴6min，然后在97.5W的功率下超声破碎6min，超声破碎的工作模式为工作2s、间隙2s，得到破细胞悬液；
S2、向所述破细胞悬液中加入200μL氯仿，震荡10s混匀，静置3min，之后12000g离心10min，取上清液，得到囊泡DNA，并检测上清液中DNA的含量为209.2ng/μL，A260/A280为1.77。本实施例提取DNA的A260/A280均在1.8左右，说明提取的DNA纯度较高，也反映了所提取的DNA中无蛋白、RNA等杂质的污染，能作为模板进行后续的PCR等实验。相比于实施例1中试剂盒(DNA含量为214.3ng/μL、A260/A280为1.78)提取的效率超过了97％；而且整个操作完成所需时间仅为21min左右，DNA提取效率高。
以本实施例和实施例1中试剂盒提取的两份DNA溶液分别进行PCR扩增检测，PCR仪型号为博日TC-96/G/H(b)，使用的Taq酶为Takara公司的2×Taq MIX，以高表达的保守基因细胞色素B为模板设计引物，引物序列如下：
上游引物序列(F)：5’-AACTTCGGCTCACTCCTTGG-3’，
下游引物序列(R)：5’GGAGGTGATTCCTAGGGGGT-3’。
扩增程序为：94℃4min→(94℃30s→60℃30s→72℃60s)×32→72℃2min。采用1.5％浓度的琼脂糖电泳检测PCR的扩增产物。结果图1所示，图1中M为DNA marker，泳道1为本实施例提取方法扩增结果，泳道2为试剂盒提取方法扩增结果，泳道3为阴性对照，泳道4为细胞基因组DNA扩增结果，可以看出两份样品均能扩增出阳性条带，且差异不明显，DNA条带集中清晰，表明DNA质量完好，没有出现降解或被打碎等情况。
实施例5 D562细胞来源囊泡DNA的提取
囊泡悬液的制备：取D562细胞来源囊泡(提取方法参见中国专利CN102302784B)，用灭菌水制成囊泡悬液，其中，囊泡悬液中囊泡的数量约为3×10个/mL。以上述实施例中优化后的参数提取D562细胞来源囊泡DNA，具体步骤为：
S1、取0.3mL囊泡悬液置于90℃的温度下水浴6min，然后在97.5W的功率下超声破碎6min，超声破碎的工作模式为工作2s、间隙2s，得到破细胞悬液；
S2、向所述破细胞悬液中加入200μL氯仿，震荡10s混匀，静置3min，之后12000g离心10min，取上清液，得到囊泡DNA，并检测上清液中DNA的含量为116.5ng/μL，A260/A280为1.78。本实施例提取DNA的A260/A280在1.8左右，说明提取的DNA纯度较高，也反映了所提取的DNA中无蛋白、RNA等杂质的污染，能作为模板进行后续的PCR等实验。相比于试剂盒(DNA含量为121.7ng/μL、A260/A280为1.78)提取的效率超过了95％。
以本实施例和试剂盒提取的两份DNA溶液分别采用实施例4的PCR扩增条件进行PCR扩增检测，结果图2所示，图2中M为DNA marker，泳道1为本实施例提取方法扩增结果，泳道2为试剂盒提取方法扩增结果，可以看出两份样品均能扩增出阳性条带，且差异不明显，DNA条带集中清晰，表明DNA质量完好，没有出现降解或被打碎等情况。
虽然本发明公开披露如上，但本发明公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本发明公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种快速提取囊泡DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取囊泡悬液置于80-100℃的温度下进行水浴，然后在90-110W的功率下进行超声破碎，得到破细胞悬液；
S2、向所述破细胞悬液中加入氯仿混匀，静置一段时间后离心取上清液，得到囊泡DNA。
2.根据权利要求1所述的快速提取囊泡DNA的方法，其特征在于，步骤S1中，在95-105W的功率下进行超声破碎。
3.根据权利要求1所述的快速提取囊泡DNA的方法，其特征在于，步骤S1中，所述超声破碎的工作模式选择间歇式的方式，所述间歇式的方式为工作1-5s、间歇1-5s，占空比为50％。
4.根据权利要求1所述的快速提取囊泡DNA的方法，其特征在于，步骤S1中，所述超声破碎的时间为2-10min。
5.根据权利要求1所述的快速提取囊泡DNA的方法，其特征在于，步骤S1中，所述水浴时间为2-10min。
6.根据权利要求1所述的快速提取囊泡DNA的方法，其特征在于，步骤S1中，所述囊泡悬液置于90℃的温度下进行水浴。
7.根据权利要求1所述的快速提取囊泡DNA的方法，其特征在于，步骤S1中，所述囊泡悬液中囊泡的浓度为3×1010-6×1010个/mL。
8.根据权利要求1-7任一项所述的快速提取囊泡DNA的方法，其特征在于，所述囊泡悬液由肿瘤细胞凋亡后产生。
9.根据权利要求1所述的快速提取囊泡DNA的方法，其特征在于，步骤S2中，所述破细胞悬液与所述氯仿的体积比为1.5-5：1。
10.根据权利要求9所述的快速提取囊泡DNA的方法，其特征在于，步骤S2中，所述离心条件为：12000g离心10min。
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