一种多项呼吸道抗原检测卡及试剂盒
技术领域
本发明涉及人呼吸道病毒检测领域,具体是一种针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体抗原检测卡及试剂盒。
背景技术
流感病毒有甲、乙、丙三型,甲型最容易引起流行,乙型次之,丙型极少引起流行。依据外膜植物血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同,甲型流感病毒目前可分为15个H亚型(H1~H15)和9个N亚型(N1~N9)。由于编码HA和(或)NA的核酸序列容易发生突变,致使HA和(或)NA的抗原表位发生改变,这种抗原性的转变使人群原有的特异性免疫力失效,故甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行。易感人群多为老年人(>65岁)和婴幼儿(<6岁);临床特点为急起高热,全身酸痛、乏力,或伴轻度呼吸道症状。该病潜伏期短,传染性强,传播迅速。流感病毒分甲、乙、丙三型,甲型流感威胁最大。由于流感病毒致病力强,易发生变异,若人群对变异株缺乏免疫力,易引起暴发流行,迄今世界已发生过五次大的流行和若干次小流行,造成数十亿人发病,数千万人死亡,严重影响了人们的社会生活和生产建设。
呼吸道合胞病毒(RSV)是一种单链、负股、有包膜的RNA病毒,为副黏病毒科肺炎病毒属成员,根据单克隆抗体及核苷酸序列不同,RSV分为A、B 两个抗原亚型,每一亚型又根据G蛋白抗原的不同分为不同的亚系,主要区别在于G、F、N、P蛋白上的抗原组成不同,G蛋白负责病毒与细胞的黏附,F蛋白负责病毒侵入细胞内,同时融合多个细胞膜形成多核巨细胞,对于RSV来说是不可缺少的。该病经空气飞沫和密切接触传播。多见于新生儿和6 个月以内的婴儿,潜伏期3~7日,婴幼儿症状较重,可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎,以后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后,主要表现为上呼吸道感染。
人腺病毒(Human adenovirus,HAdV),腺病毒呈无囊膜的球形结构,其病毒粒子在感染的细胞核内常呈晶格状排列,每个病毒颗粒包含一个36 kb的线性双链DNA,有核衣壳。目前已发现的腺病毒有7个亚群(A~G),86个型别,其中对人类具有致病性的有55个血清型。可感染呼吸***、消化***、泌尿***和眼等,引起相应的临床症状,但呼吸道腺病毒更为常见,其中可导致呼吸道感染的腺病毒包括腺病毒3、7、11、14、21、55型等,主要集中在B亚属,B亚属分别为两个亚种分别命名为B1(腺病毒3、7、16、21和50型)和B2(腺病毒11、14、34和35型),其中3、4、7、14型为最常见的引起爆发疫情的型别。感染后,主要表现为呼吸道感染,一般有发热、咳嗽、咽痛、流涕、肺部啰音类似典型肺炎的表现。
肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae,MP)属细胞外寄生菌,是人类原发性非典型肺炎的病原体。支原体大小介于细菌与病毒之间肺炎支原体,是已知能独立生活的病原微生物中最小者。含DNA和RNA,缺乏细胞壁,呈球形、杆状、丝状等多种形态,革兰染色阴性。MP感染,由支原体感染引起,其基本病理呈间质性肺炎或毛细支气管炎样改变,临床表现以顽固性剧烈咳嗽为特征。
MP肺炎的发病主要是由飞沫传播,当病原体由呼吸道进入后,在粘膜表面与呼吸道粘膜上皮细胞的神经氨酸受体紧密结合而附着,从而造成粘膜上皮细胞的破坏,这是MP的主要致病方式。
黏附素主要包括P1和P30。P1被认为是肺炎支原体的主要黏附素。缺乏P1或P1 在顶器表面分布不足或未定居于顶器表面的合适位置,肺炎支原体就不能黏附于呼吸道上皮,也无毒力。研究证明 P1 蛋白还有抗原性及免疫原性。
经研究发现了一个阻止MP对小鸡红细胞黏附的单克隆抗体,能识别野生性肺炎支原体中的一个20kDa蛋白,即P30蛋白。并发现肺炎支原体Ⅱ型非吸附无毒力突变珠不存在P30 蛋白,而Ⅱ型突变株的回复后又可重新合成P30蛋白,并获得细胞黏附功能,并具有毒力。P30与P1相似,群居于顶器上,具有高的免疫原性,与P1黏附素有许多共同的特征。
病原体感染的实验室检查方法,主要分为分离培养、血清学检测和抗原检测三种。分离培养有诊断意义,但其漏诊率较高,因此后期大多采用血清型检测进行诊断,而抗原检测凭借其敏感性高、特异性强的优势,慢慢取代血清学检测,对病原体感染的预防、诊断、治疗和预后都有极大贡献。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足,提供一种多项呼吸道抗原检测卡,检测卡可以快速、准确检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体抗原,可同时检测鼻咽拭子、口咽拭子不同检测介质中的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体抗原,一次性取样可同时检测多种病原体,可更好的辅助临床呼吸道感染的病因诊断、鉴别诊断和临床用药。
还提供一种多项呼吸道抗原试剂盒,该试剂盒操作简单,携带方便,个人可检测,达到真正的POCT检测,可有效控制因就医筛查引起的疫情传播;病毒感染出现症状后即可检测出,可用于疾病早期诊断,对患者的治疗有重要的指导意义。
为了解决以上技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种多项呼吸道抗原检测卡,检测卡包括甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条,甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条均包括胶体金结合物垫,胶体金结合物垫包括链霉亲和素结合物垫和双纳米颗粒双标记抗体结合物垫;
链霉亲和素结合物垫的制备方法如下:
调节40nm胶体金溶液至PH为9.0,加入链霉亲和素,终浓度为8~15μg/mL,室温静置1h,加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液,室温静置1h,在4℃8000rpm离心30min获得沉淀物即为胶体金标记的链霉亲和素,取玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后胶体金标记物40~50mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,干燥,得链霉亲和素结合物垫;
双纳米颗粒双标记抗体结合物垫的制备方法如下:
调节13nm胶体金溶液PH至8.5,加入相应标记抗体,甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体、呼吸道腺病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体或肺炎支原体抗体,终浓度15~20μg/mL,室温静置1h,加入1mg/mL 生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液,终浓度为1~2µmol/L,4℃静置24h,加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液,室温静置1h,在4℃10000rpm离心30min获得沉淀即为小颗粒纳米金;
调节80nm胶体金溶液PH至9.0,加入相应标记抗体,甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体、呼吸道腺病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体或肺炎支原体抗体,终浓度20~30μg/mL,室温静置1h,加入1mg/mL 生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液,终浓度为1~2µmol/L,4℃静置24h,加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液,室温静置1h,在4℃8000rpm离心45min获得沉淀即为大颗粒纳米金;
小颗粒纳米金与大颗粒纳米金按一定体积比混合制得双纳米颗粒双标记抗体混合物,其比例为3:5;
取玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后双纳米颗粒双标记抗体混合物40~50mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,干燥,得双纳米颗粒双标记抗体结合物垫。
作为一种优化方案,甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条均包括样品垫,样品垫使用样品垫处理液处理,样品垫处理液包括pH为8.0~11.0的缓冲液、大分子聚合物、表面活性剂、封闭剂和阻断剂。
作为一种优化方案,相对于每100mL的缓冲液, 大分子聚合物的添加量为0.05~0.20g,表面活性剂的添加量为0.05~0.20mL,封闭剂的添加量为0.05~0.20g,阻断剂的添加量为0.5~2.0mL。
作为一种优化方案,缓冲液为Tris缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液中的一种;大分子聚合物为PVP、PEG20000中的至少一种;表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通100、S9、S21中的至少两种;封闭剂为酪蛋白、酪蛋白钠、BSA中的一种;阻断剂为HBR。
作为一种优化方案,缓冲液为10~100mM的Tris-HCL缓冲液;大分子聚合物为PVP;表面活性剂为曲拉通100、S9;封闭剂为酪蛋白钠;阻断剂为HBR。
作为一种优化方案,还包括硝酸纤维素膜、吸水纸和底板,底板的中间位置粘贴硝酸纤维素膜,上方粘贴吸水纸,下方粘贴制备的链霉亲和素结合物垫、双纳米颗粒双标记抗体结合物垫和样品垫。
作为一种优化方案,硝酸纤维素膜上包被相应抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线。
作为一种优化方案,甲型流感病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被甲型流感病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线;甲型流感病毒抗体浓度为1.5~2.0mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.0~2.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
乙型流感病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被乙型流感病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,乙型流感病毒抗体浓度为1.5~2.0mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.0~2.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
呼吸道腺病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被呼吸道腺病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,呼吸道腺病毒抗体浓度为1.5~2.0mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.0~2.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
呼吸道合胞病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被呼吸道合胞病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,呼吸道合胞病毒抗体浓度为1.5~2.0mg/mL;羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0~2.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
肺炎支原体抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被肺炎支原体抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,肺炎支原体抗体浓度为1.5~2.0mg/mL,其P1:P30比例3:2;羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.0~2.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用。
一种多项呼吸道抗原试剂盒,试剂盒包括上述检测卡和样本稀释液。
作为一种优化方案,样本稀释液包括PH为8.0~10.5的Tris-HCL缓冲液、质量分数为0.1~1.0% 的酪蛋白、体积分数为0.01~0.10%的吐温20、体积分数为0.05~0.20%的曲拉通100和体积分数为0.10~0.20%的Proclin-300。
本发明采取以上技术方案,具有以下优点:
1、本专利检测卡中的试纸条将亲和素-生物素放大***应用于胶体金颗粒免疫层析体系,并采用双纳米颗粒双标记抗体,使生物原料反应充分,提高抗原检测的灵敏度,有效降低漏检,同时样品垫中添加阻断剂提高特异性,能够同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体抗原,为提高抗原检测的灵敏度,同时采用双胶体金颗粒结合物垫,采用不同粒径的胶体金颗粒标记制备,粒径大小不同,层析速度略有差异,有助于两个胶体金结合物垫中生物原料充分反应。
2、本专利检测卡可以快速、准确检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体抗原,可同时检测鼻咽拭子、口咽拭子、痰液不同检测介质中的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体抗原,一次性取样可同时检测多种病原体,可更好的辅助临床呼吸道感染的病因诊断、鉴别诊断和临床用药。
3、本专利试剂盒操作简单,携带方便,个人可检测,达到真正的POCT检测,可有效控制因就医筛查引起的疫情传播;病毒感染出现症状后即可检测出,可用于疾病早期诊断,对患者的治疗有重要的指导意义,同时分辨并排除相关呼吸道病原体感染,及时阻断传染源。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,实施例中未注明具体条件,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市场购买获得的常规产品。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1:一种多项呼吸道抗原检测卡,检测卡包括甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条、肺炎支原体抗原试纸条、卡体和卡盖,卡体和卡盖扣合在一起,卡体上设置有凹槽,甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条位于凹槽内。
甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条均包括底板、样品垫、胶体金结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸,底板为PVC板,样品垫、胶体金结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸粘贴在底板上且依次搭接,胶体金结合物垫包括链霉亲和素结合物垫和双纳米颗粒双标记抗体结合物垫,在底板的中间位置粘贴制备的硝酸纤维素膜,在底板固定硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水纸;在底板固定硝酸纤维素膜位置的下方,粘贴制备的胶体金结合物垫包括链霉亲和素结合物垫、双纳米颗粒双标记抗体结合物垫、样品垫,将上述步骤得到的产品压平整后,切成3.0mm~4.0mm宽的试纸条。
链霉亲和素结合物垫的制备方法如下:
调节40nm胶体金溶液至PH为9.0,加入链霉亲和素,终浓度为8μg/mL,室温静置1h,加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液,室温静置1h,在4℃8000rpm离心30min获得沉淀物即为胶体金标记的链霉亲和素,取玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后胶体金标记物40mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,干燥,得链霉亲和素结合物垫。
双纳米颗粒双标记抗体结合物垫的制备方法如下:
调节13nm胶体金溶液PH至8.5,加入相应标记抗体(甲型流感病毒抗体/乙型流感病毒抗体/呼吸道腺病毒抗体/呼吸道合胞病毒抗体/肺炎支原体抗体),终浓度15μg/mL,室温静置1h,加入1mg/mL 生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液,终浓度为1µmol/L,4℃静置24h,加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液,室温静置1h,在4℃10000rpm离心30min获得沉淀即为小颗粒纳米金。
调节80nm胶体金溶液PH至9.0,加入相应标记抗体(甲型流感病毒抗体/乙型流感病毒抗体/呼吸道腺病毒抗体/呼吸道合胞病毒抗体/肺炎支原体抗体),终浓度20μg/mL,室温静置1h,加入1mg/mL 生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液,终浓度为1µmol/L,4℃静置24h,加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液,室温静置1h,在4℃8000rpm离心45min获得沉淀即为大颗粒纳米金。
小颗粒纳米金与大颗粒纳米金按一定体积比混合制得双纳米颗粒双标记抗体混合物,其比例为3:5。
取玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后双纳米颗粒双标记抗体混合物40mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,干燥,得双纳米颗粒双标记抗体结合物垫。
甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条均包括样品垫,样品垫使用样品垫处理液处理,样品垫处理液包括pH为8.0的缓冲液、大分子聚合物、表面活性剂、封闭剂和阻断剂。
其中,相对于每100mL的缓冲液, 大分子聚合物的添加量为0.05g,表面活性剂的添加量为0.05mL,封闭剂的添加量为0.05g,阻断剂的添加量为0.5mL。
缓冲液为Tris缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液中的一种;大分子聚合物为PVP、PEG20000中的至少一种;表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通100、S9、S21中的至少两种;封闭剂为酪蛋白、酪蛋白钠、BSA中的一种;阻断剂为HBR。
缓冲液为10mM的Tris-HCL缓冲液;大分子聚合物为PVP;表面活性剂为曲拉通100、S9;封闭剂为酪蛋白钠;阻断剂为HBR。
配制1L样品垫处理液:10mM Tris-HCL(pH 8.0) 1.21gTris、0.5g PVP、0.5mL曲拉通100、0.5mL S9、0.5g酪蛋白钠、5mLHBR。
处理样品垫:每张30cm×25cm的样品垫,用50mL处理液均匀涂布后置于电热鼓风干燥箱中干燥12h以上,干燥保存备用。
底板的中间位置粘贴硝酸纤维素膜,上方粘贴吸水纸,下方粘贴制备的链霉亲和素结合物垫、双纳米颗粒双标记抗体结合物垫和样品垫,硝酸纤维素膜上包被相应抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线。
甲型流感病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被甲型流感病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线;甲型流感病毒抗体浓度为1.5mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
乙型流感病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被乙型流感病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,乙型流感病毒抗体浓度为1.5mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
呼吸道腺病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被呼吸道腺病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,呼吸道腺病毒抗体浓度为1.5mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
呼吸道合胞病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被呼吸道合胞病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,呼吸道合胞病毒抗体浓度为1.5mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
肺炎支原体抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被肺炎支原体抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,肺炎支原体抗体浓度为1.5mg/mL,其P1:P30比例3:2;羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用。
还包括保护剂,保护剂为蔗糖、海藻糖中的一种。
实施例2:一种多项呼吸道抗原检测卡,检测卡包括甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条、肺炎支原体抗原试纸条、卡体和卡盖,卡体和卡盖扣合在一起,卡体上设置有凹槽,甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条位于凹槽内。
甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条均包括底板、样品垫、胶体金结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸,底板为PVC板,样品垫、胶体金结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸粘贴在底板上且依次搭接,胶体金结合物垫包括链霉亲和素结合物垫和双纳米颗粒双标记抗体结合物垫,在底板的中间位置粘贴制备的硝酸纤维素膜,在底板固定硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水纸;在底板固定硝酸纤维素膜位置的下方,粘贴制备的胶体金结合物垫包括链霉亲和素结合物垫、、双纳米颗粒双标记抗体结合物垫、样品垫,将上述步骤得到的产品压平整后,切成3.0mm~4.0mm宽的试纸条。
链霉亲和素结合物垫的制备方法如下:
调节40nm胶体金溶液至PH为9.0,加入链霉亲和素,终浓度为15μg/mL,室温静置1h,加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液,室温静置1h,在4℃8000rpm离心30min获得沉淀物即为胶体金标记的链霉亲和素,取玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后胶体金标记物50mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,干燥,得链霉亲和素结合物垫。
双纳米颗粒双标记抗体结合物垫的制备方法如下:
调节13nm胶体金溶液PH至8.5,加入相应标记抗体(甲型流感病毒抗体/乙型流感病毒抗体/呼吸道腺病毒抗体/呼吸道合胞病毒抗体/肺炎支原体抗体),终浓度20μg/mL,室温静置1h,加入1mg/mL 生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液,终浓度为2µmol/L,4℃静置24h,加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液,室温静置1h,在4℃10000rpm离心30min获得沉淀即为小颗粒纳米金。
调节80nm胶体金溶液PH至9.0,加入相应标记抗体(甲型流感病毒抗体/乙型流感病毒抗体/呼吸道腺病毒抗体/呼吸道合胞病毒抗体/肺炎支原体抗体),终浓度30μg/mL,室温静置1h,加入1mg/mL 生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液,终浓度为2µmol/L,4℃静置24h,加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液,室温静置1h,在4℃8000rpm离心45min获得沉淀即为大颗粒纳米金。
小颗粒纳米金与大颗粒纳米金按一定体积比混合制得双纳米颗粒双标记抗体混合物,其比例为3:5。
取玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后双纳米颗粒双标记抗体混合物50mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,干燥,得双纳米颗粒双标记抗体结合物垫。
甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条均包括样品垫,样品垫使用样品垫处理液处理,样品垫处理液包括pH为11.0的缓冲液、大分子聚合物、表面活性剂、封闭剂和阻断剂。
其中,相对于每100mL的缓冲液, 大分子聚合物的添加量为0.10g,表面活性剂的添加量为0.10mL,封闭剂的添加量为0.10g,阻断剂的添加量为1.2mL。
缓冲液为Tris缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液中的一种;大分子聚合物为PVP、PEG20000中的至少一种;表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通100、S9、S21中的至少两种;封闭剂为酪蛋白、酪蛋白钠、BSA中的一种;阻断剂为HBR。
缓冲液为55mM的Tris-HCL缓冲液;大分子聚合物为PVP;表面活性剂为曲拉通100、S9;封闭剂为酪蛋白钠;阻断剂为HBR。
配制1L样品垫处理液:55mM Tris-HCL(pH 9.5)中含6.06gTris、1.0g PVP、1.0mL曲拉通100、1.0mL S9、1.0g酪蛋白钠、12mLHBR。
处理样品垫:每张30cm×25cm的样品垫,用50mL处理液均匀涂布后置于电热鼓风干燥箱中干燥12h以上,干燥保存备用。
底板的中间位置粘贴硝酸纤维素膜,上方粘贴吸水纸,下方粘贴制备的链霉亲和素结合物垫、双纳米颗粒双标记抗体结合物垫和样品垫,硝酸纤维素膜上包被相应抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线。
甲型流感病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被甲型流感病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线;甲型流感病毒抗体浓度为2.0mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为2.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
乙型流感病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被乙型流感病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,乙型流感病毒抗体浓度为2.0mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为2.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
呼吸道腺病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被呼吸道腺病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,呼吸道腺病毒抗体浓度为2.0mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为2.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
呼吸道合胞病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被呼吸道合胞病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,呼吸道合胞病毒抗体浓度为2.0mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为2.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
肺炎支原体抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被肺炎支原体抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,肺炎支原体抗体浓度为2.0mg/mL,其P1:P30比例3:2;羊抗鼠IgG抗体浓度为2.0mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用。
还包括保护剂,保护剂为蔗糖、海藻糖中的一种。
实施例3:一种多项呼吸道抗原检测卡,检测卡包括甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条、肺炎支原体抗原试纸条、卡体和卡盖,卡体和卡盖扣合在一起,卡体上设置有凹槽,甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条位于凹槽内。
甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条均包括底板、样品垫、胶体金结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸,底板为PVC板,样品垫、胶体金结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸粘贴在底板上且依次搭接,胶体金结合物垫包括链霉亲和素结合物垫和双纳米颗粒双标记抗体结合物垫,在底板的中间位置粘贴制备的硝酸纤维素膜,在底板固定硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水纸;在底板固定硝酸纤维素膜位置的下方,粘贴制备的胶体金结合物垫包括链霉亲和素结合物垫、、双纳米颗粒双标记抗体结合物垫、样品垫,将上述步骤得到的产品压平整后,切成3.0mm~4.0mm宽的试纸条。
链霉亲和素结合物垫的制备方法如下:
调节40nm胶体金溶液至PH为9.0,加入链霉亲和素,终浓度为12μg/mL,室温静置1h,加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液,室温静置1h,在4℃8000rpm离心30min获得沉淀物即为胶体金标记的链霉亲和素,取玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后胶体金标记物45mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,干燥,得链霉亲和素结合物垫。
双纳米颗粒双标记抗体结合物垫的制备方法如下:
调节13nm胶体金溶液PH至8.5,加入相应标记抗体(甲型流感病毒抗体/乙型流感病毒抗体/呼吸道腺病毒抗体/呼吸道合胞病毒抗体/肺炎支原体抗体),终浓度18μg/mL,室温静置1h,加入1mg/mL 生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液,终浓度为1.5µmol/L,4℃静置24h,加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液,室温静置1h,在4℃10000rpm离心30min获得沉淀即为小颗粒纳米金。
调节80nm胶体金溶液PH至9.0,加入相应标记抗体(甲型流感病毒抗体/乙型流感病毒抗体/呼吸道腺病毒抗体/呼吸道合胞病毒抗体/肺炎支原体抗体),终浓度25μg/mL,室温静置1h,加入1mg/mL 生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯溶液,终浓度为1.5µmol/L,4℃静置24h,加入1/10体积含10%BSA磷酸盐溶液,室温静置1h,在4℃8000rpm离心45min获得沉淀即为大颗粒纳米金。
小颗粒纳米金与大颗粒纳米金按一定体积比混合制得双纳米颗粒双标记抗体混合物,其比例为3:5。
取玻璃纤维放入不锈钢盘,量取复溶后双纳米颗粒双标记抗体混合物45mL倒入不锈钢盘,使金溶液完全均匀吸收,干燥,得双纳米颗粒双标记抗体结合物垫。
甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条均包括样品垫,样品垫使用样品垫处理液处理,样品垫处理液包括pH为10的缓冲液、大分子聚合物、表面活性剂、封闭剂和阻断剂。
其中,相对于每100mL的缓冲液, 大分子聚合物的添加量为0.20g,表面活性剂的添加量为0.20 mL,封闭剂的添加量为0.20g,阻断剂的添加量为2.0 mL。
缓冲液为Tris缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液中的一种;大分子聚合物为PVP、PEG20000中的至少一种;表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通100、S9、S21中的至少两种;封闭剂为酪蛋白、酪蛋白钠、BSA中的一种;阻断剂为HBR。
缓冲液为100mM的Tris-HCL缓冲液;大分子聚合物为PVP;表面活性剂为曲拉通100、S9;封闭剂为酪蛋白钠;阻断剂为HBR。
配制1L样品垫处理液:100mM Tris-HCL(pH 11)中含12.11gTris、2.0g PVP、2.0mL曲拉通100、2.0mL S9、2.0g酪蛋白钠、20mLHBR。
处理样品垫:每张30cm×25cm的样品垫,用50mL处理液均匀涂布后置于电热鼓风干燥箱中干燥12h以上,干燥保存备用。
底板的中间位置粘贴硝酸纤维素膜,上方粘贴吸水纸,下方粘贴制备的链霉亲和素结合物垫、双纳米颗粒双标记抗体结合物垫和样品垫,硝酸纤维素膜上包被相应抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线。
甲型流感病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被甲型流感病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线;甲型流感病毒抗体浓度为1.8mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.5mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
乙型流感病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被乙型流感病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,乙型流感病毒抗体浓度为1.8mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.5mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
呼吸道腺病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被呼吸道腺病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,呼吸道腺病毒抗体浓度为1.8mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.5mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
呼吸道合胞病毒抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被呼吸道合胞病毒抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,呼吸道合胞病毒抗体浓度为1.8mg/mL;羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.5mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用;
肺炎支原体抗原试纸条上的硝酸纤维素膜包被肺炎支原体抗体和羊抗鼠IgG抗体,形成检测线和质控线,其中,肺炎支原体抗体浓度为1.8mg/mL,其P1:P30比例3:2;羊抗鼠IgG抗体浓度为1.5mg/mL;电热鼓风干燥箱中60℃干燥2h,干燥保存备用。
还包括保护剂,保护剂为蔗糖、海藻糖中的一种。
实施例4:一种多项呼吸道抗原试剂盒,包括实施例1-3其中之一的检测卡和样本稀释液,样本稀释液包括PH为8.0~10.5的Tris-HCL缓冲液、质量分数为0.1~1.0% 的酪蛋白、体积分数为0.01~0.10%的吐温20、体积分数为0.05~0.20%的曲拉通100和体积分数为0.10~0.20%的Proclin-300。
配制1L样本稀释液:终浓度为10mM Tris-HCL (pH 8.0)中含1.21gTris、1.0g酪蛋白、0.1mL吐 温20 、0.5ml曲拉通100、1.0mL Proclin-300 ,余量为纯化水。
分别将甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条置于检测卡中,试纸条位于检测卡卡体的凹槽内,将卡盖和卡体扣合,得到多项呼吸道抗原检测卡;将配制的样本稀释液装入瓶内,与检测卡分别置于盒体内,得到多项呼吸道抗原检测试剂盒。
实施例5:一种多项呼吸道抗原试剂盒,包括实施例1-3其中之一的检测卡和样本稀释液。
样本稀释液包括PH为8.0~10.5的Tris-HCL缓冲液、质量分数为0.1~1.0% 的酪蛋白、体积分数为0.01~0.10%的吐温20、体积分数为0.05~0.20%的曲拉通100和体积分数为0.10~0.20%的Proclin-300。
配制1L样本稀释液:终浓度为10mM Tris-HCL (pH 9.0)中含1.21gTris、5.0g酪蛋白、0.6mL吐温20 、1.0ml曲拉通100、1.5mL Proclin-300 ,余量为纯化水。
分别将甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条置于检测卡中,试纸条位于检测卡卡体的凹槽内,将卡盖和卡体扣合,得到多项呼吸道抗原检测卡;将配制的样本稀释液装入瓶内,与检测卡分别置于盒体内,得到多项呼吸道抗原检测试剂盒。
实施例6:一种多项呼吸道抗原试剂盒,包括实施例1-3其中之一的检测卡和样本稀释液。
样本稀释液包括PH为8.0~10.5的Tris-HCL缓冲液、质量分数为0.1~1.0% 的酪蛋白、体积分数为0.01~0.10%的吐温20、体积分数为0.05~0.20%的曲拉通100和体积分数为0.10~0.20%的Proclin-300。
配制1L样本稀释液:终浓度为10mM Tris-HCL (pH 10.5)中含1.21gTris、10.0g酪蛋白、1.0mL吐温20 、2.0ml曲拉通100、2.0mL Proclin-300 ,余量为纯化水。
分别将甲型流感病毒抗原试纸条、乙型流感病毒抗原试纸条、呼吸道腺病毒抗原试纸条、呼吸道合胞病毒抗原试纸条和肺炎支原体抗原试纸条置于检测卡中,试纸条位于检测卡卡体的凹槽内,将卡盖和卡体扣合,得到多项呼吸道抗原检测卡;将配制的样本稀释液装入瓶内,与检测卡分别置于盒体内,得到多项呼吸道抗原检测试剂盒。
实施例7:一种用实施例4-6其中之一所述的试剂盒检测多项呼吸道抗原的检测方法,检测方法如下:
(1)检测
a、检测样本包括鼻咽拭子、口咽拭子、痰液;
b、在附属的试剂管中加入0.55mL样本稀释液;
c、将采集样本后的拭子浸入样本稀释液中,使样本稀释液充分浸透拭子,旋转挤压拭子10次,然后拔出拭子,绞出的液体作为样品液待测;
d、滴加3滴样品液,滴加量60~80µL到检测卡的加样孔,10~15min观察结果,20min后结果无效;
(2)结果判断
a、阴性:仅质控区C出现一条红色条带,在测试区T内无红色条带出现;
b、阳性:两条条带出现,一条红色条带位于测试区T内,另一条红色条带位于质控区C;
c、无效:质控区C未出现红色条带,表明操作过程不正确或检测卡已损坏。
实验数据如下:
灵敏度试验
(1)甲型流感病毒按下表进行稀释,各稀释20份,结果如下表:
含量(TCID<sub>50</sub>/L) |
10<sup>5</sup> |
10<sup>4</sup> |
10<sup>3</sup> |
10<sup>2</sup> |
检出情况 |
100% |
100% |
80% |
35% |
(2)乙型流感病毒按下表进行稀释,各稀释20份,结果如下表:
含量(TCID<sub>50</sub>/L) |
10<sup>5</sup> |
10<sup>4</sup> |
10<sup>3</sup> |
10<sup>2</sup> |
检出情况 |
100% |
100% |
75% |
20% |
(3)呼吸道腺病毒按下表进行稀释,各稀释20份,结果如下表:
含量(VP/mL) |
10<sup>5</sup> |
10<sup>4</sup> |
10<sup>3</sup> |
10<sup>2</sup> |
检出情况 |
100% |
100% |
85% |
40% |
(4)呼吸道合胞病毒按下表进行稀释,各稀释20份,结果如下表:
含量(TCID<sub>50</sub>/mL) |
10<sup>5</sup> |
10<sup>4</sup> |
10<sup>3</sup> |
10<sup>2</sup> |
检出情况 |
100% |
100% |
80% |
30% |
(5)肺炎支原体按下表进行稀释,各稀释20份,结果如下表:
含量(CFU/mL) |
10<sup>5</sup> |
10<sup>4</sup> |
10<sup>3</sup> |
10<sup>2</sup> |
检出情况 |
100% |
100% |
95% |
45% |
本发明试剂盒甲型流感病毒最低可检出104TCID50/L、乙型流感病毒最低可检出104TCID50/L、呼吸道腺病毒抗原最低可检出104VP/mL、呼吸道合胞病毒最低可检出104TCID50/mL、肺炎支原体抗原最低可检出103CFU/mL。
特异性(抗干扰能力)试验
临床检验中,检测样本常包含与抗原结构相近或临床症状相似的其他病原体,选取临床确诊副流感病毒(混合)、肺炎衣原体、腺病毒、肺炎链球菌、流感病毒A型、流感病毒B型阳性样本各10例,用本发明的试剂盒检测,结果均为阴性,证明本试剂盒特异性好,不与副流感病毒(混合)、肺炎衣原体、腺病毒、肺炎链球菌、流感病毒A型、流感病毒B型产生交叉反应。
本专利检测方法,该方法使用样本量少、可操作性强、耗时短,可在20min内得到检测结果。
最后应说明的是:以上仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,实施方式的举例,其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。