CN112362435A - 细胞染色试剂及细胞染色方法 - Google Patents
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Abstract
一种细胞染色试剂及方法，其中染色试剂包括第一染色液、第二染色液和稀释液；第一染色液中包括第一染料、第二染料、促溶剂、第一促染剂和第一主溶剂；第二染色液中包括第二促染剂和第二主溶剂。将待染色样本与第一染色液和稀释液混合均匀完成第一次染色；经第一次染色后，再加入第二染色液进行二次染色。上述试剂和方法能对样本中的活性细胞进行高效染色，操作简单、细胞染色效果好、染色后细胞特征明显，适用于明视场下的细胞分析，如细胞形态鉴别、细胞分类鉴别和计数。
Description
技术领域
本申请属于细胞染色技术领域，尤其涉及生物体的体液或分泌物中细胞检测分析前的细胞染色技术领域，尤其涉及体液或分泌物中细胞染色方法及试剂。
背景技术
在生物体体液或分泌物的细胞检测中，通常采用细胞染色技术来区分不同种类、不同形态、不同状态的细胞。
用于明场观察检测的常规细胞染色技术中，通常是将待检测样本涂抹在透明载体如载玻片上，等检测样本干燥后，再依次滴入具有不同染色效果的染液及缓冲液，混合均匀完成染色后，再冲洗掉影响观测的染液及缓冲液主体，再等待染色样本干燥后，完成整个染色过程，形成用于明场观测的染色后的样本涂片。
如图1所示，是现有技术中一个血涂片的制作过程示意图，由图可见其包括血涂片制作的步骤和血涂片染色的步骤。
血涂片制作的步骤中包括四个小步骤：分别是，步骤1.1：将血样滴加至载玻片上；步骤1.2：取另一载玻片，按30°～45°角倾斜，匀速向另一边推动；步骤1.3：血膜涂布均匀，呈“火焰”状为合格的涂片；步骤1.4：等待血膜干燥，并准备染色。
涂片染色的步骤中包括五个小步骤：分别是，步骤2.1：铅笔作标记，将血涂片平放在染色架上,蜡笔划线可防液体外溢；步骤2.2：血涂片自然干燥后，滴染液1～2滴覆盖血片,染约1分钟；步骤2.3：滴加稍多体积如2～4滴）的缓冲液，用洗耳球将其与染液吹匀,染约5分钟； 步骤2.4：慢慢摇动玻片，然后用细的自来水流从玻片的一侧冲去染液(注意，需要不要先倒去染液再冲水)，持续约1分钟；步骤2.5：终止冲洗，将血片自然干燥后或用滤纸吸干，即可用于镜检。
从上述步骤可见，现有技术中的染色步骤极其繁琐耗时，染色效率极低，无法大批量进行样本细胞染色。且每个步骤的操作都需训练有素的专业操作者，才能制作出合格的观测样本。
名词解释：
CAS编号（CAS Registry Number或称CAS Number, CAS Rn, CAS #），又称CAS登录号或CAS登记号码，是某种物质（化合物、高分子材料、生物序列（Biological sequences）、混合物或合金）的唯一的数字识别号码。其由美国化学会的下设组织化学文摘社（ChemicalAbstracts Service，简称CAS）构建。该社负责为每一种出现在文献中的物质分配一个CAS编号，避免了化学物质有多种名称的麻烦，使数据库的检索更为方便。
纯化水是指符合《中国药典（2015版）》纯化水标准的水，其主要参数为：pH值为4.4-7.6之间，使用离线电导率仪检测，25℃温度下，标示装量不大于10 ml（毫升）时，电导率不大于25 μS/cm（微西门子每厘米）的水。
发明内容
本申请要解决的技术问题在于避免现有技术上述不足之处，提出了一种简单高效的细胞染色试剂及方法，适用于规模化批量化的样本细胞染色。
本申请解决上述问题的技术方案是一种细胞染色试剂，包括第一染色液和稀释液；所述第一染色液以体积百分比计的含量范围是0.5%～33%；所述稀释液以体积百分比计的含量范围是67%～99.5%；所述细胞染色试剂的pH值范围为6～9。
上述第一染色液和稀释液含量，使细胞染色试剂给细胞染色一个较为适宜的活性染色环境，使细胞活性能保持更持久，有利于利用细胞活性来增强染色效果。利用活性细胞与溶液中染料分子共同的布朗运动，进行染色反应，染色速度更快，效率更高。
所述细胞染色试剂，其中第一染色液独立封装；稀释液独立封装；用于细胞染色时，第一染色液和稀释液联合使用；所述稀释液的pH值范围为6～9。独立封装的第一染色液和稀释液能各自独立封闭保存，保持其各自的特性，在染色时混合均匀后联合使用，完成细胞染色；上述封装方式，方便即配即用。
所述第一染色液中包括：第一染料、第二染料、第一渗透压调节剂和第一主溶剂；每1000ml的第一染色液中，包括第一染料的质量为0.01g～1.00g，第二染料的质量为0.01g～0.30g，第一渗透压调节剂的质量为4.5g～18g；第一主溶剂用量采用定容法确定，即第一主溶剂的用量会使其他组份溶解后能形成1000ml体积的第一染色液。
第一主溶剂的体积或质量的确定是采用定容法。即第一主溶剂的体积或质量，会使上述用量的第一染料、第二染料、渗透压调节剂在第一主溶剂中溶解后形成1000ml的第一染色液。
所述第一染料是甲酚紫，所述第二染料是联苯胺；所述第一渗透压调节剂是氯化钠；所述第一主溶剂是纯化水。
每1000ml的第一染色液中，包括甲酚紫0.3g，联苯胺0.03g。
上述第一染料和第二染料的染色基团选择，使其特别适用于活体细胞染色，这些染色基团能利用细胞膜的主动转运功能穿透细胞膜进入细胞内，进一步地提高了细胞染色效率。
所述第一染色液中还包括：促溶剂和第一促染剂；每1000ml的第一染色液中包括，促溶剂的质量为1.05g～31.50g，第一促染剂的质量为0.22g～1.08g。
所述促溶剂包括无水乙酸或醋酸溶液；所述第一促染剂包括Tween-80（吐温-80）。
所述促溶剂可以是无水乙酸或醋酸溶液或无水醋酸中的任意一种后多种。醋酸溶液可以是体积百分比浓度为98%的醋酸水溶液；醋酸溶液也可以是质量百分比浓度为98%的醋酸水溶液；醋酸溶液也可以用无水醋酸替代。每1000ml的第一染色液中包括醋酸溶液3.15g，第一促染剂0.54g。
所述第一染色液中还包括防腐剂，每1000ml的第一染色液中，包括防腐剂的质量是0.1g～1g。
所述防腐剂包括普乐净300（proclin-300）、叠氮钠、苯甲酸盐中任意一种或多种的组合。
每1000ml的第一染色液中，含有防腐剂的质量是0.5g。
所述的细胞染色试剂，还包括第二染色液；所述第一染色液以体积百分比计的含量范围是0.5%～33%；所述第二染色液以体积百分比计的含量范围是1%～66%；所述稀释液以体积百分比计的含量范围是1%～97.5%。
所述第一染色液独立封装；所述稀释液独立封装；所述第二染色液独立封装；用于细胞染色时，第一染色液、第二染色液和稀释液联合使用；所述稀释液的pH值范围为6～9。
所述第二染色液中包括：第二促染剂、第二渗透压调节剂和第二主溶剂；每1000ml的第二染色液中包括，第二促染剂33.3g～1000g，第二渗透压调节剂的质量为4.5g～18g，第二主溶剂用量采用定容法确定，即第二主溶剂的用量会使上述组份溶解后能形成1000ml体积的第二染色液。
所述第二促染剂是过氧化氢水溶液；所述第二渗透压调节剂是氯化钠；所述过氧化氢水溶液中，过氧化氢的质量百分比浓度为30%；所述第二主溶剂是纯化水。
第二染色液能对样本中的活体细胞进行二次染色，使染色效果更好。且第二染色液中的第二渗透压调节剂使第二染色液的细胞兼容特性和第一染色液的细胞兼容特性相似，使活性细胞能在经历第一次染色和第二次染色时具有相类似的细胞渗透压环境，从而在染色过程中更好地保持细胞活性。独立封装的第一染色液、第二染色液和稀释液能各自独立封闭保存，保持其各自的特性，在染色时混合均匀后联合使用，完成细胞染色；上述封装方式，方便即配即用。
每1000ml的第二染色液中，包括过氧化氢水溶液的质量为33.3g～333.3g；氧化氢水溶液的质量还可以为116.55g；纯化水即第二主溶剂用量采用定容法确定，即第二主溶剂的用量会使上述组份溶解后能形成1000ml体积的第二染色液。
所述第一染色液中包括：第一染料、第二染料、第一渗透压调节剂和第一主溶剂；每1000ml的第一染色液中，包括第一染料的质量为0.01g～1.00g，第二染料的质量为0.01g～0.30g，第一渗透压调节剂的质量为4.5g～18g；第一主溶剂用量采用定容法确定，即第一主溶剂的用量会使其他组份溶解后能形成1000ml体积的第一染色液；所述第一染料是詹钠斯绿B；所述第二染料是中性红；第一渗透压调节剂是氯化钠；所述第一主溶剂是纯化水；所述第二染色液中包括：第三染料是甲基蓝；第三染料的质量为5g-25g；所述第二促染剂是过氧化氢水溶液；所述第二渗透压调节剂是氯化钠；所述过氧化氢水溶液中，过氧化氢的质量百分比浓度为30%；所述第二主溶剂是纯化水。
第一染料是詹钠斯绿B，主要用于细胞内颗粒物的染色；第二染料是中性红，主要用于细胞核的染色；第三染料是甲基蓝，主要用于细胞质的染色。第二染色液不仅通过其中第二促染剂进行二次染色，还通过其中的第三染料对样本中的活体细胞进行二次染色，三种染料的配合使染色效果更好。且第二染色液中的第二渗透压调节剂使第二染色液的细胞兼容特性和第一染色液的细胞兼容特性相似，使活性细胞能在经历第一次染色和第二次染色时具有相类似的细胞渗透压环境，从而在染色过程中更好地保持细胞活性。独立封装的第一染色液、第二染色液和稀释液能各自独立封闭保存，保持其各自的特性，在染色时混合均匀后联合使用，完成细胞染色；上述封装方式，方便即配即用。
所述稀释液中包括，缓冲剂、稀释液渗透压调节剂和稀释主溶剂；所述稀释液的PH范围是6.0～8.5。缓冲剂是用于稀释液的酸碱平衡；也可以称之为酸碱平衡剂。
在每1000ml的稀释液中包括，缓冲剂的质量为0.121g～12.1g；稀释液渗透压调节剂的质量为4.5g-18g；稀释主溶剂为纯化水；稀释主溶剂用量采用定容法确定，即稀释主溶剂的用量会使上述组份溶解后能形成1000ml体积的稀释液。
所述缓冲剂包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、磷酸盐（PBS）、1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)、N-氨基甲酰甲基乙磺酸(ACES)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)中中的任意一种或多种。
所述稀释液渗透压调节剂包括：氯化钠（NaCl）、硫酸钠（Na2SO4）中的任意一种或两种。
稀释液中的稀释液渗透压调节剂使稀释液的细胞兼容特性和第一染色液以及第二染色液的细胞兼容特性相似，使活性细胞能在经历稀释、第一次染色和第二次染色时具有相类似的细胞渗透压环境，从而在染色过程中更好地保持细胞活性。
本申请解决上述问题的技术方案还可以是一种第一染色液的制备方法，用于制备上述的第一染色液；包括步骤1：量取纯化水，称量甲酚紫、联苯胺、氯化钠，将四者混合均匀；步骤2：用0.8微米尺寸的玻璃纤维过滤膜过滤,制得第一染色液。上述四者混合均匀的时间为24小时。
本申请解决上述问题的技术方案还可以是一种第一染色液的制备方法，用于制备上述的第一染色液；包括步骤1：量取纯化水，称量詹钠斯绿B、中性红、氯化钠，四者混合均匀；步骤2：用0.8微米尺寸的玻璃纤维过滤膜过滤,制得第一染色液。上述四者混合均匀的时间为2小时。
本申请解决上述问题的技术方案还可以是一种第二染色液的制备方法，用于制备上述的第二染色液；包括步骤：量取纯化水，称量30%过氧化氢水溶液、氯化钠，三者混合均匀，制得第二染色液。上述三者混合均匀的时间为10分钟。
本申请解决上述问题的技术方案还可以是一种第二染色液的制备方法，用于制备上述的第二染色液；包括步骤：量取纯化水，称量30%过氧化氢水溶液、氯化钠、甲基蓝，四者混合，制得第二染色液。上述四者混合均匀的时间为15分钟。
本申请解决上述问题的技术方案还可以是一种稀释液的制备方法，用于制备上述的稀释液；包括步骤1：量取稀释主溶剂，称量缓冲剂、稀释液渗透压调节剂三者混合均匀；步骤2：向稀释液中加入酸性物质或碱性物质，调剂稀释液pH值至6.0～8.5。上述三者混合均匀的时间混匀15分钟。酸性物质可以是常规的调节稀释液的酸，如盐酸或盐酸溶液；碱性物质可以是常规调节稀释液的碱，如氢氧化钠或氢氧化钠溶液。
本申请解决上述问题的技术方案还可以是一种细胞染色方法，使用了上述的细胞染色试剂；将待染色样本、第一染色液和稀释液三者混合均匀，完成样本的染色。
本申请解决上述问题的技术方案还可以是一种细胞染色方法，待染色样本为3～15微升；第一染色液和稀释液混合形成的第一综合试剂体积和待染色样本的体积比率范围是50:1～300：1；待染色样本和第一综合试剂混合完成染色过程中，混合液中的细胞渗透压范围是260mmol/L～350mmol/L。
上述细胞染色方法，第一染色液和稀释液混合形成的第一综合试剂体积和待染色样本的体积比率范围是100:1～200：1；待染色样本和第一综合试剂混合完成染色过程中，混合液中的细胞渗透压范围是280～320mmol/L。
待染色样本和第一综合试剂混合完成染色过程中，混合液中的细胞渗透压范围还可以是300mmol/L；第一综合试剂体积和待染色样本的体积比率范围还可以是150：1。
本申请解决上述问题的技术方案还可以是一种细胞染色方法，使用了上述的细胞染色试剂；将待染色样本、第一染色液和稀释液三者混合均匀，完成样本的第一次染色；将第一次染色后的样本，再与第二染色液混合均匀，进行二次染色。
待染色样本为3～15微升；第一染色液、稀释液和第二染色液混合形成的第二综合试剂体积和待染色样本的体积比率范围是100:1～300：1；待染色样本和第二综合试剂混合完成染色过程中，混合液中的细胞渗透压范围是260mmol/L～350mmol/L。
第一染色液、稀释液和第二染色液混合形成的第二综合试剂体积和待染色样本的体积比率范围是150:1～280：1；待染色样本和第二综合试剂混合完成染色过程中，混合液中的细胞渗透压范围是290mmol/L～310mmol/L。
待染色样本和第二综合试剂混合完成染色过程中，混合液中的细胞渗透压范围还可以是300mmol/L；第二综合试剂体积和待染色样本的体积比率范围还可以是200：1或150：1。
本申请解决上述问题的技术方案还可以是一种细胞染色方法，使用了上述的细胞染色试剂；且包括以下步骤：步骤A1：待染色样品稀释；向待染色样品中加入稀释液制得样品稀释液；样品和稀释液的体积比率范围是1：50～1：300；步骤B1：第一次染色：取步骤A1中的样品稀释液，加入第一染色液，混合均匀，制得一次染色后样本液；样品稀释液和第一染色液的体积比率范围是2：1～194：1；步骤C1：第二次染色：取步骤B1中的一次染色后样本液，加入第二染色液，混合均匀，制得二次染色样本液；一次染色后样本液和第二染色液的体积比率范围是3：2～49：1。
本申请解决上述问题的技术方案还可以是一种细胞染色方法，使用了上述的细胞染色试剂；且包括以下步骤：骤A2：第一染色液稀释；向稀释液中加入第一染色液，混合均匀，制得第一染色液稀释液；稀释液和第一染色液的体积比率范围是2：1～194：1；步骤B2：综合染色剂稀释液制备；取步骤A2中的第一染色液稀释液，加入第二染色液，混合均匀，制得综合染色剂稀释液；第二染色液和第一染色液稀释液的体积比率范围是3：2～49：1；步骤C2：待染色样品染色，取步骤B2中的综合染色剂稀释液，加入待染色样品；待染色样品和综合染色剂稀释液体积比率范围是1：50～1：300。
本申请解决上述问题的技术方案还可以是一种细胞染色方法，使用了上述的细胞染色试剂；步骤A3：第一染色液稀释；向稀释液中加入第一染色液，混合均匀，制得第一染色液稀释液；稀释液和第一染色液的体积比率范围是2：1～194：1；步骤B3：待染色样品染色，取步骤A3中的第一染色液稀释液，加入待染色样品制得一次染色后样本液；待染色样品和一次染色后样本液的体积比率范围是1：50～1：300；步骤C3：二次染色样本液制备；取步骤B3中的一次染色后样本液，加入第二染色液，混合均匀，制得二次染色样本液；第二染色液和一次染色后样本液的质量或体积比率范围是3：2～49：1。
上述的细胞染色方法，还包括步骤D：染色后样品平铺；取步骤C1、步骤C2、步骤C3或步骤C3中获取的任意一种的二次染色样本液，将二次染色样本液滴入盛放载体，使二次染色样本液均匀平铺在盛放载体上，静置30秒至1分钟后，获得用于明场观测的染色样本。
上述的细胞染色方法，所述步骤A1、步骤B1和步骤C1中，所述步骤A2、步骤B2和步骤C3中，所述步骤A3、步骤B3和步骤C3中，混匀时间为20秒～5分钟或30秒～1分钟；用于染色的容器的容积不小于细胞染色试剂加入量，同时用于染色的容器的容积不不大于试剂加入量体积1倍。
上述的细胞染色方法，还包括染色后混合液平铺的步骤：将染色后的染色样本液，滴入盛放载体，使染色样本液均匀平铺在盛放载体上；静置30秒至1分钟后，获得用于明场观测的染色样本。
所述盛放载体包括尿成渣计数板，或细胞计数板，或带空腔的透明材料制成的观察装置或载玻片。
所述的细胞染色方法，总染色时间小于8分钟，或总染色时间区间范围为5分钟～6分钟。
所述的细胞染色方法中，待染色样本包括血液样本、尿液样本、白带样本；所述血液样本包括即时采的末梢静脉血，或乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝的静脉血；待染色样本的体积不少于0.01毫升。
所述的细胞染色方法，细胞染色方法实施的环境温度范围为15摄氏度～37摄氏度。
同现有技术相比较，本申请的有益效果是：1.待染色样本中的细胞是在液态的悬浮液中完成染色过程，且用于染色液及稀释液的环境为比较接近生物生理状态，因此在染色过程中，细胞活性保持的较好，能利用细胞与溶液中染料分子共同的布朗运动，及静电作用力，进行染色反应，染色速度更快，效率更高；2.由于在这样的染色环境下，细胞活性保持得比较好，通过染色液中染色材料的染色基团选择，使其特别适用于活体细胞染色，这些染色基团能利用细胞膜的主动转运功能穿透细胞膜进入细胞内，进一步地提高了细胞染色效率；3.独立封装的第一染色液、第二染色液和稀释液能各自独立封闭保存，保持其各自的特性，在染色时混合均匀后联合使用，完成细胞染色；上述封装方式，方便即配即用；4、本申请中的方法，第一染色液、第二染色液和稀释液中由于各组份的配比适合，使得三者的细胞环境兼容性高，有利于细胞在染色过程中保持活性；同时也方便三者灵活地即配即用，适用于不同种类的样品染色；5.采用第二染色液进行二次染色，染色效果更好，染色结果更有利于细胞形态和种类鉴别，其染色后的溶液可直接适用于明场下的细胞形态分析和检测，并能根据染色后的细胞形态和图形特征分析，进一步地进行细胞分类和细胞分类计数；6.能在体液或分泌物在液态的悬浮液中完成细胞染色；其适用的样本类型多，包括各种生物体液如血液，分泌物如尿液及白带等；7.染色操作简单，能实现傻瓜式的染色操作，使其适用于多种应用场景。如即时检验、急救、床边，战地等多种缺乏专业人员、大型设备和复杂检验环境的条件下。
附图说明
图1是本申请设计的细胞染色方法实施例之一的步骤示意图；图1中的染色液一即为第一染色液；图1中的染色液二即为第二染色液；
图2是现有技术中血涂片制作过程示意图；
图3至图10显示了血液细胞被染色之后的图片；图3至图10中的图片为采用了表3、表4、最优用量下配制的染色液，以0.01M 磷酸盐缓冲液作为稀释液，按照任一实施例中体系和步骤，形成的染色图片；
图3显示了嗜中性粒细胞被染色的情况，图片近中心位置显示了被染色的嗜中性粒细胞；图3中近中心处可见，嗜中性粒细胞的细胞核呈蓝色，有分枝状结构，胞浆浅蓝色，干净无颗粒物；
图4显示了嗜碱性粒细胞被染色的情况，图片中显示了被染色的嗜碱性粒细胞；图4中近中心处可见，嗜碱性粒细胞核区呈浅蓝色，并被胞浆内大量蓝紫色颗粒物所覆盖；
图5显示了嗜酸性粒细胞被染色的情况，图5中显示了被染色的嗜酸性粒细胞；图5中框选处可见，嗜酸性粒细胞被染色后，胞浆呈红色，有大量***颗粒物；
图6显示了淋巴细胞被染色的情况，图6中显示了被染色的淋巴细胞；图6中框选部分可见，淋巴细胞的细胞核蓝色，大且圆；胞浆区域少，浅蓝色；
图7显示了单核细胞被染色的情况，图片中显示了被染色的单核细胞；图7中可近中心位置见，单核细胞呈现弱嗜碱性，胞浆浅蓝色，蓝灰色，无颗粒物；细胞核呈深蓝色，不规则形；
图8显示了血小板被染色的情况；图8中框选部分可见，血小板比红细胞小，***球形，胞浆有***颗粒物；
图9显示了红细胞被染色的情况，图9中显示了被染色的红细胞；图9中框选部分可见，红细胞：呈***或蓝紫色，面包圈状；
图10显示了网织红细胞被染色的情况，图片中显示了被染色的网织红细胞；图10中框选部分可见网织红细胞：在红细胞内有紫灰色点状、条状物质被染色，面包圈状。
具体实施方式
以下结合各附图对本申请的实施方式做进一步详述。
如图1所示，是现有技术中一个血涂片的制作过程示意图，由图可见其包括血涂片制作的步骤和血涂片染色的步骤。
血涂片制作的步骤中包括：步骤1.1：将血样滴加至载玻片上；步骤1.2：取另一载玻片，按30°～45°角倾斜，匀速向另一边推动；步骤1.3：血膜涂布均匀，呈“火焰”状为合格的涂片；步骤1.4：等待血膜干燥，并准备染色。
涂片染色的步骤中包括：步骤2.1：铅笔作标记，将血涂片平放在染色架上,蜡笔划线可防液体外溢； 步骤2.2：血涂片自然干燥后，滴瑞-吉氏染液(A液)1至2滴覆盖血片,染约1分钟；步骤2.3：滴加稍多体积（2滴至4滴）的缓冲液（如瑞-吉氏染液(B液)），用洗耳球将其与染液吹匀,染约5分钟；步骤2.4：慢慢摇动玻片，然后用细的流动水如自来水流从玻片的一侧冲去染液(不要先倒去染液再冲水)，持续约1分钟；步骤2.5：终止冲洗，将血片自然干燥后或用滤纸吸干，即可用于镜检。
从上述步骤可见，现有技术中的染色操作步骤复杂，且操作繁琐耗时，染色效率极低，无法大批量进行形态学明场检测的样本制作。且每个步骤的操作都需训练有素的专业操作者才能获得合格的用于观测染色样本，对专业操作者的操作要求高。操作过程的往往决定染色效果，染色的品质的一致性很难保证；有可能同一操作者在不同状态下，或者不同操作者，其最终染色效果的差异都挺大。
进一步地，现有技术中的染色操作步骤中，由于样品经过了玻片涂抹平铺以及干燥的过程，待染色样品中的大部分细胞在染色过程中已被“杀死”，因此染色呈现的只能是大部分细胞失去活性的状态，因此染色的涂片无法更真实反应体液中细胞的生理状态。
如表1所示的实施例中，细胞染色试剂为第一综合试剂，第一综合试剂只包括第一染色液和稀释液；表1中列出了第一染色液部分实施例的配方构成列表,表中列出了第一染色液和稀释液的体积百分比范围。
如表2所示的实施例中，细胞染色试剂为第二综合试剂，第二综合试剂包括第一染色液、第二染色液和稀释液；表2中列出了第一染色液、第二染色液和稀释液的体积百分比范围。
在一些细胞染色方法及试剂的实施例中，包括了第一染色液的配方及制备方法，第二染色液的配方及制备方法，以及稀释液的配方和制备方法。
在第一染色液的制备实施例中，包括以下步骤：
步骤一：称取一定量的纯化水，对应的称取适量第一染料即甲酚紫，二者混混匀。
步骤二：分别称取第一促染剂适量Tween-80和防腐剂proclin-300，并加入步骤一制得中的溶液，混匀60分钟。
步骤三：称取一定量第二染料即联苯胺，称取对应量的98%醋酸，二者混合，混匀45分钟。
步骤四：将完成后的步骤一制得的混合液与步骤二的混合液等体积比例混合，并混匀至少24小时。
步骤五：将步骤四制得的混合液，用0.8微米尺寸的玻璃纤维过滤膜，进行过滤，除去溶液中的固体机械杂质，留下的液体即为第一染色液。
表3是第一染色液部分实施例的配方构成列表。表4是第二染色液部分实施例的配方构成列表。表5是稀释液部分实施例的配方构成列表。
表1
表2
表3
表4
表5
在第一染色液的制备实施例中，包括以下步骤：
步骤一：称取995.48g的纯化水，称取0.3g甲酚紫，二者混合，混匀。
步骤二：分别称取0.54g Tween-80和0.5g proclin-300，并加入步骤一制得的混合液，混匀60分钟。
步骤三：称取0.03g联苯胺，称取3.15g的无水乙酸（3.15g～31.5g），二者混合，混匀45分钟。
步骤四：将完成后的步骤二与步骤三的混合液等体积比例混合，并混匀至少24小时。
步骤五：将步骤四的混合液，用0.8微米尺寸的玻璃纤维过滤膜，进行过滤，除去溶液中的固体机械杂质，留下的液体部分即为第一染色液。
在第一染色液的制备实施例中，包括以下步骤：
步骤一：先取0.30克甲酚紫，溶解于997.00ml纯化水中，获得甲酚紫水溶液；步骤二：再取0.03g联苯胺，加入3.00ml醋酸，获得联苯胺醋酸溶液。上述步骤一和步骤二不分先后顺序。
步骤三：再将前述甲酚紫水溶液与联苯胺醋酸溶液混合，并加入0.1ml TritonX-100（曲拉通-100）,混匀反应至少24小时，用0.8μm滤膜过滤，即成第一染色液。
在第一染色液的制备实施例中，包括以下步骤：
步骤一：称取一定量的纯化水，对应的称取适量甲酚紫，二者混合，混匀。
步骤二：分别称取促染剂适量Tween-80 和防腐剂proclin-300，以及三羟甲基胺基甲烷、氯化钠并加入步骤1制得混合液，调pH至7.0，混匀60分钟。
步骤三：称取一定量的第二染料联苯胺，称取对应量的98%醋酸，二者混合，混匀45分钟。
步骤四：将完成后的步骤二与步骤三的液体等体积比例混合，并混匀至少24小时。
步骤五：将步骤四的混合液，用0.8微米尺寸的玻璃纤维过滤膜，进行过滤，除去溶液中的固体机械杂质，留下的液体即为染色液一。
第一染色液主要功能，是对体液细胞中的微组织进行染色，这些微组织主要包括细胞核、细胞质及其它细胞器等组织。第一染色液中的染料之一，主要为带有色基团的、低细胞毒性的小分子化学染料如中性红、詹姆斯绿、甲苯胺蓝、亚甲蓝、亮甲蓝、台盼蓝、詹姆斯绿、甲酚紫、玫瑰红即虎红中的至少一种与联苯胺组合而成，尤其是甲酚紫与联苯胺的组合。
染色液一的主要组成染料为带有色基团的小分子化合物，此外，还包含缓冲盐、渗透压调节盐、促溶剂、促染剂、防腐剂和纯化水；其中，所谓带有色基团的小分子化合物是指，有助色基团的分子量小于500的化合物，其主要功能是让细胞内的成分带上颜色，以便于后续的形态观察与分类。
第一染料甲酚紫，其CAS号10510-54-0，分子式为C18H15N3O3，分子量为321.33，其在本体染色液系中的质量浓度范围为0.01g-1g/L，优选的为0.3g/L。
第二染料是3,3'-二甲基联苯胺，其CAS号626-13-1，分子式为C14H15N，分子量为197.28，其在本体染色液系中的质量浓度范围为0.01g-0.3g /L，优选的为0.03g/L。
在第二染色液的制备实施例中，包括以下步骤：
步骤：称取883.45g纯化水，称取116.55g质量分数为30%的过氧化氢溶液，搅拌10分钟，使二者混匀；此即为第二染色液。
第二染色液主要功能，是在血液样本与血样稀释液、第一染色液混合后，加入第二染色液，可特征性染色血细胞中的某些白细胞内的过氧化物酶颗粒；第二染色液中的主要成分为一定质量比的过氧化氢水溶液。
稀释液的一个实施例中包括：三羟甲基胺基甲烷、氯化钠、加纯化水，混合，并加入适量的酸性物质或碱性物质，调pH值至7.4，并定容至1000ml。按上述稀释液的配方中的各组份混合并充分溶解后，调整溶液pH至7.4并定容至1000ml，用0.22微米玻璃纤维滤膜过滤除菌，制得稀释液。
稀释液的主要功能，包括多个方面，其一是按一定比例稀释血液细胞，以便于用该方法和试剂进行染色后，血液细胞能以合适的比例在显微镜下被观察；其二是提供合适血细胞染色反应的液态pH环境；其三是提供以保证样本中血细胞正常形态的渗透压环境；稀释液可以是生物实验常见缓冲液体系。包括：稀释液中，缓冲盐的主要作用是用于提供血细胞 染色反应所需要的合适的pH环境。稀释液的pH值范围为5～11，稀释液的pH值相对较佳的范围为6.0～8.5，尤其最佳为6.8～7.4；稀释液和第一染色液和第二染色液共同构成的混合液，对细胞渗透压环境为一定的范围，为150mmol/L～400mmol/L，优选260mmol/L～350mmol/L。mmol/L是毫摩尔每升。
纯化水最第一染色液、第二染色液和稀释液中的主要的溶剂，用于溶解各种组份；纯化水还可以用符合要求的去离子水或蒸馏水替代。
促溶剂主要作用是促进染料分子在染色液体系中的充分溶解。促染剂的主要作用是，让细胞内的成分以更高的效率染色。防腐剂的主要作用是防止染液中其它微生物的滋生。
新鲜的待染色样本如血液样本，其内的细胞具有生物活性。在合适的、接近生理状态适宜的pH值和细胞渗透压的溶液环境下，加入低细胞毒性的染色试剂；因血液细胞的生物活性，其利用自身的胞吞作用，将小分子染料吞噬进细胞内；胞吞进入细胞内的染料属于多色染料，在细胞内环境中，因有不同的基团电荷属性，该属性决定了，不同的染料分子与细胞内不同的物质结合，并使细胞内物质带上不同的颜色。此外，本方法的第二染色液可进一步特异性促进染色液一中的组份与细胞内的过氧化物酶颗粒反应，并使其着色 。
本申请设计的细胞染色方法的一个实施例中，包括以下步骤：
步骤A1：待染色样品稀释；向待染色样品中加入稀释液；样品和稀释液的体积比率范围是1：50～1：300；所述待染色样品为离体的具有活性细胞的样本。
步骤B1：待染色样品第一次染色；取步骤A1中的样品稀释液，加入第一染色液，混合均匀，制得一次染色后样本液；样品稀释液和第一染色液体积比率范围是2：1～194：1。
步骤C1：待染色样品第二次染色；取步骤B1中的一次染色后样本液，加入第二染色液，混合均匀，制得二次染色样本液；一次染色后样本液和第二染色液体积比率范围是3：2～49：1。
本申请设计的细胞染色方法的一个实施例中，包括以下步骤：
步骤A2：第一染色液稀释；向稀释液中加入第一染色液，混合均匀，制得第一染色液稀释液；稀释液和第一染色液的体积比率范围是2：1～194：1。
步骤B2：综合染色剂稀释液制备；取步骤A2中的第一染色液稀释液，加入第二染色液，混合均匀，制得综合染色剂稀释液；第二染色液和第一染色液稀释液的体积比率范围是3：2～49：1。
步骤C2：待染色样品染色，取步骤B2中的综合染色剂稀释液，加入待染色样品；待染色样品和综合染色剂稀释液体积比率范围是1：50～1：300。
本申请设计的细胞染色方法的一个实施例中，包括以下步骤：
步骤A3：第一染色液稀释；向稀释液中加入第一染色液，混合均匀，制得第一染色液稀释液；稀释液和第一染色液的体积比率范围是2：1～194：1。
步骤B3：待染色样品染色，取步骤A3中的第一染色液稀释液，加入待染色样品制得一次染色后样本液；待染色样品和一次染色后样本液的体积比率范围是1：50～1：300。
步骤C3：二次染色样本液制备；取步骤B3中的一次染色后样本液，加入第二染色液，混合均匀，制得二次染色样本液；第二染色液和一次染色后样本液的质量或体积比率范围是3：2～49：1。
上述各细胞染色方法还包括染色后样品混合液平铺的步骤；取步骤C1至C3中获取的任意二次染色样本液，使二次染色样本液均匀平铺在盛放载体上，盖上罩覆片，静置30秒至1分钟后，获得用于明场观测的染色样本。
上述步骤A1、步骤B1和步骤C1中，步骤A2、步骤B2和步骤C3中，步骤A3、步骤B3和步骤C3中，混匀时间为20秒～5分钟，或30秒；试剂各组份在不小于液体加入量的容器下进行混合，容器的容积不小于试剂加入量体积，不大于试剂加入量体积1倍。
上述各细胞染色方法中，待染色样本包括血液样本、尿液样本、白带样本、痰液样本；所述血液样本包括即时采的末梢静脉血，或乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝的静脉血；其体积不少于0.01毫升。
上述各染色步骤单步染色的时间为30秒至1分钟；上述各染色步骤联合在一起的综合染色时间小于8分钟，最佳综合染色时间区间范围为5分钟～6分钟。
上述染色方法中染色的环境温度范围为25摄氏度～37摄氏度。
在一些细胞染色方法及试剂的实施例中，对待染色样本要求为，不少于10ul的指尖全血，或乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血。
在一些细胞染色方法及试剂的实施例中，其操作步骤为：
步骤一：血液样本的稀释：用0.9%的氯化钠（NaCl）溶液（生理盐水），或pH数值为6.8的0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)，0.01M额含义是0.01摩尔每升，在1：50至1：300倍范围内稀释血液样本，并用移液器吹打30秒混匀，或颠倒1分钟混匀；即用移液器或其它定量采血装置，取10ul全血样本，将其加入内置2ml生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)的稀释液中，充分混匀。
步骤二：第一次染色：在步骤一制得的样本稀释液中加入5ul的第一染色液，用移液器吹打30秒混匀，或颠倒1分钟混匀。
步骤三：第二次染色：在步骤二制得的第一次染色后的样本混合液中加入10ul的第二染色液，用移液器吹打30秒混匀，或颠倒1分钟混匀。
步骤四：取载玻片一张，并在其上滴加步骤三制得的第二次染色后的样本混合液10ul，盖上盖玻片，静置1分钟。
步骤五：取上述载玻片，置于普通光学显微镜下，即可进行红细胞(RBC)和白细胞（WBC）及血小板（PLT） 的形态学观察和计数。
在一些细胞染色方法及试剂的实施例中，其操作步骤为：
步骤一：取一支2ml离心管，用定量采血玻璃管，或移液器取10ul全血样本，加入1975ul生理盐水，或0.01M 磷酸盐缓冲液，用1ml移液器吹打30秒混匀。
步骤二：用10ul移液器取5ul第一染色液, 加入步骤一的样本稀释后的混合液中，用移液器吹打30秒混匀，制得第一次染色后的混合液。
步骤三：用10ul移液器取10ul第二染色液, 加入步骤二中制得的第一次染色后的混合液中，用移液器吹打30秒混匀。
步骤四：取载玻片一张，并在其上滴加步骤三制得的第二次染色后的混合液10ul，盖上盖玻片，静置1分钟。
步骤五：取上述载玻片，置于普通光学显微镜下，即可进行红细胞(RBC)和白细胞（WBC）及血小板（PLT） 的形态学观察和计数。
在一些细胞染色方法及试剂的实施例中，其操作步骤为：
步骤一：取一支2ml离心管，其内加入1975ul生理盐水，或0.01M 磷酸盐缓冲液。
步骤二：用10ul移液器取5ul第一染色液, 加入步骤一制得的混合液中，用移液器吹打30秒混匀。
步骤三：用10ul移液器取10ul第二染色液, 加入步骤二制得的混合液中，用移液器吹打30秒混匀。
步骤四：用定量采血玻璃管，或移液器取10ul全血样本，加入步骤三制得的混合液中，用移液器吹打30秒混匀。
步骤五：取载玻片一张，并在其上滴加步骤四制得的第二次染色后的混合液10ul，盖上盖玻片，静置1分钟。
步骤六：取上述载玻片，置于普通光学显微镜下，即可进行红细胞(RBC)和白细胞（WBC）及血小板（PLT） 的形态学观察和计数。
在一些细胞染色方法及试剂的实施例中，其操作步骤为：
步骤一：取一支2ml离心管，其内加入1975ul生理盐水，或0.01M PBS（磷酸盐缓冲液）。
步骤二：用10ul移液器取5ul第一染色液, 加入步骤一的混合液中，用移液器吹打30秒混匀。
步骤三：用定量采血玻璃管，或移液器取10ul全血样本，加入步骤二制得的混合液中，用移液器吹打30秒混匀。
步骤四：用10ul移液器取10ul第二染色液, 加入步骤三制得的混合液中，用移液器吹打30秒混匀。
步骤五：取载玻片一张，并在其上滴加步骤四制得的第二次染色后的混合液10ul，盖上盖玻片，静置1分钟。
步骤六：取上述载玻片，置于普通光学显微镜下，即可进行红细胞(RBC)和白细胞（WBC）及血小板（PLT） 的形态学观察和计数。
在一些细胞染色方法及试剂的实施例中，其操作步骤为：
步骤一：取一支2ml离心管，其内加入975ul生理盐水，或0.01M PBS（磷酸盐缓冲液）。
步骤二：用10ul移液器取5ul第一染色液, 加入步骤一制得的混合液中，用移液器吹打30秒混匀。
步骤三：用定量采血玻璃管，或移液器取10ul全血样本，加入步骤二制得的混合液中，用移液器吹打30秒混匀。
步骤四：用10ul移液器取10ul第二染色液, 加入步骤三制得的混合液中，用移液器吹打30秒混匀。
步骤五：在步骤四制得的混合液中加入1000ul生理盐水，或0.01M PBS（磷酸盐缓冲液），移液器吹打混匀，或手动颠倒30秒混匀。
步骤六：取载玻片一张，并在其上滴加步骤五制得的第二次染色后的混合液10ul，盖上盖玻片，静置1分钟。
步骤七：取上述载玻片，置于普通光学显微镜下，即可进行红细胞(RBC)和白细胞（WBC）及血小板（PLT） 的形态学观察和计数。
在一些细胞染色方法及试剂的实施例中，其操作步骤为：
步骤一：取一支1.5ml离心管，用定量采血玻璃管，或移液器取5ul全血样本，加入970ul稀释液，用1ml移液器吹打30秒混匀。
步骤二：取5ul第一染色液, 加入步骤一制得的混合液中，用移液器吹打1分钟混匀。
步骤三：取20ul第二染色液, 加入步骤二制得的混合液中，用移液器吹打1分钟混匀。
步骤四：取载玻片一张，并在其上滴加步骤三制得的第二次染色后的混合液10ul，盖上盖玻片，静置1分钟。
步骤五：取上述载玻片，置于普通光学显微镜下，即可进行红细胞(RBC)和白细胞（WBC）及血小板（PLT） 的形态学观察和计数。
在一些细胞染色方法及试剂的实施例中，其操作步骤为：
步骤一：取一支1.5ml离心管，其内加入970ul稀释液。
步骤二：取5ul第一染色液, 加入步骤一制得的混合液中，用移液器吹打1分钟混匀。
步骤三：取20ul第二染色液, 加入步骤二制得的混合液中，用移液器吹打1分钟混匀。
步骤四：用定量采血玻璃管，或移液器取5ul全血样本，加入步骤二制得的混合液中，用移液器吹打1分钟混匀。
步骤五：取载玻片一张，并在其上滴加步骤四制得的第二次染色后的混合液10ul，盖上盖玻片，静置1分钟。
步骤六：取上述载玻片，置于普通光学显微镜下，即可进行红细胞(RBC)和白细胞（WBC）及血小板（PLT） 的形态学观察和计数。
在一些细胞染色方法及试剂的实施例中，其操作步骤为：
步骤一：取一支1.5ml离心管，其内加入970ul稀释液。
步骤二：取5ul第一染色液, 加入步骤一制得的混合液中，用移液器吹打1分钟混匀;
步骤三：用定量采血玻璃管，或移液器取5ul全血样本，加入步骤二制得的溶液中，用移液器吹打1分钟混匀。
步骤四：10ul第二染色液, 加入步骤三制得的混合液中，用移液器吹打1分钟混匀。
步骤五：取载玻片一张，并在其上滴加步骤四制得的第二次染色后的混合液10ul，盖上盖玻片，静置1分钟。
步骤六：取上述载玻片，置于普通光学显微镜下，即可进行红细胞(RBC)和白细胞（WBC）及血小板（PLT） 的形态学观察和计数。
在一些细胞染色方法及试剂的实施例中，其操作步骤为：
步骤一：取一支1.5ml离心管，其内加入470ul稀释液。
步骤二：取5ul第一染色液, 加入步骤一制得的混合液中，用移液器吹打1分钟混匀。
步骤三：用定量采血玻璃管，或移液器取5ul全血样本，加入步骤二制得的混合液中，用移液器吹打1分钟混匀。
步骤四：取10ul第二染色液, 加入步骤三制得的混合液中，用移液器吹打1分钟混匀。
步骤五：在步骤四制得的溶液中加入500ul稀释液，移液器吹打混匀，或手动颠倒1分钟混匀。
步骤六：取载玻片一张，并在其上滴加步骤五制得的第二次染色后的混合液10ul，盖上盖玻片，静置1分钟。
步骤七：取上述载玻片，置于普通光学显微镜下，即可进行红细胞(RBC)和白细胞（WBC）及血小板（PLT） 的形态学观察和计数。
在一些细胞染色方法及试剂的实施例中，其操作步骤为：
步骤一：取一支1.5ml离心管，用定量采血玻璃管，或移液器取5ul全血样本，加入970ul稀释液，用1ml移液器吹打30秒混匀。
步骤二：取5ul第一染色液, 加入步骤一制得的混合液中，用移液器吹打1分钟混匀。
步骤三：取20ul第二染色液, 加入步骤二制得的混合液中，用移液器吹打1分钟混匀。
步骤四：取载玻片一张，并在其上滴加步骤三制得的混合液10ul，盖上盖玻片，静置1分钟。
步骤五：取上述载玻片，置于普通光学显微镜下，即可进行红细胞(RBC)和白细胞（WBC）及血小板（PLT） 的形态学观察和计数。
上述各实施例中，载玻片可包括尿成渣计数板，或细胞计数板，或其他带空腔的透明材料制成的观察装置。
在一些细胞染色方法及试剂的实施例中，其操作步骤为：
步骤一：样本的采集，用可定量采样装置进行采样，采样量不小于10微升。
步骤二：样本稀释混合，其稀释比例为，血液样本：稀释液=1：10至1：1000；优选的1：100至1：300，推荐1：200；上述混合过程可通过任何动力方式进行混匀，混匀时间为20秒至5分钟，优选的其混匀时间为30秒；上述混合试剂可在不小于液体加入量的容器内进行混合。容器的容积不小于试剂加入量体积，不大于试剂加入量体积1倍。
步骤三：第一次染色，将第一染色液加入步骤二制得的混合液中，对其中的细胞进行染色；第一染色液加入后，可通过任何动力方式进行混匀，混匀时间为20秒至5分钟，优选的其混匀时间为1分钟。
步骤四：第二次染色，将第二染色液加入步骤三制得的混合液中对细胞并进行复染色即二次染色，第二染色液加入后，通过任何动力方式进行混匀，混匀时间为20秒至5分钟，优选的其混匀时间为1分钟。
步骤五：样品混合液装载和平铺的步骤，在能形成一定空腔的透明观测装置上，加入步骤四制得的混合液，加入量为3微升至50微升，优选的为加入8-15微升，最优的为10微升。
步骤六：样品混合液静置的步骤，将透明观测装置移动到显微镜或其他观察装置下，水平静置20秒至5分钟，优选的为1分钟。
本申请中的细胞染色试剂和方法中，其技术效果包括多个方面。
其一，新鲜的体液或分泌物样本，其内的细胞具有生物活性。在合适的、接近生理状态（pH值、渗透压）缓冲体系下，加入低细胞毒性的染色试剂；这样的环境比较接近细胞原始的生理环境，细胞活性保持的时间会更长。
其二，在这样的环境下，样品中的细胞生物活性保持得好，能利用自身的胞吞作用，将小分子染料吞噬进细胞内，即利用了活性细胞的主动吞噬功能进行染色。
其三，胞吞进入细胞内的染料属于多色染料，在细胞内环境中，因有不同的基团电荷属性，该属性决定了，不同的染料分子与细胞内不同的物质结合，并使细胞内物质带上不同的颜色。
其四，本方法的第二染色液可进一步特异性促进第一染色液中的组份与细胞内的过氧化物酶颗粒反应，并使其着色。
本申请设计的细胞染色试剂和染色方法，能在体液或分泌物在液态的悬浮液中完成细胞染色。其适用的样本包括各种生物体液如血液，分泌物如尿液或白带等。
本申请中的细胞染色方法，待染色样本中的细胞是在液态的悬浮液中完成染色过程，且用于染色液及稀释液的环境为比较接近生物生理状态，因此在染色过程中，细胞活性保持的较好，一方面能利用细胞与溶液中染料分子共同的布朗运动，及静电作用力，进行染色反应，染色速度更快，效率更高；另一方面，由于在这样的染色环境下，细胞活性保持的比较好，通过染色液中染色材料的染色基团选择，使其能利用细胞膜的主动转运功能穿透细胞膜进入细胞内，容特别适用于活体细胞染色，进一步地提高了细胞染色效率。
本申请中的方法，样品染色试剂和样品之间的配比的比率设定合理，能对样本中的活体细胞进行染色，操作简单、染色快、染色效果更好，染色结果更有利于细胞形态和种类鉴别，其染色后的溶液可直接适用于明场下的细胞形态分析和检测，并能根据染色后的细胞形态和图形特征分析，进一步地进行细胞分类和细胞分类计数。
在医疗应用领域还未见在让细胞在溶液状态中，对血液样本进行体外活染，即采用带有色基团的化合物染料，对血液细胞进行直接染色，并依据血液细胞在明视场显微镜下的染色结果中所呈现的细胞特征进行细胞分类分析。本申请方法染色后的体液或分泌物，其所呈现的细胞特征包括细胞的大小、颜色、形态、细胞核的形状、颜色、胞浆的颜色、胞浆内颗粒物的颜色、多少。本申请中的染色后的样本适用于细胞的形态学分析，基于细胞特征的分析如细胞形态和染色的着色度，可以进行细胞的分类识别和计数。
相比现有技术中的染色方法、试剂，本申请的主要特色在于，本申请在染色时，样本细胞的状态是处于生理或接近生理的状态，即在生理盐水或生理盐浓度状态下，有生命活性；而现有技术中的染色样本状态，通常是贴合在透明载体如载玻片上，细胞通常是呈“干燥”状态的死细胞。
相比现有技术中的染色方法、试剂，本申请的主要特色还在于，染色时的反应环境与操作完全不一样，本申请中不涉及干燥和清洗的流程；本申请中，样本中的细胞一直处于液体溶液环境，在无额外的操作流程下，依据血细胞与溶液中染料分子共同的布朗运动，及静电作用力，进行染色反应，染色效率更高。
一种细胞染色试剂及方法，其中染色试剂包括第一染色液、第二染色液和稀释液；第一染色液中包括第一染料、第二染料、促溶剂、第一促染剂和第一主溶剂；第二染色液中包括第二促染剂和第二主溶剂。将待染色样本与第一染色液和稀释液混合均匀完成第一次染色；经第一次染色后，再加入第二染色液进行二次染色。上述试剂和方法能对样本中的活性细胞进行高效染色，操作简单、细胞染色效果好、染色后细胞特征明显，适用于明视场下的细胞分析，如细胞形态鉴别、细胞分类鉴别和计数。
本申请提供的细胞染色试剂和方法，操作简单、对操作者的要求不高、染色均匀、耗时短，能实现傻瓜化的染色过程；避免了现有技术中细胞染色操作繁琐，专业要求高，耗时长，易染色不均，染色材料成本高的不足之处。染色操作简单，能实现傻瓜式的染色操作，使其适用于多种应用场景。如即时检验这样的场景，也适用于急救、床边，战地等多种缺乏大型专业设备、专业人员及复杂检验环境的应用场景。
以上所述仅为本申请的实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (39)
1.一种细胞染色试剂，其特征在于，
包括第一染色液和稀释液；
所述第一染色液以体积百分比计的含量范围是0.5%～33%；
所述稀释液以体积百分比计的含量范围是67%～99.5%；
所述细胞染色试剂的pH值范围为6～9。
2.根据权利要求1所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述第一染色液独立封装；所述稀释液独立封装；
用于细胞染色时，第一染色液和稀释液联合使用；
所述稀释液的pH值范围为6～9。
3.根据权利要求1或2所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述第一染色液中包括：第一染料、第二染料、第一渗透压调节剂和第一主溶剂；
每1000ml的第一染色液中，包括第一染料的质量为0.01g～1.00g，第二染料的质量为0.01g～0.30g，第一渗透压调节剂的质量为4.5g～18g；第一主溶剂用量采用定容法确定，即第一主溶剂的用量会使其他组份溶解后能形成1000ml体积的第一染色液。
4.根据权利要求3所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述第一染料是甲酚紫，所述第二染料是联苯胺；所述第一渗透压调节剂是氯化钠；所述第一主溶剂是纯化水。
5.根据权利要求4所述的细胞染色试剂，其特征在于，
每1000ml的第一染色液中，包括甲酚紫0.3g，联苯胺0.03g。
6.根据权利要求3所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述第一染色液中还包括：促溶剂和第一促染剂；
每1000ml的第一染色液中包括，促溶剂的质量为1.05g～31.50g，第一促染剂的质量为0.22g～1.08g。
7.根据权利要求6所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述促溶剂包括无水乙酸或醋酸溶液；
所述第一促染剂包括吐温-80（Tween-80）。
8.根据权利要求3所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述第一染色液中还包括防腐剂，每1000ml的第一染色液中，包括防腐剂的质量是0.1g～1g。
9.根据权利要求8所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述防腐剂包括普乐净300（proclin-300）、叠氮钠、苯甲酸盐中任意一种或多种的组合。
10.根据权利要求1或2所述的细胞染色试剂，其特征在于，
还包括第二染色液；
所述第一染色液以体积百分比计的含量范围是0.5%～33%；
所述第二染色液以体积百分比计的含量范围是1%～66%；
所述稀释液以体积百分比计的含量范围是1%～97.5%。
11.根据权利要求10所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述第一染色液独立封装；
所述稀释液独立封装；
所述第二染色液独立封装；
用于细胞染色时，第一染色液、第二染色液和稀释液联合使用；
所述稀释液的pH值范围为6～9。
12.根据权利要求11所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述第二染色液中包括：第二促染剂、第二渗透压调节剂和第二主溶剂；
每1000ml的第二染色液中包括，第二促染剂33.3g～1000g，第二渗透压调节剂的质量为4.5g～18g，第二主溶剂用量采用定容法确定，即第二主溶剂的用量会使上述组份溶解后能形成1000ml体积的第二染色液。
13.根据权利要求12所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述第二促染剂是过氧化氢水溶液；所述第二渗透压调节剂是氯化钠；
所述过氧化氢水溶液中，过氧化氢的质量百分比浓度为30%；所述第二主溶剂是纯化水。
14.根据权利要求12所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述第一染色液中包括：第一染料、第二染料、第一渗透压调节剂和第一主溶剂；
每1000ml的第一染色液中，包括第一染料的质量为0.01g～1.00g，第二染料的质量为0.01g～0.30g，第一渗透压调节剂的质量为4.5g～18g；第一主溶剂用量采用定容法确定，即第一主溶剂的用量会使其他组份溶解后能形成1000ml体积的第一染色液；
所述第一染料是詹钠斯绿B；所述第二染料是中性红；第一渗透压调节剂是氯化钠；所述第一主溶剂是纯化水；
所述第二染色液中包括：第三染料是甲基蓝；第三染料的质量为5g-25g；所述第二促染剂是过氧化氢水溶液；所述第二渗透压调节剂是氯化钠；所述过氧化氢水溶液中，过氧化氢的质量百分比浓度为30%；所述第二主溶剂是纯化水。
15.根据权利要求1或2所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述稀释液中包括，缓冲剂、稀释液渗透压调节剂和稀释主溶剂；
所述稀释液的PH范围是6.0～8.5。
16.根据权利要求15所述的细胞染色试剂，其特征在于，
在每1000ml的稀释液中包括，缓冲剂的质量为0.121g～12.1g；
稀释液渗透压调节剂的质量为4.5g-18g，稀释主溶剂为纯化水；稀释主溶剂用量采用定容法确定，即稀释主溶剂的用量会使上述组份溶解后能形成1000ml体积的稀释液。
17.根据权利要求15所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述缓冲剂包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、磷酸盐（PBS）、1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)、N-氨基甲酰甲基乙磺酸(ACES)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)中中的任意一种或多种。
18.根据权利要求15所述的细胞染色试剂，其特征在于，
所述稀释液渗透压调节剂包括：氯化钠（NaCl）、硫酸钠（Na2SO4）中的任意一种或两种。
19.一种第一染色液的制备方法，其特征在于，
用于制备权利要求4所述的第一染色液；
包括步骤1：量取纯化水，称量甲酚紫、联苯胺、氯化钠，将四者混合均匀；
步骤2：用0.8微米尺寸的玻璃纤维过滤膜过滤,制得第一染色液。
20.一种第一染色液的制备方法，其特征在于，
用于制备权利要求14所述的第一染色液；
包括步骤1：量取纯化水，称量詹钠斯绿B、中性红、氯化钠，四者混合均匀；
步骤2：用0.8微米尺寸的玻璃纤维过滤膜过滤,制得第一染色液。
21.一种第二染色液的制备方法，其特征在于，
用于制备权利要求13所述的第二染色液；
包括步骤：量取纯化水，称量30%过氧化氢水溶液、氯化钠，三者混合均匀；制得第二染色液。
22.一种第二染色液的制备方法，其特征在于，
用于制备权利要求14所述的第二染色液；
包括步骤：量取纯化水，称量30%过氧化氢水溶液、氯化钠、甲基蓝，四者混合；制得第二染色液。
23.一种稀释液的制备方法，其特征在于，
用于制备权利要求15所述的稀释液；
包括步骤1：量取稀释主溶剂，称量缓冲剂、稀释液渗透压调节剂三者混合均匀；
步骤2：向稀释液中加入酸性物质或碱性物质，调剂稀释液pH值至6.0～8.5。
24.一种细胞染色方法，其特征在于，
使用了权利要求1所述的细胞染色试剂；
将待染色样本、第一染色液和稀释液三者混合均匀，完成样本的染色。
25.根据权利要求24所述的细胞染色方法，其特征在于，
待染色样本为3～15微升；
第一染色液和稀释液混合形成的第一综合试剂体积和待染色样本的体积比率范围是50:1～300：1；
待染色样本和第一综合试剂混合完成染色过程中，混合液中的细胞渗透压范围是260mmol/L～350mmol/L。
26.根据权利要求25所述的细胞染色方法，其特征在于，
第一染色液和稀释液混合形成的第一综合试剂体积和待染色样本的体积比率范围是100:1～200：1；
待染色样本和第一综合试剂混合完成染色过程中，混合液中的细胞渗透压范围是280mmol/L～320mmol/L。
27.一种细胞染色方法，其特征在于，
使用了权利要求12所述的细胞染色试剂；
将待染色样本、第一染色液和稀释液三者混合均匀，完成样本的第一次染色；
将第一次染色后的样本，再与第二染色液混合均匀，进行二次染色。
28.根据权利要求27中任意一项所述的细胞染色方法，其特征在于，
待染色样本为3～15微升；
第一染色液、稀释液和第二染色液混合形成的第二综合试剂体积和待染色样本的体积比率范围是100:1～300：1；
待染色样本和第二综合试剂混合完成染色过程中，混合液中的细胞渗透压范围是260mmol/L～350mmol/L。
29.根据权利要求28所述的细胞染色方法，其特征在于，
第一染色液、稀释液和第二染色液混合形成的第二综合试剂体积和待染色样本的体积比率范围是150:1～280：1；
待染色样本和第二综合试剂混合完成染色过程中，混合液中的细胞渗透压范围是290mmol/L～310mmol/L。
30.一种细胞染色方法，其特征在于，
使用了权利要求13所述的细胞染色试剂；且包括以下步骤：
步骤A1：待染色样品稀释；向待染色样品中加入稀释液制得样品稀释液；样品和稀释液的体积比率范围是1：50～1：300；
步骤B1：第一次染色：取步骤A1中的样品稀释液，加入第一染色液，混合均匀，制得一次染色后样本液；样品稀释液和第一染色液的体积比率范围是2：1～194：1；
步骤C1：第二次染色：取步骤B1中的一次染色后样本液，加入第二染色液，混合均匀，制得二次染色样本液；一次染色后样本液和第二染色液的体积比率范围是3：2～49：1。
31.一种细胞染色方法，其特征在于，
使用了权利要求13所述的细胞染色试剂；且包括以下步骤：
骤A2：第一染色液稀释；向稀释液中加入第一染色液，混合均匀，制得第一染色液稀释液；稀释液和第一染色液的体积比率范围是2：1～194：1；
步骤B2：综合染色剂稀释液制备；取步骤A2中的第一染色液稀释液，加入第二染色液，混合均匀，制得综合染色剂稀释液；第二染色液和第一染色液稀释液的体积比率范围是3：2～49：1；
步骤C2：待染色样品染色，取步骤B2中的综合染色剂稀释液，加入待染色样品；待染色样品和综合染色剂稀释液体积比率范围是1：50～1：300。
32.一种细胞染色方法，其特征在于，
使用了权利要求13所述的细胞染色试剂；
步骤A3：第一染色液稀释；向稀释液中加入第一染色液，混合均匀，制得第一染色液稀释液；稀释液和第一染色液的体积比率范围是2：1～194：1；
步骤B3：待染色样品染色，取步骤A3中的第一染色液稀释液，加入待染色样品制得一次染色后样本液；待染色样品和一次染色后样本液的体积比率范围是1：50～1：300；
步骤C3：二次染色样本液制备；取步骤B3中的一次染色后样本液，加入第二染色液，混合均匀，制得二次染色样本液；第二染色液和一次染色后样本液的质量或体积比率范围是3：2～49：1。
33.根据权利要求30至32中任意一项所述的细胞染色方法，其特征在于，
步骤D：染色后样品平铺；取步骤C1、步骤C2、步骤C3或步骤C3中获取的任意一种的二次染色样本液，将二次染色样本液滴入盛放载体，使二次染色样本液均匀平铺在盛放载体上，静置30秒至1分钟后，获得用于明场观测的染色样本。
34.根据权利要求30至32中任意一项所述的细胞染色方法，其特征在于，
所述步骤A1、步骤B1和步骤C1中，所述步骤A2、步骤B2和步骤C3中，所述步骤A3、步骤B3和步骤C3中，混匀时间为20秒～5分钟或30秒～1分钟；
用于染色的容器的容积不小于细胞染色试剂加入量，同时用于染色的容器的容积不不大于试剂加入量体积1倍。
35.根据权利要求24至32中任意一项所述的细胞染色方法，其特征在于，
还包括染色后混合液平铺的步骤：
将染色后的染色样本液，滴入盛放载体，使染色样本液均匀平铺在盛放载体上；静置30秒至1分钟后，获得用于明场观测的染色样本。
36.根据权利要求35所述的细胞染色方法，其特征在于，所述盛放载体包括尿成渣计数板，或细胞计数板，或带空腔的透明材料制成的观察装置或载玻片。
37.根据权利要求24至32中任意一项所述的细胞染色方法，其特征在于，
总染色时间小于8分钟，或总染色时间区间范围为5分钟～6分钟。
38.根据权利要求24至32中任意一项所述的细胞染色方法，其特征在于，
待染色样本包括血液样本、尿液样本、白带样本；
所述血液样本包括即时采的末梢静脉血，或EDTA（乙二胺四乙酸）抗凝的静脉血；
待染色样本的体积不少于0.01毫升。
39.根据权利要求24至32中任意一项所述的细胞染色方法，其特征在于，
细胞染色方法实施的环境温度范围为15摄氏度～37摄氏度。
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