CN112391300A

CN112391300A - 水飞蓟来源的黄酮3β-羟化酶及其辅酶的应用

Info

Publication number: CN112391300A
Application number: CN202011213885.5A
Authority: CN
Inventors: 周景文; 陈坚; 高松; 曾伟主; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-11-04
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2040-11-04
Also published as: CN112391300B

Abstract

本发明公开了水飞蓟来源的黄酮3β‑羟化酶及其辅酶的应用，属于基因和代谢工程领域。本发明从水飞蓟中得到并验证了具有黄酮3’‑羟化酶功能的SmF3′H和SmCPR，其具有催化柚皮素合成圣草酚的能力。本发明所使用的SmF3′H和SmCPR，较常用的GhF3′H和CrCPR，在相同培养条件下可使转化柚皮素生成圣草酚的产量提升17.0％。在此基础上，利用不同强度的启动子调控SmF3′H和SmCPR，进一步提升了圣草酚的产量，圣草酚的产量可在250mL摇瓶中达到805.6mg/L，较已报道的最高产量200mg/L，增产302.8％。水飞蓟来源的黄酮3β‑羟化酶及其辅酶良好的转化柚皮素合成圣草酚的性能，使其具备广阔的应用前景。

Description

水飞蓟来源的黄酮3β-羟化酶及其辅酶的应用

技术领域

本发明涉及水飞蓟来源的黄酮3β-羟化酶及其辅酶的应用，属于基因和代谢工程领域。

背景技术

圣草酚是一种广泛存在于蔬菜、水果及中药中的天然二氢黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤及神经保护等多种药理活性，常用于治疗气喘、过敏性鼻炎、风湿等疾病，具备非常高的药用价值，同时其还是黄杉素、花青素、水飞蓟及大风子素等的前体物质，具备广泛的应用价值。目前，圣草酚主要还是通过直接从植物中提取得到，但是在提取的过程中，需要消耗大量能量来维持高温、并添加大量化学试剂、生产效率低，因而对生态环境造成了很大影响。

目前也有报道利用生物法提取，尤其是利用微生物转化的方法，虽然较于植物法提取会更加安全环保，但是同时也存在着产量低、转化效率不高的问题。目前主要的微生物转化法是利用黄酮3β-羟化酶F3′H在辅酶CPR的共同作用下催化柚皮素得到。已有相关研究报道F3′H催化柚皮素获得圣草酚的最高产量仅200mg/L(Amor,I.L.,et al.,Biotransformation of naringenin to eriodictyol by Saccharomyces cerevisieafunctionally expressing flavonoid 3'hydroxylase.Nat Prod Commun,2010.5(12):p.1893–1898.)。在大肠杆菌中合成圣草酚的产量最高仅107mg/L(Zhu,S.,et al.,Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.ApplEnviron Microbiol,2014.80(10):p.3072–3080.)。这是由于F3′H和CPR需要锚定在内质网上才可以高效传递电子(图1)，因此大部分的F3′H和CPR在原核微生物中表达活性很低甚至没有活性。

因此，仍然缺乏高效生产的F3′H和CPR，使得圣草酚的产量受到了极大的限制，无法很好地将微生物法应用于工业化生产。

发明内容

对于特定的代谢途径中涉及到的基因，每个基因的表达水平经常不处在最佳水平、可以使用不同强度的启动子起始表达途径中的每个基因，并进行组合，随后筛选高产菌株，对高产菌株进行测序，即可以获得最佳启动子组合的基因型。因此，寻找高效的F3′H/CPR，并通过更换启动子调节F3′H/CPR的表达水平，获得最佳表达比例的基因型及其高产圣草酚菌株具有十分重要的意义。

为了获得高效的F3′H/CPR，本发明提供了一对来源于水飞蓟(Silybum marianum)的高活性F3′H及其辅酶CPR。

本发明提供了表达黄酮3β-羟化酶和/或黄酮3β-羟化酶辅酶的微生物细胞，所述黄酮3β-羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述黄酮3β-羟化酶辅酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述黄酮3β-羟化酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述黄酮3β-羟化酶辅酶的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，利用启动子P_INO1、P_SED1、P_TPI1、P_MET6、P_FAS2、P_GAL1、P_LEU2、P_ZWF1、P_ARO7和P_GLN1启动黄酮3β-羟化酶的表达。

在本发明的一种实施方式中，启动子P_INO1、P_SED1、P_TPI1、P_MET6、P_FAS2、P_GAL1、P_LEU2、P_ZWF1、P_ARO7和P_GLN1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.14所示。

在本发明的一种实施方式中，利用启动子P_TDH1、P_PGK1、P_TDH3、P_ERG20、P_ADH6、P_GAL10、P_ADE2、P_PMA1、P_ADE6和P_FAD1启动黄酮3β-羟化酶的辅酶的表达。

在本发明的一种实施方式中，启动子P_TDH1、P_PGK1、P_TDH3、P_ERG20、P_ADH6、P_GAL10、P_ADE2、P_PMA1、P_ADE6和P_FAD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.24所示。

在本发明的一种实施方式中，利用启动子P_INO1启动黄酮3β-羟化酶的表达，利用启动子P_TDH1启动黄酮3β-羟化酶的辅酶的表达。

在本发明的一种实施方式中，利用启动子P_SED1启动黄酮3β-羟化酶的表达，利用启动子P_TDH1启动黄酮3β-羟化酶的辅酶的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以原核或真核生物为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为酿酒酵母菌株C800。

本发明提供了所述微生物细胞在生产圣草酚中的应用，所述应用是以柚皮素为底物。

在本发明的一种实施方式中，在反应体系中加入所述微生物细胞。

本发明提供了一种全细胞催化生产圣草酚的方法，所述方法是在反应体系中加入所述微生物细胞。

在本发明的一种实施方式中，将在25-35℃，200-250rpm培养16-18h，获得种子培养基以1-5mL/100mL的量加入反应体系中。

本发明提供了一种全细胞催化生产圣草酚的方法在生产圣草酚或以圣草酚为原料的产品中的应用。

本发明的有益效果：本发明从水飞蓟中得到了具有黄酮3’-羟化酶功能的SmF3′H和SmCPR，本发明所使用的SmF3′H和SmCPR，较常用的GhF3′H和CrCPR，在相同培养条件下可使转化柚皮素生成圣草酚的产量提升17.0％。在此基础上，利用不同强度的启动子调控SmF3′H和SmCPR，进一步提升了圣草酚的产量，圣草酚的产量可在250mL摇瓶中达到805.6mg/L，较已报道的最高产量200mg/L，增产302.8％。高产圣草酚菌株的获得对于推动高产圣草酚在工业中的应用具有重要意义。

附图说明

图1为柚皮素经过SmF3′H/SmCPR催化产圣草酚示意图。

图2为启动子优化SmF3′H/SmCPR示意图。

图3为水飞蓟来源SmF3′H/SmCPR功能鉴定及催化能力验证图。

图4为启动子优化后产量最高的10株菌株产量、对应的启动子基因型和启动子表达强度图。

具体实施方式

YNB培养基：0.72g/L酵母氮源基础培养基、20g/L葡萄糖、50mg/L亮氨酸、50mg/L色氨酸、50mg/L组氨酸。

YPD培养基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖。

固体培养基中添加2g/L的琼脂粉。

酿酒酵母C800：构建见文献Gao,S.,et al.,Promoter-library-based pathwayoptimization for efficient(2S)-naringenin production from p-coumaric acid inSaccharomyces cerevisiae.J Agric Food Chem,2020.68(25):p.6884-6891。

实施例1：扩增和鉴定SmF3′H和SmCPR

根据试剂盒说明书从水飞蓟花蕊中提取总RNA、逆转录获得cDNA。使用引物，从cDNA中分别扩增Contig37917(SmF3′H，利用引物SmF3′H-F和SmF3′H-R)和Contig668(SmCPR，利用引物SmCPR-F和SmCP-R)，得到PCR产物，然后将得到的PCR产物克隆到pMD19T-simple中，分别得到pMD-T-SmCPR和pMD-T-SmF3′H。

因原始质粒pY26-TEF-GPD存在PmlI酶切位点，因此使用引物mut-F和mut-R环化扩增原始质粒pY26-TEF-GPF，再经过自连接获得caaggtttataa，在质粒pY26-TEF-GPD-mut引入新的酶切位点PmlI，构建得到pY26-TEF-GPD-mut用于后续构建质粒。

对已报道的基因GhF3′H(GenBank ID：ABA64468.1)和CrCPR(GenBank ID：KM111538.1)进行化学合成，分别连接至T载体上进行保存，分别为pUC57-GhF3′H和pUC57-CrCPR。使用BamHI和PmlI内切酶分别酶切pMD-T-SmF3′H和pY26-TEF-GPD-mut，将酶切后的片段分别回收并进行连接获得pY26-GR。使用NotI和PacI内切酶分别酶切pMD-T-SmCPR和pY26-GR，将酶切后的片段进行回收并进行连接获得pY26-THGR。同理使用BamHI和BspDI内切酶酶切pUC57-GhF3′H和pY26-TEF-GPD，将酶切后的片段进行回收并连接获得pY26-GR2。使用NotI和PacI内切酶分别酶切pUC57-CrCPR和pY26-GR2，将酶切后的片段进行回收并连接后获得pY26-THGR2。

将上述构建得到的质粒载体pY26-GR、pY26-THGR、转入pY26-GR2和pY26-THGR2分别大肠杆菌JM109中，在37℃培养至长出单克隆，挑取单克隆测序，测序验证正确的即为阳性转化子，从阳性转化子中提取质粒。将提取的质粒pY26-GR、pY26-THGR、pY26-GR2和pY26-THGR2分别通过乙酸锂转化法转化到酿酒酵母菌株C800中，依次获得菌株C800GR、C800THGR、C800GR2和C800THGR2。

扩增引物见表1，本发明中涉及的菌株及质粒见表2。

表1所用引物序列

表2本发明中涉及的菌株及质粒

实施例2：SmF3′H和SmCPR催化功能的验证

Contig37917(SmF3′H)和Contig668(SmCPR)及菌株C800GR、C800GR2、C800THGR和C800THGR2在250mL摇瓶中发酵条件：挑取单菌落接种在含有20mL YNB液体培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养16-18h，获得种子培养基。将种子培养基以2mL/100mL转接到含有20mL新鲜YNB液体培养基的250mL摇瓶中，培养基中含有250mg·L^-1柚皮素，30℃，220rpm培养72小时后检测圣草酚的产量。

菌株Contig37917、Contig668、C800GR、C800GR2、C800THGR、C800THGR2发酵液，使用甲醇稀释一倍后，震荡30s混匀，13500rpm离心5min后过滤使用高效液相检测圣草酚的产量。250mL摇瓶检测：将100μL发酵培养基与900μL甲醇混合涡旋振荡30s，13500rpm离心5min后过滤。过滤上清液并准备进行HPLC分析。

样品使用安捷伦高效液相检测(Agilent 1100，US)，C18反相色谱柱(4.6mm×250mm,Thermo)，柱温25℃。流动相为甲醇：水(41:59)并添加3‰的磷酸。流速1mL/min，进样量10μL，检测波长为290nm。

经过验证，来源于水飞蓟的Contig37917和Contig668被鉴定为具有催化柚皮素合成圣草酚的能力，且催化能力较常用的GhF3′H/CrCPR催化能力更强。相同250mL摇瓶培养条件下，常用的GhF3′H/CrCPR可以合成49.5mg/L的圣草酚，而水飞蓟来源的SmF3′H/SmCPR可以合成57.9mg/L，增产17.0％。由此说明Contig37917(SmF3′H)和Contig668(SmCPR)具备良好的生产圣草酚的功能。

实施例3：启动子优化SmF3′H和SmCPR表达水平文库的构建

从已报道的启动子库(Gao,S.,et al.,Promoter-library-based pathwayoptimization for efficient(2S)-naringenin production from p-coumaric acid inSaccharomyces cerevisiae.J Agric Food Chem,2020.68(25):p.6884-6891.)中选择了20个梯度启动子用于SmF3′H和SmCPR表达水平的优化。将20个启动子分为A、B两组。启动子组A包含P_INO1、P_SED1、P_TPI1、P_MET6、P_FAS2、P_GAL1、P_LEU2、P_ZWF1、P_ARO7和P_GLN1(其序列依次对应SEQ IDNO.5-SEQ ID NO.14)，用于融合和起始转录SmF3′H。启动子组B包含P_TDH1、P_PGK1、P_TDH3、P_ERG20、P_ADH6、P_GAL10、P_ADE2、P_PMA1、P_ADE6和P_FAD1(其序列依次对应SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.24)，用于融合和起始转录SmCPR。

分别使用引物PXXX-homo-F和PXXX-homo-R从质粒pMD19T-XXX(质粒pMD19T-XXX为将上述启动子连接至pMD19T载体上，XXX代表启动子的名称，具体构建方法参见Gao,S.,etal.,Promoter-library-based pathway optimization for efficient(2S)-naringeninproduction from p-coumaric acid in Saccharomyces cerevisiae.J Agric FoodChem,2020.68(25):p.6884-6891.)、使用引物pY26-THGR-homo-F和pY26-THGR-homo-R从质粒pY26-THGR上扩增载体骨架(包含SmCPR的表达框)，分别扩增启动子序列和载体骨架(如表3，其中XXX代表启动子的名称)。分别纯化载体骨架、启动子组A和B的PCR产物，然后将三种产物混合至50μL(启动子组A：启动子组B：载体骨架＝2：2：1，mol/mol/mol，总计约2-3μg)，将混合的体系通过醋酸锂高效转化法(具体转化方法参见文献：Gietz,R.D.andR.A.Woods,Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrierDNA/polyethylene glycol method.Methods Enzymol,2002.350:p.87–96.)转化到酿酒酵母菌株C800中，所有片段将在酿酒酵母体内完成组装。将转化体系涂布在YNB琼脂平板上，将琼脂板在30℃下孵育3-4天，即可获得启动子随机组装文库。

表3所用引物序列

实施例4：启动子优化菌株的筛选

从随机组装文库中随机挑取2 000个单菌落，使用48深孔板进行培养：使用自动挑菌落仪器QPix 420自动将平板上的菌落接种到48深孔板中。每个孔中添加1.5mL YNB液体培基，培养基中含有终浓度为250mg·L^-1的柚皮素。将深孔板转移到孔板摇床上，30℃，220rpm培养48小时。将深孔板置于桌面上2小时以沉淀细胞，上清液可用于高通量筛选。

高通量检测方法：随机组装库中的菌株在48深孔板中发酵后，使用配备了酶标仪的自动工作站，自动取100μL的发酵上清液转移到96浅孔酶标板孔内，再加入100μL的4MKOH。大约5min后，混合物会变成紫色，紫色的深浅与圣草酚的浓度呈正比，可以通过目测直接筛选高产菌株。将变色的酶标板自动转移到酶标仪中在550nm下检测混合物的吸光值，选择吸光值高的菌株进入摇瓶复筛。

检测方法：48深孔板发酵液，使用甲醇稀释一倍后，震荡30s混匀，13500rpm离心5min后过滤使用高效液相检测圣草酚的产量。250mL摇瓶检测：将100μL发酵培养基与900μL甲醇混合涡旋振荡30s，13500rpm离心5min后过滤。过滤上清液并准备进行HPLC分析。

通过启动子优化，选择了10株产量最高的菌株，在48深孔板水平积累圣草酚产量由低到高分别为29.2mg/L、29.9mg/L、30.7mg/L、30.8mg/L、31.9mg/L、33.0mg/L、35.5mg/L、36.6mg/L、46.2mg/L、51.8mg/L。随后对10株菌的基因型进行的测序，其基因型和对应的启动子表达强度在图4中列出。而出发菌株没有检测到圣草酚的生成。

选择10个圣草酚产量最高的菌株进行复筛和测序，250mL摇瓶复筛：挑取单菌落接种在含有20mL YNB液体培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养16-18h，获得种子培养基；将种子培养基以2mL/100mL转接到装有20mL新鲜YPD液体培养基的250mL摇瓶中，30℃、220rpm培养72小时后检测圣草酚的产量。在第0h，12h，24h和36h时，分别将375mg·L^-1柚皮素加入YPD培养基中，发酵结束后测圣草酚含量。

产量最高的两株菌株在250mL摇瓶水平进行复筛的结果显示，分别可以积累720.4mg/L和805.6mg/L的圣草酚，较已报道的最高产量增产260.2％和302.8％，菌株中的质粒分别为pY26-P04和pY26-P05，pY26-P05对应的基因型为pY26-P_INO1-SmF3′H-P_TDH1-SmCPR，pY26-P04对应的基因型为pY26-P_SED1-SmF3′H-P_TDH1-SmCPR。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 水飞蓟来源的黄酮3β-羟化酶及其辅酶的应用

<130> BAA201245A

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1557

<212> DNA

<213> Silybum marianum

<400> 1

atgactatcc tacccctgct actctacgcc tccataactg gtttactaat ctatgtattg 60

cttaacctac gcaccacccc tcgttctaac cacctcccac tcccacccgg cccaacccca 120

tggccaatca tcggaaactt acctcatctt ggaagaatac cgcaccatgc gctggcggcc 180

atggctacaa agtacggccc gttgatgcat ctccggctcg gcgtcgttga cgtggtggtg 240

gcggcgtctg cgtcggtggc ggcacagttt ttgaaggttc atgacgccaa tttcgcgagt 300

aggccgccga actccggcgc gaaacacatc gcgtataatt atcaggatct ggtgtttgca 360

ccttatggtc agaaatggcg gatgcttagg aagatttgct ccgtgcatct gttctctaac 420

aaagcactcg atgatttccg tcacgttcgt caggaggagg tggcgattct ggtgcgcgct 480

ttggccggag ccggtcgatc tacggcggcg gcgttaggtc aactacttaa cgtttgcacc 540

acaaacgcgt tggcacgagt gatgttaggt cggagagtgt tcgtggacgg aagtgaaggc 600

aatcgagacg cggatgaatt caaggatatg gtggttgaag tgatggtatt ggccggagaa 660

ttcaacatcg gcgacttcat tccggcgctt gattggctgg atctgcaaag cgtgacgaag 720

aagatgaaga aactccatct ccgattcgat tcgtttctta acaaaatcct ggaagaccat 780

agaaatggag gtgacgtcac ttcgggtaac gtggatttgc tgagcacgtt gatttcgctc 840

aaggatgacg ccgatggaga gggcgggaag ctttcagata tcgaaatcaa agctttgctt 900

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gtgaaggaaa ccttcaggct ccacccatcg accccactct ctttgccacg gattgcatca 1140

gagagctgtg aagtcgatgg gtattacatt cctaagggaa ccacacttct tgttaacgtg 1200

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ttgctcactg cgactctggt tcatgccttt gattggaaat tggctaacgg gttagaccca 1440

gagaagctca atatggaaga agcttatggg ttgacccttc aaagggctgc acccttgatg 1500

gtgcacccaa ccccacggtt agctccccat ttgtatgaaa gcagtcaagg tttataa 1557

<210> 2

<211> 518

<212> PRT

<213> Silybum marianum

<400> 2

Met Thr Ile Leu Pro Leu Leu Leu Tyr Ala Ser Ile Thr Gly Leu Leu

1 5 10 15

Ile Tyr Val Leu Leu Asn Leu Arg Thr Thr Pro Arg Ser Asn His Leu

20 25 30

Pro Leu Pro Pro Gly Pro Thr Pro Trp Pro Ile Ile Gly Asn Leu Pro

35 40 45

His Leu Gly Arg Ile Pro His His Ala Leu Ala Ala Met Ala Thr Lys

50 55 60

Tyr Gly Pro Leu Met His Leu Arg Leu Gly Val Val Asp Val Val Val

65 70 75 80

Ala Ala Ser Ala Ser Val Ala Ala Gln Phe Leu Lys Val His Asp Ala

85 90 95

Asn Phe Ala Ser Arg Pro Pro Asn Ser Gly Ala Lys His Ile Ala Tyr

100 105 110

Asn Tyr Gln Asp Leu Val Phe Ala Pro Tyr Gly Gln Lys Trp Arg Met

115 120 125

Leu Arg Lys Ile Cys Ser Val His Leu Phe Ser Asn Lys Ala Leu Asp

130 135 140

Asp Phe Arg His Val Arg Gln Glu Glu Val Ala Ile Leu Val Arg Ala

145 150 155 160

Leu Ala Gly Ala Gly Arg Ser Thr Ala Ala Ala Leu Gly Gln Leu Leu

165 170 175

Asn Val Cys Thr Thr Asn Ala Leu Ala Arg Val Met Leu Gly Arg Arg

180 185 190

Val Phe Val Asp Gly Ser Glu Gly Asn Arg Asp Ala Asp Glu Phe Lys

195 200 205

Asp Met Val Val Glu Val Met Val Leu Ala Gly Glu Phe Asn Ile Gly

210 215 220

Asp Phe Ile Pro Ala Leu Asp Trp Leu Asp Leu Gln Ser Val Thr Lys

225 230 235 240

Lys Met Lys Lys Leu His Leu Arg Phe Asp Ser Phe Leu Asn Lys Ile

245 250 255

Leu Glu Asp His Arg Asn Gly Gly Asp Val Thr Ser Gly Asn Val Asp

260 265 270

Leu Leu Ser Thr Leu Ile Ser Leu Lys Asp Asp Ala Asp Gly Glu Gly

275 280 285

Gly Lys Leu Ser Asp Ile Glu Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe

290 295 300

Thr Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Glu Trp Ala Met Ala

305 310 315 320

Glu Leu Ile Arg His Pro Gln Leu Leu Lys Gln Ala Gln Glu Glu Leu

325 330 335

Asp Thr Val Val Gly Lys Asp Arg Leu Val Ser Glu Leu Asp Leu Ser

340 345 350

Arg Leu Thr Phe Leu Glu Ala Ile Val Lys Glu Thr Phe Arg Leu His

355 360 365

Pro Ser Thr Pro Leu Ser Leu Pro Arg Ile Ala Ser Glu Ser Cys Glu

370 375 380

Val Asp Gly Tyr Tyr Ile Pro Lys Gly Thr Thr Leu Leu Val Asn Val

385 390 395 400

Trp Ala Ile Ala Arg Asp Pro Lys Met Trp Thr Asp Pro Leu Glu Phe

405 410 415

Arg Pro Thr Arg Phe Leu Pro Gly Gly Glu Lys Pro Asn Ala Asn Val

420 425 430

Lys Gly Asn Asp Phe Glu Ile Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile

435 440 445

Cys Ala Gly Met Ser Leu Gly Leu Arg Met Val Gln Leu Leu Thr Ala

450 455 460

Thr Leu Val His Ala Phe Asp Trp Lys Leu Ala Asn Gly Leu Asp Pro

465 470 475 480

Glu Lys Leu Asn Met Glu Glu Ala Tyr Gly Leu Thr Leu Gln Arg Ala

485 490 495

Ala Pro Leu Met Val His Pro Thr Pro Arg Leu Ala Pro His Leu Tyr

500 505 510

Glu Ser Ser Gln Gly Leu

515

<210> 3

<211> 2133

<212> DNA

<213> Silybum marianum

<400> 3

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gagaaagtta ttgatacagc aaacgcatct gatagtggag attcaacgat gcctccggct 120

ttggcgatga ttttggaaaa ccgtgagctg tttatgatgc tgactacaac agtggctctt 180

ttgcttggat ttattgtcgt ttcgttctgg aagagatctt ctgagaagaa gtcggctaag 240

gatttggagc taccgaagat cgttgtgcct aagagacagc aggaacagga ggttgatgac 300

ggtaagaaga aggttacgat tctttttgga acgcagaccg gaacggcgga aggtttcgct 360

aaggcactgt tggaagaagc taaagcgcga tatgaaaagg cgacctttaa agtagtcgat 420

ttggatgatt atgctgttga tgatgatgag tacgaagaga aactaaagaa ggagtcattt 480

gctttcttct tcttggctac atatggagat ggtgagccaa ctgataatgc tgccagattt 540

tataaatggt ttacagaggg aggtgagaaa ggagtttggc ttgaaaagct tcaatatgga 600

gtatttggcc ttggcaatag acaatacgag catttcaaca agattgcaaa agaggttgac 660

gatggtctcg cagagcaggg tgcaaagcgc cttgttccag ttggccttgg agatgatgat 720

caatccattg aagatgattt tactgcatgg aaagagttag tgtggcctga gttggatgaa 780

ttgcttcgtg acgaggatga caaaggcgtt gctactcctt acacagctgc tattccggaa 840

taccgagttg tgtttcatga gaaacatgat acatctgctg aagatcaaat tcagacaaat 900

ggtcatgctg ttcatgatgc tcaacatcca tgcagatcca atgtggctgt taaaaaggag 960

ctccataccc ctgaatctga tcgctcttgc acgcatctgg aatttgacat ctcacacact 1020

ggactatcat acgaaactgg ggaccatgtt ggtgtctact gtgagaactt aagtgaagtt 1080

gtggaggagg ctgagaggtt aataggttta ccatcggata cttatttctc agttcacacg 1140

gataacgaag atggaacacc acttggtgga gcttccttac tacctccttt ccctccatgc 1200

actttaagaa aagcattggc taattacgca gatgtattga cttctcccaa aaagtcggcc 1260

ttgattgctc tagctgctca tgcttctgat cctactgaag ctgaacgact aaaatttctt 1320

gcatctcctg ctgggaagga tgaatattct caatggatta ttgcaagcca aagaagcctg 1380

cttgaggtca tggaagcttt cccatcggct aagcctccac ttggggtttt ctttgcagct 1440

attgctccac gcttacagcc tcgatactac tctatttctt cctccccgaa gatggcacct 1500

agcaggattc atgttacttg tgcattagtt tatgagaaaa cacctgcagg ccgtctccat 1560

aaaggaatct gttcaacctg gatgaagaat gctgtgccta tgacggaaag tcaggattgc 1620

agctgggcac ctattttcgt tagaacgtct aacttcagac ttcccactga tcctaaagtt 1680

cctgttatca tgattggccc tggaaccgga ttggctccgt tcagaggttt tcttcaagaa 1740

agattagctc tgaaggaagc cggaactgaa ctgggatcat ccattttatt cttcggatgt 1800

agaaatcgca aagtggattt catatatgag aatgaactga aagactttgt tgagaatggt 1860

gctgtttccg agcttattgt tgccttctcc cgtgaaggcc ccaataagga atatgtgcaa 1920

cataaaatga gcgatagggc ttcggatcta tggaacttgc tttcggaggg agcatattta 1980

tacgtttgtg gtgatgccaa aggcatggct aaagatgtac accggaccct tcacacaatt 2040

gtgcaagaac agggatctct agactcgtca aaggcagagc tgtatgtgaa gaatctacaa 2100

atgtcaggaa gatacctccg tgatgtttgg tag 2133

<210> 4

<211> 710

<212> PRT

<213> Silybum marianum

<400> 4

Met Gln Ser Asp Ser Ser Leu Glu Thr Ser Ser Phe Asp Leu Ile Thr

1 5 10 15

Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ile Asp Thr Ala Asn Ala Ser Asp Ser

20 25 30

Gly Asp Ser Thr Met Pro Pro Ala Leu Ala Met Ile Leu Glu Asn Arg

35 40 45

Glu Leu Phe Met Met Leu Thr Thr Thr Val Ala Leu Leu Leu Gly Phe

50 55 60

Ile Val Val Ser Phe Trp Lys Arg Ser Ser Glu Lys Lys Ser Ala Lys

65 70 75 80

Asp Leu Glu Leu Pro Lys Ile Val Val Pro Lys Arg Gln Gln Glu Gln

85 90 95

Glu Val Asp Asp Gly Lys Lys Lys Val Thr Ile Leu Phe Gly Thr Gln

100 105 110

Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Leu Glu Glu Ala Lys

115 120 125

Ala Arg Tyr Glu Lys Ala Thr Phe Lys Val Val Asp Leu Asp Asp Tyr

130 135 140

Ala Val Asp Asp Asp Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Ser Phe

145 150 155 160

Ala Phe Phe Phe Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn

165 170 175

Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Thr Glu Gly Gly Glu Lys Gly Val

180 185 190

Trp Leu Glu Lys Leu Gln Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln

195 200 205

Tyr Glu His Phe Asn Lys Ile Ala Lys Glu Val Asp Asp Gly Leu Ala

210 215 220

Glu Gln Gly Ala Lys Arg Leu Val Pro Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp

225 230 235 240

Gln Ser Ile Glu Asp Asp Phe Thr Ala Trp Lys Glu Leu Val Trp Pro

245 250 255

Glu Leu Asp Glu Leu Leu Arg Asp Glu Asp Asp Lys Gly Val Ala Thr

260 265 270

Pro Tyr Thr Ala Ala Ile Pro Glu Tyr Arg Val Val Phe His Glu Lys

275 280 285

His Asp Thr Ser Ala Glu Asp Gln Ile Gln Thr Asn Gly His Ala Val

290 295 300

His Asp Ala Gln His Pro Cys Arg Ser Asn Val Ala Val Lys Lys Glu

305 310 315 320

Leu His Thr Pro Glu Ser Asp Arg Ser Cys Thr His Leu Glu Phe Asp

325 330 335

Ile Ser His Thr Gly Leu Ser Tyr Glu Thr Gly Asp His Val Gly Val

340 345 350

Tyr Cys Glu Asn Leu Ser Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Arg Leu Ile

355 360 365

Gly Leu Pro Ser Asp Thr Tyr Phe Ser Val His Thr Asp Asn Glu Asp

370 375 380

Gly Thr Pro Leu Gly Gly Ala Ser Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Cys

385 390 395 400

Thr Leu Arg Lys Ala Leu Ala Asn Tyr Ala Asp Val Leu Thr Ser Pro

405 410 415

Lys Lys Ser Ala Leu Ile Ala Leu Ala Ala His Ala Ser Asp Pro Thr

420 425 430

Glu Ala Glu Arg Leu Lys Phe Leu Ala Ser Pro Ala Gly Lys Asp Glu

435 440 445

Tyr Ser Gln Trp Ile Ile Ala Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val Met

450 455 460

Glu Ala Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala

465 470 475 480

Ile Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro

485 490 495

Lys Met Ala Pro Ser Arg Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr Glu

500 505 510

Lys Thr Pro Ala Gly Arg Leu His Lys Gly Ile Cys Ser Thr Trp Met

515 520 525

Lys Asn Ala Val Pro Met Thr Glu Ser Gln Asp Cys Ser Trp Ala Pro

530 535 540

Ile Phe Val Arg Thr Ser Asn Phe Arg Leu Pro Thr Asp Pro Lys Val

545 550 555 560

Pro Val Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly

565 570 575

Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Lys Glu Ala Gly Thr Glu Leu Gly

580 585 590

Ser Ser Ile Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Lys Val Asp Phe Ile

595 600 605

Tyr Glu Asn Glu Leu Lys Asp Phe Val Glu Asn Gly Ala Val Ser Glu

610 615 620

Leu Ile Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Asn Lys Glu Tyr Val Gln

625 630 635 640

His Lys Met Ser Asp Arg Ala Ser Asp Leu Trp Asn Leu Leu Ser Glu

645 650 655

Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Lys Asp

660 665 670

Val His Arg Thr Leu His Thr Ile Val Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asp

675 680 685

Ser Ser Lys Ala Glu Leu Tyr Val Lys Asn Leu Gln Met Ser Gly Arg

690 695 700

Tyr Leu Arg Asp Val Trp

705 710

<210> 5

<211> 510

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaagacgatg aggccggtgc cgatgtgccc ttgatggaca acaaacaaca gctctcttcc 60

ggccgtactt agtgatcgga acgagctctt tatcaccgta gttctaaata acacatagag 120

taaattattg cctttttctt cgttcctttt gttcttcacg tcctttttat gaaatacgtg 180

ccggtgttcc ggggttggat gcggaatcga aagtgttgaa tgtgaaatat gcggaggcca 240

agtatgcgct tcggcggcta aatgcggcat gtgaaaagta ttgtctattt tatcttcatc 300

cttctttccc agaatattga acttatttaa ttcacatgga gcagagaaag cgcacctctg 360

cgttggcggc aatgttaatt tgagacgtat ataaattgga gctttcgtca cctttttttg 420

gcttgttctg ttgtcgggtt cctaatgtta gttttatcct tgatttattc tgtttcattc 480

cctttttttt ccagtgaaaa agaagtaaca 510

<210> 6

<211> 550

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctaccttcca tacaccactg attgctccac gtcatgcggc cttctttcga ggacaaaaag 60

gcatatatcg ctaaaattag ccatcagaac cgttattgtt attatatttt cattacgaaa 120

gaggagaggg cccagcgcgc cagagcacac acggtcattg attactttat ttggctaaag 180

atccatccct tctcgatgtc atctctttcc attcttgtgt atttttgatt gaaaatgatt 240

ttttgtccac taatttctaa aaataagaca aaaagccttt aagcagtttt tcatccattt 300

tactacggta aaatgaatta gtacggtatg gctcccagtc gcattatttt tagattggcc 360

gtaggggctg gggtagaact agagtaagga acattgctct gccctctttt gaactgtcat 420

ataaatacct gacctatttt attctccatt atcgtattat ctcacctctc tttttctatt 480

ctcttgtaat tattgattta tagtcgtaac tacaaagaca agcaaaataa aatacgttcg 540

ctctattaag 550

<210> 7

<211> 623

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acccaaatgg actgattgtg agggagacct aactacatag tgtttaaaga ttacggatat 60

ttaacttact tagaataatg ccattttttt gagttataat aatcctacgt tagtgtgagc 120

gggatttaaa ctgtgaggac cttaatacat tcagacactt ctgcggtatc accctactta 180

ttcccttcga gattatatct aggaacccat caggttggtg gaagattacc cgttctaaga 240

cttttcagct tcctctattg atgttacacc tggacacccc ttttctggca tccagttttt 300

aatcttcagt ggcatgtgag attctccgaa attaattaaa gcaatcacac aattctctcg 360

gataccacct cggttgaaac tgacaggtgg tttgttacgc atgctaatgc aaaggagcct 420

atataccttt ggctcggctg ctgtaacagg gaatataaag ggcagcataa tttaggagtt 480

tagtgaactt gcaacattta ctattttccc ttcttacgta aatatttttc tttttaattc 540

taaatcaatc tttttcaatt ttttgtttgt attcttttct tgcttaaatc tataactaca 600

aaaaacacat acataaacta aaa 623

<210> 8

<211> 580

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

catgaaccag ggtcccgcac tccgggtaaa ggaccatcac gccacatcac gtgcacatta 60

ctagtaaaag ccacaggaaa tatttcacgt gacttacaaa cagagtcgta cgtcaggacc 120

ggagtcaggt gaaaaaatgt gggccggtaa agggaaaaaa ccagaaacgg gactactatc 180

gaactcgttt agtcgcgaac gtgcaaaagg ccaatatttt tcgctagagt catcgcagtc 240

atggcagctc tttcgctcta tctcccggtc gcaaaactgt ggtagtcata gctcgttctg 300

ctcaattgag aactgtgaat gtgaatatgg aacaaatgcg atagatgcac taatttaagg 360

gaagctagct agttttccca actgcgaaag aaaaaaagga aagaaaaaaa aattctatat 420

aagtgataga tatttccatc tttactagca ttagtttctc ttttacgtat tcaatatttt 480

tgttaaactc ttcctttatc ataaaaaagc aagcatctaa gagcattgac aacactctaa 540

gaaacaaaat accaatataa tttcaaagta catatcaaaa 580

<210> 9

<211> 543

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gttgtcgttg ttgtcccagc cgttgtcaaa acgcgttaat tccaactatt ttctatattt 60

ctattctatc cgaactcccc ttttgtatat caatatatct taatactttc gcctattctt 120

tactatattt cctaaatttt ctctggtctg caggccaaaa acaacaactt actactgaat 180

catggacgtg tatttagttt agccaagcaa tatttaaata tcactcttcc taaaaataca 240

ttgggcatta cccgcaaact aacccatcgc ttagcaaaat ccaaccattt tttttttatc 300

tcccgcgttt tcacatgcta cctcattcgc ctcgtaacgt tacgaccgaa atctcactaa 360

ggcacggttt gttgggcagt ttacagatgt tggataacca gttgtttcta aacggttatg 420

cctcatatat aacttgttaa ctgaaggtta cacaagacca catcaccact gtcgtgcttt 480

tctaataacc gctatattag acgtttaaag ggctacagca acaccaattg aaataccatc 540

att 543

<210> 10

<211> 668

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccca ttatcttagc ctaaaaaaac cttctctttg gaactttcag 180

taatacgctt aactgctcat tgctatattg aagtacggat tagaagccgc cgagcgggcg 240

acagccctcc gacggaagac tctcctccgt gcgtcctcgt cttcaccggt cgcgttcctg 300

aaacgcagat gtgcctcgcg ccgcactgct ccgaacaata aagattctac aatactagct 360

tttatggtta tgaagaggaa aaattggcag taacctggcc ccacaaacct tcaaattaac 420

gaatcaaatt aacaaccata ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt atttctgggg 480

taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat ggaaaagctg 540

cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct tattcaaatg 600

tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt caaggagaaa 660

aaactata 668

<210> 11

<211> 544

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcctgtactt ccttgttcat gtgtgttcaa aaacgttata tttataggat aattatactc 60

tatttctcaa caagtaattg gttgtttggc cgagcggtct aaggcgcctg attcaagaaa 120

tatcttgacc gcagttaact gtgggaatac tcaggtatcg taagatgcaa gagttcgaat 180

ctcttagcaa ccattatttt tttcctcaac ataacgagaa cacacagggg cgctatcgca 240

cagaatcaaa ttcgatgact ggaaattttt tgttaatttc agaggtcgcc tgacgcatat 300

acctttttca actgaaaaat tgggagaaaa aggaaaggtg agagcgccgg aaccggcttt 360

tcatatagaa tagagaagcg ttcatgacta aatgcttgca tcacaatact tgaagttgac 420

aatattattt aaggacctat tgttttttcc aataggtggt tagcaatcgt cttactttct 480

aacttttctt accttttaca tttcagcaat atatatatat atatttcaag gatataccat 540

tcta 544

<210> 12

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gccgtcgaaa aggatctcgt ctctgttggg agcacctggt aagtaaggtg tagttttgca 60

cccgtgtaca taagcgtgaa atcaccacaa actgtgtgta tcaagtacat agtgacattt 120

aaataatagc aagaacaaca ataatagtag cgctactgga agcaccacgt aatagtggaa 180

aagaactgga aaaaccgcta taagatgcat actccggcgg tcttacgcgg agatacaagc 240

ttccaacggt gctaaaagcc cggtttcggc tcggccggag gaggaagaga gacgaaaaaa 300

aaaaaaatga ctaaaaaaaa aatggaatat tattaatgtg ggatttttgg ctcaaggtgt 360

ggtggcccct tttctaaggg tggcgaattc ttcaatgtac ggaaaactcg ccaaggctat 420

cccatatata agcaaactgt gggttcatct atataccgac acataacacc taaagtggct 480

tcctcctgcc cctctctccc ttttctccac tcacccctcc ttctccccct tccccctctc 540

caattggctg tatagacaga aagagtaaat ccaatagaat agaaaaccac ataaggcaag 600

<210> 13

<211> 520

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tggattacat ttgattcagt catacacgaa ttatggtctt gatactgaca aattttccag 60

attgaggcgg ttcttatggt ttagaacttg gggactttac aagtcgaaag aggatttaga 120

tagagaagcc aagatcaatg aagaaatgat acgcaaactg aaagcagcta aatgaaatca 180

cctattgcgc cgctcgcgga atacaattac taaattttat atatattctt taaaaatgca 240

tctatacatt cgtttttcca cgtataccaa attcgaaaaa agttgttaaa ccatcgtttt 300

cacgtttttt aatttttttt tggttctctt tttttttttt tttcaatatc aacttttttt 360

caaacttcgt gttgcatttc ctttatcgta aattttcaat ggatctctat aatcttcgaa 420

gttcgaagaa aagaagaaaa aaagtattga aaagttgaaa catcgattcc gttttgctaa 480

caaatagcac tcagcatcct gcataaaatt ggtataagat 520

<210> 14

<211> 553

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggtccgcaca gacgatgcca gacggtgttt tatcgaaaat ttttttcgca tcatagtgcc 60

atttgtggtc attattattc cccaaatatg cgaaaatagt acactatttt tggcaggaga 120

gtaggctgat atgccgcatt gatgtcctgt gtagcgaaac acaaacaaaa aaagaaaaag 180

taggatgaaa aaaagaaaag taatatgaaa aaagagtgaa aaattaattc atttgttagt 240

gtaagcggtc aggtgtaagt agtaggcttg ataatgaatt aaagatgact ccgacgcata 300

ttgtttgcca tgtttttatt ttagtttgta gatttctttt tttgtaatat ataagggagt 360

gattctatat atcgaattct caggcttggt tggttcgtag gttgttctgt ctttgttttc 420

gttaggtaag aacatcacac aaagataact atagaatcac atacatattt gtgagaaatt 480

aacttcattt catttataga agaagttcaa ccgaaacaaa aattaaacat aatataatat 540

aatataatca aaa 553

<210> 15

<211> 530

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaaaccacac cgtggggcct tgttgcgcta ggaataggat atgcgacgaa gacgcttctg 60

cttagtaacc acaccacatt ttcagggggt cgatctgctt gcttccttta ctgtcacgag 120

cggcccataa tcgcgctttt tttttaaaag gcgcgagaca gcaaacagga agctcgggtt 180

tcaaccttcg gagtggtcgc agatctggag actggatctt tacaatacag taaggcaagc 240

caccatctgc ttcttaggtg catgcgacgg tatccacgtg cagaacaaca tagtctgaag 300

aaggggggga ggagcatgtt cattctctgt agcagtaaga gcttggtgat aatgaccaaa 360

actggagtct cgaaatcata taaatagaca atatattttc acacaatgag atttgtagta 420

cagttctatt ctctctcttg cataaataag aaattcatca agaacttggt ttgatatttc 480

accaacacac acaaaaaaca gtacttcact aaatttacac acaaaacaaa 530

<210> 16

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 240

tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 300

cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 360

agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 420

ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 480

cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 540

atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 600

tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 660

aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaaca 700

<210> 17

<211> 698

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ataaaaaaca cgctttttca gttcgagttt atcattatca atactgccat ttcaaagaat 60

acgtaaataa ttaatagtag tgattttcct aactttattt agtcaaaaaa ttagcctttt 120

aattctgctg taacccgtac atgcccaaaa tagggggcgg gttacacaga atatataaca 180

tcgtaggtgt ctgggtgaac agtttattcc tggcatccac taaatataat ggagcccgct 240

ttttaagctg gcatccagaa aaaaaaagaa tcccagcacc aaaatattgt tttcttcacc 300

aaccatcagt tcataggtcc attctcttag cgcaactaca gagaacaggg gcacaaacag 360

gcaaaaaacg ggcacaacct caatggagtg atgcaacctg cctggagtaa atgatgacac 420

aaggcaattg acccacgcat gtatctatct cattttctta caccttctat taccttctgc 480

tctctctgat ttggaaaaag ctgaaaaaaa aggttgaaac cagttccctg aaattattcc 540

cctacttgac taataagtat ataaagacgg taggtattga ttgtaattct gtaaatctat 600

ttcttaaact tcttaaattc tacttttata gttagtcttt tttttagttt taaaacacca 660

agaacttagt ttcgaataaa cacacataaa caaacaaa 698

<210> 18

<211> 530

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gaaaccacac cgtggggcct tgttgcgcta ggaataggat atgcgacgaa gacgcttctg 60

cttagtaacc acaccacatt ttcagggggt cgatctgctt gcttccttta ctgtcacgag 120

cggcccataa tcgcgctttt tttttaaaag gcgcgagaca gcaaacagga agctcgggtt 180

tcaaccttcg gagtggtcgc agatctggag actggatctt tacaatacag taaggcaagc 240

caccatctgc ttcttaggtg catgcgacgg tatccacgtg cagaacaaca tagtctgaag 300

aaggggggga ggagcatgtt cattctctgt agcagtaaga gcttggtgat aatgaccaaa 360

actggagtct cgaaatcata taaatagaca atatattttc acacaatgag atttgtagta 420

cagttctatt ctctctcttg cataaataag aaattcatca agaacttggt ttgatatttc 480

accaacacac acaaaaaaca gtacttcact aaatttacac acaaaacaaa 530

<210> 19

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acgcacgtag gcgcatactt ctatcatacg tagaaaagcg tttcccagag gttatgatgt 60

tggaaaaata gcttcattga acattttagc attagtggga agaattcctc atgttactta 120

tgagggagtt aattttcctt agggatttta ggaatttcta tacggaggta gcgatcgacc 180

ttagaacttt tatttagttt gtacatatac ctcacctgag ttttgctttt ttctctggga 240

gcctaaacca tttaaaatga tatataatag ataataaatc caggataaaa tgtggctaat 300

tgatcttttt tcattttcaa cttggtaatg acgtactgga tactttcgac gctctttttt 360

agtccccgat ccccgtcttc caggaccttg acgtggaatt ccgatcacag ccactctcgt 420

cacggctccg ttaaaatgaa tggttttccg ttacatttac tggtcttttt atctttttac 480

agtaaatggg tgatatactg tgacacaatt tgtgtctcta ctgtgtgaac ttccattgct 540

gactaaagat tccccgctcc gcttatatgt ccggtccgtc cttgaccgaa gatcacattg 600

ccaatttttc acatctggaa gcgatacgac aatataggag aaaaagaaaa gtgaaaggca 660

aaaaagcacc aacagttctc gaggtgaagt gccgtcaatc ttctgtataa attcggccaa 720

ttcaatctaa tttaatagat ttgcgacaga ctttcacatc cacattcgag gaagaaattc 780

aacacaacaa caagaaaagc caaaatc 807

<210> 20

<211> 668

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60

ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120

tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180

attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccta tggttgttaa 240

tttgattcgt taatttgaag gtttgtgggg ccaggttact gccaattttt cctcttcata 300

accataaaag ctagtattgt agaatcttta ttgttcggag cagtgcggcg cgaggcacat 360

ctgcgtttca ggaacgcgac cggtgaagac gaggacgcac ggaggagagt cttccgtcgg 420

agggctgtcg cccgctcggc ggcttctaat ccgtacttca atatagcaat gagcagttaa 480

gcgtattact gaaagttcca aagagaaggt ttttttaggc taagataatg gggctcttta 540

catttccaca acatataagt aagattagat atggatatgt atatggtggt aatgccatgt 600

aatatgatta ttaaacttct ttgcgtccat ccaaaaaaaa agtaagaatt tttgaaaatt 660

caatataa 668

<210> 21

<211> 689

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctagtaacgc cgtatcgtga ttaacgtatt acataagtta caggattcat gcttatgggt 60

tagctatttc gcccaatgtg tccatctgac attactattt tgcattttaa tttaattaga 120

acttgactag cgcactacca gtatatcatc tcatttccgt aaataccaaa tgtattatat 180

attgaaagct tttgaccagg ttattataaa agaaacttca tgctcgaaaa agatcatttc 240

gaaaagttgc ctagtttcat gaaattttaa agcagtttat ataaatttta ccttttgatg 300

cggaattgac tttttcttga ataatacata acttttctta aaagaatcaa agacagataa 360

aatttaagag atattaaata ttagtgagaa gccgagaatt ttgtaacacc aacataacac 420

tgacatcttt aacaactttt aattatgata catttcttac gtcatgattg attattacag 480

ctatgctgac aaatgactct tgttgcatgg ctacgaaccg ggtaatacta agtgattgac 540

tcttgctgac cttttattaa gaactaaatg gacaatatta tggagcattt catgtataaa 600

ttggtgcgta aaatcgttgg atctctcttc taagtacatc ctactataac aatcaagaaa 660

aacaagaaaa tcggacaaaa caatcaagt 689

<210> 22

<211> 545

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccctcgttca cagaaagtct gaagaagcta tagtagaact atgagctttt tttgtttctg 60

ttttcctttt tttttttttt acctctgtgg aaattgttac tctcacactc tttagttcgt 120

ttgtttgttt tgtttattcc aattatgacc ggtgacgaaa cgtggtcgat ggtgggtacc 180

gcttatgctc ccctccatta gtttcgatta tataaaaagg ccaaatattg tattattttc 240

aaatgtccta tcattatcgt ctaacatcta atttctctta aattttttct ctttctttcc 300

tataacacca atagtgaaaa tctttttttc ttctatatct acaaaaactt tttttttcta 360

tcaacctcgt tgataaattt tttctttaac aatcgttaat aattaattaa ttggaaaata 420

accatttttt ctctctttta tacacacatt caaaagaaag aaaaaaaata taccccagct 480

agttaaagaa aatcattgaa aagaataaga agataagaaa gatttaatta tcaaacaata 540

tcaat 545

<210> 23

<211> 508

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ctgaacgtat cgagactcgg ttgtgtcgtt atgctagcaa tgtcctcaca ggctccattc 60

cttctttcgc tctattggat atcatcacag ctattctccc tggtgcaaaa tatcatatta 120

aattggattt atccttacca acgatggtga agctgacgca tagataggat atgtaattct 180

acatcagctt gtaaataaac aaaaatgact ttcaatatcc ttcaaccgtt cctgactctt 240

tcctgctgac ccgtttttcc aaatttctcg tcgaacttga aattgaaaaa aaaaaaaaaa 300

aattgaatga ggactcatta aacagatgat gccgtaataa atgcaatata tcttgctatt 360

taactctttc tttctttgaa aaccttgaca tacgtattta aataattggc tgtccctgcc 420

tcgaagtata tttctcttct acttttatct tagcgatatc cctaagagtt taatcctccc 480

aggtccataa caaaagaagt caagttca 508

<210> 24

<211> 520

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cttgaagcag gagaacagct cagtgcagat gaggaagttt cgtccagcgc aaataaaata 60

gtgaatgtag gtgttttatg gaataaagac acgaataatg acttactaat tgttgaaaat 120

tatctcaaaa gcctcaaaaa aaatttaact agagacaggt agaaaattat tcaaaccttg 180

taaatagtgt tatatatatg tgttagactt aaaagcgcta ataaacgttc ctgctcgcat 240

ttaacttctg ttccaatttt cctatttttt agttagcttg ttcggcagat ttcaaattca 300

ttgagtccga ggaaacaaaa ggatgggaag agctcaaaat ttggagatgg gtttcatata 360

caacacgttg gttagcaaga acctaaggat ccgtctatag aaagaacctc gaaaaatctt 420

cgaaagattt tgttgactga gagtggaaaa aactgatatt actttctcgg tatagagggc 480

aacatttgca aaaagtaata aacaaatagg ggagcacaat 520

Claims

1.表达黄酮3β-羟化酶和/或黄酮3β-羟化酶辅酶的微生物细胞，其特征在于，所述黄酮3β-羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述黄酮3β-羟化酶辅酶的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的微生物细胞，其特征在于，利用启动子P_INO1、P_SED1、P_TPI1、P_MET6、P_FAS2、P_GAL1、P_LEU2、P_ZWF1、P_ARO7和P_GLN1启动黄酮3β-羟化酶的表达。

3.根据权利要求1所述的微生物细胞，其特征在于，利用启动子P_TDH1、P_PGK1、P_TDH3、P_ERG20、P_ADH6、P_GAL10、P_ADE2、P_PMA1、P_ADE6和P_FAD1启动黄酮3β-羟化酶的辅酶的表达。

4.根据权利要求1所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞以原核或真核生物为宿主。

5.权利要求1-4任一所述微生物细胞在生产圣草酚中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在反应体系中加入权利要求1-4任一所述微生物细胞。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，以柚皮素为底物。

8.一种全细胞催化生产圣草酚的方法，其特征在于，在反应体系中加入权利要求1-4任一所述微生物细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将在25-35℃，200-250rpm培养16-18h，获得种子液，将种子液以1-5mL/100mL的量加入反应体系中。

10.权利要求8或9所述方法在生产圣草酚或以圣草酚为原料的产品中的应用。