CN112362777A - 宝乐果及其制品中标志性成分Borojo-8,9-环烯醚萜苷的微量分析方法 - Google Patents
宝乐果及其制品中标志性成分Borojo-8,9-环烯醚萜苷的微量分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了宝乐果及其制品中标志性成分Borojo‑8,9‑环烯醚萜苷的微量分析方法，包括如下步骤：步骤1：Borojo原果的前处理；步骤2：Borojo酶解浓缩粉的前处理；步骤3：宝乐果发酵果酒的前处理；步骤4：含宝乐果成分饮料的前处理；步骤5：含宝乐果成分糕点、面包和饼干的前处理；步骤6：含宝乐果成分化妆品的前处理。本发明对多种不同基质的宝乐果产品中微量标志活性物的分析测试，排除了不同产品中类成分干扰，质谱分析引入了内标的使用。同时建立了液相色谱分析技术，确保对宝乐果产品中微量目标物的再现分析及其结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定方法，特别涉及宝乐果及其制品中标志性成分Borojo-8,9-环烯醚萜苷的微量分析方法。
背景技术
宝乐果(中文名)(西班牙名Borojo)是一种生长在南美洲热带雨林的水果，它只适应南美洲厄瓜多尔气候生长，茜草科林果属植物。Borojo果实直径达到7-12厘米，未成熟时绿色，成熟后转为茶褐色，重量700-1000克/只，果肉柔软，味酸且粘稠，去种子后果肉重量占88％。宝乐果具有一种特别的独有的香气，浓郁而久长。长久以来，当地土著人因其富含营养和促进健康的效果而将其视为珍宝，有着几千年的食用习惯。宝乐果营养丰富，含多糖、多酚、总黄酮、萜类、植物油、多种矿物质、多种维生素、稀土元素，蛋白质、必需氨基酸等成分，其自身营养成分配制比例同人类相近，适合人类吸收利用，美国人称其为“21世纪超级水果”。
经国际检索，2008年美国新泽西州立大学(RUTGERS)食品技术发展中心报道，在Borojo植物图谱中发现一个分子量为388的物质。认为是唯一一个先前未经确认的、含量丰富的、新奇的、“单一多酚类”物质。该实验室优化采用ISO14502-1/2:2005《SOP植物中茶多酚的检验方法--分光光度法》的方法进行分析，每100g Borojo sorbilis Cuatrec冻干粉中检出茶多酚(以没食子酸计gallic acid)0.323g。
2010年8月11日www.nutropical.com网站报道了Secaucus NJ(PRWEB)的文章：Borojo sorbilis Cuatrec研究结果发现，Borojo sorbilis Cuatrec中只含有一种多酚并相对浓度很高，这在植物界是独一无二的具有革命性意义。
2010年中国以焦红教授为核心的食品研究技术团队受南美华侨委托，对Borojosorbilis Cuatrec全营养成分、食物安全性和营养功效进行了全面的研究。2013年同中国科学院华南植物园合作，鉴定并给Borojo sorbilis Cuatrec命名中文名宝乐果。2014年申请宝乐果粉进入中国新食品原料行政审批。2017年第7号公告被国家卫计委批准为：中国新食品原料宝乐果粉。
早在2011年，焦红的团队优化提取了宝乐果中丰度极高、单一分子量的、被美国学者成为“多酚”的物质，采用高分辨质谱、核磁共振以及红外光谱3种方法对宝乐果中高含量天然活性物进行了分子结构的鉴定。得出结果：
1.高分辨质谱HPLC-MS/MS全扫描，仪器：API 3200Qtrap，离子扫描模式：EI
①ESI-负离子扫描，保留时间为2.79min，重现了(RUTGERS)食品技术发展中心确认的为“单一多酚类”的成分，分子量为388。在扫描图谱中，该物质极性最强。共流出物质中还有一个m/z 775.5的物质，推断是388二聚体775.5(2M-H)，如图1所示。
②对二聚体M/Z 775.5特殊扫描确证，判断其二级碎片峰为M/Z 387(M-H-)，脱羧峰为M/Z 343(M-C02-H-)。
③对M/Z 387(M-H-)和M/Z 343(M-H20-H-)及其所有碎片进行特殊扫描确证，推断M/Z 343(M-H20-H-)可脱掉六碳糖。该扫描效果的丰度远胜于(RUTGERS)食品技术发展中心的碎片峰图。
④经查询质谱文献分析，多酚、黄酮或类黄酮等结构在脱掉六碳糖162分子量后，产生的骨架结构应该大于181，但在本次离子阱扫描结果中不存在此类物质，故初步判断，宝乐果中主要特征物质分子量为388的活性物质不是多酚类、黄酮或类黄酮结构。
⑤环烯醚萜苷分子特性是具有端位六碳糖，其CID谱中具有较强的[M－H－162]－峰。我们的扫描图中M/Z 181是经过峰M/Z 343(M-C02-H-脱羧而来，M/Z 181可继续脱羧形成M/Z 136.9和93。宝乐果具有环烯醚萜苷类质谱的显著特点。
⑥根据宝乐果果实的pH值偏酸，m/z 387保留时间短的特点，推断该目标物质除六碳糖外，应该具有多个羧酸结构，至少M/Z 181可继续脱羧形成M/Z 136.9和93，可能含有两个羧酸集团。
⑦最后，在高分辨FTMS质谱分析下，确认原分子量388物质的精确分子量是M/Z387.09289,分子式为C16 H20 O11。另一脱羧而来的特征峰M/Z 343精确分子量为M/Z309.04361，分子式为C15 H19 O10。
2、核磁共振对特征分子量(388)活性物质的分子结构鉴定结果
核磁共振谱仪，型号：Avance 500。
化合物结构软件:ChemDraw Ultra推断氢谱和碳谱结构的鉴定
如图2，从核磁共振氢谱图看，全扫描时理论上预测宝乐果主要活性物质结构和实际氢谱基本重合。H谱还有一个应该在5.1左右出的峰，此次没出来，可能被最高的那个溶剂峰5.0给掩盖了。实际氢谱虽然有氘代甲醇的干扰信号，但仍可确定无芳香环等其它结构存在。因此，可确定在氢谱中是没有芳香环类结构物质的。
核磁共振仪碳谱图同全扫描质谱分析理论预测结构也基本符合。在宝乐果主要活性物的实际碳谱中，每个棒状图表示一个碳原子，而且出现了标准的六碳糖集团。即(C’1-98.994，C’2-73.219，C’3-76.379，C’4-70.015，C’5-76.730和C’6-61.260)。糖基化8,9-环烯醚萜苷(8,9-unsaturated iridoids)主要骨架上的碳原子分布情况为：C1-95.022，C3-152.280，C4-111.141，C5-38.849，C6-146.416，C7-134.825，C8-33.89，C9-45.977，C10-166.742和C11-169.242。其它(47.166-48.189)是氘代甲醇的2N+1峰，为试剂的干扰信号。
3、红外光谱鉴定：傅利叶红外-拉曼-显微光谱仪(FT-IP)结果：
如图3，利用提取的宝乐果单一分子量晶体物，进行红外光谱检测，可以推断3405.21为游离-OH集团，2890为-CH-集团，1250-909为脂环醚特征集团吸收峰，970-960峰为-C＝C-吸收峰，进一步证实前期结构的判断同实际结构相吻合。
通过质谱、核磁共振和红外光谱对活性物的结构进行分析推断，可以确定：宝乐果中主要活性物质(质谱质量分子数388的物质)分子结构是：
化学名：8,9-糖基化-环烯醚萜苷(8,9-unsaturated iridoids)(倍半萜)
分子式：C16 H20 O11
精确分子量：M/Z 387.09289
化学结构式：
因此推断：宝乐果的主要活性物质是倍半萜类而非多酚类。这是同美国食品工程技术中心实验室报道的结果不同之处。
此项技术于2011年申请发明专利《Borojo活性提取物及其制备方法和抗菌抗氧化用途》2013.12.18获发明专利授权，ZL201110236556.7。
在此项技术里，对Borojo果酱、果粉及其初产品中的活性物宝乐果-环烯醚萜苷采用HPLC-MS/MS的方法进行了外标法定量测试，建立了宝乐果及其初级产品中的活性物定量分析方法。并用以作为Borojo(宝乐果)及其产品中的标志性鉴定方法判定产品的真伪。
在不断对宝乐果应用研究和产品开发过程中发现，上述技术对基质复杂的保健食品、化妆品、酒、饮料和食品样品中微量宝乐果活性成分的提取，分析过程容易受样品中其他成分的干扰。且质谱外标法使用的成本也高。
发明内容
本发明的目的在于提供宝乐果及其制品中标志性成分Borojo-8,9-环烯醚萜苷的微量分析方法，对多种不同基质宝乐果产品中微量活性物的测试，排除了产品中类成分干扰，在质谱法中引入了内标的使用。同时建立液相色谱分析技术，确保在宝乐果应用范围不断扩大的前景下，对大部分常规样品的目标物分析重现及其结果的准确性，可以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
宝乐果及其制品中标志性成分Borojo-8,9-环烯醚萜苷的微量分析方法，包括如下步骤：
步骤1：Borojo原果的前处理
称取10g样品至烧杯中，加入100mL 60％甲醇水，搅拌均匀，用锡纸纸封住烧杯口，然后90摄氏度水浴加热30分钟，取出烧杯冷却至室温后，离心取上清液，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测；
步骤2：Borojo酶解浓缩粉的前处理
称取1.0g样品至烧杯中，用60％甲醇水溶解定容至100ml，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，滤液用60％甲醇水溶液稀释1000倍后，进高效液相色谱仪检测；
步骤3：宝乐果发酵果酒的前处理
称取1.0g样品于烧杯中，60℃热水中水浴20min，挥发其中乙醇，待样液温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至25ml，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，滤液用60％甲醇水溶液稀释相应倍数后，进高效液相色谱仪检测；
步骤4：含宝乐果成分的饮料的前处理；
步骤5：含宝乐果成分的糕点、面包和饼干的前处理
将样品用粉碎机粉碎或剪碎后，充分搅拌均匀，称取约1.0g样品于烧杯中，加入20ml石油醚，搅拌均匀，放置分层后，倒掉石油醚层，重复操作2次，充分去除样品中脂肪，挥干石油醚后，加入约20ml60％甲醇水溶液，超声提取30min，待溶液冷却至室温后将上层溶液转移至25ml容量瓶中，并用少量60％甲醇水溶液洗涤残渣，洗液并入容量瓶中，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，进高效液相色谱仪检测；
步骤6：含宝乐果成分的化妆品的前处理。
进一步地，步骤4包括液体样品的处理和固体样品的处理两个部分，其中：
(1)液体样品的前处理
称取1.0g样品于25ml容量瓶中，加入约20ml的60％甲醇水溶液，超声提取10min，待液体温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，滤液用60％甲醇水溶液稀释相应倍数后，进高效液相色谱仪检测；
(3)固体样品的前处理
称取0.5g-1.0g样品于25ml容量瓶中，加约5.0ml的水，涡旋震荡，充分将样品溶解，溶解后加入月15.0ml的60％甲醇水溶液，摇匀，超声提取10min-15min，待液体温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，滤液用60％甲醇水溶液稀释相应倍数后，进高效液相色谱仪检测。
进一步地，步骤6包括不含蜡质的样品的处理和含蜡质的样品的处理两个部分，其中：
(1)不含蜡质的样品的处理
称取2.5g样品于10.0ml比色管中，用5.0ml纯净水溶解，超声30分钟，待试液温度降至室温，用60％甲醇水定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测；
(2)含蜡质的样品的前处理
称取2.5g样品于10.0ml比色管中，用1ml四氢呋喃溶解，再加入4ml甲醇，在涡旋振荡器上高速震荡5min，超声30分钟，待试液温度降至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测。
进一步地，包括如下步骤：
S1：Borojo原果的前处理
称取1.0g样品至烧杯中，加入2.0ml内标使用液，加入100mL 60％甲醇水，搅拌均匀，用锡纸纸封住烧杯口，然后90摄氏度水浴加热30分钟，取出烧杯冷却至室温后，离心取上清液，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱-质谱仪检测；
S2：Borojo酶解浓缩粉的前处理
称取0.1g样品至烧杯中，加入2.0ml内标使用液，用60％甲醇水溶解定容至100ml，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱-质谱仪检测；
S3：宝乐果发酵果酒的前处理
称取1.0g样品于烧杯中，加入0.5ml内标使用液，60℃热水中水浴20min，挥发其中乙醇，待样液温度降至室温后，用60％甲醇水定容至25ml，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测；
S4：含宝乐果成分的饮料的前处理
S5：含宝乐果成分的糕点、面包和饼干的前处理
将样品用粉碎机粉碎或剪碎后，充分搅拌均匀，称取约1.0g样品于烧杯中，加入20ml石油醚，搅拌均匀，放置分层后，倒掉石油醚层，重复操作2次，充分去除样品中脂肪，挥干石油醚后，加入约20ml60％甲醇水溶液，加入0.5ml内标使用液，超声提取30min，待溶液冷却至室温后将上层溶液转移至25ml容量瓶中，并用少量60％甲醇水溶液洗涤残渣，洗液并入容量瓶中，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，进高效液相色谱仪检测；
S6：含宝乐果成分的化妆品的前处理。
进一步地，S4包括液体样品的处理和固体样品的处理两个部分，其中：
A：液体样品的前处理
称取1.0g样品于25ml容量瓶中，加入0.5ml内标使用液，加入约20ml的60％甲醇水溶液，超声提取10min，待液体温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测；
B：固体样品的前处理
称取0.5g-1.0g样品于25ml容量瓶中，加约5.0ml的水，涡旋震荡，充分将样品溶解，加入0.5ml内标使用液，溶解后加入月15.0ml的60％甲醇水溶液，摇匀，超声提取10min-15min，待液体温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测。
进一步地，S6包括不含蜡质的样品的处理和含蜡质的样品的处理，其中：
A：不含蜡质的样品的前处理
称取2.5g样品于10ml比色管中，加入0.2ml内标使用液，用4.0ml纯净水溶解，超声30分钟，待试液温度降至室温，用60％甲醇水定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱-质谱仪检测；
B：含蜡质的样品的前处理
称取2.5g样品于10ml比色管中，加入0.2ml内标使用液，用1ml四氢呋喃溶解，再加入4.0ml甲醇，在涡旋振荡器上高速震荡5min，超声30分钟，待试液温度降至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱-质谱仪检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供的2种检测方法具有比第一种方法更高的检测灵敏度和特异性。
2、本发明引入芹菜素为质谱内标法的内标物，可抵消样品在处理过程、上样体积、乃至流动相、检测器等的变化所引起的***误差，确保检测结果准确性。
3、本发明提供的2种检测方法成本低廉、安全环保，具有极高的经济价值。
附图说明
图1为现有技术的高分辨质谱HPLC-MS/MS全扫描的扫描图谱；
图2为现有技术的核磁共振氢谱图；
图3为现有技术的红外光谱图；
图4为本发明Borojo-环烯醚萜苷的高效液相色谱图；
图5为本发明Borojo-环烯醚萜苷和内标物对照品图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
宝乐果及其制品中标志性成分Borojo-8,9-环烯醚萜苷的微量分析方法(高效液相色谱法)
1.试剂与溶液
实验用水为符合GB/T 6682规定的一级水。
试剂：乙腈(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；四氢呋喃(色谱纯)；石油醚(分析纯，沸点30-60℃)，标准品：Borojo对照品。
溶液的配置：
1.标准溶液
1.1标准储备溶液
准确称取Borojo对照品10mg，置于10mL棕色容量瓶中，用60％甲醇水配置成浓度为1.0mg/mL储备液。所用储备液均用锡纸做避光保护，放置在4℃冰箱中储存。
1.2.标准使用溶液
按1：10、1：100、1:200、1：1,000、1:2,000、1：10,000比例用50％甲醇水稀释标准品储备液至2mL进样瓶中，标准曲线浓度范围：0.1μg/ml～100μg/ml。
2.仪器和设备
2.1Shimadzu公司HPLC型号：LC20A
2.2普通C18反相柱，规格：150*4.6mm；粒径：5μ
2.3恒温水浴锅
2.4电子天平
2.5超声波清洗仪
2.6涡旋振荡器。
本实施例的实验步骤如下：
步骤1：Borojo原果的前处理
称取10g样品至烧杯中，加入100mL 60％甲醇水，搅拌均匀，用锡纸纸封住烧杯口，然后90摄氏度水浴加热30分钟，取出烧杯冷却至室温后，离心取上清液，用0.22μm的超滤膜过滤(或用滤纸过滤，滤液再过超滤膜)，进高效液相色谱仪检测；
步骤2：Borojo酶解浓缩粉的前处理
称取1.0g样品至烧杯中，用60％甲醇水溶解定容至100ml，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，滤液用60％甲醇水溶液稀释1000倍后，进高效液相色谱仪检测；
步骤3：宝乐果发酵果酒的前处理
称取1.0g样品于烧杯中，60℃热水中水浴20min，挥发其中乙醇，待样液温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至25ml，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，滤液用60％甲醇水溶液稀释相应倍数后，进高效液相色谱仪检测；
步骤4：含宝乐果成分的饮料的前处理
(1)液体样品的前处理
称取1.0g样品于25ml容量瓶中，加入约20ml的60％甲醇水溶液，超声提取10min，待液体温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，滤液用60％甲醇水溶液稀释相应倍数后，进高效液相色谱仪检测；
(2)固体样品的前处理
称取0.5g-1.0g样品于25ml容量瓶中，加约5.0ml的水，涡旋震荡，充分将样品溶解，溶解后加入月15.0ml的60％甲醇水溶液，摇匀，超声提取10min-15min，待液体温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，滤液用60％甲醇水溶液稀释相应倍数后，进高效液相色谱仪检测。
步骤5：含宝乐果成分的糕点、面包和饼干的前处理
将样品用粉碎机粉碎或剪碎后，充分搅拌均匀，称取约1.0g样品于烧杯中，加入20ml石油醚，搅拌均匀，放置分层后，倒掉石油醚层，重复操作2次，充分去除样品中脂肪，挥干石油醚后，加入约20ml60％甲醇水溶液，超声提取30min，待溶液冷却至室温后将上层溶液转移至25ml容量瓶中，并用少量60％甲醇水溶液洗涤残渣，洗液并入容量瓶中，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，进高效液相色谱仪检测。
步骤6：含宝乐果成分的化妆品的前处理。
(1)不含蜡质的样品的处理(护肤类、香波类、粉类等)
称取2.5g样品于10.0ml比色管中，用5.0ml纯净水溶解，超声30分钟，待试液温度降至室温，用60％甲醇水定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测；
(2)含蜡质的样品的前处理(唇膏、口红等)
称取2.5g样品于10.0ml比色管中，用1ml四氢呋喃溶解，再加入4ml甲醇，在涡旋振荡器上高速震荡5min，超声30分钟，待试液温度降至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测。
液相条件：
水相(A)：高纯水；有机相(B)：乙腈；进样条件：8％有机相，92％水相等度进样15min；流速:1.0mL/min；
柱温:25℃；进样量:10μL。
结果按(1)式计算试样中活性物的含量：
式中:
X——试样中Borojo-环烯醚萜苷含量，单位为毫克每千克，mg/100g；
C——从标准工作曲线得到被测样液中Borojo-环烯醚萜苷的浓度，单位为微克每毫升，μg/mL；
n——初始样液稀释倍数；
V——初始样液的定容体积，单位为毫升，mL；
m——称取的试样质量，单位为克,g。
注：计算结果应表示到小数点后两位。
检出限和定量限
方法浓度为0.01μg/ml，定量浓度为0.03μg/ml，当取样量为1.0g，定容体积为10.0ml时，检出限为0.1mg/kg，定量限为0.3mg/kg，高效液相色谱图如图4。
本实施例的检测结果如下表1：
表1液相色谱法Borojo-环烯醚萜苷回收率测定结果
实施例2
宝乐果及其制品中标志性成分Borojo-8,9-环烯醚萜苷的微量分析方法(高效液相色谱-质谱内标法)
1.试剂与溶液
实验用水为符合GB/T 6682规定的一级水。
试剂：甲醇(色谱纯)；甲酸(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；8,9-环烯醚萜苷对照品；内标物：芹菜素(中国食品药品检定研究院，纯度>99％,批号：111901-201603)。
溶液的配置：
1.标准溶液
1.1标准储备溶液
准确称取标准品10mg，置于10mL棕色容量瓶中，用60％甲醇水配置成浓度为1.0mg/mL储备液。
所用储备液均用锡纸做避光保护，放置在4C冰箱中储存。
1.2标准使用溶液
用水将标准储备液配制成系列浓度：0.20、0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00及50.00ng/mL的标准溶液并加入终浓度为10ng.mL-1的芹菜素内标溶液。
2.内标储备溶液
准确称取标准品10.0mg，置于10mL棕色容量瓶中，用水配置成浓度为1.0mg/mL内标储备液。
2.1内标使用溶液
用水将内标储备液稀释至使用液浓度为500ng/ml。
2仪器和设备
2.1超高效液相串联质谱仪，型号：美国Waters,XEVOTQ-S,四元泵
2.2 ACQUICTYUPLC HSS T3色谱柱，规格：2.1X100 mm,1.8um
2.3冷冻离心机，德国Eppendorf公司，规格：5804R
2.4电子天平，型号：BT-125D。
本实施例的实验步骤如下：
S1：Borojo原果的前处理
称取1.0g样品至烧杯中，加入2.0ml内标使用液，加入100mL 60％甲醇水，搅拌均匀，用锡纸纸封住烧杯口，然后90摄氏度水浴加热30分钟，取出烧杯冷却至室温后，离心取上清液，用0.22μm的超滤膜过滤(或用滤纸过滤，滤液再过超滤膜)，进高效液相色谱-质谱仪检测。
S2：Borojo酶解浓缩粉的前处理
称取0.1g样品至烧杯中，加入2.0ml内标使用液，用60％甲醇水溶解定容至100ml，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱-质谱仪检测；
S3：宝乐果酒的前处理
称取1.0g样品于烧杯中，加入0.5ml内标使用液，60℃热水中水浴20min，挥发其中乙醇，待样液温度降至室温后，用60％甲醇水定容至25ml，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测；
S4：含宝乐果成分的饮料的前处理
A：液体样品的前处理
称取1.0g样品于25ml容量瓶中，加入0.5ml内标使用液，加入约20ml的60％甲醇水溶液，超声提取10min，待液体温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测；
B：固体样品的前处理
称取0.5g-1.0g样品于25ml容量瓶中，加约5.0ml的水，涡旋震荡，充分将样品溶解，加入0.5ml内标使用液，溶解后加入月15.0ml的60％甲醇水溶液，摇匀，超声提取10min-15min，待液体温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测。
S5：含宝乐果成分的糕点、面包和饼干的前处理
将样品用粉碎机粉碎或剪碎后，充分搅拌均匀，称取约1.0g样品于烧杯中，加入20ml石油醚，搅拌均匀，放置分层后，倒掉石油醚层，重复操作2次，充分去除样品中脂肪，挥干石油醚后，加入约20ml60％甲醇水溶液，加入0.5ml内标使用液，超声提取30min，待溶液冷却至室温后将上层溶液转移至25ml容量瓶中，并用少量60％甲醇水溶液洗涤残渣，洗液并入容量瓶中，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，进高效液相色谱仪检测；
S6：含宝乐果成分的化妆品的前处理。
A：不含蜡质的样品的前处理(护肤类、香波类、粉类等)
称取2.5g样品于10ml比色管中，加入0.2ml内标使用液，用4.0ml纯净水溶解，超声30分钟，待试液温度降至室温，用60％甲醇水定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱-质谱仪检测；
B：含蜡质的样品的前处理(唇膏、口红等)
称取2.5g样品于10ml比色管中，加入0.2ml内标使用液，用1ml四氢呋喃溶解，再加入4.0ml甲醇，在涡旋振荡器上高速震荡5min，超声30分钟，待试液温度降至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱-质谱仪检测。
液质联用法色谱条件：水相(A)：0.1％甲酸水溶液；有机相(B)：乙睛；进样条件：梯度洗脱；流速:0.3mL/min；柱温:25℃；进样量:8μL；脱溶剂化温度：350℃；锥孔电压：8V；碰撞电压：15V；锥孔气流量：30fhr-1；脱溶剂气流量：700L＜＜hr-1；离子源：ESI-模式；多离子反应监测通道(MRM)具体参数如表2所示。
表2 Borojo--环烯醚萜苷及其内标的MRM参数
根据样液中Borojo-环烯醚萜苷含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中活性物成分响应值均应在仪器检测线性范围内。
结果按(2)式计算试样中Borojo-环烯醚萜苷的含量：
式中：
X——试样中Borojo-环烯醚萜苷含量，单位为毫克每千克，mg/100g；
C——从标准工作曲线得到被测样液中Borojo-环烯醚萜苷的浓度，单位为微克每毫升，μg/mL；
n——初始样液稀释倍数；
V——初始样液的定容体积，单位为毫升，mL；
m——称取的试样质量，单位为克，g。
检出限和定量限：方法浓度为5.0ng/ml，定量浓度为15.0ng/ml，当取样量为1.0g，定容体积为10.0ml时，检出限为0.05mg/kg，定量限为0.15mg/kg，质谱扫描图如图5。
本实施例的检测结果如下表3:
表1液质联用法Borojo-环烯醚萜苷回收率测定结果
为了克服外标法质谱测试技术的缺陷，对多种不同基质宝乐果产品中微量活性物的测试，排除了产品中类成分干扰，引入了内标的使用。同时建立液相色谱分析技术，确保对常规样品检测结果的准确性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.宝乐果及其制品中标志性成分Borojo-8,9-环烯醚萜苷的微量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：Borojo原果的前处理
称取10g样品至烧杯中，加入100mL 60％甲醇水，搅拌均匀，用锡纸纸封住烧杯口，然后90摄氏度水浴加热30分钟，取出烧杯冷却至室温后，离心取上清液，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测；
步骤2：Borojo酶解浓缩粉的前处理
称取1.0g样品至烧杯中，用60％甲醇水溶解定容至100ml，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，滤液用60％甲醇水溶液稀释1000倍后，进高效液相色谱仪检测；
步骤3：宝乐果发酵果酒的前处理
称取1.0g样品于烧杯中，60℃热水中水浴20min，挥发其中乙醇，待样液温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至25ml，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，滤液用60％甲醇水溶液稀释相应倍数后，进高效液相色谱仪检测；
步骤4：含宝乐果成分饮料的前处理；
步骤5：含宝乐果成分的糕点、面包和饼干的前处理
将样品用粉碎机粉碎或剪碎后，充分搅拌均匀，称取约1.0g样品于烧杯中，加入20ml石油醚，搅拌均匀，放置分层后，倒掉石油醚层，重复操作2次，充分去除样品中脂肪，挥干石油醚后，加入约20ml60％甲醇水溶液，超声提取30min，待溶液冷却至室温后将上层溶液转移至25ml容量瓶中，并用少量60％甲醇水溶液洗涤残渣，洗液并入容量瓶中，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，进高效液相色谱仪检测；
步骤6：含宝乐果成分化妆品的前处理。
2.如权利要求1所述的宝乐果及其制品中标志性成分Borojo-8,9-环烯醚萜苷的微量分析方法，其特征在于，步骤4包括液体样品的前处理和固体样品的前处理两个部分，其中：
(1)液体样品的前处理
称取1.0g样品于25ml容量瓶中，加入约20ml的60％甲醇水溶液，超声提取10min，待液体温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，滤液用60％甲醇水溶液稀释相应倍数后，进高效液相色谱仪检测；
(2)固体样品的前处理
称取0.5g-1.0g样品于25ml容量瓶中，加约5.0ml的水，涡旋震荡，充分将样品溶解，溶解后加入约15.0ml的60％甲醇水溶液，摇匀，超声提取10min-15min，待液体温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，滤液用60％甲醇水溶液稀释相应倍数后，进高效液相色谱仪检测。
3.如权利要求1所述的宝乐果及其制品中标志性成分Borojo-8,9-环烯醚萜苷的微量分析方法，其特征在于，步骤6包括不含蜡质样品的前处理和含蜡质样品的前处理两个部分，其中：
(1)不含蜡质样品的前处理
称取2.5g样品于10.0ml比色管中，用5.0ml纯净水溶解，超声30分钟，待试液温度降至室温，用60％甲醇水定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测；
(2)含蜡质样品的前处理
称取2.5g样品于10.0ml比色管中，用1ml四氢呋喃溶解，再加入4ml甲醇，在涡旋振荡器上高速震荡5min，超声30分钟，待试液温度降至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测。
4.如权利要求1所述的宝乐果及其制品中标志性成分Borojo-8,9-环烯醚萜苷的微量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：Borojo原果的前处理
称取1.0g样品至烧杯中，加入2.0ml内标使用液，加入100mL 60％甲醇水，搅拌均匀，用锡纸纸封住烧杯口，然后90摄氏度水浴加热30分钟，取出烧杯冷却至室温后，离心取上清液，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱-质谱仪检测；
S2：Borojo酶解浓缩粉的前处理
称取0.1g样品至烧杯中，加入2.0ml内标使用液，用60％甲醇水溶解定容至100ml，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱-质谱仪检测；
S3：宝乐果发酵果酒的前处理
称取1.0g样品于烧杯中，加入0.5ml内标使用液，60℃热水中水浴20min，挥发其中乙醇，待样液温度降至室温后，用60％甲醇水定容至25ml，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测；
S4：含宝乐果成分饮料的前处理
S5：含宝乐果成分的糕点、面包和饼干的前处理
将样品用粉碎机粉碎或剪碎后，充分搅拌均匀，称取约1.0g样品于烧杯中，加入20ml石油醚，搅拌均匀，放置分层后，倒掉石油醚层，重复操作2次，充分去除样品中脂肪，挥干石油醚后，加入约20ml60％甲醇水溶液，加入0.5ml内标使用液，超声提取30min，待溶液冷却至室温后将上层溶液转移至25ml容量瓶中，并用少量60％甲醇水溶液洗涤残渣，洗液并入容量瓶中，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，进高效液相色谱仪检测；
S6：含宝乐果成分化妆品的前处理。
5.如权利要求4所述的宝乐果及其制品中标志性成分Borojo-8,9-环烯醚萜苷的微量分析方法，其特征在于，S4包括液体样品的处理和固体样品的处理两个部分，其中：
A：液体样品的前处理
称取1.0g样品于25ml容量瓶中，加入0.5ml内标使用液，加入约20ml的60％甲醇水溶液，超声提取10min，待液体温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测；
B：固体样品的前处理
称取0.5g-1.0g样品于25ml容量瓶中，加约5.0ml的水，涡旋震荡，充分将样品溶解，加入0.5ml内标使用液，溶解后加入月15.0ml的60％甲醇水溶液，摇匀，超声提取10min-15min，待液体温度降至室温后，用60％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱仪检测。
6.如权利要求4所述的宝乐果及其制品中标志性成分Borojo-8,9-环烯醚萜苷的微量分析方法，其特征在于，S6包括不含蜡质样品的前处理和含蜡质样品的前处理，其中：
A：不含蜡质的样品的处理
称取2.5g样品于10ml比色管中，加入0.2ml内标使用液，用4.0ml纯净水溶解，超声30分钟，待试液温度降至室温，用60％甲醇水定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱-质谱仪检测；
B：含蜡质的样品的处理
称取2.5g样品于10ml比色管中，加入0.2ml内标使用液，用1ml四氢呋喃溶解，再加入4.0ml甲醇，在涡旋振荡器上高速震荡5min，超声30分钟，待试液温度降至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm的超滤膜过滤，进高效液相色谱-质谱仪检测。
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