CN112391278A - 液滴数字pcr芯片、检测***、检测方法和制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种液滴数字PCR芯片、检测***、检测方法和制造方法。该液滴数字PCR芯片包括芯片本体，芯片本体开设有依次连通的注液池、液滴生成池、流通池和液滴存储池，及与注液池连通的第一驱动源，注液池底部由一隔膜组成；液滴生成池具有液滴生成腔；注液池一端开设注样口、另一端延伸至液体生成腔内，并在注液池与液滴生成腔连通路径形成第一毛细管路；第一驱动源能够驱动隔膜弹性舒张和收缩，以将注液池内的液体经过第一毛细管路从液滴生成腔内挤出形成液滴。该芯片可将芯片直接进行PCR反应，无需二次转移液滴，更好地维持液滴的状态，有利于PCR的进行，提高检测的效率和准确率，在液滴数字PCR装置中有广泛的应用前景。

Description

液滴数字PCR芯片、检测***、检测方法和制造方法

技术领域

本发明涉及微流控液滴数字聚合酶链式反应技术领域，尤其涉及一种液滴数字PCR芯片、检测***、检测方法和制造方法。

背景技术

液滴数字PCR是在传统的PCR扩增前利用微流控芯片对样品进行液滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。每一个芯片可以产生上百万个液滴，其中液滴的大小以及液滴间是否有重叠均会影响检测结果。

实时荧光定量PCR(以下简称qPCR或qRT-PCR)技术是一种在DNA扩增反应中以荧光化学物质测每次PCR循环后产物总量的方法，其中，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。由于qPCR技术具有准确度高，线性范围宽等优势，因此，己经广泛地用于分子诊断、疾病研究、临床医学等领域。

目前，液滴数字PCR过程一般为加入PCR试剂和油相，在液滴生成仪中生成微滴，再利用移液枪将产生的微滴移至96孔板中进行PCR反应，最后利用读取仪进行荧光检测。该过程中需要将产生的微滴进行转移，很有可能破坏微滴的大小和内环境，同时对操作者的操作要求高，需要花费时间精力；其次，液滴在96孔板中呈堆叠式分布，在后续检测中需要将液滴在单个独立分开进行荧光检测；并且，在PCR过程中需要长时间的加热，油相容易在加热过程中产生气泡，从而会破坏微滴结构，造成检测失败。

此外，通常遵循传统PCR的扩增原理，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量检测溶液中模板的原始拷贝数的依据。利用TaqMan探针测定PCR扩增产物的荧光曲线时，需要PCR扩增产物达到10“个拷贝/微升的饱和量，为了使10μ1的PCR反应体系在30个循环后达到这样的产物浓度，PCR反应体系至少需要10³个起始模板量。如果将PCR的体积减少至10纳升(n1)，则单个模板就可以在经30个PCR循环后被检测到。

现有的一般采用PDMS和玻璃片作为微流控芯片的材料，亦即作为微液滴的产生芯片。其中如此得到的微液滴尺寸具有均匀、界面稳定、PCR反应效率高等优点，但由于使用PDMS作为芯片材料，而PDMS材料的透气性特别好，透水性也会有，因此在这种芯片上直接进行PCR会导致PCR反应液蒸发而造成结果不准确。并且该芯片只具有液滴生成功能，而没有对反应产物进行检测的功能，所以该芯片的功能并不完整。另外，所述芯片还在3个试剂注入口均设置了单相液滴成型微结构，结构较为复杂。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种液滴数字PCR芯片，集成了液滴生成和单层液滴平铺的功能，直接将芯片放置在PCR仪中即可使其中的液滴进行PCR反应，无需再次转移生成的液滴，更好地维持液滴的状态，有利于PCR的进行；液滴均为单层平铺，液滴间不会产生重叠，后续检测方便，提高检测的效率和准确率。

本发明提供一种液滴数字PCR芯片，包括芯片本体，所述芯片本体上设置有液滴形成单元，所述液滴形成单元开设有依次连通的注液池、液滴生成池、流通池和液滴存储池；

所述注液池用于盛放样品稀释液；

所述液滴生成池具有液滴生成腔；

所述注液池一端开设注样口、另一端延伸至所述液体生成腔内，并在所述注液池与所述液滴生成腔连通路径形成第一毛细管路；

所述芯片本体还包括与所述注液池连通的第一驱动源，所述注液池底部由一隔膜组成，所述第一驱动源能够驱动所述隔膜弹性舒张和收缩，以将所述注液池内的液体挤入所述第一毛细管路，并从所述液滴生成腔内挤出形成液滴；

所述流通池一端开设有注油口、另一端开设出油口，通过所述注油口向所述液滴生成单元注入油液，通过所述出油口回收所述油液；

所述液滴存储池用于承接生成的液滴并进行PCR扩增反应。

进一步的，所述芯片本体包括设置于所述第一毛细管路末端的第一止回结构；所述第一止回结构位于所述第一毛细管路与所述注液池连通一端，用于阻止所述第一毛细管路内的液体流入注液池内。

具体的，所述第一毛细管路包括设置于其与所述注液池连通一端的大端及延伸至所述液滴生成腔内的小端，所述第一止回结构设置于所述大端上；所述第一止回结构包括若干弹片，所述弹片的一端固接于所述大端内壁、另一端向所述小端延伸，且每相邻两个弹片朝向所述小端的一端相互抵靠。

具体的，所述芯片本体还包括设置于所述注样口的第二止回结构，以阻止所述注液池内的液体返流。

具体的，所述注液池还形成一排气管路，所述排气管路竖直设置于所述注液池顶部；所述注液池还包括设置于其内壁底部的注样板，所述注样口设置于所述注液池底部；所述注样板一端延伸至所述注样口、另一端延伸至抵近所述大端，所述注样板与所述隔膜之间形成第二毛细管路。

更具体的，所述液滴生成池还具有与所述液滴生成腔连通的液滴平铺腔，由所述液滴生成腔生成的多个液滴进入并平铺在所述液滴平铺腔内；所述芯片本体还包括第二驱动源，所述第二驱动源驱动所述流通池内的油液流动。

本发明还提供一种液滴PCR检测***，包括所述的液滴数字PCR芯片，用于PCR扩增反应的循环加热装置，及检测装置。

具体的，所述检测装置包括：PMT光电倍增管模块和检测装置。

本发明还提供一种液滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：

S1、将油相添加到流通池中，PCR起始反应液通过注样口注入加样至注液池中；

S2、分别在所述流通池和所述注液池施加气压并持续特定时间，以便使分别来自流通池和PCR起始反应液储液池的液体汇合而生成大量大小均匀的小液滴；

S3、当所述生成的液滴都汇入所述液滴储存池后进行PCR扩增反应(203)；

S4、当PCR扩增反应结束后，读取PCR反应结果。

本发明还提供一种所述的液滴数字PCR芯片的制造方法，包括以下步骤：

S51、将所设计的图形进行掩膜版加工：将图形按等比例大小复制到一块菲林版或福版上，待进行后续模具加工；

S52、采用塑模法取图形：运用微加工技术在一块基板上加工凸起的模型作为模具，将复制的图形材料剥离开得到所需要的通道图形；其中模具的制取过程如下：首先在清洁的基底上溅射一层Cr/Ag，然后在金属层上甩上一层光刻胶，利用步骤一的掩膜版进行光刻图形化、显影，最后在清水中进行震荡过程，得到最终的刻有该图形的模具；

S53、将配制好的聚碳酸和环烯烃共聚物浇灌在模具上，对模具上的微图形进行复制，利用甩胶机将共聚物层甩均匀，使取下的图形平整，待共聚物层固化后从模具上剥离得到具有通道形状的盖片；

S54、将共聚物盖片与下层的玻璃基板键合封装成一个完整的芯片：在玻璃基板上甩一层薄的共聚物层，在烘箱内烘至共聚物层成为半固态时取出，然后利用真空氧等离子体去胶机对上层的共聚物层盖片和下层剥离基板去胶，改变表面化学特性，取出后将两部分对准、键合在一起成完整的芯片。

有益效果：

1、本发明提供了一种液滴数字PCR芯片，包括了依次连通的注液池、液滴生成池、流通池和液滴存储池，液滴生成单元注满油相试剂之后，PCR试剂经注液池从液滴生成池通过第一驱动源驱动隔膜弹性舒张和收缩，从而将注液池内的液体从第一毛细管路挤出并形成多个平铺的液滴。该芯片集成了液滴生成和单层液滴平铺的功能，直接将芯片放置在PCR仪中即可使其中的液滴进行PCR反应，无需再次转移生成的液滴，更好地维持液滴的状态，有利于PCR的进行；液滴均为单层平铺，液滴间不会产生重叠，后续检测方便，提高检测的效率和准确率，在液滴数字PCR装置中有广泛的应用前景。

2、本发明还利用微液滴技术可以对液滴进行细化生成纳升级别的微小体积液体进行操控，具体而言将起始样本反应液分割成皮升至纳升级的微液滴，在这样大小的微液滴中最多只包含一个目的DNA或RNA模板。当完成PCR之后，通过计算阳性液滴的数量就可以推导出起始反应液中目的DNA或RNA的总模板数。微液滴芯片基于传统的单相微流控芯片技术，但相比于单相微流控***，由于其水/油两相分离的特征，其具有消耗样品和试剂量更少、混合速度更快、不易造成交叉污染、易于操控等。

附图说明

图1为本发明实施例提供的微滴数字PCR芯片的立体结构示意图。

图2为本发明实施例提供的液滴生成单元部分的平面结构示意图。

图3为本发明实施例提供的第二毛细管路的立体结构示意图。

图4为本发明实施例提供的大端处的第一止回结构示意图。

图5为本发明实施例提供的小端处的结果示意图。

图6为本发明实施例提供的流通池和液滴生成池处的结构示意图。

图7为本发明实施例提供的检测***示意图。

图8为本发明实施例提供的液滴数字PCR检测方法流程示意图。

图9为图8中S2的具体流程示意图。

图10为本发明实施例提供的微液滴PCR芯片的制备方法流程示意图。

1液滴数字PCR芯片、10芯片本体、100液滴形成单元、

101注液池、1010注样口、1011第一毛细光路、1012大端、1013小端、1014排气管路、1015注样板、1016第二毛细管路、

1018隔膜、

102液滴生成池、1020液滴生成腔、1021撞击肋条、1022液滴平铺腔、

103流通池、1030注油口、1031出油口、

104液滴存储池、

105第一驱动源、

106第一止回结构、1060弹片、

107第二止回结构、

108第二驱动源、

2检测***、3循环加热装置、4检测装置。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1、2所示，本发明实施例提供一种液滴数字PCR芯片1，包括芯片本体10，芯片本体10上设置有液滴形成单元100，液滴形成单元100开设有依次连通的注液池101、液滴生成池102、流通池103和液滴存储池104；

注液池101用于盛放样品稀释液；

液滴生成池102具有液滴生成腔1020；

注液池101一端开设注样口1010、另一端延伸至液体生成腔1020内，并在注液池101与液滴生成腔1020连通路径形成第一毛细管路1011；

芯片本体10还包括与注液池101连通的第一驱动源105，注液池101底部由一隔膜1018组成，第一驱动源105能够驱动隔膜1018弹性舒张和收缩，以将注液池101内的液体挤入第一毛细管路1011，并从液滴生成腔1020内挤出形成液滴；具体的，第一驱动源105能够是电机、油缸、气缸或者蠕动泵，只要能够驱动隔膜1018舒张和收缩即可，但第一驱动源105的输出端连接于隔膜1018位于注液成101外表面上。

流通池103一端开设有注油口1030、另一端开设出油口1031，通过注油口1030向流通池103注入油液，通过出油口1031回收油液；

液滴存储池104用于承接生成的液滴并进行PCR扩增反应。

本发明提供的液滴数字PCR芯片，包括了依次连通的注液池、液滴生成池、流通池和液滴存储池，液滴生成单元注满油相试剂之后，PCR试剂经注液池从液滴生成池通过第一驱动源驱动隔膜弹性舒张和收缩，从而将注液池内的液体从第一毛细管路挤出并形成多个平铺的液滴。该芯片集成了液滴生成和单层液滴平铺的功能，直接将芯片放置在PCR仪中即可使其中的液滴进行PCR反应，无需再次转移生成的液滴，更好地维持液滴的状态，有利于PCR的进行；液滴均为单层平铺，液滴间不会产生重叠，后续检测方便，提高检测的效率和准确率，在液滴数字PCR装置中有广泛的应用前景。

如图3、4、5、6所示，为防止液滴生成腔1020内的液滴进入注液池101内，进一步的实施例中，芯片本体10包括设置于第一毛细管路1011末端的第一止回结构106；第一止回结构106位于第一毛细管路1011与注液池101连通一端，用于阻止第一毛细管路1011内的液体流入注液池101内。

为使得形成的液滴尽可能小且还能防止液滴返流至注液池101内，进一步的实施例中，第一毛细管路1011包括设置于其与注液池103连通一端的大端1012及延伸至液滴生成腔1020内的小端1013，第一止回结构106设置于大端1012上；第一止回结构106包括若干弹片1060，弹片1060的一端固接于大端1012内壁、另一端向小端1013延伸，且每相邻两个弹片1060朝向小端1013的一端相互抵靠。

如此，隔膜1018舒张时，能够将注液池101内的液体经第一毛细管路1011挤出，并形成微液滴；隔膜1018收缩时，能够第一止回结构106能够阻止液滴返流至的注液池101内。具体的，大端1012的内径为500～1000μm，小端1013的内径为10～50μm，第一毛细管路1011长度为5～10mm；弹片1060由弹性塑料制成，如聚碳酸或环烯烃共聚物制成的弹性塑料。

为进一步细化液滴，优选的实施例中，液滴生成池102包括设置于液滴生成腔1020内的撞击肋条1021，撞击肋条1021靠近小端1013设置，如此，经过第一毛细管路1011挤出的液滴撞击于撞击肋条1021上，受撞击后的液滴进一步分散成更细的液滴，从而使得液滴能够进一步细化。具体的，撞击肋条1021由液滴生成腔1020内壁向其内延伸形成。

为防止隔膜1018舒张时，将注液池101内的液体从注样口1010挤出，芯片本体10还包括设置于注样口1010的第二止回结构107，以阻止注液池101内的液体返流。

具体的，注液池101还形成一排气管路1014，排气管路1014竖直设置于注液池101顶部，排气管路1014一端连通至注液池101内、另一端连通至大气，优选的，排气管路1014连通大气一端向下弯折，并在其开口端设置有过滤层，防止外部颗粒其粉尘进入注液池101；

如图2、3所示，注液池101还包括设置于其内壁底部的注样板1015，注样口1010设置于注液池101底部；注样板1015一端延伸至注样口1010、另一端延伸至抵近大端1012，注样板1015与隔膜1018之间形成第二毛细管路1016。

具体的，注样口1010为带有硅胶帽的微孔注入头(即为第二止回结构107)，在进样时，通过微针***注入头，将样品注入，拔出微针后，硅胶对其进行密封，能够阻止内部液滴渗漏。具体的，排气管路1014的长度能够满足隔膜1018舒张和收缩时，导致注液池101内的液面涨跌，而不至于将其内部液体从排气管路1014挤出。如此，当隔膜1018舒张时，注液池101内的液体进入排气管路1014，并将第二毛细管路1016内的样品向大端1012挤入，而注样板1015在靠近大端1012的一端空缺，能够将部分注液池101内的样品稀释液一起从大端1012带入第一毛细管路1011中。

更具体的，第二毛细管路1016的内径与注样口1010注入的样品量有关，其内径可为100～200μm。

进一步的实施方式中，液滴生成池102还具有与液滴生成腔1020连通的液滴平铺腔1022，由液滴生成腔1020生成的多个液滴进入并平铺在液滴平铺腔1022内。

具体的，如图2所示，液滴平铺腔1022位于液滴生成腔1020上方。由于油相密度大，生成液滴会上浮至液滴平铺腔1022顶部并且单层平铺在充满油相的液滴平铺腔1022内，形成油包水型液滴，以进行后续PCR反应。

具体的，液滴平铺腔1022的高度与小端1013的内径相适应，为10～50μm。

进一步的，如图6所示，芯片本体10还包括第二驱动源108，第二驱动源108驱动流通池103内的油液流动，以便将形成的微滴带至需要控制反应温度和便于检测的部位。

本发明还提供了一种液滴PCR检测***2，如图7所示，包括：上述实施例提供的液滴数字PCR芯片1；用于PCR扩增反应的循环加热装置3；及检测装置4。

于功能性而言，PCR起始反应液和样品液经注液池101注入，在液滴生成池102中生成液滴，并被流动相带入流通池103中，并最终抵达液滴存储池104内，最终能够在液滴存储池104内形成若干单层的0.5～1纳升的液滴反应液，而液滴存储池104置于循环加热装置3的加热通路及检测装置4的检测通路中，能够进行PCR扩增反应后，直接读取结果，检测过程简便，检测效率高。

进一步的，检测装置4包括：PMT光电倍增管模块40和荧光显微镜41，以及激发光源，可变焦镜头、荧光滤光片和CCD相机等，共同形成一个荧光检测通道，具体的，芯片本体10由透明材质制成。激发光源包括发光二极管(LED)和15°透镜以及带通激发光滤光片，其中所述带通激发光滤光片具有473nm的中心波长和10nm的带宽。此外，所述带通荧光滤光片具有535nm的中心波长和40nm的带宽。

在PCR反应结束之后，***中的发光二极管经由15°透镜以及带通激发光滤光片，从芯片上方45°均匀斜射在芯片的单层液滴平铺区域，透镜和带通激发光滤光片分别用于聚焦和过滤。在此，45°的斜射光路可有效降低激发光散射背景，从而提高荧光检测的灵敏度。由此激发液滴内部的荧光之后，上方的可变焦镜头可进行收集，并经带通荧光滤光片过滤后进入CCD相机，通过CCD相机采集荧光图片从而获取PCR反应结果。

因此，本发明实施例还提供了一种液滴数字PCR检测方法，如图8所示，包括以下步骤：

S1、将油相添加到流通池中，PCR起始反应液通过注样口注入加样至注液池中；

S2、启动第一驱动源，驱动隔膜弹性舒张和收缩，在液滴生成腔内形成微滴，在液滴平铺腔内平铺液滴；

S3、启动第二驱动源，使得流通池内的油相流动，将液滴平铺腔内的微滴带入并流动至液滴存储池；

S4、当所述生成的液滴都汇入所述液滴储存池后进行PCR扩增反应；

S5、当PCR扩增反应结束后，通过检测装置读取PCR反应结果。

具体的，方法还包括以下步骤：当PCR扩增反应结束后，将所述液滴数字PCR芯片置于所述检测装置的检测通量中，使用PMT光电倍增管模块读取PCR反应结果。

本发明还利用微液滴技术可以对液滴进行细化生成纳升级别的微小体积液体进行操控，具体而言将起始样本反应液分割成皮升至纳升级的微液滴，在这样大小的微液滴中最多只包含一个目的DNA或RNA模板。当完成PCR之后，通过计算阳性液滴的数量就可以推导出起始反应液中目的DNA或RNA的总模板数。微液滴芯片基于传统的单相微流控芯片技术，但相比于单相微流控***，由于其水/油两相分离的特征，其具有消耗样品和试剂量更少、混合速度更快、不易造成交叉污染、易于操控等。

具体的，油相加入至流通池中是通过注油口1030加入。进一步的，流通池103成环形通道，且液滴存储池104为该环形通道上的一个分支，注油口1030和出油口1031分别设置于该环形通道的两端，而液滴存储池104设置于靠近出油口1031的末端。

具体的将流通池103内注满油液的步骤如下：将注油口1030与外部油源连通，出油口1031与外部废油容器连通，外部油源不断向流通池103内注入油液，当流通池103内油液注满后，切断注油口1030和出油口1031并保持流通池103密封。如此，流通池103内充满油液而无气体。

进一步的，流通池103与第二驱动源108为柔性部位，第二驱动源108是能够驱动流通成103内油液单向流动的蠕动泵。

具体的，PCR起始反应液通过注样口1010注入加样至注液池101的具体步骤如下：将带有样品的微针注射器***至注样口，将样品注入，拔出微针，硅胶对第二毛细管路进行密封。

其中，如图9所示，S2具体包括如下步骤：

S21、开启第一驱动源，驱动隔膜舒张和收缩，挤压第二毛细管路，将第二毛细管路内的PCR起始反应液向大端驱动，并经过第一毛细管路挤出至液滴生成腔；

S22、挤出的液滴从第一毛细管路挤出形成液滴，并撞击在撞击肋条上进一步细化，形成雾化的液滴；

S23、雾化的液滴上浮至液滴平铺腔内，进行平铺成单层的液滴。

更具体的，液滴平铺腔与环形的流通池连通，具体与靠近注油口1030的一端连通，启动第二驱动源后，流通池103内的油液产生由注油口1030至出油口1031流动的流向，从而带动液滴平铺腔内的液滴经过流通池103进入液滴存储池中，从而进行PCR反应和检测。

更具体的，为使得液滴能够顺利进入液滴存储池中，液滴存储池位于整个液滴形成单元100的最高位置，且液滴生成腔1020、液滴平铺腔1021和液滴存储池104的位置依次升高，且由液滴平铺腔1021至液滴存储池104之间的流通池103不断升高，以便于液滴能够移动至液滴存储1池104中。

优选的，流通池103的其他部位位于由液滴平铺腔1021至液滴存储池104之间的部分的下方，且其柔性部位亦位于这一部分，从而便于第二驱动源驱动，并且便于液滴移动。

液滴在汇入至液滴存储池的过程中和处于液滴存储池中均能够将其处于循环加热装置3和检测装置4中，以便于实时进行PCR反应和检测。

本发明实施例的另一个方面，提供一种微液滴PCR芯片的制备方法，如图10所示，该方法包括如下步骤：

S51、将所设计的图形进行掩膜版加工：将图形按1:l大小复制到一块菲林版或福版上，待进行后续模具加工；

S52、采用塑模法取图形：运用微加工技术在一块基板上加工凸起的模型作为模具，将复制的图形材料剥离开得到所需要的通道图形；其中模具的制取过程如下：首先在清洁的基底上溅射一层Cr/Ag，然后在金属层上甩上一层光刻胶，利用步骤一的掩膜版进行光刻图形化、显影，最后在清水中进行震荡过程，得到最终的刻有该图形的模具；

为了使后续过程模具整洁，将模具上残留的光刻胶用丙酮和酒精先后清洗震荡。

S53、将配制好的聚碳酸和环烯烃共聚物浇灌在模具上，对模具上的微图形进行复制，利用甩胶机将共聚物层甩均匀，使取下的图形平整，待共聚物层固化后从模具上剥离得到具有通道形状的盖片。

S54、将共聚物盖片与下层的玻璃基板键合封装成一个完整的芯片：在玻璃基板上甩一层薄的共聚物层，在烘箱内烘至共聚物层成为半固态时取出，然后利用真空氧等离子体去胶机对上层的共聚物层盖片和下层剥离基板去胶，改变表面化学特性，取出后将两部分对准、键合在一起成完整的芯片。

优选地，所述对准是通过共聚物层图形化盖片和玻璃基底上的对准符号实现。

液滴PCR芯片相对于传统的PCR芯片具有能够快速实现与反应酶、反应催化剂等试剂快速融合，并且通量较高；

本发明考虑到PCR过程的物质利用率较低，前期利用该芯片将PCR所需要的反应物创造一个独立的微液滴环境，因而在PCR反应中不会受到外界环境的影响，有效的提高了PCR的效率；

本发明制作的PCR微液滴芯片微型化，成本低廉，方便、快捷的形成PCR反应物的微液滴，为后续PCR反应的DNA合成与分离创造了优势条件；同时在此设计与制作过程利用了很多前沿的MEMS工艺，并对以后的芯片进行改进和制作过程的创新提供了很大的空间。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种液滴数字PCR芯片，其特征在于，包括芯片本体，所述芯片本体上设置有液滴形成单元，所述液滴形成单元开设有依次连通的注液池、液滴生成池、流通池和液滴存储池；

所述注液池用于盛放样品稀释液；

所述液滴生成池具有液滴生成腔；

所述注液池一端开设注样口、另一端延伸至所述液体生成腔内，并在所述注液池与所述液滴生成腔连通路径形成第一毛细管路；

所述芯片本体还包括与所述注液池连通的第一驱动源，所述注液池底部由一隔膜组成，所述第一驱动源能够驱动所述隔膜弹性舒张和收缩，以将所述注液池内的液体挤入所述第一毛细管路，并从所述液滴生成腔内挤出形成液滴；

所述流通池一端开设有注油口、另一端开设出油口，通过所述注油口向所述液滴生成单元注入油液，通过所述出油口回收所述油液；

所述液滴存储池用于承接生成的液滴并进行PCR扩增反应。

2.根据权利要求1所述的液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述芯片本体包括设置于所述第一毛细管路末端的第一止回结构；

所述第一止回结构位于所述第一毛细管路与所述注液池连通一端，用于阻止所述第一毛细管路内的液体流入注液池内。

3.根据权利要求2所述的液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述第一毛细管路包括设置于其与所述注液池连通一端的大端及延伸至所述液滴生成腔内的小端，所述第一止回结构设置于所述大端上；

所述第一止回结构包括若干弹片，所述弹片的一端固接于所述大端内壁、另一端向所述小端延伸，且每相邻两个弹片朝向所述小端的一端相互抵靠。

4.根据权利要求3所述的液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述芯片本体还包括设置于所述注样口的第二止回结构，以阻止所述注液池内的液体返流。

5.根据权利要求4所述的液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述注液池还形成一排气管路，所述排气管路竖直设置于所述注液池顶部；

所述注液池还包括设置于其内壁底部的注样板，所述注样口设置于所述注液池底部；

所述注样板一端延伸至所述注样口、另一端延伸至抵近所述大端，所述注样板与所述隔膜之间形成第二毛细管路。

6.根据权利要求1-5任一项所述的液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述液滴生成池还具有与所述液滴生成腔连通的液滴平铺腔，由所述液滴生成腔生成的多个液滴进入并平铺在所述液滴平铺腔内；

所述芯片本体还包括第二驱动源，所述第二驱动源驱动所述流通池内的油液流动。

7.一种液滴PCR检测***，包括：

权利要求1-6任一项所述的液滴数字PCR芯片；

用于PCR扩增反应的循环加热装置；及

检测装置。

8.根据权利要求7所述的液滴PCR检测***，其特征在于，所述检测装置还包括：PMT光电倍增管模块和荧光显微镜。

9.一种液滴数字PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将油相添加到所述流通池中，PCR起始反应液通过所述注样口注入加样至注液池中；

S2、启动所述第一驱动源，驱动隔膜弹性舒张和收缩，在液滴生成腔内形成微滴，在液滴平铺腔内平铺液滴；

S3、启动所述第二驱动源，使得流通池内的油相流动，将液滴平铺腔内的微滴带入并流动至液滴存储池；

S4、当所述生成的液滴都汇入所述液滴储存池后进行PCR扩增反应；

S5、当PCR扩增反应结束后，通过检测装置读取PCR反应结果。

10.一种权利要求1-6任一项所述的液滴数字PCR芯片的制造方法，其特征在于，包括以下步骤：

S51、将所设计的图形进行掩膜版加工：将图形按等比例大小复制到一块菲林版或福版上，待进行后续模具加工；

S52、采用塑模法取图形：运用微加工技术在一块基板上加工凸起的模型作为模具，将复制的图形材料剥离开得到所需要的通道图形；其中模具的制取过程如下：首先在清洁的基底上溅射一层Cr/Ag，然后在金属层上甩上一层光刻胶，利用步骤一的掩膜版进行光刻图形化、显影，最后在清水中进行震荡过程，得到最终的刻有该图形的模具；

S53、将配制好的聚碳酸和环烯烃共聚物浇灌在模具上，对模具上的微图形进行复制，利用甩胶机将共聚物层甩均匀，使取下的图形平整，待共聚物层固化后从模具上剥离得到具有通道形状的盖片；

S54、将共聚物盖片与下层的玻璃基板键合封装成一个完整的芯片：在玻璃基板上甩一层薄的共聚物层，在烘箱内烘至共聚物层成为半固态时取出，然后利用真空氧等离子体去胶机对上层的共聚物层盖片和下层剥离基板去胶，改变表面化学特性，取出后将两部分对准、键合在一起成完整的芯片。

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