CN112390872A - 一种角蛋白肽衍生物及其制备方法、应用和药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药材料技术领域，具体讲，涉及一种角蛋白肽衍生物及其制备方法、应用和药物组合物。本发明的角蛋白肽衍生物的结构如式I所示，R为疏水基团。本发明的角蛋白肽衍生物在角蛋白肽结构上引入疏水基团，在水性介质中可通过自组装形成纳米粒子，不仅具有缓控释作用，而且还具有生物黏附性，是一种性能良好的药物载体。
Description
技术领域
本发明属于生物医药材料技术领域，具体讲，涉及一种角蛋白肽衍生物及其制备方法、应用和药物组合物。
背景技术
角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于人和动物的皮毛、角、蹄、壳、爪、鳞片等生物体组织，在自然界中来源丰富，在我国年产量可达几十万吨。角蛋白根据是否纤维化可分为软角蛋白和硬角蛋白两种，两者结构中含硫氨基酸含量有所不同，软胶蛋白主要存在与皮肤组织和细胞组织中。硬角蛋白为纤维化的蛋白，主要存在于动物的表皮和蛋壳内膜中，对机体具有保护作用。角蛋白分子根据二级结构的不同又分为α-角蛋白和β-角蛋白两类，角蛋白结构中富含胱氨酸和羟基氨基酸，可通过二硫键、氢键和离子键作用等黏附于细胞或粘膜。
天然角蛋白是可以直接使用或经物理、化学改性后使用的天然高分子材料，具有可再生性、生物相容性、生物可降解性及热稳定性等诸多优良性能，具有较好的应用价值和发展前景，因此，有待进一步的研究开发。角蛋白肽是角蛋白的水解产物，近年来，随着对角蛋白肽材料的理论和应用研究的深入开展，这种水溶性小分子肽因具有良好的亲和性、保湿性、抗氧化性、修护毛发、促进哺乳动物细胞有丝***、较高的营养等功效和作用，已经开始广泛应用于医药、化妆品、食品、纺织等行业。
角蛋白肽结构中富含半胱氨酸、丝氨酸及羟基氨基酸，并含有细胞黏附肽序列，如常用的黏附肽RGD和LDV，可被细胞膜上的整合素识别并参与细胞和基质间的黏附。角蛋白肽作为一种天然黏附性生物材料，虽然具有诸多优势，但是其本身还存在重现性差、理化性能有限等缺点。因此，需要经过适当的修饰以增强其适用性能。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提出一种角蛋白肽衍生物。
本发明的第二发明目的在于提出该角蛋白肽衍生物的制备方法。
本发明的第三发明目的在于提出该角蛋白肽衍生物的应用。
本发明的第四发明目的在于提出含有该角蛋白肽衍生物的药物组合物。
为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案如下：
本发明提出一种角蛋白肽衍生物，所述角蛋白肽衍生物的结构如式I所示：
其中，Keratin Pepide表示角蛋白肽，R为疏水基团，优选碳原子数为8～18的烷基、环戊烷多氢菲基中的至少一种。
可选的，所述环戊烷多氢菲基选自式II所示取代基：
其中，R1、R2各自独立的选自碳原子数为1～6的烷基，R3选自碳原子数为1～12的亚烷基，R’各自独立的选自羟基、碳原子数为1～6的烷基；n＝1～10；
优选的，所述环戊烷多氢菲基选自式IIA所示取代基：
可选的，所述角蛋白肽的分子量为300～8000Da。
本发明还涉及上述角蛋白肽衍生物的制备方法，至少包括以下步骤：
S1、将R-COOH溶解于反应溶剂中，加入EDC和NHS活化羧基；
S2、加入角蛋白肽，与活化后的羧基进行缩合反应；
S3、提取缩合产物，即得所述角蛋白肽衍生物。
优选的，R-COOH为疏水化合物，优选脱氧胆酸或碳原子数为8～18烷基酸。
可选的，R-COOH与反应溶剂的重量比为1：10～80；所述反应溶剂优选甲醇、乙醇、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺中的至少一种；进一步优选的，所述活化羧基的反应温度为15～25℃、反应时间为8～36小时，反应条件为避光反应；更进一步优选的，R-COOH、EDC和NHS的重量比为1：10～500：20～600。
可选的，在S2中，所述角蛋白肽溶解于缓冲溶液中，所述缓冲溶液为柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中的一种；
优选的，所述缩合反应的反应温度为15～25℃、反应时间为4～24小时，反应条件为避光反应。
可选的，所述提取缩合产物包括：将所述缩合反应后的产物置于截留分子量为300～14000Da的透析袋中，于去离子水中0～10℃透析3～8天，干燥，得所述角蛋白肽衍生物；所述干燥优选冷冻干燥、喷雾干燥或减压干燥中的一种。
可选的，所述R-COOH与角蛋白肽的偶联率为18％～90％。
本发明还涉及上述角蛋白肽衍生物作为药物载体的应用；优选的，所述药物载体包括胃肠道给药、眼部给药、皮肤给药、鼻腔粘膜给药、直肠给药或***给药的药物载体。
本发明还涉及一种采用上述角蛋白肽衍生物制备的药物载体，所述药物载体的制备方法为：将所述角蛋白肽衍生物和药物溶于药学上可接受的溶剂，蒸发至形成一层薄膜，所述薄膜干燥后加入水化介质至脱模，得到所述药物载体；优选的，所述蒸发为旋转蒸发，时间为10～40min，温度为15～25℃，反应条件为避光反应；更优选的，所述水化介质为缓冲溶液、去离子水或蒸馏水；进一步优选的，所述药物载体的粒径为5～1000nm。
本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包括药物和药物载体，所述药物载体上述角蛋白肽衍生物或为上述药物载体；优选的，所述药物包括化学治疗药物、解热镇痛药、甾体抗炎药、非甾体抗炎药、消化***药物、循环***药物、神经***药物、降血糖药、利尿药和激素类药物中的至少一种，所述化学治疗药物包括抗生素和抗肿瘤药；所述药物组合物的剂型选自液体剂型、半固体剂型、固体剂型或喷雾剂型，所述液体剂型为胶体液、乳浊液或混悬液，所述半固体剂型为软膏剂、凝胶剂或栓剂。
本发明的技术方案至少具有以下技术效果：
本发明的角蛋白肽衍生物在角蛋白肽结构上引入疏水基团而制备的两亲性衍生物载体，本发明的角蛋白肽衍生物在水性介质中可通过自组装形成纳米粒子，用作药物或活性物质的递送载体，角蛋白肽结构中富含半胱氨酸、丝氨酸及羟基氨基酸，并含有细胞黏附肽序列，如常用的黏附肽RGD和LDV，可被细胞膜上的整合素识别并参与细胞和基质间的黏附，延长载体在细胞和粘膜表面的滞留时间，促进药物的吸收；还可以提高局部药物浓度，增强药物局部靶向性。
本发明的角蛋白肽衍生物可在水性介质中自组装形成纳米载体，其对药学活性分子具有较好的包载。
本发明的角蛋白肽衍生物作为药物载体用于胃肠道给药、眼部给药、皮肤给药、鼻腔粘膜给药、直肠给药或***给药等途径给药，具有缓释作用，可减少给药次数。
附图说明
图1为脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物1HNMR谱图；
图2为脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物的临界胶束浓度的荧光图谱；
图3为载鬼臼毒素角蛋白肽衍生物纳米载体扫描电镜图；
图4为载鬼臼毒素角蛋白肽衍生物纳米载体的粒径分布图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提出一种角蛋白肽衍生物，该角蛋白肽衍生物的结构如式I所示：
其中，Keratin Pepide表示角蛋白肽，R为疏水基团，优选碳原子数为8～18的烷基、环戊烷多氢菲基中的至少一种。
本发明实施例将角蛋白肽经疏水修饰后，可通过自组装形成纳米粒子，用作药物或活性物质的递送载体，不仅具有缓控释作用，而且还具有生物黏附性，可以促进药物或活性物质的吸收，提高药物或活性物质生物利用度。
可选的，环戊烷多氢菲基选自式II所示取代基：
其中，R1、R2各自独立的选自碳原子数为1～6的烷基，优选为甲基、乙基、正丙基和异丙基，优选甲基。
表示取代位置。
R3选自碳原子数为1～12的亚烷基；
R’为n个，各自独立的选自羟基、碳原子数为1～6的烷基；n＝1～10。
可选的，环戊烷多氢菲基选自式IIA所示取代基：
其中，
表示取代位置。
具体的，本发明实施例中角蛋白肽的分子量为300～8000Da。
本发明实施例还涉及上述角蛋白肽衍生物的制备方法，至少包括以下步骤：
S1、将R-COOH溶解于反应溶剂中，加入EDC和NHS活化羧基；
S2、加入角蛋白肽，与活化后的羧基进行缩合反应；
S3、提取缩合产物，即得角蛋白肽衍生物。
具体的，R-COOH为疏水化合物，具体选自脱氧胆酸或碳原子数为8～18烷基酸。
在S1中，R-COOH与反应溶剂的重量比为1：10～80，反应溶剂选自甲醇、乙醇、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺中的至少一种，优选甲醇。
在S1中，活化羧基的反应温度为15～25℃、反应时间为8～36小时，反应条件为避光反应。并优选搅拌加速反应。
在S1中，R-COOH、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的重量比为1：10～500：20～600。
在S2中，将角蛋白肽溶解于缓冲溶液中，缓冲溶液为柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中的一种；
在S2中，缩合反应的反应温度为15～25℃、反应时间为4～24小时，反应条件为避光反应。并优选搅拌加速反应。
在S3中，提取缩合产物的步骤包括：将缩合反应后的产物置于截留分子量为300～14000Da的透析袋中，于去离子水中0～10℃透析3～8天，再干燥得到本发明实施例的角蛋白肽衍生物。
其中，干燥可选自冷冻干燥、喷雾干燥或减压干燥中的一种。
依据H-NMR图谱分析，本发明实施例的制备方法中疏水化合物与角蛋白肽的偶联率为18％～90％。
下面以角蛋白肽与脱氧胆酸的反应进一步说明本发明实施例的制备方法：
称取脱氧胆酸粉末于干燥无水的圆底烧瓶中，向烧瓶中加入反应溶剂，匀速搅拌使其完全溶解，随后加入EDC和NHS，室温避光条件下匀速搅拌4～24h，然后缓慢加入角蛋白肽磷酸缓冲溶，室温避光反应2～24h后置于截留分子量为300～14000Da的透析袋中，于去离子水中0～10℃透析3～8天后干燥得固体粉末，即为角蛋白肽衍生物。脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物对鬼臼毒素的包封率高达92.20％(w/w)，对布洛芬的包封率高达85.0％，对吲哚美辛的负载高达89.50％。
下面以角蛋白肽与烷基酸的反应进一步说明本发明实施例的制备方法：
称取烷基酸于干燥无水的圆底烧瓶中，向烧瓶中加入反应溶剂，匀速搅拌使其完全溶解，随后加入EDC和NHS，室温避光条件下匀速搅拌4～24h，然后缓慢加入角蛋白肽磷酸缓冲溶，室温避光反应2～24h后置于截留分子量为300～14000Da的透析袋中，于去离子水中0～10℃透析3～8天后干燥得固体粉末，即为烷基酸-角蛋白肽衍生物。
本发明实施例还涉及上述角蛋白肽衍生物作为药物载体的应用。优选的，药物载体包括胃肠道给药、眼部给药、皮肤给药、鼻腔粘膜给药、直肠给药或***给药的载药载体。本发明的角蛋白肽衍生物可在水性介质中自组装形成纳米载体，其对药学活性分子具有较好的包载，具有缓释作用，可减少给药次数。
本发明实施例还涉及一种上述的角蛋白肽衍生物制备的药物载体，药物载体的制备方法为：将本发明实施例的角蛋白肽衍生物和药物溶于药学上可接受的溶剂，蒸发至形成一层薄膜，薄膜干燥后加入水化介质至脱模，得到本发明实施例的药物载体。
优选的，蒸发旋转蒸发，时间为10～40min，温度为15～25℃，反应条件为避光反应；
更优选的，水化介质为缓冲溶液、去离子水或蒸馏水；具体的，缓冲液可选用磷酸盐缓冲溶液。
进一步优选的，药物载体的粒径为5～1000nm。
本发明实施例还涉及一种药物组合物，包括药物和药物载体，药物载体包括上述角蛋白肽衍生物或为上述药物载体。
具体的，药物包括化学治疗药物、解热镇痛药、甾体抗炎药、非甾体抗炎药、消化***药物、循环***药物、神经***药物、降血糖药、利尿药和激素类药物中的至少一种；化学治疗药物包括抗生素和抗肿瘤药；具体药物可选自：布洛芬、吲哚美辛、鬼臼毒素、甲氨蝶呤、维A酸、环孢素A、阿霉素、紫杉醇、阿托伐他汀、硝苯地平、马来酸依那普利、呋塞米、螺内酯、单硝酸异山梨酯、格列齐特、头抱克肟、头孢呋辛脂、尼扎替丁、尼莫地平、美洛昔康、双环醇、艾司***、盐酸小檗碱等，但并不局限于这些药物。
本发明实施例的药物组合物的剂型选自液体剂型、半固体剂型、固体剂型或喷雾剂型，液体剂型为胶体液、乳浊液或混悬液，半固体剂型为软膏剂、凝胶剂或栓剂。
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物的制备
1、称取脱氧胆酸粉末0.2g于干燥无水的圆底烧瓶中，向烧瓶中加入15mL甲醇，匀速搅拌30min使其完全溶解，然后加入96mg EDC和70mg NHS，室温避光条件下匀速搅拌过夜，转速60r/min，得到羧基末端活化的脱氧胆酸溶液。
2、称取角蛋白肽粉末1.0g于圆底烧瓶中，向烧瓶中加入30mL pH值为6的磷酸缓冲溶液，搅拌使充分溶解。
3、将角蛋白肽溶液缓慢滴加到羧基末端活化的脱氧胆酸溶液中，室温避光搅拌12h。所得溶液置于截留分子量为300Da的透析袋中，去离子水透析72h。透析后的溶液冷冻干燥机干燥，得脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物粉末。该步骤的化学反应方程式如下所示。
将脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物溶于氘代水，样品浓度为10mg/mL，利用400MHz的核磁共振谱仪(德国布鲁克仪器公司，型号：AVANCE III 400M)对样品结构进行1HNMR表征，结果如图1所示。
从图1的核磁共振图谱中可以看出，角蛋白肽经脱氧胆酸修饰后，在δ0.6～2.5ppm处出现了脱氧胆酸的特征峰，在δ0.7～2.4ppm处保留了角蛋白的特征峰，证明脱氧胆酸-角蛋白肽合成成功。
实施例2：脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物临界胶束浓度的测定：
精密称取实施例1制备的脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物25mg，采用pH值为7.4的PBS溶液定容至25mL，得到1.0mg/mL的脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物溶液。然后用PBS稀释成不同浓度，浓度范围为5.0×10-4mg/mL～0.5mg/mL。分别移取0.1mL 2×10-4mol/L芘的丙酮溶液于玻璃试管中，氮气吹去丙酮。将10mL不同浓度的角脱氧胆酸-角蛋白肽溶液加入含芘的10mL试管中，室温下水浴超声30min，激发波长为334nm，在350～500nm发射波长范围内扫描芘的激发光谱和发射光谱，通过373nm与384nm的荧光强度之比(I1/I3)的突然变化来确定脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物的临界胶束浓度。脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物的临界胶束浓度测定荧光图谱如图2所示。
从图2可以看出，随着脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物浓度的增加，芘的荧光强度下降，I1/I3在0.05mg/mL时突然降低，因此，脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物的临界胶束浓度为0.05mg/mL。
实施例3：脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物载鬼臼毒素载体的制备：
采用薄膜分散法制备脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物载鬼臼毒素载体：将鬼臼毒素和脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物分散于乙醇中，旋蒸30min使形成一层薄膜；真空干燥2h；25℃下旋转水化直至完全脱膜；将载药载体于5℃水浴超声处理5min，0.22μm微孔滤膜过滤，即得脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物载鬼臼毒素载体。
脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物载鬼臼毒素载体外观形态观察：
将脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物载鬼臼毒素载体样品放在铜片上，用导电双面胶将带有样品的铜片固定在样品台上，喷镀铂金后，设定加速电压为5kV，用扫描电子显微镜(型号：Zeiss Sigma 500)观察其外观形态。载鬼臼毒素角蛋白肽衍生物纳米载体扫描电镜图如图3所示。
由图3可知，载药载体外观形状大多为不规则的圆柱形、球形，分散较好，无团聚现象。
脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物载鬼臼毒素载体粒径分布的测定：
将脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物载鬼臼毒素载体稀释50倍，用激光粒度仪(英国马尔文公司，型号：Nano ZS90)测定载药载体的粒径分布及其多分散指数(PDI)，光源为He-Ne激光源，测量角为90°，激光波长633nm，测量温度为25℃。脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物载鬼臼毒素载体粒径分布如图4所示。
从图4可知，脱氧胆酸-角蛋白肽衍生物载鬼臼毒素载体平均粒径为(181.5±63.65)nm，PDI为0.12，表明其结构稳定，粒径呈单峰分布，且分布较窄。
Claims (10)
1.一种角蛋白肽衍生物，其特征在于，所述角蛋白肽衍生物的结构如式I所示：
其中，Keratin Pepide表示角蛋白肽，R为疏水基团，优选碳原子数为8～18的烷基、环戊烷多氢菲基中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的角蛋白肽衍生物，其特征在于，所述环戊烷多氢菲基选自式II所示取代基：
其中，R1、R2各自独立的选自碳原子数为1～6的烷基，R3选自碳原子数为1～12的亚烷基，R’各自独立的选自羟基、碳原子数为1～6的烷基；n＝1～10；
优选的，所述环戊烷多氢菲基选自式IIA所示取代基：
3.根据权利要求1或2所述的角蛋白肽衍生物，其特征在于，所述角蛋白肽的分子量为300～8000Da。
4.如权利要求1～3任一项所述的角蛋白肽衍生物的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
S1、将R-COOH溶解于反应溶剂中，加入EDC和NHS活化羧基；
S2、加入角蛋白肽，与活化后的羧基进行缩合反应；
S3、提取缩合产物，即得所述角蛋白肽衍生物；
优选的，R-COOH为疏水化合物，优选脱氧胆酸或碳原子数为8～18烷基酸。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，R-COOH与反应溶剂的重量比为1：10～80；
所述反应溶剂优选甲醇、乙醇、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺中的至少一种；
进一步优选的，所述活化羧基的反应温度为15～25℃、反应时间为8～36小时，反应条件为避光反应；
更进一步优选的，R-COOH、EDC和NHS的重量比为1：10～500：20～600。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在S2中，所述角蛋白肽溶解于缓冲溶液中，所述缓冲溶液为柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中的一种；
优选的，所述缩合反应的反应温度为15～25℃、反应时间为4～24小时，反应条件为避光反应。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述提取缩合产物包括：
将所述缩合反应后的产物置于截留分子量为300～14000Da的透析袋中，于去离子水中0～10℃透析3～8天，干燥，得所述角蛋白肽衍生物；
所述干燥优选冷冻干燥、喷雾干燥或减压干燥中的一种。
8.如权利要求1～3任一项所述的角蛋白肽衍生物作为药物载体的应用；
优选的，所述药物载体包括胃肠道给药、眼部给药、皮肤给药、鼻腔粘膜给药、直肠给药或***给药的药物载体。
9.一种采用权利要求1～3任一项所述的角蛋白肽衍生物制备的药物载体，其特征在于，所述药物载体的制备方法为：将所述角蛋白肽衍生物和药物溶于药学上可接受的溶剂，蒸发至形成一层薄膜，所述薄膜干燥后加入水化介质至脱模，得到所述药物载体；
优选的，所述蒸发为旋转蒸发，时间为10～40min，温度为15～25℃，反应条件为避光反应；
更优选的，所述水化介质为缓冲溶液、去离子水或蒸馏水；
进一步优选的，所述药物载体的粒径为5～1000nm。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括药物和药物载体，所述药物载体包括权利要求1～3任一项所述的角蛋白肽衍生物或为权利要求9所述的药物载体；
优选的，所述药物包括化学治疗药物、解热镇痛药、甾体抗炎药、非甾体抗炎药、消化***药物、循环***药物、神经***药物、降血糖药、利尿药和激素类药物中的至少一种，所述化学治疗药物包括抗生素和抗肿瘤药；
所述药物组合物的剂型选自液体剂型、半固体剂型、固体剂型或喷雾剂型，所述液体剂型为胶体液、乳浊液或混悬液，所述半固体剂型为软膏剂、凝胶剂或栓剂。
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