CN112384623A - 用于疏水活性化合物递送的基于蛋白质的胶束 - Google Patents
用于疏水活性化合物递送的基于蛋白质的胶束 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112384623A CN112384623A CN201980045931.4A CN201980045931A CN112384623A CN 112384623 A CN112384623 A CN 112384623A CN 201980045931 A CN201980045931 A CN 201980045931A CN 112384623 A CN112384623 A CN 112384623A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- peptide
- amino acid
- acid sequence
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 title claims abstract description 102
- 239000000693 micelle Substances 0.000 title claims description 184
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 166
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 156
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 326
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 96
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 96
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 30
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 160
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 159
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 151
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 138
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 138
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 134
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 114
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 98
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 76
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 56
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 claims description 47
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 claims description 39
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 claims description 35
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 claims description 35
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 33
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 30
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 claims description 28
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 claims description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 27
- OEANUJAFZLQYOD-CXAZCLJRSA-N (2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-acetamido-3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methoxyoxan-4-yl]oxy-4,5-dihydroxy-3-methoxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](OC)[C@H](C(O)=O)O1 OEANUJAFZLQYOD-CXAZCLJRSA-N 0.000 claims description 21
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 claims description 21
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 claims description 21
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 claims description 21
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 18
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 18
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 16
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 16
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 15
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 15
- TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 1-O-galloyl-3,6-(R)-HHDP-beta-D-glucose Natural products OC1C(O2)COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC1C(O)C2OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229920002786 Corilagin Polymers 0.000 claims description 14
- TUSDEZXZIZRFGC-XIGLUPEJSA-N corilagin Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H]2OC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC[C@@H](O1)[C@H]2O)C(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 TUSDEZXZIZRFGC-XIGLUPEJSA-N 0.000 claims description 14
- CPWYQGWOJMNXGJ-UHFFFAOYSA-N corilagin Natural products OC1C2COC(=O)c3c(O)c(O)c(O)c(O)c3c4c(O)c(O)c(O)c(O)c4C(=O)OC1C(O)C(OC(=O)c5cc(O)c(O)c(O)c5)O2 CPWYQGWOJMNXGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 14
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 13
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 claims description 12
- 102000002669 Small Ubiquitin-Related Modifier Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 108010043401 Small Ubiquitin-Related Modifier Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 11
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 9
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 9
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 claims description 8
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 claims description 8
- 101710199711 Early E1A protein Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims description 8
- 208000001077 Spastic ataxia Diseases 0.000 claims description 8
- 108050008367 Transmembrane emp24 domain-containing protein 7 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000001392 Wiskott Aldrich Syndrome protein Human genes 0.000 claims description 8
- 108010093528 Wiskott Aldrich Syndrome protein Proteins 0.000 claims description 8
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 8
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 8
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- MKSPBYRGLCNGRC-OEMOKZHXSA-N (2s)-2-[[(2s)-1-[(2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s,3r)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound O=C([C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)[C@@H](C)O)CC(C)C)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MKSPBYRGLCNGRC-OEMOKZHXSA-N 0.000 claims description 7
- 101710170225 Antimicrobial peptide 5 Proteins 0.000 claims description 7
- 101710170229 Antimicrobial peptide 7 Proteins 0.000 claims description 7
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 7
- 102400000361 DCD-1 Human genes 0.000 claims description 7
- 101800003946 DCD-1 Proteins 0.000 claims description 7
- 108010033584 FROP-1 peptide Proteins 0.000 claims description 7
- 108010061875 HN-1 peptide Proteins 0.000 claims description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 7
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 7
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims description 7
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 claims description 7
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 7
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 7
- 108010062381 leucyl-threonyl-valyl-seryl-prolyl-tryptophyl-tyrosine Proteins 0.000 claims description 7
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 7
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 claims description 7
- NQUNIMFHIWQQGJ-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-5-thiocyanatobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(SC#N)=CC=C1[N+]([O-])=O NQUNIMFHIWQQGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 6
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims description 6
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 6
- 241001195348 Nusa Species 0.000 claims description 6
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 6
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 claims description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 claims description 6
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 claims description 6
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 claims description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 5
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 claims description 5
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 150000004696 coordination complex Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 4
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 4
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003973 paint Substances 0.000 claims description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 claims 4
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 52
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 36
- 239000005869 Pyraclostrobin Substances 0.000 description 32
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 32
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 29
- HZRSNVGNWUDEFX-UHFFFAOYSA-N pyraclostrobin Chemical compound COC(=O)N(OC)C1=CC=CC=C1COC1=NN(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=C1 HZRSNVGNWUDEFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 22
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 22
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 19
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 15
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 14
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 13
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 description 8
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 8
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 5
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N palladium Substances [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 101000599885 Dictyostelium discoideum Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial Proteins 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- KZPYGQFFRCFCPP-UHFFFAOYSA-N 1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene Chemical compound [Fe+2].C1=CC=C[C-]1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=C[C-]1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 KZPYGQFFRCFCPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001042052 Colwellia maris Isocitrate dehydrogenase [NADP] 2 Proteins 0.000 description 3
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 3
- 108010029660 Intrinsically Disordered Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101100005280 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cat-3 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000235 small-angle X-ray scattering Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 101000999655 Colwellia maris Isocitrate dehydrogenase [NADP] 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 101000960235 Dictyostelium discoideum Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 2
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- -1 cells Chemical class 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- WWYNJERNGUHSAO-XUDSTZEESA-N (+)-Norgestrel Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](CC)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 WWYNJERNGUHSAO-XUDSTZEESA-N 0.000 description 1
- WTJXVDPDEQKTCV-UHFFFAOYSA-N 4,7-bis(dimethylamino)-1,10,11,12a-tetrahydroxy-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide;hydron;chloride Chemical compound Cl.C1C2=C(N(C)C)C=CC(O)=C2C(O)=C2C1CC1C(N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)C1(O)C2=O WTJXVDPDEQKTCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026398 Cyclic AMP-responsive element-binding protein 3 Human genes 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 101000855520 Homo sapiens Cyclic AMP-responsive element-binding protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001024703 Homo sapiens Nck-associated protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 239000002616 MRI contrast agent Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100036946 Nck-associated protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710089395 Oleosin Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000006069 Suzuki reaction reaction Methods 0.000 description 1
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- OZVBMTJYIDMWIL-AYFBDAFISA-N bromocriptine Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@]2(C(=O)N3[C@H](C(N4CCC[C@H]4[C@]3(O)O2)=O)CC(C)C)C(C)C)C2)=C3C2=C(Br)NC3=C1 OZVBMTJYIDMWIL-AYFBDAFISA-N 0.000 description 1
- 229960002802 bromocriptine Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical group 0.000 description 1
- 229960004400 levonorgestrel Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Chemical class 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960002421 minocycline hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003182 parenteral nutrition solution Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- RAPZEAPATHNIPO-UHFFFAOYSA-N risperidone Chemical compound FC1=CC=C2C(C3CCN(CC3)CCC=3C(=O)N4CCCCC4=NC=3C)=NOC2=C1 RAPZEAPATHNIPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001534 risperidone Drugs 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical group 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70567—Nuclear receptors, e.g. retinoic acid receptor [RAR], RXR, nuclear orphan receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
- A01N25/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing liquids as carriers, diluents or solvents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
- A01N47/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having one or more single bonds to nitrogen atoms
- A01N47/10—Carbamic acid derivatives, i.e. containing the group —O—CO—N<; Thio analogues thereof
- A01N47/24—Carbamic acid derivatives, i.e. containing the group —O—CO—N<; Thio analogues thereof containing the groups, or; Thio analogues thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/425—Thiazoles
- A61K31/429—Thiazoles condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/43—Compounds containing 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula, e.g. penicillins, penems
- A61K31/431—Compounds containing 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula, e.g. penicillins, penems containing further heterocyclic rings, e.g. ticarcillin, azlocillin, oxacillin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
- A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
- B01J31/02—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing organic compounds or metal hydrides
- B01J31/06—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing organic compounds or metal hydrides containing polymers
- B01J31/061—Chiral polymers
- B01J31/062—Polymeric amino acids
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
- B01J31/16—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes
- B01J31/22—Organic complexes
- B01J31/2282—Unsaturated compounds used as ligands
- B01J31/2295—Cyclic compounds, e.g. cyclopentadienyls
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
- B01J31/16—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes
- B01J31/24—Phosphines, i.e. phosphorus bonded to only carbon atoms, or to both carbon and hydrogen atoms, including e.g. sp2-hybridised phosphorus compounds such as phosphabenzene, phosphole or anionic phospholide ligands
- B01J31/2404—Cyclic ligands, including e.g. non-condensed polycyclic ligands, the phosphine-P atom being a ring member or a substituent on the ring
- B01J31/2442—Cyclic ligands, including e.g. non-condensed polycyclic ligands, the phosphine-P atom being a ring member or a substituent on the ring comprising condensed ring systems
- B01J31/2447—Cyclic ligands, including e.g. non-condensed polycyclic ligands, the phosphine-P atom being a ring member or a substituent on the ring comprising condensed ring systems and phosphine-P atoms as substituents on a ring of the condensed system or on a further attached ring
- B01J31/2452—Cyclic ligands, including e.g. non-condensed polycyclic ligands, the phosphine-P atom being a ring member or a substituent on the ring comprising condensed ring systems and phosphine-P atoms as substituents on a ring of the condensed system or on a further attached ring with more than one complexing phosphine-P atom
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J35/00—Catalysts, in general, characterised by their form or physical properties
- B01J35/20—Catalysts, in general, characterised by their form or physical properties characterised by their non-solid state
- B01J35/23—Catalysts, in general, characterised by their form or physical properties characterised by their non-solid state in a colloidal state
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
- C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4747—Apoptosis related proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
- C11D3/38636—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing enzymes other than protease, amylase, lipase, cellulase, oxidase or reductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
- C12Y503/03—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing C=C bonds (5.3.3)
- C12Y503/03001—Steroid DELTA-isomerase (5.3.3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2231/00—Catalytic reactions performed with catalysts classified in B01J31/00
- B01J2231/40—Substitution reactions at carbon centres, e.g. C-C or C-X, i.e. carbon-hetero atom, cross-coupling, C-H activation or ring-opening reactions
- B01J2231/42—Catalytic cross-coupling, i.e. connection of previously not connected C-atoms or C- and X-atoms without rearrangement
- B01J2231/4205—C-C cross-coupling, e.g. metal catalyzed or Friedel-Crafts type
- B01J2231/4211—Suzuki-type, i.e. RY + R'B(OR)2, in which R, R' are optionally substituted alkyl, alkenyl, aryl, acyl and Y is the leaving group
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2531/00—Additional information regarding catalytic systems classified in B01J31/00
- B01J2531/80—Complexes comprising metals of Group VIII as the central metal
- B01J2531/82—Metals of the platinum group
- B01J2531/824—Palladium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Immunology (AREA)
- Botany (AREA)
Abstract
一种具有分子式S/I‑X‑H1‑H2的两亲性融合蛋白,其中,S‑为增溶部分,I‑为不溶部分,‑X‑为包括蛋白水解或化学裂解位点的肽序列,‑H1‑为亲水性肽,并且‑H2为疏水性肽。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年7月9日提交的申请号为62/695,474的美国申请的优先权权益,其全部内容被并入本文。
技术领域
本技术总体上涉及与自组装以形成稳定胶束的两亲性蛋白质有关的方法和组合物。这样的两亲性蛋白和相应的胶束可用于递送疏水性化合物以用于多种应用。
背景技术
提供下面的描述以帮助读者理解。所提供的信息或所引用的参考文献均未被认为是本文公开的组合物和方法的现有技术。
与两亲性蛋白的重组表达有关的先前研究主要集中在自然使用自组装蛋白质,诸如向日葵蛋白质油质蛋白,通过亮氨酸拉链蛋白或弹性蛋白样蛋白质(ELP)形成水凝胶,其由序列VPGXG(SEQ ID NO:64)的重复序列组成。虽然这些构建体可以在体内和体外形成各种3D结构,但是它们的功能化能力受到限制,并且严重依赖于天然自组装已知的蛋白质的使用。因此,需要一种更有效且更高效的方法来生产两亲性蛋白质。
发明内容
在一个方面,本公开提供了一种具有式S/I-X-H1-H2的两亲性融合蛋白,其中,S-为增溶部分,I-为不溶部分,-X-为包括蛋白水解或化学裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽。
在一个方面,本公开提供了一种具有式S-X-H1-H2的两亲性融合蛋白,其中,S-为增溶部分,-X-为包括蛋白水解裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽。
在一个方面,本公开提供了一种具有式I-X-H1-H2的两亲性融合蛋白,其中,I-为不溶部分,-X-为包括化学裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽。
在一些实施方案中,所述-H1-包括固有无序的肽(IDP)序列。在一些实施方案中,所述IDP序列包括来自以下各项中的一种或多种多肽序列:人类神经丝蛋白、San1蛋白、Hsp-33蛋白、E1A蛋白、PhD蛋白、Sic1蛋白、WASP蛋白、p27蛋白、CREB蛋白、PUP蛋白或LEA蛋白。在一些实施方案中,所述IDP包括人类神经丝多肽序列。在一些实施方案中,所述人类神经丝多肽序列包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,本技术的IDP包括SEQ ID NO:69所示的人类神经丝多肽序列或其片段。在一些实施方案中,所述IDP包括序列(SPAEAK)n(SEQ ID NO:3)的重复序列或序列(SPAEAR)n(SEQ ID NO:4)的重复序列,其中,n是从2到50的整数。在一些实施方案中,所述IDP包括序列(SPAX1AX2)n(SEQ ID NO:53)的重复序列,其中,X1和X2各自为任何带电荷的氨基酸,并且n为从2到50的整数。
在一些实施方案中,所述-H2包括疏水性多肽序列,所述疏水性多肽序列包括富含酪氨酸的氨基酸序列,其长度为5-20个残基。在一些实施方案中,所述-H2包括选自由以下各项组成的组的疏水性多肽序列:YGAYAQYVYIYAYWYL(SEQ ID NO:5);YGAYAQYVYIYAYWYLYAYI(SEQ ID NO:6);YGAYAQYVYIYAYWYLYAYIAVAL(SEQ ID NO:54);WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(SEQ ID NO:7);YWCCA(X)a(SEQ ID NO:8),其中,a为任何疏水残基(X)的数目;YWXXVbAb(SEQ ID NO:9),其中,b为3或更大的整数,并且X为任何疏水残基;和YWA(X)c(SEQ ID NO:10),其中,c是任何疏水残基(X)的数目。
在一些实施方案中,所述S-包括以下各项中的一项或多项:麦芽糖结合蛋白(MBP)多肽序列、小泛素样修饰物(SUMO)多肽序列、谷胱甘肽S-转移酶(GST)多肽序列、SlyD多肽序列、NusA多肽序列、硫氧还蛋白多肽序列、泛素多肽序列或T7基因10多肽序列。在一些实施方案中,所述S-还包括多组氨酸标签(His标签)。在一些实施方案中,所述S-包括MBP多肽序列。在一些实施方案中,所述S-包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述-X-包括选自以下各项中的蛋白水解裂解位点:凝血酶裂解位点、烟草蚀纹病毒(TEV)裂解位点、3C裂解位点、肠激酶裂解位点或Xa因子裂解位点。在一些实施方案中,所述蛋白水解裂解位点为包括多肽序列LVPR(SEQ ID NO:13)的凝血酶裂解位点。
在一些实施方案中,所述I-包括酮类固醇异构酶多肽序列。在一些实施方案中,所述I-包括SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述-X-包括选自以下各项中的化学裂解位点:在蛋氨酸残基处裂解的CNBr裂解位点;或在半胱氨酸残基处裂解的2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸裂解位点。
在一些实施方案中,所述融合蛋白还包括在所述-X-和所述-H1-之间的细胞靶向肽(-T-),使得所述两亲性融合蛋白具有式S/I-X-T-H1-H2。在一些实施方案中,所述融合蛋白还包括在所述-X-和所述-H1-之间的细胞靶向肽(-T-),使得所述两亲性融合蛋白具有式S-X-T-H1-H2。在一些实施方案中,所述融合蛋白还包括在所述-X-和所述-H1-之间的细胞靶向肽(-T-),使得所述两亲性融合蛋白具有式I-X-T-H1-H2。在一些实施方案中,所述-T-选自由以下各项组成的组:几丁质结合域(CBD)、癌细胞靶向肽和抗菌肽。在一些实施方案中,所述-T-是选自由以下各项组成的组的癌细胞靶向肽:靶向人类头部和颈部实体瘤并且具有氨基酸序列TSPLNIHNGQKL(SEQ ID NO:18)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列CGKRK(SEQ ID NO:19)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列CGNKRTRGC(SEQ ID NO:20)的肽;靶向***脉管***并且具有氨基酸序列SMSIARL(SEQ ID NO:21)的肽;靶向肝细胞癌细胞并且具有氨基酸序列FQHPSFI(SEQ ID NO:22)的肽;靶向整联蛋白受体并且具有氨基酸序列RGD(SEQ ID NO:23)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列NGR(SEQ IDNO:24)的肽;靶向内皮VCAM-1表达细胞并且具有氨基酸序列VHSPNKK(SEQ ID NO:25)的肽;靶向腺癌细胞并且具有氨基酸序列RRPYIL(SEQ ID NO:26)的肽;靶向各种癌症并且具有氨基酸序列EDYELMDLLAYL(SEQ ID NO:27)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列LTVSPWY(SEQ ID NO:28)的肽;以及靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列ATWLPPR(SEQ ID NO:29)的肽。在一些实施方案中,所述-T-是选自由以下各项组成的组的抗菌肽:皮离蛋白、蜜蜂抗菌肽、牛抗菌肽和红蝽素(pyrrhocoricin)。在一些实施方案中,所述皮离蛋白是选自由以下各项组成的组的皮离蛋白变体:包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSVL(SEQ ID NO:30)的DCD-1L;包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSV(SEQ ID NO:31)的DCD-1;以及包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDA(SEQ ID NO:32)的SSL25。在一些实施方案中,所述蜜蜂抗菌肽包括氨基酸序列GNNRP(V/I)YIPQPRPPHPR(L/I)(SEQ ID NO:33)。在一些实施方案中,所述牛抗菌肽为牛抗菌肽5(Bac 5)或牛抗菌肽7(Bac 7)。在一些实施方案中,所述红蝽素包括氨基酸序列VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN(SEQ ID NO:34)。
在一些实施方案中,所述-H1-H2包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列:SEQID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57。
在一个方面,本公开提供了一种表达载体,其包括对具有式S/I-X-H1-H2的两亲性融合蛋白进行编码的嵌合核酸序列,其中,S-为增溶部分,I-为不溶部分,-X-为包括蛋白水解或化学裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽。在一个方面,本公开提供了一种表达载体,其包括对具有式S-X-H1-H2的两亲性融合蛋白进行编码的嵌合核酸序列,其中,S-为增溶部分,-X-为包括蛋白水解裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽。在一个方面,本公开提供了一种表达载体,其包括对具有式I-X-H1-H2的两亲性融合蛋白进行编码的嵌合核酸序列,其中,I-为不溶部分,-X-为包括化学裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽。
在一个方面,本公开提供了一种重组宿主细胞,其被工程改造为表达具有式S/I-X-H1-H2的两亲性融合蛋白,其中,S-为增溶部分,I-为不溶部分,-X-为包括蛋白水解或化学裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽,其中,所述宿主细胞是真核细胞、原核细胞、古细菌细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、蓝藻细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一个方面,本公开提供了一种重组宿主细胞,其被工程改造为表达具有式S-X-H1-H2的两亲性融合蛋白,其中,S-为增溶部分,-X-为包括蛋白水解裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽,其中,所述宿主细胞是真核细胞、原核细胞、古细菌细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、蓝藻细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一个方面,本公开提供了一种重组宿主细胞,其被工程改造为表达具有式I-X-H1-H2的两亲性融合蛋白,其中,I-为不溶部分,-X-为包括化学裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽,其中,所述宿主细胞是真核细胞、原核细胞、古细菌细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、蓝藻细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一些实施方案中,所述细菌细胞是大肠杆菌。
在一个方面,本公开提供了一种产生自发自组装以形成稳定胶束的两亲性融合蛋白的方法,所述方法包括:(a)将包括嵌合核酸构建体的表达载体引入宿主细胞,所述嵌合核酸构建体包括在5'至3'方向上的启动子,所述启动子适于引导在宿主细胞中的表达,所述宿主细胞可操作地连接至对两亲性融合蛋白进行编码的核酸序列,所述两亲性融合蛋白具有式(I):S/I-X-H1-H2,其中,S-为增溶部分,I-为不溶部分,-X-为包括蛋白水解或化学裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽;(b)在允许表达所述嵌合核酸以产生所述两亲性融合蛋白的条件下培养所述宿主细胞;(c)纯化所述两亲性融合蛋白;以及(d)使所述两亲性融合蛋白与蛋白酶或试剂接触以诱导化学裂解,从而提供具有式(II):H1-H2的两亲性融合蛋白。
在所述方法的一些实施方案中,部分(a)的所述嵌合核酸构建体编码两亲性融合蛋白,所述两亲性融合蛋白还包括在所述-X-和所述-H1-之间的细胞靶向肽(-T-),使得所述两亲性融合蛋白具有式(III):S/I-X-T-H1-H2,并且使得在部分(d)之后,所述两亲性融合蛋白具有式(IV):T-H1-H2。
在所述方法的一些实施方案中,所述-H1-包括固有无序的肽(IDP)序列。在一些实施方案中,所述IDP序列包括来自以下各项中的一种或多种多肽序列:人类神经丝蛋白、San1蛋白、Hsp-33蛋白、E1A蛋白、PhD蛋白、Sic1蛋白、WASP蛋白、p27蛋白、CREB蛋白、PUP蛋白或LEA蛋白。在一些实施方案中,所述IDP包括人类神经丝多肽序列。在一些实施方案中,所述人类神经丝多肽序列包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,本技术的IDP包括SEQ ID NO:69所示的人类神经丝多肽序列或其片段。在一些实施方案中,所述IDP包括序列(SPAEAK)n(SEQ ID NO:3)的重复序列或序列(SPAEAR)n(SEQ ID NO:4)的重复序列,其中,n是从2到50的整数。在一些实施方案中,所述IDP包括序列(SPAX1AX2)n(SEQ IDNO:53)的重复序列,其中,X1和X2各自为任何带电荷的氨基酸,并且n为从2到50的整数。
在所述方法的一些实施方案中,所述-H2包括疏水性多肽序列,所述疏水性多肽序列包括富含酪氨酸的氨基酸序列,其长度为5-20个残基。在一些实施方案中,所述-H2包括选自由以下各项组成的组的疏水性多肽序列:YGAYAQYVYIYAYWYL(SEQ ID NO:5);YGAYAQYVYIYAYWYLYAYI(SEQ ID NO:6);YGAYAQYVYIYAYWYLYAYIAVAL(SEQ ID NO:54);WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(SEQ ID NO:7);YWCCA(X)a(SEQ ID NO:8),其中,a为任何疏水残基(X)的数目;YWXXVbAb(SEQ ID NO:9),其中,b为3或更大的整数,并且X为任何疏水残基;和YWA(X)c(SEQ ID NO:10),其中,c是任何疏水残基(X)的数目。
在所述方法的一些实施方案中,所述S-包括以下各项中的一项或多项:麦芽糖结合蛋白(MBP)多肽序列、小泛素样修饰物(SUMO)多肽序列、谷胱甘肽S-转移酶(GST)多肽序列、SlyD多肽序列、NusA多肽序列、硫氧还蛋白多肽序列、泛素多肽序列或T7基因10多肽序列。在一些实施方案中,所述S-还包括多组氨酸标签(His标签)。在一些实施方案中,所述S-包括MBP多肽序列。在一些实施方案中,所述S-包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在所述方法的一些实施方案中,所述-X-包括选自以下各项中的蛋白水解裂解位点:凝血酶裂解位点、烟草蚀纹病毒(TEV)裂解位点、3C裂解位点、肠激酶裂解位点或Xa因子裂解位点。在一些实施方案中,所述蛋白水解裂解位点为包括多肽序列LVPR(SEQ ID NO:13)的凝血酶裂解位点。
在一些实施方案中,所述I-包括酮类固醇异构酶多肽序列。在一些实施方案中,所述I-包括SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述-X-包括选自以下各项中的化学裂解位点:在蛋氨酸残基处裂解的CNBr裂解位点;或在半胱氨酸残基处裂解的2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸裂解位点。
在所述方法的一些实施方案中,所述-T-选自由以下各项组成的组:几丁质结合域(CBD)、癌细胞靶向肽和抗菌肽。在一些实施方案中,所述-T-是选自由以下各项组成的组的癌细胞靶向肽:靶向人类头部和颈部实体瘤并且具有氨基酸序列TSPLNIHNGQKL(SEQ IDNO:18)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列CGKRK(SEQ ID NO:19)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列CGNKRTRGC(SEQ ID NO:20)的肽;靶向***脉管***并且具有氨基酸序列SMSIARL(SEQ ID NO:21)的肽;靶向肝细胞癌细胞并且具有氨基酸序列FQHPSFI(SEQ ID NO:22)的肽;靶向整联蛋白受体并且具有氨基酸序列RGD(SEQ ID NO:23)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列NGR(SEQ ID NO:24)的肽;靶向内皮VCAM-1表达细胞并且具有氨基酸序列VHSPNKK(SEQ ID NO:25)的肽;靶向腺癌细胞并且具有氨基酸序列RRPYIL(SEQ ID NO:26)的肽;靶向各种癌症并且具有氨基酸序列EDYELMDLLAYL(SEQ IDNO:27)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列LTVSPWY(SEQ ID NO:28)的肽;以及靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列ATWLPPR(SEQ ID NO:29)的肽。在一些实施方案中,所述-T-是选自由以下各项组成的组的抗菌肽:皮离蛋白、蜜蜂抗菌肽、牛抗菌肽和红蝽素。在一些实施方案中,所述皮离蛋白是选自由以下各项组成的组的皮离蛋白变体:包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSVL(SEQ ID NO:30)的DCD-1L;包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSV(SEQ ID NO:31)的DCD-1;以及包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDA(SEQ ID NO:32)的SSL25。在一些实施方案中,所述蜜蜂抗菌肽包括氨基酸序列GNNRP(V/I)YIPQPRPPHPR(L/I)(SEQ ID NO:33)。在一些实施方案中,所述牛抗菌肽为牛抗菌肽5(Bac 5)或牛抗菌肽7(Bac 7)。在一些实施方案中,所述红蝽素包括氨基酸序列VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN(SEQ ID NO:34)。
在一些实施方案中,所述-H1-H2包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列:SEQID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57。
在一个方面,本公开提供了一种包括两亲性融合蛋白的胶束,其包括:(i)亲水性肽(H1);和(ii)疏水性肽(H2)。
在一些实施方案中,所述H1包括固有无序的肽(IDP)序列。在一些实施方案中,所述IDP序列包括来自以下各项中的一种或多种多肽序列:人类神经丝蛋白、San1蛋白、Hsp-33蛋白、E1A蛋白、PhD蛋白、Sic1蛋白、WASP蛋白、p27蛋白、CREB蛋白、PUP蛋白或LEA蛋白。在一些实施方案中,所述IDP包括人类神经丝多肽序列。在一些实施方案中,所述人类神经丝多肽序列包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,本技术的IDP包括SEQID NO:69所示的人类神经丝多肽序列或其片段。在一些实施方案中,所述IDP包括序列(SPAEAK)n(SEQ ID NO:3)的重复序列或序列(SPAEAR)n(SEQ ID NO:4)的重复序列,其中,n是从2到50的整数。在一些实施方案中,所述IDP包括序列(SPAX1AX2)n(SEQ ID NO:53)的重复序列,其中,X1和X2各自为任何带电荷的氨基酸,并且n为从2到50的整数。
在一些实施方案中,所述H2包括疏水性多肽序列,所述疏水性多肽序列包括富含酪氨酸的氨基酸序列,其长度为5-20个残基。在一些实施方案中,所述H2包括选自由以下各项组成的组的疏水性多肽序列:YGAYAQYVYIYAYWYL(SEQ ID NO:5);YGAYAQYVYIYAYWYLYAYI(SEQ ID NO:6);WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(SEQ ID NO:7);YWCCA(X)a(SEQ IDNO:8),其中,a为任何疏水残基(X)的数目;YWXXVbAb(SEQ ID NO:9),其中,b为3或更大的整数,并且X为任何疏水残基;和YWA(X)c(SEQ ID NO:10),其中,c是任何疏水残基(X)的数目。
在一些实施方案中,所述两亲性融合蛋白还包括与所述H1的N端共价连接的细胞靶向肽(T)。在一些实施方案中,所述T选自由以下各项组成的组:几丁质结合域(CBD)、癌细胞靶向肽和抗菌肽。在一些实施方案中,所述癌细胞靶向肽选自由以下各项组成的组:靶向人类头部和颈部实体瘤并且具有氨基酸序列TSPLNIHNGQKL(SEQ ID NO:18)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列CGKRK(SEQ ID NO:19)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列CGNKRTRGC(SEQ ID NO:20)的肽;靶向***脉管***并且具有氨基酸序列SMSIARL(SEQ ID NO:21)的肽;靶向肝细胞癌细胞并且具有氨基酸序列FQHPSFI(SEQ ID NO:22)的肽;靶向整联蛋白受体并且具有氨基酸序列RGD(SEQ ID NO:23)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列NGR(SEQ ID NO:24)的肽;靶向内皮VCAM-1表达细胞并且具有氨基酸序列VHSPNKK(SEQ ID NO:25)的肽;靶向腺癌细胞并且具有氨基酸序列RRPYIL(SEQ ID NO:26)的肽;靶向各种癌症并且具有氨基酸序列EDYELMDLLAYL(SEQ ID NO:27)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列LTVSPWY(SEQ ID NO:28)的肽;以及靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列ATWLPPR(SEQ ID NO:29)的肽。在一些实施方案中,所述T是选自由以下各项组成的组的抗菌肽:皮离蛋白、蜜蜂抗菌肽、牛抗菌肽和红蝽素。在一些实施方案中,所述皮离蛋白是选自由以下各项组成的组的皮离蛋白变体:包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSVL(SEQ ID NO:30)的DCD-1L;包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSV(SEQ ID NO:31)的DCD-1;以及包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDA(SEQ ID NO:32)的SSL25。在一些实施方案中,所述蜜蜂抗菌肽包括氨基酸序列GNNRP(V/I)YIPQPRPPHPR(L/I)(SEQ ID NO:33)。在一些实施方案中,所述牛抗菌肽为牛抗菌肽5(Bac 5)或牛抗菌肽7(Bac 7)。在一些实施方案中,所述红蝽素包括氨基酸序列VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN(SEQ ID NO:34)。
在一些实施方案中,所述两亲性融合蛋白在水中的临界胶束浓度(CMC)在约7.4的生理pH下为约10μM至约20μM。
在一些实施方案中,所述胶束的直径为约20nm至约40nm。在一些实施方案中,所述胶束的直径为约27nm。
在一些实施方案中,所述胶束在约2.0至约10.0的pH下是稳定的。
在一些实施方案中,所述胶束在约25℃至约70℃的温度下是稳定的。
在一些实施方案中,所述胶束还包括荧光染料。在一些实施方案中,所述荧光染料共价附接至所述亲水性肽(H1)。在一些实施方案中,所述荧光染料共价附接至所述疏水性肽(H2)。在一些实施方案中,所述荧光染料是荧光素或若丹明。
在一些实施方案中,所述胶束具有核-壳结构。在一些实施方案中,所述胶束的壳直径为约40nm至约75nm。在一些实施方案中,所述胶束的核直径为约25nm至约45nm。在一些实施方案中,所述胶束的壳厚度为约5nm至约20nm。
在一些实施方案中,所述胶束还包括疏水性货物。在一些实施方案中,所述疏水性货物是药物、杀真菌剂、蛋白质、核酸、激素、受体、诊断剂、显像剂、金属络合物、硅油、甘油三酯或其组合。
在一些实施方案中,包括H1和H2的所述两亲性融合蛋白包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57。
在一个方面,本公开提供了一种药物组合物,其包括本技术的胶束和疏水性货物,其中,所述疏水性货物为治疗活性剂。
在一个方面,本公开提供了一种用于对有需要的受试者治疗疾病或病症的方法,包括对所述受试者施用所述药物组合物。
在一个方面,本公开提供了一种包括本技术的胶束的组合物,其适用于药物递送、化妆品、油漆和涂料、作物保护、纳米颗粒合成和催化、家庭和个人护理以及清洁。
附图说明
图1示出了本文所述的三种构建体的疏水性图。红色值对应于蛋白质序列中被分配为负值或亲水值的区域,而蓝色值对应于疏水性区域。直到C端区域为止,这3种蛋白质的序列都是相同的,在其中每个区域都已被修饰以包括带有增加的疏水部分的附件。
图2A和2B。图2A示出了在不同IPTG诱导条件和20或6小时时间点对NiNTA纯化的2Yx2A-MBP蛋白进行的4-12%Bis-Tris SDS PAGE凝胶分析。所有培养物均在16℃下表达。从右到左的泳道:MW梯子,20h 0.5mM IPTG,20h 0.2mM IPTG,20h 0.1mM IPTG,6h 0.5mMIPTG,6h 0.2mM IPTG,6h 0.1mM IPTG。图2B示出了NiNTA纯化构建体的最严格表达条件:6h0.1mM IPTG的LC-MS(ESI-TOF)分析。减少IPTG的表达时间和数量可减少蛋白质产量,但可提高蛋白质纯度。预期分子量(具有N端Met裂解):63604.62,观察到:63605。
图3A-3D。图3A示出了离子交换纯化2Yx2A的4-12%Bis-Tris SDS PAGE凝胶分析(在ImageJ中通过凝胶密度测定法分析纯度为75%)。图3B示出了Biotage HPLC纯化的2Yx2A的4-12%Bis-Tris SDS PAGE凝胶分析,示出了一条对应于2Yx2A单体的条带,同时还出现了一条不沿凝胶向下移动的大条带,对应于未在PAGE凝胶上分解的组装蛋白(在ImageJ中通过光度法分析纯度大于95%)。在两种凝胶中2Yx2A复合物均以较高的表观分子量运行,IDP构建体也观察到了这种现象,这很可能是由于其无序的性质引起的。图3C示出了在多孔壳柱上从MBP纯化2Yx2A。2Yx2A在8.2分钟时洗脱,而MBP在10分钟时洗脱。由于与MBP的相互作用,少量的2Yx2A也可能在9分钟左右洗脱出来。仅收集纯部分,以实现更高的通量纯化,在Biotage HPLC装置上使用C18 Biotage SNAP Bio 300A。图3D示出了离子交换纯化和HPLC纯化2Yx2A的LC-MS(ESI-TOF)分析。预期的单体的分子量:18290.69。对于离子交换纯化蛋白,70%作为单体(18291Da)、10%作为二聚体(36580Da)和通过MBP的19%杂质(45332Da)存在。对于Biotage HPLC纯化蛋白,76%作为单体(在缓冲液中在+76:18367Da下半胱氨酸残基被过量的B-巯基乙醇封端)、23%作为二聚体(36580Da)和通过MBP的0%杂质(45332Da)存在。
图4A-4C。图4A是一张照片,示出了在细胞裂解、超声处理和过滤后,2Yx3A-MBP粗蛋白混合物呈肥皂泡沫状。图4B是一张照片,示出了在NiNTA纯化2Yx3A-MBP构建体后,蛋白质混合物仍然呈肥皂泡沫状。图4C上图:NiNTA纯化的2Yx3A-MBP的LC-MS(ESI-TOF)分析显示,含有截短的2Yx3A-MBP蛋白的不纯混合物,其中所需的构建体的纯度为88%。预期分子量2Yx3A-MBP:64115.21或64191.21(在缓冲液+76中半胱氨酸残基被过量的B-巯基乙醇封端)。观察到的分子量64193。图4C中间图:凝血酶裂解后直接对2Yx3A+MBP进行LC-MS(ESI-TOF)分析。观察到对应于MBP:45332以及2Yx3A单体:18802,二聚体:37602和三聚体:56401的分子量,表明该构建体即使在存在可溶MBP的情况下也具有很高的组装倾向,即使在LC-过程中也保持接触MS TOF分析。图4C下图:离子交换纯化的2Yx3A。由于该构建体甚至在存在MBP的情况下也具有组装能力,因此从MBP纯化构建体成为一项挑战。单体的预期分子量:18801.28或18877.26(+B-巯基乙醇)。对于离子交换,纯化的蛋白质存在19%作为单体:18802+18878,18%作为二聚体:37601,以及63%的MBP杂质:45333。
图5A-5C。两亲性蛋白构建体的设计。图5A:固有无序的蛋白质(IDP)区段与疏水序列融合。MBP蛋白裂解后,两亲部分自组装。图5B:示出了在MBP区域裂解之后的设计的序列的疏水性图。这些值来自Kyte-Doolittle疏水性标度,窗口大小为9。大于0的值表示疏水区域,而小于零的值表示亲水区域。这些图是使用Expasy ProtScale工具(web.expasy.org/protscale)生成的。图5C:示出了该报告中使用的构建体的特定疏水序列区域。示出了IDP(YWCA)(SEQ ID NO:65)的c端残基,并且疏水性延伸部分用下划线标出(SEQ ID NO:65、66、67和68按出现顺序)。
图6是示出IDP(在pH 5.3的磷酸盐缓冲液中为2μM)和2Yx2A构建体(在pH 5.3的100mM磷酸盐缓冲液中为40μM)的DLS测量的图。平均直径的数量%IDP:11.25±0.80nm和2Yx2A:27.02±1.06nm。
图7A和7B是示出本技术的2Yx2A构建体的pH稳定性的图。图7A是示出在pH值为3.7-9.7且缓冲液浓度为0-200mM的磷酸盐缓冲液中重悬至浓度为40μM的冻干的2Yx2A蛋白的DLS测量结果的图。在所有pH和缓冲液浓度(186个测量值)下,平均直径为26.17+/-4.28nm。图7B是总结来自图7A的DLS测量值的图表。没有观察到明显的pH依赖性。似乎在某些pH值(例如pH 9.7)下,磷酸盐缓冲液的增加会导致尺寸增加,而其他pH值(7.2和7.9)在较高的磷酸钾条件下似乎会崩溃。有趣的是,在低pH值下,未观察到磷酸钾缓冲液添加的依赖性。
图8是示出2Yx2A胶束大小与1x PBS pH 7.4和100mM PB pH 5.3中的浓度的相关性。随着蛋白质浓度的降低,通过DLS观察到平均大小的增加。此外,每个测量组的标准偏差随着浓度的降低而增加,表明样品的多分散性更高。在蛋白质浓度高于10μM的1xPBS中,观察到较低的标准偏差,其直径根据在较高浓度下(平均10和30μM样品28.86±3.37nm)所见的。当将数据拟合到对数图时,可以用0.92的R2计算得出EC50值为3.5μM。当在100mM PB pH5.7中放置2Yx2A时,形成低多分散性且平均直径接近27nm的胶束的浓度明显低于在pH值为7.4的1xPBS中的浓度。当将数据拟合到对数图时,可以用0.84的R2计算得出EC50值为0.0035μM。这些趋势紧密反映了由芘荧光测定法确定的CMC的趋势。
图9A和9B是示出温度对2Yx2A胶束直径的影响的图。图9A是示出随着温度升高,在100mM PB pH 5.3中40μM 2Yx2A的DLS测量结果的图表。随着温度升高,2Yx2A胶束的平均直径减小。另外,误差线随着温度的升高而变小。25℃时的直径:27.02±1.06nm 70℃时的直径:16.5±0.49nm。图9B是一个图表,示出了将样品加热到70℃之后,将其冷却至室温,并在25℃下1周后再次进行分析,此时,该样品恢复到其被加热之前所观察到的较大直径。加热前的平均直径(蓝色):27.02±1.06nm,加热后的平均直径(红色):33.99±1.50nm。
图10是一个图表,示出了病毒样粒子MS2(已知直径27nm),IDP和2Yx2A胶束的尺寸排阻色谱法LS9的痕量。2Yx2A胶束的主峰与MS2的主峰重叠,进一步支持了DLS测量报告的27.73nm直径。在DLS上显示11.25nm直径的IDP也较晚洗脱,表明尺寸较小。痕量已归一化至最大峰高;但是,应该指出的是,IDP的LS90迹线的强度非常低,反映了单体蛋白的预期值。
图11A和11B是示出在不同的芘浓度用芘培育的2Yx2A的荧光发射光谱的图。图11A示出了在100mM PB pH 5.7中用2μM芘培育的2Yx2A的荧光发射光谱。当蛋白质浓度从100μM降低到0μM时,观察到芘的第三振动带强度降低,这表明随着蛋白质浓度的降低,芘处于越来越亲水的环境中。图11B示出了芘的第一振动带在约372nm处,但在疏水环境中经历了红移。第三振动带出现在383nm。另外,当存在于394nm附近的疏水环境时,芘的第五振动带也经历红移。
图12是一个图表,示出了当绘制芘发射的第一和第三振动带的比率相对于2Yx2A和IDP蛋白浓度时,对于2Yx2A观察到的玻耳兹曼关系,其中,EC50被计算为27.6μM,同时观察到芘的包封和I3带形成低至10μM。这表明2Yx2A胶束的CMC在低μM范围内,与图8的DLS结果一致,其中,当在1xPBS中时,观察到尺寸和多分散度增加到10μM以下。或者,当在100mM PBpH 5.7中(如我们的DLS分析所示)更稳定的pH时,EC50值降至12.96μM。此外,当对IDP进行相同的分析时,未观察到对浓度的依赖性,I1/I3比率在0-100μM之间保持恒定。由于这些颗粒的CMC低(低μM范围),芘测定法只能为CMC的检测提供上限。该数据应与DLS数据(图8)以及通过冷沉淀TEM在0.4μM处形成胶束的实验证据(图15)结合起来进行检查。
图13示出了用若丹明红染料(上图)或荧光素染料(下图)标记4%的2Yx2A蛋白。
图14A和14B是示出2Yx2A的FRET分析的图。图14A是当用490nm光激发时对2Yx2A的FRET分析,在515nm处观察到荧光素的发射,而在580nm处观察到罗丹明的发射。由于当用490nm的光激发时仅在580nm处的2Yx2A-RhoRed络合物观察到少量荧光,因此将时间点零作为第二条迹线1:1FITC-2Yx2A:RhoRED-2Yx2A用于动力学测量。图14B是一个图表,表明可以将I580/(I580+I515)定义的FRET比相对于时间绘制并拟合到对数方程。75分钟后,在1xPBS中达到50%的胶束混合,表明本技术的胶束本质上是动态的。
图15为示出在100mM PB pH 5.3中的4μM2Yx2A胶束的冷沉淀TEM的照片。平均胶束大小为50.46±12.14nm。胶束大小可与分析前48.43±10.62nm的DLS相比。在某些胶束中可以观察到核-壳结构,这可能概述了堆积的胶束内部与固有无序的亲水壳之间的过渡。
图16是示出10个胶束的核-壳直径的图。随着核尺寸的增加,外壳尺寸也增加。这些胶束的厚度(定义为单个胶束核与壳之间的距离)平均为12.23±3.95nm,接近构建体的固有无序的亲水性区域的预期长度。DLS测得的IDP:11.25±0.80nm。
图17A和17B是示出2Yx2A的Rg和P(r)分布的图。图17A是示出在100mM PB pH 5.7中的68和34μM 2Yx2A和在1xPBS中的32μM 2Yx2A的SAXS散射曲线的图表。曲线的拟合用于确定实际空间Rg和P(r)分布。图17B是示出P(r)分布拟合的结果的图。所有这三个曲线看起来都非常相似,导致实际空间的Rg值都约为10nm。Rg/Rh可以洞察特定样品的结构特性,例如,值0.775表示硬球形,而较大的数字表示非球形和细长样品。从DLS测量获得的Rh为13.08nm,Rg/Rh比为0.76,与堆积的球形胶束一致。此外,可以确定三个样品的平均半径,它们都显示出10至15nm之间的最大概率,并在320nm附近变为零概率(dmax)。
图18A和18B示出了用于确定封装在2Yx2A蛋白中的唑菌胺酯(pyraclostrostrobin)的数量的相应HPLC分析。图18A示出了使用乙腈中已知的芘浓度绘制的校正曲线。图18B示出了对注入到HPLC上的已知量的蛋白质-唑菌胺酯溶液的HPLC分析。根据芘峰值和体积的面积,可以确定注入的摩尔数以及因此唑菌胺酯的浓度。使用这种方法(其中唑菌胺酯被直接添加到2Yx2A),7.37μM唑菌胺酯被包封在11μM的蛋白质中。
图19是示出在存在和不存在2Yx2A蛋白的样品中唑菌胺酯的摩尔数的比较的图。对于含2Yx2A的样品,冻干蛋白已用唑菌胺酯重新悬浮在10μL THF中,然后用40μL 100mMPB pH 5.7稀释至3μM的最终浓度。由HPLC校准曲线确定唑菌胺酯和2Yx2A的摩尔数。重悬于2Yx2A的唑菌胺酯导致HPLC上平均注入0.63nmol唑菌胺酯,而重悬浮于水中的唑菌胺酯导致HPLC上注入0.03nmol唑菌胺酯。对于含2Yx2A的样品,测定的唑菌胺酯:2Yx2A蛋白单体的平均摩尔比为15.2±8:1。
图20A和20B是照片,其示出了装载有Pd(dppf)Cl2的2Yx2A胶束的未染色TEM图像。使用ImageJ分析了4000多个颗粒,平均直径为14.9±8nm。
图21示出了通过离心纯化的KSI-IDP-2Yx2A蛋白的SDS PAGE。细胞裂解后,KSI-IDP-2Yx2A蛋白以相对纯的形式存在于不溶部分中。仅使用离心作为纯化方式,该凝胶表明KSI-IDP-2Yx2A蛋白是不溶部分中的主要物质。
图22示出了通过离心纯化的KSI-IDP-2Yx2A蛋白的LCMS分析。细胞裂解后,KSI-IDP-2Yx2A蛋白以相对纯的形式存在于不溶部分中。仅使用离心作为纯化方式,LCMS分析表明,KSI-IDP-2Yx2A蛋白是不溶部分中的主要种类,预期分子量为32328.60Da,观察到的分子量为:32328Da。
图23示出了CNBr裂解的KSI-IDP-2Yx2A的LCMS分析。经CNBr裂解过夜后,未观察到对应于KSI-IDP-2Yx2A(32328Da)的原始质量。观察到对应于IDP-2Yx2A(17631Da)及其二聚体(35259Da)的预期分子量(17631.04Da)的质量。
具体实施方式
应当理解的是,下文以不同的详细程度来描述本技术的某些方面、模式、实施方案、变型和特征,以便于实质理解本技术。下面提供了本说明书中使用的某些术语的定义。除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语通常具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
I.定义
本文使用的下列术语,提供了其定义以用于引导。
如本文所使用的,除非明确指出仅表示单数,否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述”均表示单数和复数。
术语“约”和范围的一般使用,无论是否由术语“约”限定,是指在不脱离本技术的范围的情况下,所理解的数字不限于本文所述的确切数字,并且旨在指代基本上在所引用的范围内的范围。如本文所使用,“约”将为所属领域的一般技术人员所理解,并且在某种程度上将根据使用其的上下文而变化。如果术语的使用在其使用的上下文中对所属领域的一般技术人员而言并不明确,则“约”将意指特定术语的最多加或减10%。
当在治疗和诊断用途的上下文中使用时,术语“施用的”或“施用”是指并包括将本文所述的选定量的胶束引入体内或体外环境中,以用于例如将治疗剂输送到目标部位的目的。施用可以通过任何合适的途径进行,包括但不限于静脉内、肌内、腹膜内、皮下和本文所述的其他合适途径。施用包括自我施用和他人施用。
如本文所用,“两亲性融合蛋白”是指通过平移序列的来自两个或多个不同的基因的接合创建以创建一个连续混合或包括转译融合与亲水性结构域的疏水结构域的嵌合蛋白分子的蛋白质。本技术的两亲性融合蛋白还可在与疏水域的转译融合中包括增溶域和蛋白水解裂解位点。在一些实施方案中,本技术的两亲性融合蛋白还包括与疏水域转译融合的细胞靶向肽。在一些实施方案中,“两亲性融合蛋白”是指包括两亲性融合蛋白的胶束。
术语“细胞靶向肽”指的是本领域中常规使用的识别和结合特定的细胞和组织的肽。在一些实施方案中,可以将形成稳定胶束的本技术的两亲性融合肽缀合至一种或多种细胞靶向肽,以实现将试剂或疏水性货物靶向递送至特定细胞和组织。
“嵌合核酸”包括与核苷酸序列连接的编码序列或其片段,该核苷酸序列不同于在天然存在该编码序列的细胞中与之相关的核苷酸序列。
如本文所用,术语“有效量”或“治疗有效量”或“药物有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防作用的量,例如引起对疾病、病症和/或症状的预防。在治疗或预防应用的情况下,给予对象的组合物的量将取决于疾病的类型和严重性以及个体的特征,例如总体健康状况、年龄、性别、体重和对组合物药物的耐受性。它还取决于疾病或状况的程度、严重性和类型。技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。在一些实施方案中,给予多次剂量。另外或可替代地,在一些实施方案中,施用多种治疗组合物或化合物。
“异源核酸”是指已被引入细胞中的核酸、DNA或RNA,其不是在其所引入的细胞中天然发现的序列的拷贝。这样的异源核酸可以包括作为其引入的细胞中天然存在的序列的拷贝的片段或其片段。
如本文所使用的,重组或工程改造的“宿主细胞”是指这样的一种细胞,例如,真核细胞、原核细胞、酵母细胞、细菌细胞(如大肠杆菌)、蓝藻细胞、昆虫细胞、植物细胞、古细菌细胞、无细胞或哺乳动物细胞,其经过修饰使其产生本技术的融合蛋白。在一些实施方案中,宿主细胞是体外培养的细胞。在一些实施方案中,重组宿主细胞包括一个或多个多核苷酸,每个多核苷酸编码本技术的两亲性融合蛋白或其部分。
如本文所用,“疏水性货物”指的是适合于通过本文所述的胶束递送的任何疏水性化合物或试剂。合适的疏水性货物的例子包括但不限于药物、杀菌剂、蛋白质、核酸、激素、受体、诊断剂、显像剂、金属络合物、硅油、甘油三酯、或其组合。疏水性货物可以包括具有生物学和/或药学活性的疏水剂。
如本文所用,“不溶部分”是指增强本文所述两亲性蛋白的不溶性并且在某些情况下防止两亲性蛋白自组装形成胶束的部分,例如肽。在一些实施方案中,不溶部分包括酮类固醇异构酶多肽序列。在一些实施方案中,不溶部分包括SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,不溶部分是进一步包括化学裂解位点并且是可裂解的肽。在一些实施方案中,化学裂解位点选自在甲硫氨酸残基处裂解的CNBr(溴化氰)裂解位点或在半胱氨酸残基处裂解的2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸裂解位点。
如本文所用,“固有无序蛋白(IDP),也称为固有非结构蛋白(IUP),其特征在于在生理条件下缺乏稳定的三级结构。在一些实施方案中,IDP包括选自由以下各项组成的组的多肽序列:人类神经丝蛋白、San1蛋白、Hsp-33蛋白、E1A蛋白、PhD蛋白、Sic1蛋白、WASP蛋白、p27蛋白、CREB蛋白、PUP蛋白、LEA蛋白或其包括固有无序的区域的部分或片段。在一些实施方案中,本技术的IDP包括SEQ ID NO:2所示的人类神经丝多肽序列或其片段。在一些实施方案中,本技术的IDP包括SEQ ID NO:69所示的人类神经丝多肽序列或其片段。在一些实施方案中,本技术的IDP包括序列(SPAEAK)n(SEQ ID NO:3)的重复序列,其中n是2到100的整数,或介于其间的任何范围,例如2到50或2到25。在一些实施方案中,n为25。在一些实施方案中,本技术的IDP包括序列(SPAEAR)d(SEQ ID NO:4)的重复序列,其中d是2至100的整数,或介于其间的任何范围,例如2至50或2至25。在一些实施方案中,d为25。在某些实施方案中,IDP包括序列(SPAX1AX2)n(SEQ ID NO:53)的重复序列,其中X1和X2均为任何带电荷的氨基酸,并且n是2到100的整数,或介于其间的任何范围,例如2到50或2到25。在一些实施方案中,n为25。
如本文所用,术语“纯化”是指通过例如分离或分离将分子从其环境中除去或分离。
如本文所用,术语“重组多肽”是指通过重组DNA技术产生的多肽,其中通常将编码表达的蛋白质或RNA的DNA***合适的表达载体中,并随后用于将宿主细胞转化为产生多肽或RNA。
如本文所用,“增溶部分”是指增强本文所述两亲性蛋白的溶解性并且在某些情况下防止两亲性蛋白自组装形成胶束的部分,例如肽。在一些实施方案中,增溶部分包括以下各项中的一项或多项:麦芽糖结合蛋白(MBP)多肽序列、小泛素样修饰物(SUMO)多肽序列、谷胱甘肽S-转移酶(GST)多肽序列、SlyD多肽序列、NusA多肽序列、硫氧还蛋白多肽序列、泛素多肽序列或T7基因10多肽序列。在一些实施方案中,增溶部分还包括多组氨酸标签(His标签),例如6xHis标签。在一些实施方案中,增溶部分包括SEQ ID NO:12中设定的氨基酸序列。在一些实施方案中,增溶部分是进一步包括蛋白水解裂解位点并且是可裂解的肽。在一些实施方案中,蛋白水解裂解位点选自:凝血酶裂解位点(例如,LVPR;SEQ ID NO:13),烟草蚀纹病毒裂解位点(例如,ENLYFQ;SEQ ID NO:14),3C裂解位点(例如,LEVLFQ;SEQ ID NO:15),肠激酶裂解位点(例如DDDDK;SEQ ID NO:16),或Xa因子裂解位点(例如IEGR;SEQ IDNO:17)。
如本文所使用的,术语“受试者”是指任何动物(例如,哺乳动物),包括但不限于人类、非人灵长类动物、啮齿动物等(例如,其是特定的处理方式的接收者,或从中收集细胞)。
术语“治疗活性剂”和类似的术语指治疗或医学功能,是指所引用的小分子、大分子、蛋白质、核酸、生长因子、激素、药物、其他物质、细胞、金属络合物、硅油、甘油三酯或其组合可以有益地影响受试者的疾病或病症的发生、发展和/或一种或多种症状,并且可以与本文所述的胶束一起用于制备用于治疗疾病或其他病症的药物。用于包封在本文所述的胶束中的合适治疗剂包括疏水性治疗剂。
术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”可包括:(i)预防疾病、病理或医学状况的发生(例如,预防);(ii)抑制疾病、病理或医学状况或阻止其发展;(iii)减轻疾病、病理或医学状况;和/或(iv)减轻与疾病、病理或医学状况有关的症状。因此,术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”可以扩展到预防并且可以包括预防(prevent,prevention,preventing)、降低、停止或逆转所治疗的病症或症状的进展或严重程度。这样,术语“治疗”可以适当地包括医学、治疗和/或预防性给药。
如本文所使用的,术语“载体”或“表达载体”是指能够指导与它们可操作地连接的基因的表达的核酸分子。通常,在重组DNA技术中有用的表达载体通常是“质粒”的形式,通常是指环状双链DNA环,其载体形式未与染色体结合。术语“质粒”和“载体”在本文可互换使用。本文所述的表达载体包括以适于在宿主细胞中表达多核苷酸序列的形式的本文所述的多核苷酸序列。本领域技术人员将理解,表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需多肽的表达水平等因素。可将本文所述的表达载体引入宿主细胞以产生由本文所述的多核苷酸序列编码的多肽,包括融合多肽,例如两亲性融合蛋白。
如本文所用,“IDP1-2Yx2A”是指SEQ ID NO:39或包括SEQ ID NO:39的胶束,这取决于其使用的上下文。在一些实施方案中,“IDP2-2Yx2A”是指SEQ ID NO:56或包括SEQ IDNO:56的胶束,这取决于其使用的上下文。如本文所用,“IDP-2Yx3A”是指SEQ ID NO:42或包括SEQ ID NO:42的胶束,这取决于其使用的上下文。如本文所用,“IDP-2Yx4A”是指SEQ IDNO:57或包括SEQ ID NO:57的胶束。
II.两亲性蛋白质和相应的基于蛋白质的胶束
与所述自组装两亲性蛋白质的生产有关的努力集中在使用自然自组装的蛋白质,这需要使用自然自组装已知的蛋白质,并限制了进一步官能化的可能性。其他方法集中在聚合物、小分子和肽的使用上。这些方法相对而言成本低效且费力。
为了解决这些缺点,本发明的技术涉及一系列包括被通过生物机制产生的固有无序蛋白(IDP)可生物降解的链段的两亲性的融合蛋白。因此,本文在一个方面提供了重组两亲性蛋白质,其自组装形成稳定胶束。本公开的两亲性蛋白质包括衍生自天然无序蛋白质(例如,固有无序蛋白质(IDP))的亲水性重复序列和设计的疏水性区域以允许自身聚集。由天然无序序列产生自组装的两亲性蛋白提供了进一步功能化的机会,该功能尚待采用需要使用天然自组装蛋白的制备两亲性蛋白的方法来实现。此外,本公开认识到,遗传编码本文所述的两亲性蛋白的溶解度增强和可裂解的蛋白基团提供了在表达和初始纯化后以受控方式产生自组装蛋白的有效方法,这不能通过仅表达两亲性蛋白来实现。
在一些实施方案中,本文所述的从重组蛋白形成的胶束具有可取的特性,所述特性致使这些胶束适合在多种应用中递送各种疏水剂。这样的可取的特性包括但不限于:低临界胶束浓度(CMC)、pH稳定性、温度稳定性、包封效率、尺寸、外部修饰的潜力和生物降解性。这样的应用包括但不限于药物递送、化妆品、油漆和涂料、作物保护、纳米颗粒合成和催化、家庭和个人护理以及清洁。
本技术提供了包括两亲性融合蛋白的组合物,其包括融合到疏水性肽(H2)的亲水性肽(H1)。在一些实施方案中,两亲性融合蛋白包括与亲水性肽的N端融合的增溶部分(S)和蛋白水解裂解位点(X)。在一些实施方案中,本技术的两亲性融合蛋白具有如下所示的一般结构:
S-X-H1-H2
在一些实施方案中,所述两亲性融合蛋白进一步包括蛋白水解裂解位点(X)和亲水性肽(H1)之间的细胞靶向肽(T)和下述有所示的通用结构:
S-X-T-H1-H2
在一些实施方案中,所述两亲性融合蛋白在所述结构域SX裂解之后自发地自组装以形成稳定的胶束。
在一些实施方案中,两亲性融合蛋白包括融合到亲水性肽的N端的不溶化基团(I)和化学裂解位点(X)。在一些实施方案中,本技术的两亲性融合蛋白具有如下所示的一般结构:
I-X-H1-H2。
在一些实施方案中,所述两亲性融合蛋白还包括化学裂解位点(X)和亲水性肽(H1)之间的细胞靶向肽(T)和下述有所示的通用结构:
I-X-T-H1-H2。
在一些实施方案中,所述两亲性融合蛋白在所述结构域IX裂解之后自发地自组装以形成稳定的胶束。
A.亲水性肽(H1)
在一些实施方案中,本技术的亲水性肽包括一种固有无序蛋白(IDP)。在一些实施方案中,IDP包括选自由以下各项组成的组的多肽序列:人类神经丝蛋白、San1蛋白、Hsp-33蛋白、E1A蛋白、PhD蛋白、Sic1蛋白、WASP蛋白、p27蛋白、CREB蛋白、PUP蛋白、LEA蛋白或其包括固有无序区域的部分或片段。在一些实施方案中,IDP包括含有固有无序的肽区的完整蛋白质或蛋白质片段。在一些实施方案中,本技术的IDP包括SEQ ID NO:2所示的人类神经丝多肽序列或其片段。在一些实施方案中,本技术的IDP包括SEQ ID NO:69所示的人类神经丝多肽序列或其片段。表1中提供了示例性人类神经丝核酸和多肽序列。
在一些实施方案中,本技术的IDP包括序列(SPAEAK)n(SEQ ID NO:3)的重复序列,其中,n为2至100的整数,或者在例如2至50或2至25的任何范围内。在一些实施方案中,n为25。在一些实施方案中,本技术的IDP包括序列(SPAEAR)d(SEQ ID NO:4)的重复序列,其中,d为2至100的整数,或者在2至50或2至25的任何范围内。在一些实施方案中,d为25。在某些实施方案中,IDP包括序列(SPAX1AX2)n(SEQ ID NO:53)的重复序列,其中X1和X2均为任何带电荷的氨基酸,并且n是2到100的整数,或介于其间的任何范围,例如2到50或2到25。在一些实施方案中,n为25。
B.疏水性肽(H2)
在一些实施方案中,本技术的疏水性肽包括选自由以下各项组成的组的疏水性多肽序列:YGAYAQYVYIYAYWYL(SEQ ID NO:5);YGAYAQYVYIYAYWYLYAYI(SEQ ID NO:6);WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(SEQ ID NO:7);YWCCA(X)a(SEQ ID NO:8),其中,a为任何疏水残基(X)的数目;YWXXVbAb(SEQ ID NO:9),其中,b为3或更大的整数,并且X为任何疏水残基;和YWA(X)c(SEQ ID NO:10),其中,c是任何疏水残基(X)的数目。
C.增溶部分(S)/增溶部分(I)
在一些实施方案中,本技术的增溶部分包括以下各项中的一项或多项:麦芽糖结合蛋白(MBP)多肽序列、小泛素样修饰物(SUMO)多肽序列、谷胱甘肽S-转移酶(GST)多肽序列、SlyD多肽序列、NusA多肽序列、硫氧还蛋白多肽序列、泛素多肽序列或T7基因10多肽序列。在一些实施方案中,增溶部分还包括多组氨酸标签(His标签),例如6xHis标签。表2A中列出了MBP的示例性核酸序列及其多肽序列。
在一些实施方案中,本技术的不溶部分包括类固醇异构酶(KSI)多肽序列。
表2B中列出了KSI的示例性核酸序列及其多肽序列。
D.蛋白水解裂解位点/化学裂解位点(X)
示例性非限制性的蛋白水解裂解位点包括:凝血酶裂解位点(例如,LVPR;SEQ IDNO:13)、烟草蚀纹病毒的裂解位点(例如,ENLYFQ;SEQ ID NO:14)、3C裂解位点(例如,LEVLFQ;SEQ ID NO:15)、肠激酶裂解位点(例如DDDDK;SEQ ID NO:16)或Xa因子裂解位点(例如IEGR;SEQ ID NO:17)。
示例性非限制性的化学裂解位点包括选自以下各项中的化学裂解位点:在蛋氨酸残基处裂解的CNBr(溴化氰)裂解位点;或在半胱氨酸残基处裂解的2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸裂解位点。
E.细胞靶向肽(T)
在一些实施方案中,所述两亲性融合蛋白还包括可用于特异性地靶向包括两亲性融合蛋白在特定细胞或组织中的两亲性融合蛋白或胶束的细胞靶向肽(T)。在一些实施方案中,细胞靶向肽可用于将疏水性货物递送至靶细胞(例如癌细胞、真菌细胞、微生物细胞)内部的方法。
因此,在一些实施方案中,细胞靶向肽是选自由以下各项组成的组的癌细胞靶向肽:靶向人类头部和颈部实体瘤并且具有氨基酸序列TSPLNIHNGQKL(SEQ ID NO:18)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列CGKRK(SEQ ID NO:19)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列CGNKRTRGC(SEQ ID NO:20)的肽;靶向***脉管***并且具有氨基酸序列SMSIARL(SEQ ID NO:21)的肽;靶向肝细胞癌细胞并且具有氨基酸序列FQHPSFI(SEQ IDNO:22)的肽;靶向整联蛋白受体并且具有氨基酸序列RGD(SEQ ID NO:23)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列NGR(SEQ ID NO:24)的肽;靶向内皮VCAM-1表达细胞并且具有氨基酸序列VHSPNKK(SEQ ID NO:25)的肽;靶向腺癌细胞并且具有氨基酸序列RRPYIL(SEQ ID NO:26)的肽;靶向各种癌症并且具有氨基酸序列EDYELMDLLAYL(SEQ ID NO:27)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列LTVSPWY(SEQ ID NO:28)的肽;以及靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列ATWLPPR(SEQ ID NO:29)的肽。
在一些实施方案中,细胞靶向肽包括靶向真菌细胞的几丁质结合域(CBD)。
在一些实施方案中,细胞靶向肽包括靶向微生物的抗菌肽。在一些实施方案中,所述抗菌肽选自由以下各项组成的组:皮离蛋白、蜜蜂抗菌肽、牛抗菌肽和红蝽素。在一些实施方案中,所述皮离蛋白是选自由以下各项组成的组的皮离蛋白变体:包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSVL(SEQ ID NO:30)的DCD-1L;包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSV(SEQ ID NO:31)的DCD-1;以及包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDA(SEQ ID NO:32)的SSL25。在一些实施方案中,所述蜜蜂抗菌肽包括氨基酸序列GNNRP(V/I)YIPQPRPPHPR(L/I)(SEQ ID NO:33)。在一些实施方案中,牛抗菌肽为牛抗菌肽5(Bac 5)或牛抗菌肽7(Bac 7)。在一些实施方案中,红蝽素包括氨基酸序列VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN(SEQ ID NO:34)。
F.重组融合蛋白核酸和氨基酸序列
在表3A中提供了示例性IDP-麦芽糖结合蛋白(MBP)的核酸和氨基酸序列。
在表3B中提供了示例性IDP-类固醇异构酶蛋白(KSI)的氨基酸序列。
在表4A、4B、5和6中分别列出了用于本技术的两亲性融合蛋白的示例性序列,包括融合到亲水性多肽序列的疏水性多肽序列,并且命名为IDP1-2Yx2A、IDP2-2Yx2A、IDP-2Yx3A和IDP-2Yx4A。
III.合成
本部分提供了合成、形成和使用如本文所描述的两亲性融合蛋白和胶束组合物的一般描述。根据实施例中概述的方法,制备编码本技术的2Yx2A、2Yx3A或2Yx4A两亲性融合蛋白的质粒。
可以使用用于产生两亲性融合蛋白的任何合适的表达***。在一些实施方案中,无细胞***用于两亲性融合蛋白的产生。在一些实施方案中,用本技术的表达载体转化宿主细胞。在一些实施方案中,宿主细胞是任何真核细胞、原核细胞或古细菌细胞。在一些实施方案中,宿主细胞是酵母细胞、细菌细胞、蓝藻细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中,宿主细胞是大肠杆菌。
在一些实施方案中,本公开涉及包括用包括编码本技术的两亲性融合蛋白的嵌合核酸的表达载体转化的宿主细胞的细胞培养物。
然后用蛋白酶(例如,凝血酶)消化所表达的融合蛋白,以除去增溶部分,然后可以通过本领域中已知的任何合适的方式进行纯化。实施例中进一步描述了非限制性纯化方法。
此外,在一个方面,本文提供了一种产生自发自组装以形成稳定胶束的两亲性融合蛋白的方法,所述方法包括:(a)将包括嵌合核酸构建体的表达载体引入宿主细胞,所述嵌合核酸构建体包括在5'至3'方向上的启动子,所述启动子适于引导在宿主细胞中的表达,所述宿主细胞可操作地连接至对两亲性融合蛋白进行编码的核酸序列,所述两亲性融合蛋白具有式(I):S-X-H1-H2,其中,S-为增溶部分,I-为不溶部分,-X-为包括蛋白水解或化学裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽;(b)在允许表达所述嵌合核酸以产生所述两亲性融合蛋白的条件下培养所述宿主细胞;(c)纯化所述两亲性融合蛋白;以及(d)使所述两亲性融合蛋白与蛋白酶或试剂接触以诱导化学裂解,从而提供具有式(II):H1-H2的两亲性融合蛋白。在一些实施方案中,部分(a)的所述嵌合核酸构建体编码两亲性融合蛋白,所述两亲性融合蛋白还包括在所述-X-和所述-H1-之间的细胞靶向肽(-T-),使得所述两亲性融合蛋白具有式(III):S-X-T-H1-H2,并且使得在部分(d)之后,所述两亲性融合蛋白具有式(IV):T-H1-H2。
然后用试剂消化所表达的融合蛋白以诱导化学裂解(例如,溴化氰),从而除去不溶部分,然后可以通过本领域中已知的任何合适的方式进行纯化。实施例中进一步描述了非限制性纯化方法。
此外,在一个方面,本文提供了一种产生自发自组装以形成稳定胶束的两亲性融合蛋白的方法,所述方法包括:(a)将包括嵌合核酸构建体的表达载体引入宿主细胞,所述嵌合核酸构建体包括在5'至3'方向上的启动子,所述启动子适于引导在宿主细胞中的表达,所述宿主细胞可操作地连接至对两亲性融合蛋白进行编码的核酸序列,所述两亲性融合蛋白具有式(I):I-X-H1-H2,其中,I-为不溶部分,-X-为包括蛋白水解或化学裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽;(b)在允许表达所述嵌合核酸以产生所述两亲性融合蛋白的条件下培养所述宿主细胞;(c)纯化所述两亲性融合蛋白;以及(d)[1]使所述两亲性融合蛋白与蛋白酶或试剂接触以诱导化学裂解,从而提供具有式(II):H1-H2的两亲性融合蛋白。在一些实施方案中,部分(a)的所述嵌合核酸构建体编码两亲性融合蛋白,所述两亲性融合蛋白还包括在所述-X-和所述-H1-之间的细胞靶向肽(-T-),使得所述两亲性融合蛋白具有式(III):I-X-T-H1-H2,并且使得在部分(d)之后,所述两亲性融合蛋白具有式(IV):T-H1-H2。
IV.胶束特性
本文在另一个方面提供了包括本文所述的两亲性融合蛋白中的任何一种的胶束。在一些实施方案中,两亲性融合蛋白的特征在于亲水性肽(H1);和疏水性肽(H2)。
在一些实施方案中,所述胶束本文所述具有低的临界胶束浓度(CMC)。在一些实施方案中,在约7.4的生理pH下,水中两亲性融合蛋白的CMC大于约10μM。在一些实施方案中,在约7.4的生理pH下,水中两亲性融合蛋白的CMC小于约20μM。在一些实施方案中,在约7.4的生理pH下,水中两亲性融合蛋白的CMC为约10μM至约20μM。在一些实施方案中,在约7.4的生理pH值下,水中两亲性融合蛋白的CMC为约10μM、约11μM、约12μM、约13μM、约14μM、约15μM、约16μM、约17μM、约18μM、约19μM或约20μM。
在一些实施方案中,本文所述的胶束直径为约20nm至约40nm。在一些实施方案中,本文所述的胶束具有大于约20nm的直径。在一些实施方案中,本文所述的胶束的直径小于约40nm。在一些实施方案中,本文所述的胶束的直径为约20nm、约21nm、约22nm、约23nm、约24nm、约25nm、约26nm、约27nm、约28nm、约29nm、约30nm、约31nm、约32nm、约33nm、约34nm、约35nm、约36nm、约37nm、约38nm、约39nm或约40nm。在一些实施方案中,本文所述的胶束具有约27nm的直径。
在一些实施方案中,本文所述的胶束是pH稳定的。在一些实施方案中,胶束在约2.0至约10.0的pH下是稳定的。在一些实施方案中,胶束在大于约2.0的pH下是稳定的。在一些实施方案中,胶束在小于约10.0的pH下是稳定的。在一些实施方案中,所述胶束在约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0的pH下是稳定的。
在一些实施方案中,本文所述的胶束是温度稳定的。在一些实施方案中,胶束在约25℃至约70℃的温度下是稳定的。在一些实施方案中,胶束在大于约25℃的温度下是稳定的。在一些实施方案中,胶束在小于约70℃的温度下是稳定的。在一些实施方案中,胶束在约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃或约75℃的温度下是稳定的。
在一些实施方案中,所述胶束还含有荧光染料。在一些实施方案中,所述荧光染料共价附接至所述亲水性肽(H1)。在一些实施方案中,所述荧光染料共价附接至所述疏水性肽(H2)。在一些实施方案中,所述荧光染料是荧光素或若丹明。
在一些实施方案中,所述胶束具有核-壳结构。在一些实施方案中,胶束的壳直径为约40nm至约75nm。在一些实施方案中,胶束的壳直径大于约40nm。在一些实施方案中,胶束的壳直径小于约75nm。在一些实施方案中,胶束的壳直径为约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm或约75nm。在一些实施方案中,所述胶束的核直径为约25nm至约45nm。在一些实施方案中,胶束的核直径大于约25nm。在一些实施方案中,胶束的核直径小于约45nm。在一些实施方案中,胶束具有约25nm、约30nm、约35nm、约40nm或约45nm的核直径。在一些实施方案中,所述胶束的壳厚度为约5nm至约20nm。在一些实施方案中,胶束具有大于约5nm的壳厚度。在一些实施方案中,胶束的壳厚度小于约20nm。在一些实施方案中,胶束的壳厚度为约5nm、约10nm、约15nm或约20nm。
在一些实施方案中,胶束进一步包括疏水性货物。在一些实施方案中,所述疏水性货物是药物、杀真菌剂、蛋白质、核酸、激素、受体、诊断剂、显像剂、金属络合物、硅油、甘油三酯或其组合。在一些实施方案中,疏水性货物是药物。在一些实施方案中,疏水性货物是杀真菌剂。在一些实施方案中,疏水性货物是蛋白质。在一些实施方案中,疏水性货物是核酸。在一些实施方案中,疏水性货物是激素。在一些实施方案中,疏水性货物是受体。在一些实施方案中,疏水性货物是诊断剂。在一些实施方案中,疏水性货物是显像剂。在一些实施方案中,疏水性货物是金属络合物。在一些实施方案中,疏水性货物是硅油。在一些实施方案中,疏水性货物是甘油三酯。
V.药物组合物
在另一个方面,提供了组合物,例如,“药物组合物”,其包括有效量的本文所述的胶束、疏水性货物和/或治疗活性剂。在一些实施方案中,组合物还包括至少一种药学上可接受的赋形剂。
包括本文所述的胶束、疏水性货物和/或治疗活性剂的药物组合物可配制成用于不同的给药途径,包括静脉内、动脉内、经肺、直肠、鼻、***、舌下、肌肉内、腹膜内、皮内、透皮、颅内、皮下和口服途径。其他剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、气雾剂、栓剂、肠胃外剂和口服液,包括混悬剂、溶液剂和乳剂。可以使用本领域标准的方法制备所有剂型(参见,例如,Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,A.Oslo编辑,Easton Pa.1980)。
在一些实施方案中,结合适当的盐和缓冲液来配制本文所述的胶束、疏水性货物和/或治疗活性剂,以呈现以稳定的方式将组合物递送从而允许被靶细胞摄取。当将本文所述的胶束、疏水性货物和/或治疗活性剂引入患者时,也使用缓冲剂。在一些实施方案中,使用水性组合物(包括有效量的胶束、疏水性货物和/或治疗活性剂,其分散在药学上可接受的载体或赋形剂水性介质中)。如本文所用,“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上合适的赋形剂的一个实例。其他合适的载体和赋形剂是本领域技术人员众所周知的,参见,例如,Ansel等人,《药物剂量形式和药物递送***》(PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMSAND DRUG DELIVERY SYSTEMS),第5版(Lea&Febiger 1990),和Gennaro(编辑),REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版(Mack出版公司,1990年)及其修订版。
本文所述的胶束、疏水性货物和/或治疗活性剂可以在肠胃外或腹膜内或肿瘤内施用。活性化合物的游离碱或药理学上可接受的盐的溶液是在水中与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合而成的。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在常规的储存和使用条件下,这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。
VI.使用方法
还提供了一种使用本文所述的两亲性融合蛋白和胶束组合物将疏水性货物和/或治疗活性剂递送至靶细胞(例如,癌细胞、真菌细胞、微生物细胞)的内部的有效方法。因此,在一些实施方案中,提供了治疗方法,其包括或需要将疏水性货物和/或治疗活性剂递送至细胞中。在一些实施方案中,疏水性货物和/或治疗活性剂是化疗药物,例如阿霉素。
在另一个方面,提供了一种用于对受试者治疗癌症的方法,其中,该方法包括:给所述受试者施用有效量的包括本文所述的任何胶束和治疗活性剂(例如,化学治疗药物)的组合物。在一些实施方案中,化疗药物的实例包括但不限于阿霉素、紫杉醇和雷帕霉素。在一些实施方案中,治疗活性剂是类固醇药物,包括但不限于氢化可的松、***、孕酮、17β-***或左炔诺孕酮。在一些实施方案中,本技术的胶束可以用于递送至靶细胞或组织的方法中,所述药物否则封装在聚合物纳米颗粒中以有效递送,所述药物包括但不限于利培酮、盐酸米诺环素或溴隐亭。在一些实施方案中,本技术的胶束在用于将成像剂递送至靶细胞或组织的方法中是有用的,所述成像剂包括但不限于荧光染料、PET探针和MRI造影剂。
本文所述的施用的胶束和疏水性货物和/或用于人类的治疗活性剂的剂量将取决于以下因素,例如患者的年龄、体重、身高、性别、一般医学状况和以前的医疗史。
在一些实施方案中,提供了用于治疗癌症的方法和组合物。预期可通过所述方法治疗的细胞增生性疾病或癌症包括但不限于人头和颈部实体瘤、乳腺癌、***癌、肝细胞癌、腺癌。在一些实施方案中,该方法用于抑制癌症,尤其是以上所列的癌症的生长、进展和/或转移。
实施例
提供的实施例仅作为说明并且不具有限制性。所属领域的技术人员将容易地识别出多种可被改变或修改以产生基本相同或类似结果的非关键参数。实例决不应被解释为限制由所附权利要求限定的本发明技术的范围。
实施例1:融合蛋白的制备
该实施例描述本文中所描述的示例性融合蛋白的制备。
序列设计。源于神经丝重臂侧链的固有无序的序列是在头部区域周围张开的自然刺激响应序列,产生柱形刷状结构。由于这种高电荷和重复序列的有趣特性,开发了表达具有增加的疏水性附件的蛋白这一部分的方法,以尝试创建一种固有无序的蛋白,该蛋白可以围绕遗传编码的疏水序列自组装(图1)。
重组表达蛋白带来的两个主要挑战是如下这些:
1.无序区蛋白酶降解的高趋势导致截短和异质性;以及
2.体内蛋白质的聚集/自组装导致截短,这是由于核糖体过早离开、对宿主细胞的毒性、降解或穿梭于包涵体引起的。
为了解决这些问题,所述构建体具有N端麦芽糖结合蛋白(MBP)和然后可通过在两种蛋白质之间***凝血酶裂解位点而从感兴趣的蛋白质裂解6xHis标签。MBP用于在表达和纯化的初始步骤中增强蛋白质构建体的溶解度,从而支持正常的蛋白质表达处理技术。MBP还增加了其所附的构建体的表达产量,这对于生产目的也是有利的。
质粒的构建。(a)IDP-MBP质粒:IDP固有的重复序列使得不可能合成一个连续的基因块。相反,必须合成两个基因块(gBlocks:IDT Technologies)(IDP-1和IDP2;有关各自的序列,请参见下文),它们具有32bp的共有序列,可以进行Gibson组装。每个gBlock的100ng样品和10μl的2x Gibson预混液(参考Gibson,DG,Young,L.,等人.Nat.Methods.2009年,6,343-345)与水调节至20μL的体积,并在50℃下培育60min。用QiaQuick(Qiagen)纯化DNA后,利用正向和反向引物对组装产物进行PCR扩增(来自NEB的VENT聚合酶,Tm=61℃):5’-ATAATA GCT AGC TTA GTT CCT CGT GCC TGG CGT G-3’(SEQ ID NO:43)和5’-TAT TAT CTCGAG CTA TTA GGC ACA CCA GTA CGG AGA TTT C-3’(SEQ ID NO:44)。IDT***片段包括NheI和XhoI限制性酶切位点,它们被双重消化并在80℃下被热灭活5min,并与5'端MBPpSKB3载体连接(QuickLigase,NEB)。在卡那霉素琼脂平板上平板接种产生单个菌落,对其进行培养,DNA纯化(NucleoSpin,MacheryNagel)和测序(Quintara BioSciences)。
gBlock IDP-1:
ATAATAGCTAGCTTAGTTCCTCGTGCCTGGCGTGGCTCCCCGTGGGCAGAGGCCAAGAGTCCAGCGGAAGCTAAGTCGCCAGCCGAAGTCAAGTCGCCCGCCGTCGCGAAAAGCCCCGCAGAGGTGAAATCCCCGGCCGAAGTCAAATCGCCGGCAGAAGCGAAATCCCCGGCAGAAGCAAAAAGTCCTGCTGAGGTCAAATCGCCAGCAACCGTCAAATCCCCTGGAGAGGCAAAATCTCCGGCAGAAGCCAAGTCCCCTGCCGAAGTGAAGTCAC(SEQ ID NO:45)
gBlock IDP-2:
AGAAGCCAAGTCCCCTGCCGAAGTGAAGTCACCTGTCGAAGCCAAGTCGCCGGCCGAAGCGAAGAGCCCAGCGAGCGTGAAAAGTCCTGGTGAGGCTAAGTCCCCGGCGGAAGCGAAATCTCCAGCGGAAGTAAAGAGTCCGGCCACCGTTAAATCCCCGGTAGAGGCCAAAAGCCCTGCGGAAGTTAAATCGCCGGTGACGGTCAAATCACCCGCGGAAGCGAAGTCCCCGGTGGAGGTGAAATCTCCGTACTGGTGTGCCTAATAGCTCGAGATAATA(SEQ ID NO:46)
下划线:用于Gibson组装的共识序列
(b)2Y-MBP质粒:对(a)中构建的MBP-IDP质粒进行突出PCR。正向引物用Bsa1裂解位点延伸序列,反向引物用所需的疏水部分和Bsa1裂解位点延伸序列,以允许通过金门组装法掺入我们的质粒。扩增的序列在1%琼脂糖凝胶上电泳,并证实其具有大约长度。提取PCR产物并纯化。为了进行金门组装,将2Y PCR产物与我们的金门质粒、Bsa1、NEB连接酶缓冲液和连接酶一起培育,并循环25次。连接后,将质粒转化入化学感受态细胞中,并在卡那霉素LB琼脂平板上于37℃下过夜。当将琼脂平板暴露于紫外线下时,选择白色菌落(绿色表示Bsa1未切除GFP),并在10mL LB培养基中于37℃过夜生长。随后纯化质粒DNA(NucleoSpin,MacheryNagel)并测序(Quintara BioSciences)。
正向引物:5'AGGTCT CTC ATG GCC AGC AGC CAT CAT 3'(SEQ ID NO:47)
反向引物:5'TGG TCT CGT TTA CAC ATA CTG CGC ATA CGC GCC ATA GGC ACACCA GTA CGG AGA TTT CA 3'(SEQ ID NO:48)
下划线:BsaI裂解位点
(c)2Yx2A质粒的构建:对(b)中构建的2Y-MBP质粒进行突出PCR。正向引物以Bsa1裂解位点延伸序列,而反向引物以疏水部分和Bsa1裂解位点延伸序列,以允许通过金门组装法掺入我们的质粒中。按照与(b)中相同的步骤,纯化并测序2Yx2A质粒。
正向引物:5'AGG TCT CTC ATG GCC AGC AGC CAT CAT 3’(SEQ ID NO:49)
反向引物:5'TGG TCT CGT TTA AAT ATA AGC ATA CAG ATA CCA ATA CGC ATAAAT ATA CAC ATA CTG CG 3’(SEQ ID NO:50)
下划线:BsaI裂解位点
(d)2Yx3A质粒的构建:对(c)中构建的2Yx2A质粒进行突出PCR。正向引物以Bsa1裂解位点延伸序列,而反向引物以疏水部分和Bsa1裂解位点延伸序列,以允许通过金门组装法掺入我们的质粒中。按照与(c)中相同的步骤,纯化并测序2Yx3A质粒。
正向引物:5'AGG TCT CTC ATG GCC AGC AGC CAT CAT 3’(SEQ ID NO:51)
反向引物:5'TGG TCT CGT TTAAAT ATA AGC ATA CAG ATA CCAATA CGC ATA AATATA CAC ATA CTG CG 3’(SEQ ID NO:52)
下划线:BsaI裂解位点
MBP-IDP的表达。(a)将质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。从单个菌落中生长起子培养物(20ml LB,50mg/L卡那霉素),于37℃过夜生长,并用于接种1L TB培养基(50mg/L卡那霉素)。培养物生长至OD约0.5,在25℃下冷却20min,用0.5mM IPTG诱导,并在25℃下表达过夜(约18小时)。在4℃下以4,000rcf(g)离心15min收集细胞。
纯化MBP-IDP融合蛋白。将沉淀物转移至50ml Falcon管中的PBS缓冲液中,并以4000rcf(g)离心10min。将所得沉淀(约5g)溶解于30ml裂解缓冲液(20mM HEPES,pH=7.5,300mM NaCl,10mM咪唑=缓冲液A)中,补充一片不含EDTA的SigmaFast蛋白酶抑制剂(SigmaAldrich),2mM PMSF和10mg溶菌酶。用Avestin C3均质器裂解重悬的样品,然后在4℃下以24,000rcf(g)离心20min。将上清液通过40μm Steriflip过滤器(Millipore)过滤,并加载到5ml NiNTA色谱柱(Protino,Machery Nagel)上,该色谱柱与用缓冲液A预先平衡的Akta纯化器连接。用50ml(10CV)的20mM HEPES(pH=7.5),300mM NaCl,10mM咪唑,10mMβMe洗涤色谱柱。用20mM HEPES(pH=7.5),300mM NaCl,250mM咪唑,10mMβMe洗脱蛋白质。通过与10DG脱盐柱(BioRad)交换20mM HEPES(pH=7.5),100mM NaCl除去咪唑,然后用1mg凝血酶蛋白酶(来自Bovine,MP Biomedicals的高纯度蛋白酶)消化。经LC/MS(ESI/TOF)确认,在1小时后于室温完全消化。将蛋白混合物用无盐HEPES缓冲液(20mM,pH=7.5)稀释至50ml([NaCl]~5mM),然后将其加载到与Akta纯化器(GE Healthcare)连接的1ml HiTrap Q HP阳离子交换柱上。该柱用20mM HEPES,10mMβMe预先平衡,用10ml(10CV)的20mM HEPES(pH=7.5),10mMβMe洗涤,并用0-1M NaCl梯度洗脱(总体积50ml)。单体IDP在200mM NaCl左右洗脱。在不添加还原剂的情况下,观察到明显的二聚体形成,其在加载步骤的尾端几乎没有保留地洗脱。用20mM HEPES(pH=7.5),300mM NaCl,250mM咪唑,10mMβMe洗脱蛋白质。用最终的脱盐柱(10DG,BioRad)获得最终的IDP样品,以获得在20mM HEPES(pH=7.5),50mM NaCl中的最终浓度为270μM的蛋白质。通过SDS-PAGE和LCMS(ESI-TOF;Agilent),该蛋白质的纯度>95%。将纯化的蛋白质与液体N2以20μl等分试样快速冷冻。
2Yx2A-MBP的表达和纯化。(b)表达:将质粒转化到大肠杆菌Rosetta 2plys感受态细胞中。从单个菌落中生长起子培养物(20ml LB,50mg/L卡那霉素),于37℃过夜生长,并用于接种1L TB培养基(50mg/L卡那霉素)。培养物生长至OD约0.5,在16℃下冷却20min,用0.1mM IPTG诱导,并在16℃下表达(约6小时)。通过在4℃下以4,000rcf(g)离心15min收集细胞。
(c)MBP-2Yx2A融合蛋白的纯化:将沉淀转移至PBS缓冲液中的50ml Falcon管中,并以4000rcf(g)缓慢旋转10min。将所得沉淀(约5g)溶解于30ml裂解缓冲液(20mM HEPES,pH=7.5,300mM NaCl,10mM咪唑=缓冲液A)中,补充一片不含EDTA的SigmaFast蛋白酶抑制剂(Sigma Aldrich),2mM PMSF和10mg溶菌酶。将重悬的样品通过超声裂解(振幅50%,2:4秒开关10分钟),然后在4℃下以24,000rcf(g)离心20min。将上清液通过40μm Steriflip过滤器(Millipore)过滤,并加载到5ml NiNTA色谱柱(Protino,Machery Nagel)上,该色谱柱与用缓冲液A预先平衡的Akta纯化器连接。用50ml(10CV)的20mM HEPES(pH=7.5),300mMNaCl,10mM咪唑洗涤色谱柱。用20mM HEPES(pH=7.5),300mM NaCl,250mM咪唑洗脱蛋白质。通过用20mM HEPES(pH=7.5),100mM NaCl旋转浓缩除去咪唑。随后用1mg凝血酶蛋白酶(来自Bovine,MP Biomedicals的高纯度)消化MBP-2Yx2/3A。经LC/MS确认,在1小时后于室温下完全消化。然后可以使用离子交换或Biotage HPLC纯化去除残留的MBP。
(d)离子交换:将蛋白混合物用无盐HEPES缓冲液(20mM,pH=7.5)和8M尿素稀释至50ml([NaCl]~5mM),然后将其加载到1ml HiTrap SP HP上阳离子交换柱连接到Akta净化器(GE Healthcare)。该柱用20mM HEPES,10mMβMe预平衡,用10ml(10CV)的20mM HEPES(pH=7.5)洗涤,并用0-1M NaCl梯度洗脱(总体积为100ml)。2Yx2A在约500mM NaCl中洗脱。最终的2Yx2A样品针对100mM PB pH 5.5进行透析。凝胶分析显示纯度为75%。
(e)Biotage HPLC:将10%乙腈(ACN)添加到粗蛋白混合物中,然后将其加载到10gC18 Biotage SNAP Bio 300A反相柱上,该柱已用H2O+0.1%TFA中的10%ACN平衡。该柱运行14分钟,得到100%ACN,所需产物洗脱在40%ACN附近。通过LC/MS(ESI/TOF)分析含有2Yx2A的部分的纯度。收集100%纯部分,冻干至干燥,得到白色粉末。凝胶分析显示>95%的纯度。
2Yx2A-MBP蛋白的纯度和通过凝胶和LC/MS的表征示于图2A、2B、3A、3B、3C和3D。图2A示出了在不同IPTG诱导条件和20或6小时时间点对NiNTA纯化的2Yx2A-MBP蛋白进行的4-12%Bis-Tris SDS PAGE凝胶分析。图2B示出了NiNTA纯化构建体的最严格表达条件:6h0.1mM IPTG的LC-MS(ESI-TOF)分析。图3A示出了离子交换纯化2Yx2A的4-12%Bis-TrisSDS PAGE凝胶分析(在ImageJ中通过凝胶密度测定法分析纯度为75%)。图3B示出了Biotage HPLC纯化的2Yx2A的4-12%Bis-Tris SDS PAGE凝胶分析,示出了一条对应于2Yx2A单体的条带,同时还出现了一条不沿凝胶向下移动的大条带,对应于未在PAGE凝胶上分解的组装蛋白(在ImageJ中通过光度法分析纯度大于95%)。在两种凝胶中2Yx2A复合物均以较高的表观分子量运行,IDP构建体也观察到了这种现象,这很可能是由于其无序的性质引起的。图3C示出了在多孔壳柱上从MBP纯化2Yx2A。2Yx2A在8.2分钟时洗脱,而MBP在10min时洗脱。由于与MBP的相互作用,少量的2Yx2A也可能在9分钟左右洗脱出来。仅收集纯部分,以实现更高的通量纯化,在Biotage HPLC装置上使用C18 Biotage SNAP Bio 300A。图3D示出了离子交换纯化和HPLC纯化2Yx2A的LC-MS(ESI-TOF)分析。预期的单体的分子量:18290.69。对于离子交换纯化蛋白,70%作为单体(18291Da)、10%作为二聚体(36580Da)和通过MBP的19%杂质(45332Da)存在。对于Biotage HPLC纯化蛋白,76%作为单体(在缓冲液中在+76:18367Da下半胱氨酸残基被过量的B-巯基乙醇封端)、23%作为二聚体(36580Da)和通过MBP的0%杂质(45332Da)存在。
2Yx3A-MBP的表达和纯化。(f)表达:2Yx3A-MBP的表达方式与2Yx2A-MBP(b)相同。
(g)纯化:与2Yx2A-MBP(f)相同地纯化2Yx3A-MBP。
与IDP-MBP和2Yx2A-MBP的表达形成对比,2Yx3A-MBP在表达过程中引致较低的沉淀体积。另外,通过超声处理细胞裂解后,蛋白质上清液类似于肥皂水,难以处理且难以纯化。NiNTA纯化后,仍然存在类似2Yx3A-MBP性质的表面活性剂,这在2Yx2A-MBP构建体中是看不到的。这很有趣,因为两个序列的唯一区别是在2Yx3A-MBP序列中增加了四个氨基酸(YAYI)。
2Yx3A-MBP蛋白的表征示于图4A、4B和4C。图4A是一张照片,显示在细胞裂解、超声处理和过滤后,2Yx3A-MBP粗蛋白混合物呈肥皂泡沫状。图4B是一张照片,显示在NiNTA纯化2Yx3A-MBP构建体后,蛋白质混合物呈肥皂泡沫状。图4C上图:NiNTA纯化的2Yx3A-MBP的LC-MS(ESI-TOF)分析显示,含有截短的2Yx3A-MBP蛋白的不纯混合物,其中所需的构建体的纯度为88%。图4C中间图:凝血酶裂解后直接对2Yx3A+MBP进行LC-MS(ESI-TOF)分析。观察到的分子量表明,即使在存在可溶的MBP的情况下,该构建体也具有很高的组装倾向,即使在LC-MS TOF分析期间也保持接触。图4C下图:离子交换纯化的2Yx3A,显示难以从MBP纯化构建体,这很可能是由于该构建体即使在存在MBP的情况下也具有组装能力。
图5A是该实施例中描述的蛋白质构建体的示意图。
实施例2:胶束表征
该实施例提供了从本文所述的示例性融合蛋白制备的胶束的特征数据。
所得的胶束来自2Yx2A构建体已得到充分表征,并且在某些情况下,使用非组装IDP构建体进行比较。由于难以表达和纯化2Yx3A构建体,因此无法进一步表征2Yx3A构建体的胶束。简而言之,为了分析2Yx2A,将冻干的蛋白重悬于水中,然后调节至所需的缓冲条件。
动态光散射。在Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS上进行DLS分析。数据图和标准差是根据三个测量值的平均值计算得出的,每个测量值包括13次运行。测量数据表示为由%数值分布确定的直径。当测量任何组装结构时,蛋白质模块可用于分析颗粒,但是,要获得IDP的任何信号,必须将其视为聚合物并稀释至低浓度。
图6是显示IDP(在pH 5.3的磷酸盐缓冲液中为2μM)和2Yx2A构建体(在pH 5.3的100mM磷酸盐缓冲液中为40μM)的DLS测量值的图表。
图7A和7B是示出通过DLS测定的2Yx2A构建体的pH稳定性的图。
图8是示出2Yx2A胶束大小与1x PBS pH 7.4和100mM PB pH 5.3中的浓度的相关性,其趋势紧密反映了芘荧光测定法测定的CMC浓度。
图9A和9B是示出温度对通过DLS测定的2Yx2A胶束直径的影响的图。
尺寸排阻色谱。图10是示出病毒样MS2粒子(已知直径27nm),IDP和2Yx2A胶束的尺寸排阻色谱法LS9痕量的图。2Yx2A胶束的主峰与MS2的主峰重叠,进一步支持了DLS测量报告的27.73nm直径。在DLS上显示11.25nm直径的IDP也较晚洗脱,表明尺寸较小。
通过芘荧光法测定临界胶束浓度。100mM PB pH 5.8中的2Yx2A和IDP的CMC通过测量芘的第一和第三振动带(I1/I3比)来分析,其随着探针环境极性的增加而增加。例如,水中的I1/I3比为1.32,而在环己烷中则为0.6。
对于每个样品,添加2μM的芘,使其平衡5分钟。然后将每种蛋白质溶液在缓冲液中用2μM芘的溶液稀释,以保持芘和盐浓度恒定,但降低蛋白质浓度。芘的发射光谱是在Horiba荧光计上以5nm窗口在335nm处激发并监测350-800nm的发射而收集的。在较高的蛋白质浓度下,在383nm处存在对应于芘第三振动带的峰,而在较低的浓度下,该带的强度降低(图11A和11B)。
当将I1/I3比相对于2Yx2A蛋白浓度作图时,玻尔兹曼拟合可应用于数据点来计算EC50值。在1xPBS pH 7.4中,该值为26μM,而在100mM PB pH 5.7中,该值为13μM。或者,将该相同的分析应用于IDP时,I1/I3比保持恒定,并且显示出最高100μM的水(0uM蛋白)总浓度。高浓度(高于30μM)的2Yx2AM中芘的I1/I3比)与约1.0的1-丙醇中的芘非常相似(图12)。
使用FRET测量胶束交换动力学。(a)用荧光染料标记内部半胱氨酸:为测量2Yx2A胶束的交换动力学,在位于蛋白质的疏水和亲水部分之间的内部半胱氨酸残基上用荧光素马来酰亚胺若丹明红马来酰亚胺标记两个分开的2Yx2A种群。24小时后,两个种群均显示4%标记(图13)。
为了除去过量的染料,所述的蛋白用NAP5色谱柱纯化,引致1μM下600μL的蛋白质(在CMC下方)。对于此解决方案,添加50μL的40uM 2Yx2A L,然后用3KDa MWCO旋转浓缩。这应实现所有2Yx2A蛋白单体的大约1%标记。假设聚集数为数百,则与每个胶束的染料分子的平均数较低相关。
(b)FRET分析:使用Horiba荧光计用490nm 5nm窗口分别激发2Yx2A-FITC和2Yx2A-RhoRED,并以1nm的增量从500-800nm收集发射光谱。然后将30μL的每种溶液混合在一起,然后立即进行分析。然后连续超过40小时。图14A是当用490nm光激发时对2Yx2A的FRET分析,在515nm处观察到荧光素的发射,而在580nm处观察到罗丹明的发射。图14B是一个图表,表明可以将I580/(I580+I515)定义的FRET比相对于时间绘制并拟合到对数方程。到75分钟时,胶束达到了50%的混合,表明我们的胶束本质上是动态的。
冷沉淀TEM。冷沉淀TEM样品由100mM PB pH 5.3中的12μM的2Yx2A的储备溶液制备,然后将分析样品稀释30倍至0.4μM的浓度进行分析。通过DLS,由于稀释(参见图8),平均粒径为48.43±10.62nm,观察到的这些颗粒的平均直径和标准偏差略大。通过在图像采集之前将栅格预先暴露于光子中,使图像除冰。嵌入在玻璃化的冰中,观察到球形胶束。使用ImageJ进行的图像分析显示,平均直径为50.46±12.14nm,与DLS结果的直径非常接近(图15)。另外,在一些粒子中,可以观察到核-壳状结构。
图16是示出10个胶束的核-壳直径的图。下表7示出了壳直径、核直径和壳厚度的相应测量值。随着核尺寸的增加,外壳尺寸也增加。这些胶束的厚度(定义为单个胶束核与壳之间的距离)平均为12.23±3.95nm,接近构建体的固有无序的亲水性区域的预期长度。
表7.
壳直径(nm) | 核直径(nm) | 差(nm) | 壳厚度(nm) |
51.08 | 31.16 | 19.92 | 9.96 |
57.60 | 32.85 | 24.75 | 12.37 |
50.72 | 30.05 | 20.67 | 10.33 |
49.82 | 34.55 | 15.27 | 7.63 |
44.73 | 27.98 | 16.74 | 8.37 |
78.05 | 41.35 | 36.69 | 18.34 |
55.00 | 33.69 | 21.30 | 10.65 |
71.53 | 34.75 | 36.78 | 18.39 |
54.56 | 34.02 | 20.54 | 10.27 |
64.93 | 33.04 | 31.88 | 15.94 |
SAXS。这项工作得益于SasView应用程序的使用(M.Doucet等人,SasView版本4.1.2)。
图17A和17B是示出2Yx2A的Rg和P(r)分布的图。图17A是示出在100mM PB pH 5.7中的68和34μM 2Yx2A和在1xPBS中的32μM 2Yx2A的SAXS散射曲线的图表。曲线的拟合用于确定实际空间Rg和P(r)分布。图17B是示出P(r)分布拟合的结果的图。所有这三个曲线看起来都非常相似,导致实际空间的Rg值都约为10nm。从DLS测量获得的Rh为13.08nm,Rg/Rh比为0.76,与堆积的球形胶束一致。此外,可以确定三个样品的平均半径,它们都显示出10至15nm之间的最大概率,并在320nm附近变为零概率(dmax)。
实施例3:用唑菌胺酯加载2Yx2A胶束
该实施例是在证明,从本文描述的示例性融合蛋白制备的胶束能够用疏水性化合物加载,如唑菌胺酯。
唑菌胺酯是高度水不溶性有机化合物,也是有效的杀菌剂。据报告其在水中的溶解度为be 1.9mg/L。作为对照,通过将唑菌胺酯的饱和溶液添加到100mM PB pH 5.3中并测量其在280nm的吸光度来创建,如预期的那样,没有可观察到的信号。为了确定唑菌胺酯是否可以吸收到2Yx2A胶束中,加入唑菌胺酯直至其饱和溶液达到100μL of 11μM(A280:0.361)2Yx2A,由黄色颗粒证明。然后将溶液离心,除去上清液,然后放入新管中并再次离心。重复3次去除上清液并离心以去除尚未分配到胶束内部的任何不溶性唑菌胺酯。然后用纳滴测量溶液,以测定其在280nm处的吸光度,引起0.502的an A280(+0.141mAU)。鉴于芘消光系数在A275下为24,000,吸光度的增加对应于存在5.8μM的芘。同样,可以通过HPLC使用利用乙腈中已知芘浓度开发的校准曲线来分析同一样品的唑菌胺酯含量(图18A)。为了进行HPLC分析,通过芘将蛋白质-唑菌胺酯溶液稀释至其体积的1/2以分解胶束。然后将已知的体积注入到HPLC上(图18B)。根据芘峰值和体积的面积,可以确定注入的摩尔数以及因此唑菌胺酯的浓度。使用这种方法,将7.37μM唑菌胺酯封装在11μM的蛋白中。
替代将唑菌胺酯直接添加到2Yx2A胶束溶液中的方法用于提高加载效率。这种方法涉及到冻干的蛋白质和唑菌胺酯在THF中的重悬,然后用缓冲液缓慢稀释。然后将溶液离心,除去上清液,然后放入新管中并再次离心。重复3次去除上清液并离心以去除尚未分配到胶束内部的任何不溶性唑菌胺酯。然后将样品冻干以除去所有溶剂,然后重悬于milliQ水中。尽管未观察到沉淀,但将样品离心以去除任何未掺入的唑菌胺酯。为了进行HPLC分析,通过芘将蛋白质-唑菌胺酯溶液稀释至其体积的1/2以分解胶束。然后将已知的体积注入到HPLC中。根据芘峰值和体积的面积,可以确定注入的摩尔数以及因此唑菌胺酯的浓度。图19显示,唑菌胺酯:2Yx2A蛋白单体的平均摩尔比被确定为15.2±8:1。
因此,这些结果表明,本技术的胶束可用于增溶高度水不溶性有机化合物的组合物中,并可用于将此类化合物递送至预期靶标的方法中。例如,包括唑菌胺酯的胶束组合物可用作杀真菌剂。
实施例4:加载Pd(dppf)Cl2的2Yx2A胶束的TEM
该实施例是在证明,能够用疏水性金属络合物加载从本文所述的示例性融合蛋白制备的胶束。
为了可视化2Yx2A胶束将疏水性化合物装载到其核中的能力,将40μM 2Yx2A蛋白与常用的Suzuki偶联催化剂Pd(dppf)Cl2一起在4℃下培育1周。使用前,将样品离心,然后将上清液通过2μm旋转过滤器除去尚未分配到胶束内部的任何不溶催化剂。然后将样品放在已亲水化的经聚乙烯醇缩甲醛涂层的碳网格上,静置2分钟。使用滤纸尖端将多余的液体核吸掉。然后在通过TECANI 12TEM(UC Berkeley电子显微镜设施)进行分析之前,将格栅完全干燥。由于钯和含铁的二茂铁配体的高电子密度,因此可以在不使用染色的情况下获得TEM图像中的对比度(图20A和20B)。
实施例5:融合蛋白的制备
该实施例描述了制备本文所述的示例性融合蛋白的另一种方法。
该实施例描述了这样的表达***,其中,增溶融合蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP),已由包涵体定向融合蛋白酮类固醇异构酶(KSI)取代。通过在IDP-2Yx2A蛋白序列的N端安装KSI,整个融合蛋白在表达过程中被送至不溶性包涵体。由于融合蛋白的不溶性,融合蛋白在细胞裂解后很容易通过离心纯化。KSI部分的使用减少了初始纯化步骤所需的溶剂量,还避免了可溶性蛋白质遇到的稳定性问题。为了从IDP-2Yx2A序列中删除KSI融合蛋白,在两个蛋白结构域(KSI-Met-IDP-2Yx2A)之间安装了甲硫氨酸(Met)残基。暴露于溴化氰(CNBr)后,Met残基C端的肽键水解,在KSI融合蛋白和所需的IDP-2Yx2A上留下C端内酯。然后使用反相色谱法纯化IDP-2Yx2A蛋白。
使用以下材料:
·通过将100mg/mL固体抗生素溶解在MilliQ H2O中制备1000x羧苄青霉素溶液(Carb),并在使用前储存在-20℃下。
·通过在EtOH中溶解25mg/mL制备1000x氯霉素溶液(Cam),并在使用前储存在-20℃下。
·通过将12.5g的Thermo Fisher Scientific LB肉汤(粉)和7.5g琼脂在500mLMilliQ水中混合,制备LB琼脂板+Carb。将溶液高压灭菌并冷却至55℃。通过涡旋加入500uL1000x(100mg/mL)氨苄西林储备液进行混合,最终浓度为100ug/mL。通过使用70%的乙醇和打开本生灯对工作台进行灭菌。将30-40mL倒入每个10cm培养皿中。在盖的一半打开的情况下将板干燥5分钟,然后关闭盖。琼脂固化后,将板堆叠成柱,并在环境温度下再干燥3小时。使用前,将板在4℃下保存。
·具有Carb和Cam的LB琼脂板如下制备。使用前一小时,将带有Carb的LB琼脂平板从4℃冰箱中取出,并在37℃加热30分钟。在无菌条件下,将30μL的1000x Cam溶液铺在板上。将板放回到37℃培养箱中30分钟,然后准备使用。
·TB培养基由8mL甘油47.5g极好的肉汤粉(Sigma Aldrich)和1000mL MilliQ H2O制备。
·LB培养基是由25克Luria肉汤粉(Sigma Aldrich)和1000毫升MilliQ H2O制备的。
·由20mM Hepes,300mM NaCl,10mM Bme,0.1%Triton X和MilliQ H2O制备裂解缓冲液。
Pet31b-KSI-IDP-2Yx2A质粒构建
进入载体:pet31b KSI进入载体是从Millipore以69952 Sigma-AldrichpET-31b(+)DNA–Novagen购买的。
模板DNA:将MBP-IDP-2Yx2A pet28b载体用作模板DNA,并进行突出PCR扩增IDP-2Yx2A序列。
突出PCR引物:购自Integrated DNA Technologies。
正向引物:F2 xho1 alwnl pet 31b
5’-AAC TAT AAT ATA TAC AGA TGC TGG CAG AGG CCA AGA GT-3’(SEQ ID NO:62);MW=11,767.7g/mol。
反向引物:R2 xho1 alwnl pet31b
5’-AAA TTC CCA AAA CTC GAG CAT CAG ATA CCA ATA CGC ATA AA-3’(SEQ IDNO:63);MW=12,516.2g/mol。
如下面的表8所示,突出PCR在BioRad S1000热循环仪上进行,退火温度为55℃。在Phusion酶热失活后,将6μL 6X加载染料添加到每个突出的PCR反应中,然后将其加载到预先用SYBR Safe(ThermoFisher)染色的1%琼脂糖凝胶上。凝胶电泳在120V下进行35分钟,然后使用BioRad GelDoc EZ Imager在UV荧光下成像。从凝胶上切下对应于大约500个碱基对的DNA条带,并将它们都置于1.5mL Eppendorf管中。使用快速凝胶提取试剂盒(Promega)从凝胶中除去扩增的PCR产物。扩增的PCR产物的最终体积为50μL,浓度为23.7ng/μL。
表8.IDP-2Yx2A的突出PCR
表7.*最后添加Phusion DNA Pol
然后用XhoI和AlwnI限制酶消化扩增的PCR产物和pet31b进入载体,以产生互补的粘性末端。限制酶消化的参数如表9所示。
表9.pet31b进入载体和扩增的PCR产物的限制酶消化
***物 | 载体 | |
MilliQ H<sub>2</sub>O | - | 49 |
1μL Xho1 | 1 | 1 |
1μL AlwnI | 1 | 1 |
CutSmart缓冲液(NEB) | 6 | 6 |
扩增的PCR产物(23.7ng/μL) | 50 | - |
Pet31b进入载体 | - | 1 |
总体积 | 58 | 58 |
将限制酶消化物在37℃下培育1h,然后在80℃下加热灭活20min。消化后,将10μL6X加载染料添加到每个样品中,然后将其加载到用SYBR Safe(ThermoFisher)预染色的1X琼脂糖凝胶上。凝胶电泳在120V下进行35分钟,然后使用BioRad GelDoc EZ Imager在UV荧光下成像。从凝胶上切下对应于大约500个碱基对(***物)和5000个碱基对(载体)的荧光带,并使用快速凝胶提取试剂盒(Promega)进行纯化。洗脱后,裂解的载体和***DNA的浓度分别为15.1ng/μL和13.9ng/μL。
用不同比例的载体:***物进行消化的pet31b(载体)与消化的扩增PCR产物(***物)之间的连接反应,其中,载体浓度保持恒定在5ng/μL。消化的pet31B载体的连接的参数如表10所示。
表10.消化的pet31B载体与扩增的PCR产物的连接
载体DNA:***DNA | 1:0 | 1:1 | 1:3 | 1:7 |
T4 DNA连接酶缓冲液 | 2μL | 2μL | 2μL | 2μL |
载体DNA(15.1ng/μL) | 7μL | 7μL | 7μL | 7μL |
***DNA(13.9ng/μL) | - | 1μL | 2.5μL | 6.5μL |
无核酸酶的水 | 10μL | 9μL | 7.5μL | 3.5μL |
T4 DNA连接酶 | 1μL | 1μL | 1μL | 1μL |
总体积 | 20μL | 20μL | 20μL | 20μL |
将连接反应物在16℃下培育16h,并在80℃下加热灭活20min。将每个连接反应物的一半(10μL)转移到单独的1.5mL Eppendorf管中,其中装有50μL冷冻的XL1蓝色化学感受态细胞。轻弹连接反应以确保正确混合,然后在冰上培育30分钟。通过在42℃水浴中热震细胞-连接混合物42秒,然后放回冰上来进行转化。在无菌条件下,立即将950μLSOC培养基添加到Eppendorf管中,然后将其置于37℃恒温箱中,轨道旋转器设置为200rpm。1小时后,将四个转化中的每一个200μL分别铺板在单独的羧苄青霉素琼脂平板上,并用各自的***物:载体比例标记,然后置于37C培养箱中过夜。
过夜培育后,对应于1:3和1:7连接物的转化菌落最多,阴性对照为1:0的菌落少于5个,表明未掺入***片段的载体背景较低。用无菌移液器吸头刮擦每个平板上的四个菌落,并将其转移至5mL LB培养基+羧苄青霉素中,并在37℃恒温箱中将其过夜,并将其旋转转子设为200rpm。将过夜培养物转移至1.5mL Eppendorf管中,并在13.1g离心2min以沉淀细胞。除去上清液,并使用QIAGEN miniprep试剂盒从沉淀的细胞中提取质粒。使用T7正向引物将洗脱的质粒送去测序。送出测序的八个质粒中,所有质粒均在KSI融合蛋白的C末端包括IDP-2Yx2A***片段,如下所示。
KSI-IDP-2Yx2A:
大写字母=KSI多肽
下划线大写字母=CNBr裂解位点
粗体大写字母=IDP多肽
下划线粗体大写字母=疏水性多肽
斜体粗体大写字母=His-tag
KSI-IDP-2Yx2A的表达。将含KSI-IDP-2Yx2A的pet31b质粒转化到Rosetta2plys细胞中进行表达,方法是在冰上1.5mL Eppendorf管中的50μL Rosetta2plys细胞中加入1μL质粒。然后轻轻摇动细胞以确保适当混合,并在冰上培育30min,然后在42℃水浴中热震荡细胞42秒钟。在无菌条件下,立即将950μL SOC培养基添加到含有转化液的Eppendorf管中,然后将其置于37℃恒温箱中,轨道旋转器设置为200rpm。1小时后,将200μL转化液铺在羧苄青霉素+氯霉素琼脂平板上,并置于37℃的培养箱中过夜。
过夜培育后,使用无菌移液器从琼脂平板上挑出单个菌落,然后将其加入含有羧苄青霉素+氯霉素的15mL LB培养基中,培育过夜。第二天,将整个过夜培养物添加到1L无菌TB培养基中,在4升烧瓶中羧苄青霉素+氯霉素。然后将烧瓶置于以200rpm旋转的37℃培养箱中。当600nm处的光密度达到0.7时,将培养物冷却至18℃30分钟。为了诱导表达,将0.5mMIPTG添加至培养基,并将培养物以200rpm摇动另外18h过夜。
过夜表达后,将培养物以4000rpm离心15分钟。弃去上清液,将剩余的细胞沉淀均匀地分散并转移到两个50mL离心管中,使细胞沉淀的总重量为10g(每个离心管5g)。然后将细胞沉淀在-20℃下冷冻过夜。
纯化KSI-IDP-2Yx2A。在使用前,将冷冻的5g细胞沉淀重悬于30mL裂解缓冲液(20mM HEPES,300mM NaCl,10mM BMe,0.1%Triton-X)和300μL PMSF中。通过在冰上以70%的振幅超声处理细胞30分钟(在4秒关闭后2秒)裂解细胞。然后将裂解的细胞以14000rpm离心20分钟。除去上清液并丢弃。然后将沉淀重悬于裂解缓冲液中,并再次以14000rpm离心。弃去上清液,然后将沉淀重悬,并在MilliQ H2O中再离心两次。然后将得到的沉淀重悬于10mL的6M盐酸胍中,并以14000rpm离心。现在,所需的KSI-IDP-2Yx2A蛋白存在于上清液中,在该上清液中从沉淀的细胞碎片中移出并储存在4℃。从一个5g细胞沉淀(500mL细胞培养物)的不溶部分中获得的蛋白质浓度,在280nm处的UV吸光度约为180mg,其中A280的近似值为1.0=1mg/mL。在获得的180mg蛋白质中,离心纯化过程产生的蛋白质溶液在通过SDSPAGE凝胶和LCMS分析时主要为KSI-IDP-2Yx2A(分别为图21和22)。
KSI-IDP-2Yx2A的CNBr裂解。向KSI-IDP-2Yx2A在6M盐酸胍中的10mL溶液中,加入2mL 3M HCl和一勺(约50mg)溴化氰(CNBr)。将溶液容器包裹在箔中,并在氮气下搅拌过夜。第二天,通过LCMS观察到完全裂解,因为没有检测到对应于原始KSI-IDP-2Yx2A的质量,并且还观察到了IDP-2Yx2A的质量(图23)。
IDP-2Yx2A的HPLC纯化。然后,如本文先前所述,使用反相色谱法纯化IDP-2Yx2A。
等同物
尽管已经说明和描述了某些实施方案,本领域普通技术人员在阅读前述说明书之后可以对本文所述的本技术的蛋白融合体和胶束或衍生物或其药物组合物进行改变、等同物的替代和其他类型的改变。上述每个方面和实施方案也可以已经包括或并入其中,例如关于任何或所有其它方面和实施方案所公开的变化或方面。
本发明技术也不限于本文描述的特定方面,其旨在作为本发明技术的个别方面的单个说明。可以在不脱离本发明技术的精神和范围的情况下对本发明技术进行多种修改和变化,这对本领域技术人员而言将是显而易见的。除了本文中列举的方法以外,所属领域的技术人员从上述描述还将显而易见在本发明技术范围内的功能上等效的方法。这类修改和变化也旨在属于所附权利要求书的范围内。应理解,本发明技术不限于特定方法、试剂、化合物、组合物、经标记的化合物或生物***,其当然可以变化。除非本文中另外指示或以其它方式与上下文明显矛盾,否则本文中所描述的所有方法可以按任何合适的顺序进行。还应理解,本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的,而不旨在进行限制。因此,旨在仅在仅由所附权利要求、其中的定义及其任何等同物指示的本技术的广度、范围和精神的情况下,将说明书视为示例性的。本说明书中的任何语言都不应理解为将任何未要求的元素指示为必要的。
本文说明性地描述的实施方案可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下适当地实践。因此,例如,应广泛地而非限制性地理解术语“包括(comprising)”、“包括(including)”、“含有”等。另外,本文中所用术语和表达已用作描述而非限制性的术语,并且无意使用所述术语和表达来排除所示和所描述特征的任何等效物或其部分,但应认识到,在所要求的技术的范围内可以进行各种修改。另外,短语“基本上由……组成”将理解为包括那些特定列举的元素和那些并未显著影响所要求的技术的基本和新颖特征的额外元素。短语“由……组成”排除未指定的任何元素。
另外,在根据马库什组(Markush group)描述本公开的特征或方面的情况下,所属领域技术人员将认识到,本公开也因此根据马库什组的任意单个成员或成员的子组描述。落入一般公开范围内的每个较窄的种类和亚类分组也形成本技术的一部分。这包含本现有技术的通用说明,其限制条件或负面限制从所述属中移除任何标的物,无论所删除的材料是否在本文中特定叙述。
如所属领域的技术人员将理解,出于任何和所有目的,特别是就提供书面描述方面,本文所公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并使相同的范围被分解为至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等。作为非限制性实例,本文所讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的,如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包括所引用的数字并且指代可以随后分解成如上所讨论的子范围的范围。最终,如本领域技术人员将理解的,范围包括每个单独的成员,并且每个单独的值都被并入说明书中,就好像其在本文中被单独叙述一样。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请、已授权的专利和其它文件(例如期刊、文章和/或教科书)均通过引用并入本文,就好像每个单独的出版物、专利申请、已授权的专利或其它文件都被具体地和单独地指示通过引用整体并入。在与本公开中的定义相矛盾的程度上,排除通过引用并入的文本中含有的定义。
在以下权利要求中阐述了其它实施方案,以及此类权利要求所赋予的等效物的全部范围。
参考文献
1.Vargo,K.B.,Parthasarathy,R.&Hammer,D.A.Self-assembly of tunableprotein suprastructures from recombinant oleosin.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109,11657–62(2012).
2.Petka,W.A.,Harden,J.L.,McGrath,K.P.,Wirtz,D.&Tirrell,D.A.ReversibleHydrogels from Self-Assembling Artificial Proteins.Science(80-.).281,389LP-392(1998).
3.Park,W.M.&Champion,J.A.Thermally Triggered Self-Assembly of FoldedProteins into Vesicles.J.Am.Chem.Soc.136,17906–17909(2014).
4.Huber,M.C.等人Designer amphiphilic proteins as building blocks forthe intracellular formation of organelle-like compartments.Nat.Mater.14,125–132(2015).
5.Wen,Y.&Li,J.Ultrastable micelles boostchemotherapy.Nat.Biomed.Eng.2,273–274(2018).
6.Fuguet,E.,Ràfols,C.,Rosés,M.&Bosch,E.Critical micelle concentrationof surfactants in aqueous buffered and unbuffered systems.Anal.Chim.Acta548,95–100(2005).
7.Adiga,S.P.&Brenner,D.W.Molecular Basis for Neurofilament HeavyChain Side Arm Structure Modulation by Phosphorylation.J.Phys.Chem.C114,5410–5416(2010).
8.Chang,R.,Kwak,Y.&Gebremichael,Y.Structural Properties ofNeurofilament Sidearms:Sequence-Based Modeling of NeurofilamentArchitecture.J.Mol.Biol.391,648–660(2009).
9.Bhagawati,M.等人Site-Specific Modulation of Charge Controls theStructure and Stimulus Responsiveness of Intrinsically Disordered PeptideBrushes.Langmuir32,5990–5996(2016).
10.Raran-Kurussi,S.&Waugh,D.S.Unrelated solubility-enhancing fusionpartners MBP and NusA utilize a similar mode of action.Biotechnol.Bioeng.111,2407–11(2014).
11.L.,Novo,M.&Al-Soufi,W.Fluorescence emission of pyrene insurfactant solutions.Adv.Colloid Interface Sci.215,1–12(2015).
12.Guler,M.O.,Claussen,R.C.&Stupp,S.I.Encapsulation of pyrene withinself-assembled peptide amphiphile nanofibers.J.Mater.Chem.15,4507(2005).
Claims (95)
1.一种具有式S/I-X-H1-H2的两亲性融合蛋白,其中,S-为增溶部分,I-为不溶部分,-X-为包括蛋白水解或化学裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽。
2.根据权利要求1所述的两亲性融合蛋白,其中,所述-H1-包括固有无序的肽(IDP)序列。
3.根据权利要求2所述的两亲性融合蛋白,其中,所述IDP序列包括来自以下各项中的一种或多种多肽序列:人类神经丝蛋白、San1蛋白、Hsp-33蛋白、E1A蛋白、PhD蛋白、Sic1蛋白、WASP蛋白、p27蛋白、CREB蛋白、PUP蛋白或LEA蛋白。
4.根据权利要求3所述的两亲性融合蛋白,其中,所述IDP包括人类神经丝多肽序列。
5.根据权利要求4所述的两亲性融合蛋白,其中,所述人类神经丝多肽序列包括SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求2所述的两亲性融合蛋白,其中,所述IDP包括序列(SPAEAK)n(SEQ IDNO:3)的重复序列或序列(SPAEAR)n(SEQ ID NO:4)的重复序列,其中,n是从2到50的整数。
7.根据权利要求2所述的两亲性融合蛋白,其中,所述IDP包括序列(SPAX1AX2)n(SEQ IDNO:53)的重复序列,其中,X1和X2各自为任何带电荷的氨基酸,并且n为从2到50的整数。
8.根据权利要求1所述的两亲性融合蛋白,其中,所述-H2包括疏水性多肽序列,所述疏水性多肽序列包括富含酪氨酸的氨基酸序列,其长度为5-20个残基。
9.根据权利要求1所述的两亲性融合蛋白,其中,所述-H2包括选自由以下各项组成的组的疏水性多肽序列:YGAYAQYVYIYAYWYL(SEQ ID NO:5);YGAYAQYVYIYAYWYLYAYI(SEQ IDNO:6);YGAYAQYVYIYAYWYLYAYIAVAL(SEQ ID NO:54);WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(SEQ ID NO:7);YWCCA(X)a(SEQ ID NO:8),其中,a为任何疏水残基(X)的数目;YWXXVbAb(SEQ ID NO:9),其中,b为3或更大的整数,并且X为任何疏水残基;和YWA(X)c(SEQ ID NO:10),其中,c是任何疏水残基(X)的数目。
10.根据权利要求1所述的两亲性融合蛋白,其中,所述S-包括以下各项中的一项或多项:麦芽糖结合蛋白(MBP)多肽序列、小泛素样修饰物(SUMO)多肽序列、谷胱甘肽S-转移酶(GST)多肽序列、SlyD多肽序列、NusA多肽序列、硫氧还蛋白多肽序列、泛素多肽序列或T7基因10多肽序列。
11.根据权利要求10所述的两亲性融合蛋白,其中,所述S-还包括多组氨酸标签(His标签)。
12.根据权利要求10所述的两亲性融合蛋白,其中,所述S-包括MBP多肽序列。
13.根据权利要求12所述的两亲性融合蛋白,其中,所述S-包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的两亲性融合蛋白,其中,所述-X-包括选自以下各项中的蛋白水解裂解位点:凝血酶裂解位点、烟草蚀纹病毒(TEV)裂解位点、3C裂解位点、肠激酶裂解位点或Xa因子裂解位点。
15.根据权利要求14所述的两亲性融合蛋白,其中,所述蛋白水解裂解位点为包括多肽序列LVPR(SEQ ID NO:13)的凝血酶裂解位点。
16.根据权利要求1所述的两亲性融合蛋白,其中,所述I-包括酮类固醇异构酶多肽序列。
17.根据权利要求16所述的两亲性融合蛋白,其中,所述I-包括SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求16或17所述的两亲性融合蛋白,其中,所述-X-包括选自以下各项中的化学裂解位点:在蛋氨酸残基处裂解的CNBr裂解位点;或在半胱氨酸残基处裂解的2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸裂解位点。
19.根据权利要求1所述的两亲性融合蛋白,其中,所述融合蛋白还包括在所述-X-和所述-H1-之间的细胞靶向肽(-T-),使得所述两亲性融合蛋白具有式S/I-X-T-H1-H2。
20.根据权利要求19所述的两亲性融合蛋白,其中,所述-T-选自由以下各项组成的组:几丁质结合域(CBD)、癌细胞靶向肽和抗菌肽。
21.根据权利要求20所述的两亲性融合蛋白,其中,所述-T-是选自由以下各项组成的组的癌细胞靶向肽:靶向人类头部和颈部实体瘤并且具有氨基酸序列TSPLNIHNGQKL(SEQID NO:18)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列CGKRK(SEQ ID NO:19)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列CGNKRTRGC(SEQ ID NO:20)的肽;靶向***脉管***并且具有氨基酸序列SMSIARL(SEQ ID NO:21)的肽;靶向肝细胞癌细胞并且具有氨基酸序列FQHPSFI(SEQ ID NO:22)的肽;靶向整联蛋白受体并且具有氨基酸序列RGD(SEQ ID NO:23)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列NGR(SEQ ID NO:24)的肽;靶向内皮VCAM-1表达细胞并且具有氨基酸序列VHSPNKK(SEQ ID NO:25)的肽;靶向腺癌细胞并且具有氨基酸序列RRPYIL(SEQ ID NO:26)的肽;靶向各种癌症并且具有氨基酸序列EDYELMDLLAYL(SEQID NO:27)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列LTVSPWY(SEQ ID NO:28)的肽;以及靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列ATWLPPR(SEQ ID NO:29)的肽。
22.根据权利要求20所述的两亲性融合蛋白,其中,所述-T-是选自由以下各项组成的组的抗菌肽:皮离蛋白、蜜蜂抗菌肽、牛抗菌肽和红蝽素。
23.根据权利要求22所述的两亲性融合蛋白,其中,所述皮离蛋白是选自由以下各项组成的组的皮离蛋白变体:包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSVL(SEQ ID NO:30)的DCD-1L;包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSV(SEQ ID NO:31)的DCD-1;以及包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDA(SEQ ID NO:32)的SSL25。
24.根据权利要求22所述的两亲性融合蛋白,其中,所述蜜蜂抗菌肽包括氨基酸序列GNNRP(V/I)YIPQPRPPHPR(L/I)(SEQ ID NO:33)。
25.根据权利要求22所述的两亲性融合蛋白,其中,所述牛抗菌肽为牛抗菌肽5(Bac 5)或牛抗菌肽7(Bac 7)。
26.根据权利要求22所述的两亲性融合蛋白,其中,所述红蝽素包括氨基酸序列VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN(SEQ ID NO:34)。
27.根据权利要求1所述的两亲性融合蛋白,其中,所述-H1-H2包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57。
28.根据权利要求1所述的两亲性融合蛋白,其中,所述两亲性融合蛋白的式为S-X-H1-H2,其中,S-为增溶部分,-X-为包括蛋白水解裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽。
29.根据权利要求1所述的两亲性融合蛋白,其中,所述两亲性融合蛋白的式为I-X-H1-H2,其中,I-为不溶部分,-X-为包括化学裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽。
30.一种表达载体,其包括对根据权利要求1所述的两亲性融合蛋白进行编码的嵌合核酸序列。
31.一种重组宿主细胞,其被工程改造为表达根据权利要求1所述的两亲性融合蛋白,其中,所述宿主细胞是真核细胞、原核细胞、古细菌细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、蓝藻细胞、昆虫细胞或植物细胞。
32.根据权利要求31所述的重组宿主细胞,其中,所述细菌细胞是大肠杆菌。
33.一种产生自发自组装以形成稳定胶束的两亲性融合蛋白的方法,所述方法包括:
(a)将包括嵌合核酸构建体的表达载体引入宿主细胞,所述嵌合核酸构建体包括在5'至3'方向上的启动子,所述启动子适于引导在宿主细胞中的表达,所述宿主细胞可操作地连接至对两亲性融合蛋白进行编码的核酸序列,所述两亲性融合蛋白具有式(I):S/I-X-H1-H2,其中,S-为增溶部分,I-为不溶部分,-X-为包括蛋白水解或化学裂解位点的肽序列,-H1-为亲水性肽,并且-H2为疏水性肽;
(b)在允许表达所述嵌合核酸以产生所述两亲性融合蛋白的条件下培养所述宿主细胞;
(c)纯化所述两亲性融合蛋白;以及
(d)使所述两亲性融合蛋白与蛋白酶或试剂接触以诱导化学裂解,从而提供具有式(II):H1-H2的两亲性融合蛋白。
34.根据权利要求33所述的方法,其中,部分(a)的所述嵌合核酸构建体编码两亲性融合蛋白,所述两亲性融合蛋白还包括在所述-X-和所述-H1-之间的细胞靶向肽(-T-),使得所述两亲性融合蛋白具有式(III):S/I-X-T-H1-H2,并且使得在部分(d)之后,所述两亲性融合蛋白具有式(IV):T-H1-H2。
35.根据权利要求33或34所述的方法,其中,所述-H1-包括固有无序的肽(IDP)序列。
36.根据权利要求33所述的方法,其中,所述IDP序列包括来自以下各项中的一种或多种多肽序列:人类神经丝蛋白、San1蛋白、Hsp-33蛋白、E1A蛋白、PhD蛋白、Sic1蛋白、WASP蛋白、p27蛋白、CREB蛋白、PUP蛋白或LEA蛋白。
37.根据权利要求35所述的方法,其中,所述IDP包括人类神经丝多肽序列。
38.根据权利要求37所述的方法,其中,所述人类神经丝多肽序列包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
39.根据权利要求35所述的方法,其中,所述IDP包括序列(SPAEAK)n(SEQ ID NO:3)的重复序列或序列(SPAEAR)n(SEQ ID NO:4)的重复序列,其中,n是从2到50的整数。
40.根据权利要求35所述的方法,其中,所述IDP包括序列(SPAX1AX2)n(SEQ ID NO:53)的重复序列,其中,X1和X2各自为任何带电荷的氨基酸,并且n为从2到50的整数。
41.根据权利要求33或34所述的方法,其中,所述-H2包括疏水性多肽序列,所述疏水性多肽序列包括富含酪氨酸的氨基酸序列,其长度为5-20个残基。
42.根据权利要求33或34所述的方法,其中,所述-H2包括选自由以下各项组成的组的疏水性多肽序列:YGAYAQYVYIYAYWYL(SEQ ID NO:5);YGAYAQYVYIYAYWYLYAYI(SEQ ID NO:6);YGAYAQYVYIYAYWYLYAYIAVAL(SEQ ID NO:54);WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(SEQ IDNO:7);YWCCA(X)a(SEQ ID NO:8),其中,a为任何疏水残基(X)的数目;YWXXVbAb(SEQ ID NO:9),其中,b为3或更大的整数,并且X为任何疏水残基;和YWA(X)c(SEQ ID NO:10),其中,c是任何疏水残基(X)的数目。
43.根据权利要求33或34所述的方法,其中,所述S-包括以下各项中的一项或多项:麦芽糖结合蛋白(MBP)多肽序列、小泛素样修饰物(SUMO)多肽序列、谷胱甘肽S-转移酶(GST)多肽序列、SlyD多肽序列、NusA多肽序列、硫氧还蛋白多肽序列、泛素多肽序列或T7基因10多肽序列。
44.根据权利要求33或34所述的方法,其中,所述S-还包括多组氨酸标签(His标签)。
45.根据权利要求43所述的方法,其中,所述S-包括MBP多肽序列。
46.根据权利要求45所述的方法,其中,所述S-包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的方法,其中,所述-X-包括选自以下各项中的蛋白水解裂解位点:凝血酶裂解位点、烟草蚀纹病毒(TEV)裂解位点、3C裂解位点、肠激酶裂解位点或Xa因子裂解位点。
48.根据权利要求47所述的方法,其中,所述蛋白水解裂解位点为包括多肽序列LVPR(SEQ ID NO:13)的凝血酶裂解位点。
49.根据权利要求33或34所述的方法,其中,所述I-包括酮类固醇异构酶多肽序列。
50.根据权利要求49所述的方法,其中,所述I-包括SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
51.根据权利要求49或50所述的方法,其中,所述-X-包括选自以下各项中的化学裂解位点:在蛋氨酸残基处裂解的CNBr裂解位点;或在半胱氨酸残基处裂解的2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸裂解位点。
52.根据权利要求34所述的方法,其中,所述-T-选自由以下各项组成的组:几丁质结合域(CBD)、癌细胞靶向肽和抗菌肽。
53.根据权利要求52所述的方法,其中,所述-T-是选自由以下各项组成的组的癌细胞靶向肽:靶向人类头部和颈部实体瘤并且具有氨基酸序列TSPLNIHNGQKL(SEQ ID NO:18)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列CGKRK(SEQ ID NO:19)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列CGNKRTRGC(SEQ ID NO:20)的肽;靶向***脉管***并且具有氨基酸序列SMSIARL(SEQ ID NO:21)的肽;靶向肝细胞癌细胞并且具有氨基酸序列FQHPSFI(SEQ IDNO:22)的肽;靶向整联蛋白受体并且具有氨基酸序列RGD(SEQ ID NO:23)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列NGR(SEQ ID NO:24)的肽;靶向内皮VCAM-1表达细胞并且具有氨基酸序列VHSPNKK(SEQ ID NO:25)的肽;靶向腺癌细胞并且具有氨基酸序列RRPYIL(SEQ ID NO:26)的肽;靶向各种癌症并且具有氨基酸序列EDYELMDLLAYL(SEQ ID NO:27)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列LTVSPWY(SEQ ID NO:28)的肽;以及靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列ATWLPPR(SEQ ID NO:29)的肽。
54.根据权利要求52所述的方法,其中,所述-T-是选自由以下各项组成的组的抗菌肽:皮离蛋白、蜜蜂抗菌肽、牛抗菌肽和红蝽素。
55.根据权利要求54所述的方法,其中,所述皮离蛋白是选自由以下各项组成的组的皮离蛋白变体:包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSVL(SEQID NO:30)的DCD-1L;包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSV(SEQ ID NO:31)的DCD-1;以及包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDA(SEQ IDNO:32)的SSL25。
56.根据权利要求54所述的方法,其中,所述蜜蜂抗菌肽包括氨基酸序列GNNRP(V/I)YIPQPRPPHPR(L/I)(SEQ ID NO:33)。
57.根据权利要求54所述的方法,其中,所述牛抗菌肽为牛抗菌肽5(Bac 5)或牛抗菌肽7(Bac 7)。
58.根据权利要求54所述的方法,其中,所述红蝽素包括氨基酸序列VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN(SEQ ID NO:34)。
59.根据权利要求33或34所述的方法,其中,所述-H1-H2包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57。
60.一种包括两亲性融合蛋白的胶束,其包括:
(i)亲水性肽(H1);和
(ii)疏水性肽(H2)。
61.根据权利要求60所述的胶束,其中,所述H1包括固有无序的肽(IDP)序列。
62.根据权利要求61所述的胶束,其中,所述IDP序列包括来自以下各项中的一种或多种多肽序列:人类神经丝蛋白、San1蛋白、Hsp-33蛋白、E1A蛋白、PhD蛋白、Sic1蛋白、WASP蛋白、p27蛋白、CREB蛋白、PUP蛋白或LEA蛋白。
63.根据权利要求62所述的胶束,其中,所述IDP包括人类神经丝多肽序列。
64.根据权利要求63所述的胶束,其中,所述人类神经丝多肽序列包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
65.根据权利要求61所述的胶束,其中,所述IDP包括序列(SPAEAK)n(SEQ ID NO:3)的重复序列或序列(SPAEAR)n(SEQ ID NO:4)的重复序列,其中,n是从2到50的整数。
66.根据权利要求61所述的胶束,其中,所述IDP包括序列(SPAX1AX2)n(SEQ ID NO:53)的重复序列,其中,X1和X2各自为任何带电荷的氨基酸,并且n为从2到50的整数。
67.根据权利要求60所述的胶束,其中,所述H2包括疏水性多肽序列,所述疏水性多肽序列包括富含酪氨酸的氨基酸序列,其长度为5-20个残基。
68.根据权利要求67所述的胶束,其中,所述H2包括选自由以下各项组成的组的疏水性多肽序列:YGAYAQYVYIYAYWYL(SEQ ID NO:5);YGAYAQYVYIYAYWYLYAYI(SEQ ID NO:6);YGAYAQYVYIYAYWYLYAYIAVAL(SEQ ID NO:54);WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(SEQ IDNO:7);YWCCA(X)a(SEQ ID NO:8),其中,a为任何疏水残基(X)的数目;YWXXVbAb(SEQ ID NO:9),其中,b为3或更大的整数,并且X为任何疏水残基;和YWA(X)c(SEQ ID NO:10),其中,c是任何疏水残基(X)的数目。
69.根据权利要求60所述的胶束,其中,所述两亲性融合蛋白还包括与所述H1的N端共价连接的细胞靶向肽(T)。
70.根据权利要求69所述的胶束,其中,所述T选自由以下各项组成的组:几丁质结合域(CBD)、癌细胞靶向肽和抗菌肽。
71.根据权利要求70所述的胶束,其中,所述癌细胞靶向肽选自由以下各项组成的组:靶向人类头部和颈部实体瘤并且具有氨基酸序列TSPLNIHNGQKL(SEQ ID NO:18)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列CGKRK(SEQ ID NO:19)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列CGNKRTRGC(SEQ ID NO:20)的肽;靶向***脉管***并且具有氨基酸序列SMSIARL(SEQ ID NO:21)的肽;靶向肝细胞癌细胞并且具有氨基酸序列FQHPSFI(SEQ IDNO:22)的肽;靶向整联蛋白受体并且具有氨基酸序列RGD(SEQ ID NO:23)的肽;靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列NGR(SEQ ID NO:24)的肽;靶向内皮VCAM-1表达细胞并且具有氨基酸序列VHSPNKK(SEQ ID NO:25)的肽;靶向腺癌细胞并且具有氨基酸序列RRPYIL(SEQ ID NO:26)的肽;靶向各种癌症并且具有氨基酸序列EDYELMDLLAYL(SEQ ID NO:27)的肽;靶向乳腺癌并且具有氨基酸序列LTVSPWY(SEQ ID NO:28)的肽;以及靶向肿瘤新脉管***并且具有氨基酸序列ATWLPPR(SEQ ID NO:29)的肽。
72.根据权利要求70所述的胶束,其中,所述T是选自由以下各项组成的组的抗菌肽:皮离蛋白、蜜蜂抗菌肽、牛抗菌肽和红蝽素。
73.根据权利要求72所述的胶束,其中,所述皮离蛋白是选自由以下各项组成的组的皮离蛋白变体:包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSVL(SEQID NO:30)的DCD-1L;包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSV(SEQ ID NO:31)的DCD-1;以及包括氨基酸序列SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDA(SEQ IDNO:32)的SSL25。
74.根据权利要求72所述的胶束,其中,所述蜜蜂抗菌肽包括氨基酸序列GNNRP(V/I)YIPQPRPPHPR(L/I)(SEQ ID NO:33)。
75.根据权利要求72所述的胶束,其中,所述牛抗菌肽为牛抗菌肽5(Bac 5)或牛抗菌肽7(Bac 7)。
76.根据权利要求72所述的胶束,其中,所述红蝽素包括氨基酸序列VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN(SEQ ID NO:34)。
77.根据权利要求60所述的胶束,其中,所述两亲性融合蛋白在水中的临界胶束浓度(CMC)在约7.4的生理pH下为约10μM至约20μM。
78.根据权利要求60所述的胶束,其中,所述胶束的直径为约20nm至约40nm。
79.根据权利要求78所述的胶束,其中,所述胶束的直径为约27nm。
80.根据权利要求60至79中任一项所述的胶束,其中,所述胶束在约2.0至约10.0的pH下是稳定的。
81.根据权利要求60至80中任一项所述的胶束,其中,所述胶束在约25℃至约70℃的温度下是稳定的。
82.根据权利要求60至81中任一项所述的胶束,其中,所述胶束还包括荧光染料。
83.根据权利要求82所述的胶束,其中,所述荧光染料共价附接至所述亲水性肽(H1)。
84.根据权利要求82所述的胶束,其中,所述荧光染料共价附接至所述疏水性肽(H2)。
85.根据权利要求82至84中任一项所述的胶束,其中,所述荧光染料是荧光素或若丹明。
86.根据权利要求60至85中任一项所述的胶束,其中,所述胶束具有核-壳结构。
87.根据权利要求86所述的胶束,其中,所述胶束的壳直径为约40nm至约75nm。
88.根据权利要求86所述的胶束,其中,所述胶束的核直径为约25nm至约45nm。
89.根据权利要求86所述的胶束,其中,所述胶束的壳厚度为约5nm至约20nm。
90.根据权利要求60至89中任一项所述的胶束,其中,所述胶束还包括疏水性货物。
91.根据权利要求90所述的胶束,其中,所述疏水性货物是药物、杀真菌剂、蛋白质、核酸、激素、受体、诊断剂、显像剂、金属络合物、硅油、甘油三酯或其组合。
92.根据权利要求60至91中任一项所述的胶束,其中,包括H1和H2的所述两亲性融合蛋白包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57。
93.一种药物组合物,其包括根据权利要求60至92中任一项所述的胶束和疏水性货物,其中,所述疏水性货物为治疗活性剂。
94.一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法,包括对所述受试者施用根据权利要求93所述的药物组合物。
95.一种包括根据权利要求60至92中任一项所述的胶束的组合物,其适用于药物递送、化妆品、油漆和涂料、作物保护、纳米颗粒合成和催化、家庭和个人护理以及清洁。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862695474P | 2018-07-09 | 2018-07-09 | |
US62/695,474 | 2018-07-09 | ||
PCT/US2019/040775 WO2020014106A1 (en) | 2018-07-09 | 2019-07-08 | Protein-based micelles for the delivery of hydrophobic active compounds |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112384623A true CN112384623A (zh) | 2021-02-19 |
Family
ID=67659930
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201980045931.4A Pending CN112384623A (zh) | 2018-07-09 | 2019-07-08 | 用于疏水活性化合物递送的基于蛋白质的胶束 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210269504A1 (zh) |
EP (1) | EP3821016A1 (zh) |
CN (1) | CN112384623A (zh) |
BR (1) | BR112021000380A2 (zh) |
WO (1) | WO2020014106A1 (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20210269504A1 (en) * | 2018-07-09 | 2021-09-02 | The Regents Of The University Of California | Protein-based micelles for the delivery of hydrophobic active compounds |
CN114225047B (zh) * | 2021-12-13 | 2023-12-26 | 安徽医科大学 | 一种免疫逃逸纳米制剂、制备方法及应用 |
CN115124607B (zh) * | 2022-06-27 | 2024-02-27 | 上海理工大学 | 含有氨基酸结构pfp的自组装肽及其制备方法和应用 |
KR20240043838A (ko) * | 2022-09-27 | 2024-04-04 | 크리포 주식회사 | 주요 아미노산이 전하성 및 소수성 아미노산으로 구성된 비정형 펩타이드 태그를 포함하여 자가 조립체를 형성하는 융합 단백질 및 이를 이용하여 재조합 단백질을 정제하는 방법 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5302526A (en) * | 1987-03-20 | 1994-04-12 | Creative Biomolecules, Inc. | Recombinant DNA enclosed amphiphilic leader sequences for the production and purification of fusion proteins |
US5589364A (en) * | 1994-07-29 | 1996-12-31 | Magainin Pharmaceuticals Inc. | Recombinant production of biologically active peptides and proteins |
CN101374949A (zh) * | 2006-01-31 | 2009-02-25 | 国立水产科学院 | 通过信号序列和分泌增强子生产可溶的天然形式的重组蛋白质 |
WO2017081239A1 (en) * | 2015-11-13 | 2017-05-18 | Spiber Technologies Ab | Charge-reversed n-terminal spider silk protein domain and uses thereof |
US20210269504A1 (en) * | 2018-07-09 | 2021-09-02 | The Regents Of The University Of California | Protein-based micelles for the delivery of hydrophobic active compounds |
-
2019
- 2019-07-08 US US17/258,250 patent/US20210269504A1/en active Pending
- 2019-07-08 BR BR112021000380-0A patent/BR112021000380A2/pt unknown
- 2019-07-08 CN CN201980045931.4A patent/CN112384623A/zh active Pending
- 2019-07-08 WO PCT/US2019/040775 patent/WO2020014106A1/en unknown
- 2019-07-08 EP EP19753489.4A patent/EP3821016A1/en active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5302526A (en) * | 1987-03-20 | 1994-04-12 | Creative Biomolecules, Inc. | Recombinant DNA enclosed amphiphilic leader sequences for the production and purification of fusion proteins |
US5589364A (en) * | 1994-07-29 | 1996-12-31 | Magainin Pharmaceuticals Inc. | Recombinant production of biologically active peptides and proteins |
CN101374949A (zh) * | 2006-01-31 | 2009-02-25 | 国立水产科学院 | 通过信号序列和分泌增强子生产可溶的天然形式的重组蛋白质 |
WO2017081239A1 (en) * | 2015-11-13 | 2017-05-18 | Spiber Technologies Ab | Charge-reversed n-terminal spider silk protein domain and uses thereof |
US20210269504A1 (en) * | 2018-07-09 | 2021-09-02 | The Regents Of The University Of California | Protein-based micelles for the delivery of hydrophobic active compounds |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
BALASUBRAMANIAN VIMALKUMAR ET AL: "Multifaceted polymersome platforms: Spanning from self-assembly to drug delivery and protocells", 《PROGRESS IN POLYMER SCIENCE》 * |
JOSEPH R. SIMON ET AL: "Programming molecular self-assembly of intrinsically disordered proteins containing sequences of low complexity", 《NATURE CHEMISTRY》 * |
K. B. VARGO ET AL: "Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin", 《PROCEEDINGS OF THE NATIONA-ACADEMY OF SCIENCES》 * |
MANIRAJ BHAGAWATI ET AL: "Site-Specific Modulation of Charge Controls the Structure and Stimulus Responsiveness of Intrinsically Disordered Peptide Brushes", 《LANGMUIR》 * |
何碧: "自组装两亲性阳离子肽及其抗菌活性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 * |
阮靖淞: "天然无序蛋白的结构性质研究进展", 《中国科技纵横》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR112021000380A2 (pt) | 2021-04-13 |
US20210269504A1 (en) | 2021-09-02 |
EP3821016A1 (en) | 2021-05-19 |
WO2020014106A1 (en) | 2020-01-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112384623A (zh) | 用于疏水活性化合物递送的基于蛋白质的胶束 | |
Tai et al. | Functional peptides for siRNA delivery | |
Karimi et al. | Albumin nanostructures as advanced drug delivery systems | |
Habibi et al. | Protein nanoparticles: uniting the power of proteins with engineering design approaches | |
Wang et al. | Synergistic anticancer effect of RNAi and photothermal therapy mediated by functionalized single-walled carbon nanotubes | |
Ding et al. | A biomimetic nanovector-mediated targeted cholesterol-conjugated siRNA delivery for tumor gene therapy | |
CN102666879B (zh) | 模板化的纳米缀合物 | |
Ezzat et al. | Solid formulation of cell-penetrating peptide nanocomplexes with siRNA and their stability in simulated gastric conditions | |
US11472876B2 (en) | Conditionally active polypeptides | |
JP2007535908A (ja) | 運搬ペプチド、活性物質を有するその構築物および用途 | |
Demchuk et al. | The biomedical and bioengineering potential of protein nanocompartments | |
Li et al. | Preoccupation of empty carriers decreases endo-/lysosome escape and reduces the protein delivery efficiency of mesoporous silica nanoparticles | |
Santra et al. | Functional dye-doped silica nanoparticles for bioimaging, diagnostics and therapeutics | |
CN108024957A (zh) | 用于纳米粒冷冻干燥物形式的组合物及方法 | |
He et al. | Smart cell-penetrating peptide-based techniques for intracellular delivery of therapeutic macromolecules | |
Nag et al. | Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress | |
WO2016072500A1 (ja) | 修飾rnaを含有する分子集合体及びそれを用いたrna送達システム | |
EP4141020A1 (en) | Novel cell-penetrating peptide and use thereof | |
US20210106525A1 (en) | Formulations for gastrointestinal delivery of oligonucleotides | |
Pranatharthiharan et al. | Inorganic nanovectors for nucleic acid delivery | |
KR101336552B1 (ko) | 전립선암 특이적 siRNA 전달체 | |
JP5510808B2 (ja) | 有機ナノチューブからなる核酸導入剤 | |
US20200164072A1 (en) | Nanocomplexes for remotely-triggered guest molecule release and methods for fabricating the same | |
KR101579879B1 (ko) | siRNA 전달을 위한 히알루론산-콜레스테롤 나노파티클 및 이를 포함하는 조성물 | |
Fernández-Fernández et al. | Molecular chaperones: functional mechanisms and nanotechnological applications |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20210219 |