CN112359041B - 一种用rna干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体是一种用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步骤：从青蒿中克隆腺毛发育负调控因子AaMYB2基因，构建含AaMYB2基因的植物干扰载体pHellsgate‑AaMYB2，用根癌农杆菌介导，将pHellsgate‑AaMYB2转入青蒿并再生出植株，PCR检测外源目的基因AaMYB2的整合情况，再测定转基因青蒿中腺毛密度和青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量显著提高，最高达到非转化对照植株的1.8倍，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。

Description

一种用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法。
背景技术
青蒿素(artemisinin)作为一种有效的抗疟药物已经得到全世界的认同。目前，青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取。Artemisia annua L.(青蒿)又名黄花蒿，是一年生草本药用植物。由于青蒿中青蒿素的含量非常低(占干重的0.01％-1％)，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。虽然现在已经能够人工合成青蒿素，但由于难度大，产量低，成本高，不具备商业化生产的可行性。
利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素是一种很有吸引力的方法。然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性不高。
利用基因工程技术获得稳定的高产青蒿素的青蒿新品种是一种比较可行的方法。目前主要采用过量表达青蒿合成途径中的关键酶法尼基焦磷酸合酶(farnesyldiphosphate synthase，FPS)的方法，而对于本发明涉及的通过抑制青蒿素合成途径的竞争性支路的研究尚未有成功报道。Pu Shi等发表了题为“青蒿中的AaMIXTA1调控青蒿分泌型腺毛的起始及蜡质的合成”的论文，报道通过在青蒿中过表达AaMIXTA1，使青蒿腺毛密度提高了1.5倍，青蒿素含量也提高了近1.5倍(Pu Shi等,The roles of AaMIXTA1 inregulating the initiation of glandular trichomes and cuticle biosynthesis inArtemisia annua.New Phytologist,2018年217,261-276.)。因此，调控青蒿腺毛密度为提高青蒿中青蒿素的含量提供了一条可行的方法。
但是关于用一种用RNA干扰青蒿中AaMYB2提高青蒿素含量的方法目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法，使其用RNA干扰抑制青蒿腺毛发育负调控因子的表达从而提高青蒿中腺毛密度，提高青蒿素含量。本发明涉及基因克隆、RNA干扰载体构建、遗传转化、分子检测、腺毛密度测定、青蒿素提取及含量测定，建立了提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素奠定坚实的基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明从青蒿中克隆AaMYB2基因部分序列，通过构建hairpin结构建立用于RNA干扰的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将AaMYB2hairpin基因转入青蒿植株中，通过PCR和RT-PCR检测目的基因AaMYB2 hairpin的整合和表达情况，通过荧光显微镜统计腺毛密度，通过高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。
为了实现上述目的，本发明提供一种用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法，是从青蒿中克隆青蒿腺毛发育负调控基因AaMYB2片段，构建含AaMYB2 hairpin的植物表达载体pHellsgate-AaMYB2，用根癌农杆菌介导，将pHellsgate-AaMYB2载体转入青蒿中获得再生植株，PCR和qRT-PCR检测目的基因AaMYB2的整合和表达情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。
进一步的，所述的用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括以下步骤：
(a)采用基因克隆方法获得包含AaMYB2编码序列的基因片段，其核苷酸序列如SEQID No.1所示，通过选取AaMYB2干扰序列SEQ ID No.2，用于构建RNA干扰载体，其扩增引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
SEQ ID No.3：ATGGACTCGAAGTCAAACAA；
SEQ ID No.4：TCTACCAGGTAGTCTTCCCG。
(b)把AaMYB2干扰序列SEQ ID No.2构建成hairpin结构后可操作性地连于表达调控序列，形成含AaMYB2 hairpin基因的植物表达载体pHellsgate-AaMYB2；
(c)将含AaMYB2 hairpin基因的植物表达载体pHellsgate-AaMYB2转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaMYB2 hairpin基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；
(d)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株；
(e)QRT-PCR测定青蒿中AaMYB2基因的表达；
(f)利用荧光显微镜统计腺毛密度；
(g)对获得的转基因青蒿植株中青蒿素含量进行高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定，获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。
进一步的，所述的步骤b中，扩增AaMYB2干扰序列SEQ ID No.2的引物序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.4所示：
SEQ ID No.5：CACCATGGACTCGAAGTCAAACAA；
SEQ ID No.4：TCTACCAGGTAGTCTTCCCG。
进一步的，所述的步骤b具体包括以下步骤：
b1)中间载体pENTR-AaMYB2 hairpin的构建：通过引物扩增AaMYB2基因片段，通过GATAWAY的入门克隆的方法连接到pENTR上形成中间载体PENTR-AaMYB2；
b2)植物双元表达载体pHellsgate-AaMYB2 hairpin的构建：以所述的pENTR-AaMYB2载体为基础，同载体pHellsgate12进行LR反应，连接到pHellsgate上形成植物双元表达载体pHellsgate-AaMYB2。
进一步的，所述的步骤d中，分别设计合成AaMYB2 hairpin的检测引物，对***正向的AaMYB片段(扩增引物SEQ ID No.6，SEQ ID No.4)和反向的AaMYB片段(扩增引物SEQID No.7，SEQ ID No.4)扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性植株即为所述的经PCR检测的转基因青蒿。
SEQ ID No.6：GGGATGACGCACAATCC；
SEQ ID No.7：GAGCTACACATGCTCAGG。
进一步的，所述的步骤e中，QRT-PCR测定青蒿中AaMYB2基因的表达的方法为：设计合成青蒿中AaMYB2基因的引物(核苷酸序列如SEQ ID No.8-SEQ ID No.9所示)，进行QRT-PCR扩增，用相对定量法分析基因相对表达量。
SEQ ID No.8：GAAGCTATCGAGATACATGGTCCTA；
SEQ ID No.9：GCGAATAATCAAATCCTCCTCTT。
进一步的，所述的步骤g中，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量的方法如下：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇：水，甲醇：水的体积比为70：30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数(gain)为7，载气压力5bar。
本发明优点在于：
本发明的利用hairpinRNA介导的RNA干扰抑制青蒿素合成途径的竞争支路关键酶的表达从而提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，将载体pHellsgate-AaMYB2导入青蒿植株中，获得了青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株，转基因青蒿植株中青蒿素的含量最高可达到16mg/g DW(即干重的1.6％)，是非转化普通青蒿(9mg/g DW，即干重的0.9％)的1.8倍，该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。
附图说明
图1.MYB-RNAi腺毛密度变化；
图2.青蒿素合成途径基因表达量；
图3.腺毛密度统计和青蒿素含量测定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：青蒿AaMYB2基因片段的克隆
1.青蒿基因组总RNA的提取
取少量青蒿(采用产于重庆酉阳青蒿素含量较高的青蒿品种)幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1mL TRIzol(TRIzol Reagents,GIBCO BRL,USA)的1.5mLEppendorf管中，充分振荡后，于室温下放置5min，加200μL氯仿，用力振荡15sec，室温放置2-3min后，于4℃、12,000g离心15min；将上清液(约600μL)吸入干净的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4℃、12,000g离心10min；弃上清,加1mL 75％乙醇清洗，振荡后，于4℃、7,500g离心5min；室温干燥15-20min后溶于适量(30-50μL)RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
2.青蒿AaMYB2基因片段的克隆
将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所述青蒿AaMYB2基因的编码序列(SEQ ID No.1)，设计扩增出AaMYB2的干扰序列(SEQ IDNo.2，即SEQ ID No.1的1bp到300bp)的上下游引物(SEQ ID No.3：ATGGACTCGAAGTCAAACAA；SEQ ID No.4：TCTACCAGGTAGTCTTCCCG)，并在上游和下游引物上分别引入接头序列(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由苏州金唯智技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的AaMYB2的干扰序列(SEQ ID No.2)与GenBank中所报道的青蒿AaMYB2基因的编码序列(SEQ ID No.1)的1bp到300bp一致。
本实施例采用基因克隆方法从青蒿中获得序列正确的青蒿中青蒿腺毛负调控基因AaMYB2的干扰序列(SEQ ID No.2)，为通过RNA干扰抑制AaMYB2的表达从而提高青蒿素含量提供了基因片段。
实施例2：含AaMYB2 hairpin基因的植物双元表达载体的构建
1.中间载体pENTR-AaMYB2 hairpin的构建
将实施例1中AaMYB2的干扰序列(SEQ ID No.2)通过基因引物CACCATGGACTCGAAGTCAAACAA(SEQ ID No.5)和TCTACCAGGTAGTCTTCCCG(SEQ ID No.4)扩增出来，通过GATAWAY的入门克隆的方法连接到pENTR上形成PENTR-AaMYB2。具体操作如下：用高保真酶KOD plus(日本东洋纺)同引物F1R1扩增出AaMYB2片段。通过和pENTR载体(赛默飞公司商品化载体)的同源重组30min后，将重组产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测，获得中间载体pENTR-AaMYB2。
Figure BDA0002769711030000051
Figure BDA0002769711030000061
2.植物双元表达载体pHellsgate-AaMYB2 hairpin的构建
以所述的pENTR-AaMYB2载体为基础，同载体pHellsgate12进行LR反应，连接到pHellsgate上形成pHellsgate-AaMYB2。具体操作如下：抽提pENTR-AaMYB2的质粒，通过和pHellsgate载体(赛默飞公司商品化载体)同源重组30min后，将重组产物转化大肠杆菌DH5α，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测，获得植物双元表达载体pHellsgate-AaMYB2。
Figure BDA0002769711030000062
本实施例将青蒿腺毛发育负调控基因AaMYB2的干扰序列(300bp,SEQ ID No.2)构建成hairpin结构后可操作性地连于表达调控序列，形成含AaMYB2hairpin基因的植物表达载体pHellsgate-AaMYB2，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高青蒿中青蒿素含量。
实施例3：根癌农杆菌介导AaMYB2 hairpin基因遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株
1.含AaMYB2 hairpin基因双元植物表达载体pHellsgate-AaMYB2根癌农杆菌工程菌的获得
将实施例2中含AaMYB2 hairpin基因的植物双元表达载体pHellsgate-AaMYB2转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。结果表明，含AaMYB2 hairpin基因植物双元表达载体pHellsgate-AaMYB2已成功构建到根癌农杆菌菌株。
2.根癌农杆菌介导AaMYB2 hairpin基因转化青蒿
2.1.外植体的预培养
青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog,1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
2.2.农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含AaMYB2 hairpin基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
2.3.抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。
3.转基因青蒿植株的PCR检测
根据目的基因所在载体序列AaMYB2 hairpin分别设计引物(SEQ ID No.6，SEQ IDNo.7)对转基因青蒿植株中目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出约900bp的特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组提取的DNA作为PCR的阴性模板，没有扩增出任何片段，表明RNAi载体成功转化到青蒿中。
本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaMYB2hairpin基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。
实施例4：QRT-PCR检测转基因青蒿植株中AaMYB2基因的表达
1.引物的设计和合成
根据青蒿AaMYB2基因和看家基因actin全序列设计引物。引物扩增基因片段长度分别为162bp、300bp。所用引物由苏州金唯智合成。引物序列如下：
SEQ ID No.8：GAAGCTATCGAGATACATGGTCCTA；
SEQ ID No.9：GCGAATAATCAAATCCTCCTCTT；
SEQ ID No.10：CCAGGCTGTTCAGTCTCTGTAT；
SEQ ID No.11：CGCTCGGTAAGGATCTTCATCA。
2.RNA的提取和反转录
参照实施例1中所述方法，从青蒿植株中提取RNA，用DNaseI除去RNA中基因组DNA，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成。
3.RT-PCR检测转基因青蒿中AaMYB2基因和看家基因actin的表达
为调整各样品间在RNA抽提和逆转录过程中反应效率的差异，检测目的基因AaMYB2表达量的同时需检测看家基因actin基因的表达。检测actin和目的基因的PCR的反应体系如下：
Figure BDA0002769711030000081
PCR反应条件：热启动和变性94℃5min，1个循环；94℃30s，54℃30s，72℃10s，35个循环；72℃8min，1个循环；4℃保存。电泳检测结果。
本实施例采用qRT-PCR技术测定转基因青蒿中腺毛发育负调控因子AaMYB2基因表达量的高低，同时检测青蒿素合成途径基因的表达量的高低可以初步筛选出可能的青蒿素高产的青蒿植株。
结果如图2所示，干扰了腺毛发育负调控基因AaMYB2，青蒿素合成途径基因ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1的表达量增加，可能导致代谢流流向青蒿素合成途径，青蒿素的含量增加。
实施例5：利用荧光显微镜测定青蒿腺毛密度
由于青蒿腺毛会自发荧光，通过奥林巴斯荧光显微镜BX43***，在激发光波长为430nm下观察荧光，计算面积统计腺毛密度。
结果如图1所示，干扰了AaMYB2基因的表达量，相对于对照实验组来说，干扰植物的叶片腺毛密度增加，从而导致青蒿素的合成增加。
实施例6：利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量
1.HPLC-ELSD条件及***适用性以及标准溶液的配制
HPLC：采用water alliance 2695***，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为甲醇：水，甲醇：水的体积比为70：30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。
ELSD：采用water alliance 2420***，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7，载气压力5bar；
精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。
本发明中流动相为甲醇(methanol)：水，比例为70％：30％时，青蒿素的保留时间为5.1min，峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。
2.标准曲线的制作
将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl，4μl，6μl，8μl，10μl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,μg)进行回归分析。通过研究，本发明中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为：
Y＝1.28e+000X+4.71e+000，R＝0.979546
3.样品的制备和青蒿素含量的测定
青蒿素的提取过程基于Van Nieuwerburgh et al.(2006)中报道的方法：取少量新鲜的青蒿叶片(1-2g鲜重)，于50ml试管中将其浸没在10ml氯仿中摇荡1分钟，将浸出液倒入新的试管中使氯仿挥发完全，取3ml无水乙醇充分溶解提取物，用于HPLC检测。同时，氯仿提取后的叶片收集放入60度烘箱进行烘干，称重(计算青蒿叶片的干重)；
采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20ul，根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。
结果如图3所示，RNAi植株的腺毛密度较CK提高了1.7倍，其相应的青蒿素含量也较CK提高最高为1.8倍。
在本发明中转AaMYB2 hairpin基因显著提高青蒿中青蒿素含量。转AaMYB2hairpin基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到16mg/g DW(即干重的1.6％)，是非转化普通青蒿(0.9mg/g DW，即干重的0.9％)的1.8倍。
本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量。采用RNA干扰策略获得了青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供了一种理想方法。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军海军军医大学
<120> 一种用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法
<130> /
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 546
<212> DNA
<213> 青蒿(Artemisia annua)
<400> 1
atggactcga agtcaaacaa atccaagaat aaagaaatta atagaggagc atggacagca 60
gaagaagatg aaaagctagc agaagctatc gagatacatg gtcctaaaaa atggacagtc 120
attgcaacaa aagcaggttt gcaaaggtgt ggaaagagtt gtaggttaag atggttaaat 180
tatttgagac caaacatcaa acgaggaaat atatcagatc aagaggagga tttgattatt 240
cgccttcata aacttttagg aaacaggtgg tcactgatag cgggaagact acctggtaga 300
acggataatg agatcaagaa ctattggaat tcccatttga gcaaaaagaa ggaaacaatg 360
gaaaaacaaa cggatcataa aaagaagatg aaagaagagg atgtcaccga tagaaacaaa 420
cttggagttg aatcttcaaa gttcagtttc aacgttgatg agttttttga tttttcgaat 480
gaggatccct cgaccttgga ttgggttaac aggtaccttg cgggtacaag tgatgcattt 540
ctgtag 546
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> 青蒿(Artemisia annua)
<400> 2
atggactcga agtcaaacaa atccaagaat aaagaaatta atagaggagc atggacagca 60
gaagaagatg aaaagctagc agaagctatc gagatacatg gtcctaaaaa atggacagtc 120
attgcaacaa aagcaggttt gcaaaggtgt ggaaagagtt gtaggttaag atggttaaat 180
tatttgagac caaacatcaa acgaggaaat atatcagatc aagaggagga tttgattatt 240
cgccttcata aacttttagg aaacaggtgg tcactgatag cgggaagact acctggtaga 300
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
atggactcga agtcaaacaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
tctaccaggt agtcttcccg 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
caccatggac tcgaagtcaa acaa 24
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
gggatgacgc acaatcc 17
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
gagctacaca tgctcagg 18
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
gaagctatcg agatacatgg tccta 25
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
gcgaataatc aaatcctcct ctt 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
ccaggctgtt cagtctctgt at 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
cgctcggtaa ggatcttcat ca 22

Claims (7)

1.一种用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，是从青蒿中克隆青蒿腺毛发育负调控基因AaMYB2，构建含AaMYB2 hairpin的植物表达载体pHellsgate-AaMYB2，用根癌农杆菌介导，将pHellsgate-AaMYB2载体转入青蒿中获得再生植株，PCR和qRT-PCR检测目的基因AaMYB2的整合和表达情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。
2.根据权利要求1所述的用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)采用基因克隆方法获得包含AaMYB2编码序列的基因片段，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，通过选取AaMYB2干扰序列SEQ ID No.2，用于构建RNA干扰载体，其扩增引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
(b)把AaMYB2干扰序列SEQ ID No.2构建成hairpin结构后可操作性地连于表达调控序列，形成含AaMYB2 hairpin基因的植物表达载体pHellsgate-AaMYB2；
(c)将含AaMYB2 hairpin基因的植物表达载体pHellsgate-AaMYB2转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaMYB2 hairpin基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；
(d)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株；
(e)QRT-PCR测定青蒿中AaMYB2基因的表达；
(f)利用荧光显微镜统计腺毛密度；
(g)对获得的转基因青蒿植株中青蒿素含量进行高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定，获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。
3.根据权利要求2所述的用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述的步骤b中，扩增AaMYB2干扰序列SEQ ID No.2的引物序列分别如SEQ ID No.5和SEQ IDNo.4所示。
4.根据权利要求2所述的用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述的步骤b具体包括以下步骤：
b1)中间载体pENTR-AaMYB2 hairpin的构建：通过引物扩增AaMYB2基因片段，通过GATAWAY的入门克隆的方法连接到pENTR上形成中间载体PENTR-AaMYB2；
b2)植物双元表达载体pHellsgate-AaMYB2 hairpin的构建：以所述的pENTR-AaMYB2载体为基础，同载体pHellsgate12进行LR反应，连接到pHellsgate上形成植物双元表达载体pHellsgate-AaMYB2。
5.根据权利要求2所述的用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述的步骤d中，分别设计合成AaMYB2 hairpin的检测引物，对***正向的AaMYB片段和反向的AaMYB片段扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性植株即为所述的经PCR检测的转基因青蒿。
6.根据权利要求2所述的用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述的步骤e中，QRT-PCR测定青蒿中AaMYB2基因的表达的方法为：设计合成青蒿中AaMYB2基因的引物，进行QRT-PCR扩增，用相对定量法分析基因相对表达量。
7.根据权利要求2所述的用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述的步骤g中，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定青蒿中青蒿素含量的方法如下：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇：水，甲醇：水的体积比为70：30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数为7，载气压力5bar。
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