CN112353741A

CN112353741A - 一种抗皱组合物和抗皱霜

Info

Publication number: CN112353741A
Application number: CN202011544525.3A
Authority: CN
Inventors: 潘兰英; 潘宏川
Original assignee: Ruizilan Hangzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Ruizilan Hangzhou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2040-12-24
Also published as: CN112353741B

Abstract

本发明提供了一种抗皱组合物和抗皱霜。该抗皱组合物包括重量比为5～7∶3～6∶1的黄精提取物、山茱萸提取物和金桔提取物。本申请的抗皱组合物包括黄精提取物、山茱萸提取物和金桔提取物，该抗皱组合物可阻断肌肉中细胞膜上的电压依赖型Nav1.4通道，从而影响离子的释放，作用靶点明确，效果亦明确；且黄精提取物、山茱萸提取物的使用促进了金桔提取物的吸收。本申请的各提取物中的化合物分子量小，易于穿透皮肤，可起到显著放松过度单一的肌肉紧张的效果，亦可缓解和改善已产生的皱纹。

Description

一种抗皱组合物和抗皱霜

技术领域

本发明涉及抗皱技术领域，具体而言，涉及一种抗皱组合物和抗皱霜。

背景技术

随着年龄的增长，人体新陈代谢开始减慢，水分和皮下脂肪减少，弹性纤维逐渐***，皮肤变皱、光泽消退。皮肤老化是整个机体衰老的突出表现，其中脸部皮肤老化尤为明显，人体内成纤维细胞的数量逐渐减少，其分泌的胶原蛋白和弹力纤维蛋白也因为被氧化逐渐减少、断裂，对表皮的支撑作用就消失，造成不均一的塌陷，真皮层开始变薄，皮肤弹性变差，皱纹也开始逐渐产生。虽然皮肤老化是不可逆的生理现象，但其进程却可以延缓或减慢。针对脸部皱纹，最为常用的是抗皱化妆品。

目前，抗皱化妆品多从提高皮肤抗氧化能力的角度实现抗氧化的功能，抗氧化的原理基本是对抗人体产生的自由基，目前已知的具有抗氧化功能的主要物质有维生素A/C/E、原花青素PC、辅酵素Q10、虾青素、酵母提取物等。但是，由于自由基类型之多，很难在一种产品中包含具有对抗各种自由基的有效成分，因此导致抗氧化产品的抗皱功能难以进一步提升。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种抗皱组合物和抗皱霜，以解决现有技术中的抗氧化技术实现抗皱功能有限的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗皱组合物，抗皱组合物包括重量比为5～7∶3～6∶1的黄精提取物、山茱萸提取物和金桔提取物。

进一步地，上述金桔提取物为金桔水提物和/或金桔醇提物。

进一步地，上述金桔水提物的制备方法包括：采用水对金桔皮进行加热回流提取，得到水提取液；对水提取液进行固液分离和旋转蒸发，得到金桔水提物，金桔水提物的体积为水提取液体积的1/8～1/3，优选水与金桔皮的重量比为7～14∶1，优选加热回流提取的时间为1～5h。

进一步地，上述金桔醇提物的制备方法包括：采用乙醇溶液对金桔皮进行加热回流提取，得到醇提取液；对醇提取液进行固液分离和旋转蒸发，得到金桔醇提物，金桔醇提物的体积为醇提取液体积的1/8～1/3，优选以浓度为20％的乙醇溶液计，乙醇溶液与金桔皮的重量比为7～14∶1，加热回流提取的时间为1～5h。

进一步地，上述黄精提取物和山茱萸提取物各自独立地为醇提物或水提物。

进一步地，上述黄精提取物或山茱萸提取物的制备方法包括：将黄精或山茱萸以1g∶20～30mL的比例与水混合，在50～90℃下浸提50～90min，得到黄精提取物或山茱萸提取物。

根据本发明的另一方面，还提供了一种抗皱霜，包括抗皱有效成分和辅料，该抗皱有效组分为上述任一种的抗皱组合物混合而成。

进一步地，上述抗皱霜中抗皱有效成分的重量百分含量为3～10％。

进一步地，上述辅料包括硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡、白凡士林、甘油、超纯水、三乙醇胺和吐温80。

进一步地，上述硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡、白凡士林、甘油、超纯水、三乙醇胺和吐温80的比例为2～3g∶1～1.5g∶1.0～2.2g∶0.2～1.0g∶1.0～2.5g∶2～8mL∶0.05～0.1mg∶0.14～0.2mL。

应用本发明的技术方案，本申请的抗皱组合物包括黄精提取物、山茱萸提取物和金桔提取物，该抗皱组合物可阻断肌肉中细胞膜上的电压依赖型Nav1.4通道，从而影响离子的释放，作用靶点明确，效果亦明确；且黄精提取物、山茱萸提取物的使用促进了金桔提取物的吸收。本申请的各提取物中的化合物分子量小，易于穿透皮肤，可起到显著放松过度单一的肌肉紧张的效果，亦可缓解和改善已产生的皱纹。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明的实施例1显微镜下的细胞和膜片钳针尖接近细胞膜过程；

图2示出了根据本发明的实施例1加入混合物前后的电流变换；以及

图3示出了根据本发明的实施例1的混合物对于Nav1.4的灌流抑制作用，电流单位为pA。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

如本申请背景技术所分析的，现有技术由于自由基类型之多，很难在一种产品中包含具有对抗各种自由基的有效成分，因此导致抗氧化产品的抗皱功能难以进一步提升。为了解决该问题，本申请尝试其他抗皱途径。本申请发现由于皮肤附着在肌肉表面，面部皮肤因为强的肌肉收缩，而产生众多表情纹，诸如抬头纹、鱼尾纹以及眼睛之间的垂直褶皱。因此缓解肌肉收缩程度应该可以起到抗皱效果。基于该思路，本申请对影响肌肉收缩的因素进行研究，发现Nav1.4通道与肌肉收缩有密切关系。

为了本领域技术人员便于理解本申请的技术原理，以下对Nav钠离子进行说明：

钠离子是由负责感受电压和离子选择的α亚基以及1-2个调节它的β亚基组成的，在人体中，α亚基有9种不同的亚型，分别被命名为Nav1.1-1.9，β亚基有4种亚型，分别被命名为β1-β4。

α亚基一般包含大约2000个氨基酸，其中包含了四个序列相近结构类似的跨膜结构域I-IV，每个结构域含有6根跨膜螺旋。每个结构域中的前四根跨膜螺旋S1-S4构成电压感受器(VSD)，而四组S5-S6跨膜螺旋共同构成位于整个结构中央的负责离子通透的孔道结构域，连接跨膜螺旋S5-S6之间的两个半穿膜短螺旋共同支撑一小段伸展序列，构成负责实现离子通透特异性的选择筛。连接第三和第四个结构域之间的序列比较短，已被证明对于钠通道的快速失活至关重要，但具体机理并不清楚。

快速失活机制可以让钠通道在感受刺激，引起动作电位后迅速关闭，防止神经肌肉细胞持续性放电。同时钠钾泵重建膜电势，为下一次动作电位做好准备。因此钠通道的快速失活对它发挥正常的生理功能至关重要。

电压门控钠通道是跨膜糖蛋白复合物，其由具有24个跨膜结构域和一个或多个调节β亚基的大α亚基组成，在人中由编码SCN4A基因。编SCN4A基因的突变与低钾性周期性麻痹，高钾性周期性麻痹，先天性副肌病和钾加重的肌强直有关。不一样的钠离子亚型会产生各种各样的药理作用，而跨膜糖蛋白复合物负责神经元和肌肉中动作电位的产生和传播。该基因编码钠通道α亚基基因家族的一个成员。它在骨骼肌中表达，并且该基因的突变与几种肌强直和周期性瘫痪病症有关。

如果可以阻断肌肉中细胞膜上的电压依赖型Nav1.4通道，从而影响离子的释放，进而实现快速恢复收缩的肌肉，进而实现抗皱作用。本申请进一步研究发现，金桔等提取物对阻断肌肉中细胞膜上的电压依赖型Nav1.4通道具有明显作用，因此本申请提供了一种抗皱组合物和抗皱霜。

在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种抗皱组合物，该抗皱组合物包括重量比为5～7∶3～6∶1的黄精提取物、山茱萸提取物和金桔提取物。

本申请的抗皱组合物包括黄精提取物、山茱萸提取物和金桔提取物，该抗皱组合物可阻断肌肉中细胞膜上的电压依赖型Nav1.4通道，从而影响离子的释放，作用靶点明确，效果亦明确。本申请的各提取物中的化合物分子量小，易于穿透皮肤，可起到显著放松过度单一的肌肉紧张的效果，亦可缓解和改善已产生的皱纹。当然，也可应用于神经肌肉过度紧张等症状。

虽然目前还没有明确是上述提取物中的具体哪种组分还是哪几种组分协同作用实现了阻断肌肉中细胞膜上的电压依赖型Nav1.4通道的作用，但是可以确定无论是金桔水提物还是金桔醇提物在应用至上述抗皱组合物中均可实现上述作用，因此本申请的金桔提取物包括但不限于金桔水提物和/或金桔醇提物。

为了便于本申请的抗皱组合物的制备，以及本申请的抗皱组合物的抗皱作用的稳定发现，本申请的一些实施例中还提供了一种金桔水提物的制备方法包括：采用水对金桔皮进行加热回流提取，得到水提取液；对水提取液进行固液分离和旋转蒸发，得到金桔水提物，金桔水提物的体积为水提取液体积的1/8～1/3，优选水与金桔皮的重量比为7～14∶1，优选加热回流提取的时间为1～5h。现有技术中其他提取方法得到的金桔水提物也在一定程度上具有抗皱作用，但是上述制备方法简单易操作，且得到的金桔水提物在应用至本申请的抗皱组合物时对于阻断肌肉中细胞膜上的电压依赖型Nav1.4通道的作用效果更为显著。

同样地，本申请的一些实施例中还提供了一种金桔醇提物的制备方法包括：采用乙醇溶液对金桔皮进行加热回流提取，得到醇提取液；对醇提取液进行固液分离和旋转蒸发，得到金桔醇提物，金桔醇提物的体积为醇提取液体积的1/8～1/3，优选以浓度为20％的乙醇溶液计，乙醇溶液与金桔皮的重量比为7～14∶1，加热回流提取的时间为1～5h。现有技术中其他提取方法得到的金桔醇提物也在一定程度上具有抗皱作用，但是上述制备方法简单易操作，且得到的金桔醇提物在应用至本申请的抗皱组合物时对于阻断肌肉中细胞膜上的电压依赖型Nav1.4通道的作用效果更为显著。

用于本申请的黄精提取物和山茱萸提取物没有特别限定，本领域技术人员可以选用各自的醇提物或水提物作为黄精提取物和山茱萸提取物。

在一种优选的实施例中，上述黄精提取物或山茱萸提取物的制备方法包括：将黄精或山茱萸以1g∶20～30mL的比例与水混合，在50～90℃下浸提50～90min，得到黄精提取物或山茱萸提取物。上述制备方法易于实现，且所得提取物与金桔提取物的配合作用更提出，更有利于金桔提取物的吸收。

为了本申请的抗皱组合物在作为抗皱产品中的使用，在本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种抗皱霜，包括抗皱有效成分和辅料，该抗皱有效组分为上述任一种的抗皱组合物混合而成。将上述抗皱组合物混合后与辅料混合形成抗皱霜，实现了消费者使用的便利性。

在一种实施例中，以重量份剂，上述抗皱霜中抗皱有效成分的重量百分含量为3～10％。上述抗皱霜中的抗皱有效成分含量充足，且辅料的用量足以保持其在常规使用和储存条件下的稳定性。

用于本申请的辅料可以采用目前常规护肤霜中常用的辅料，为了使本申请的抗皱霜在常温、高温以及低温条件下的稳定性，优选上述辅料包括硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡、白凡士林、甘油、超纯水、三乙醇胺和吐温80。进一步优选硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡、白凡士林、甘油、超纯水、三乙醇胺和吐温80的比例为2～3g∶1～1.5g g∶1.0～2.2g∶0.2～1.0g∶1.0～2.5g∶2～8mL∶0.05～0.1mL∶0.14～0.2mL

当然，本申请的上述抗皱组合物不仅可以制作为，上述抗皱霜的抗皱，其还可以单独使用或者制作为乳液、喷雾剂等形式，其具体组合方式可以参考现有技术，在此不再赘述。

以下结合实施例和对比例，对本申请的有益效果进行说明。

实施例1

1、原料准备

金桔醇提物：采用500mL 20％的乙醇溶液对50g新鲜金桔皮进行加热回流提取3次，每次1h，合并3次提取液，经抽滤后旋转蒸发，获得约50ml的醇提取物。

金桔水提物：采用500mL水对50g新鲜金桔皮进行加热回流提取3次，每次1h，合并3次提取液，经抽滤后旋转蒸发，获得约50ml的水提取物。

黄精提取物：采用500mL水对20g山茱萸在50～90℃下浸提50～90min，得到黄精提取物；

山茱萸提取物：采用500mL水对20g山茱萸在50～90℃下浸提50～90min，得到山茱萸提取物。

将上述黄精提取物、山茱萸提取物和金桔水提物以5∶5∶1的重量比进行混合，形成混合物，进行混合物对Nav1.4通道的阻滞作用细胞膜片钳实验，明确提取物对Nav1.4通道的阻滞作用。

2.试验细胞

稳定转染Na1.4钠离子通道的CHO细胞株由浙江德清奥丽芙生物科技有限公司赠与。

2.1试验相关试剂配制

一)细胞外液(1L)：

将8.01g NaCl，0.30g KCl，1.8ml CaCl2(1m mol/L)，1ml MgCl2(1m mol/L)，1.80g Glucose和2.39g HEPES试剂加入到800ml无菌水的烧杯中，搅拌混匀，再加入200ml无菌水定容至1L；根据pH仪显示操作，用NaOH将其pH调节至7.35-7.40之间；用抽滤装置过滤，将配好的试剂装入玻璃瓶中盖紧，放入4℃冰箱保存备用。

二)细胞内液(1L)：

称量2.4457g KASP，0.2383g HEPES，0.0407g MgCl2和0.481g EGTA加入到800ml无菌水的烧杯中，搅拌混匀，再加入200ml无菌水定容至1L；根据pH仪显示操作，用NaOH将其pH调节至7.35-7.40之间；用抽滤装置过滤，分装至1.5ml PE管中，放入-20℃冰箱保存备用。

三)(10％FBS+P/S)DMEM培养基、(10％FBS)DMEM无抗培养基、DMEM(20％FBS+P/S)细胞冻存液、20％DMSO细胞冻存液的配制：

试剂：小牛血清(FBS)溶液、100×P/S(青霉素+链霉素)溶液；DMEM培养基(含L-谷氨酰胺)、DMSO

步骤：1.准备超净台：事先将移液管、枪头等放入超净台，打开紫外灭菌0.5h后通风15min，点燃酒精灯；

2.从-20℃冰箱中取出早已分装好备用的FBS溶液45ml和100×P/S溶液5ml；4℃冰箱取出DMEM溶液一瓶；全部放入37℃恒温水浴箱中，使达到室温以备用；

3.当FBS、DMEM、P/S溶液达到室温后，从水浴箱取出，用纸巾擦干瓶体的水珠。用70％的消毒酒精喷洒瓶底和瓶颈，再用纸巾擦干，移入已点燃酒精灯的无菌操作台上备用；

4.打开DMEM的培养瓶，将瓶盖的瓶口朝下放置，瓶口在酒精灯上过火焰，取装有FBS 45ml的50ml离心管，打开盖子，瓶口过火焰，立刻倒入500ml DMEM中，使FBS在DMEM中的含量几乎达到10％，盖好盖子；

5-1 DMEM(10％FBS+P/S)：另取装有5ml P/S(青霉素+链霉素)的15ml的离心管，以同样方法倒入已配好的含FBS(10％)的500ml DMEM中；

5-2 DMEM(10％FBS)：配制无抗的DMEM只需到第四步，配制好摇匀并分装保存。

5-3 DMEM(20％FBS+P/S)：细胞冻存液：取18ml的DMEM(10％FBS+P/S)注入50ml的离心管中，再加2ml的FBS(胎牛血清)即可；

5-4 20％DMSO细胞冻存液：取8ml已配好的DMEM(20％FBS+P/S)注入15ml的离心管中，再用移液枪移取2ml DMSO，慢慢的逐滴地加入，并不断的混匀；

6.在配好的试剂瓶上及时贴上标签，做好标记，标明试剂名称，配制的时间，放入普通冰箱保存备用。

四)植物提取物溶液的配制：植物提取物为实验室自主提取。植物提取物以DMSO为溶剂溶解，配制成50mmol/L的储存浓度，同时依次稀释成9mmol/L、3mmol/L、0.9mmol/L、0.3mmol/L，按照试验浓度，各自分装167μL在PE小管中保存于-20℃冰箱。试验时，每种浓度各取一支稀释到50ml细胞外液中，依次配制成浓度为30μmol/L、10μmol/L、3μmol/L、1μmol/L。

细胞培养过程如下：

一)细胞的复苏及换液

试剂及材料：10ml移液管、移液枪(10微升、200微升、1 000微升)、枪头(10微升、200微升、1 000微升)、离心管(15ml)、培养皿(100mm)、酒精(75％)、酒精灯、打火机、剪刀、废液缸、餐巾纸；

仪器：37℃恒温水浴锅、超净台(100级)、37℃细胞培养箱；

试剂：DMEM(10％FBS+P/S)；

1.先将需要用的实验材料放入超净台上，打开紫外，灭菌0.5h后关闭紫外打开风机吹15min左右；

2.将DMEM(10％FBS+P/S)放入37℃恒温水浴锅预热备用；

3.待第一步完成后，在超净台喷适量酒精(75％)再次消毒并用纸擦拭超净台，点燃酒精灯，把预热好的DMEM取出擦干再用75％的酒精喷管身消毒后转移至超净台；

4.在两15ml离心管中各加入8ml、9ml DMEM备用；

5.准备一个-80的冰盒，将冻存细胞从液氮罐取出，置于-80℃冰盒迅速转移到37℃水浴锅中摇晃1-2min，使冻存管内冰块接近完全融化，待管内只有米粒大小冰块时，迅速移入超净台上(移出时先擦干水，再用酒精消毒管外壁后再移入)；

6.在冻存管中加入1ml DMEM，用移液枪吹打混匀，把冻存管中的细胞全部移入预先准备好的装有8ml DMEM(10％FBS+P/S)的离心管中，再置于离心机中配平，1 500rmp离心5min，弃上清；

7.在离心管中加入1ml DMEM把离心好的细胞沉淀悬浮后，全部移入预先准备好的装有9ml DMEM离心管中，进行离心，1 500rmp，离心5min；

8.用1ml DMEM培养液将细胞沉淀悬浮；

9.将细胞悬浮液均匀加入到盛有10ml DMEM(10％FBS+P/S)的培养皿中，在台面上上下左右轻微晃动，使细胞分布均匀然后将复苏好的细胞放入培养箱中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下培养，细胞贴壁生长；

10.次日，观察细胞生长情况，当细胞死亡较多或者培养基发黄时应进行换液，方法如下：前期准备工作按上述方法，准备好超净台；将细胞从培养箱取出放入超净台台面操作，用移液枪轻轻吸走所有废液，然加入10ml的完全培养基，将细胞放回培养箱继续培养观察，如果细胞死亡较多，应该增加换液次数。

二)细胞传代及冻存

当培养皿内的细胞生长达80％(贴壁覆盖面积)时，应当进行细胞传代或者冻存。方法如下：

1.按照前边方法准备好超净台以及培养基；

2.将长好的细胞从培养箱取出，吸走所有原培养基，用10ml的PBS清洗细胞一次，弃去；

3.缓慢加入1ml含的0.25％胰酶消化液，上下左右倾斜培养皿，使细胞表面全都覆盖胰酶；

4.将培养皿放入37℃CO2恒温培养箱中消化5min左右，如较难消化，可适当延长消化时间消化过程中(以观察到细胞是否脱离培养皿底为准，注意不要用力摇晃培养皿，防止细胞粘连成片，不利于消化完整)；

5.待消化完成后取出培养皿，加入1ml含血清的完全培养基，终止消化；

6.用1ml的枪轻轻吹打细胞，使之分散成为单个细胞；

7-1.细胞传代：第6步完成后，吸取200微升细胞，加入到有10ml培养基的100mm培养皿中，贴台面上下左右轻轻晃动，使细胞分布均匀，在培养皿上标记好时间，代数，细胞种类后放入培养箱培养观察；如需膜片钳实验细胞则准备好35mm培养皿，每个培养皿中放置3个无菌爬片，用移液枪在每个爬片上加入90μl第6步中消化好的细胞，静置5min，待大部分细胞贴上爬片后，用移液枪轻轻加入不含抗生素的培养基，12h后即可取出进行膜片钳实验。

7-1.细胞冻存：第6步完成后，用无菌移液管吸取10ml DMEM(10％FBS+P/S)培养液，沿着培养皿底用适当的力度加入，并轻微进行吹打，全部移入15ml的离心管中，放入离心机中，1500rpm离心5min；把离心好的离心管放在操作台上，弃上清，余下的液滴在纸巾上倒干，加入0.5ml DMEM(20％FBS+p/s)，轻轻吹匀，快速移入2ml的冻存管，再逐滴加入0.5ml的20％DMSO，使冻存管中的细胞在1ml(20％FBS+10％DMSO)的液体中保存；在冻存管上标明细胞的名称，代数以及保存时间，并在冻存管的外壁上贴上标签，在标签纸上再次记录细胞的名称，细胞的代数，保存时间，4℃冰箱放置30min；-80℃冰箱放置过夜；最后移到液氮罐中保存。

其具体全细胞膜片钳实验如下：

实验前准备：1.分别从4℃冰箱取出细胞外液，-20℃冰箱取出分装好的细胞内液及植物提取物并放至室温备用；将灌流冲洗装置装好，根据需要按照浓度梯度分别装上细胞外液及含有不同浓度植物提取物的细胞外液，确保整个装置不漏水；2.打开数模转换器、膜片钳放大器、三维微电极操作仪、倒置显微镜，打开电脑主机及显示屏，点击patch clamp软件，确认模式为Digidata 1 550模式，进入patch页面，点击bath键；3.打开微电极拉制仪，放入硬质中性玻璃管，调节程序使拉制出来的电极达到适合大小；

Nav1.4高表达细胞由本实验室培养。

膜片钳实验：待整个***准备好后从培养箱中取出头一天分装好的实验细胞，将培养皿中的爬片夹出，表面朝上放入浴槽中，打开灌流装置，不断补充细胞外液(实验过程中根据需要将细胞外液阀门关闭、打开含有植物提取物的细胞外液)；

在显微镜下调节倍数，找到状态较好的细胞，将细胞位置调至最中央(做膜片钳用的CHO细胞需要找体型较大、表面光滑无杂质的球型细胞，该状态下的细胞较容易被patch且能够存活较长的时间)，将显微镜倍数调解至最低；在拉制好的电极内注入细胞内液，弹出内部气泡，装至holder上，入水前先先予以一定的正压，防止灰尘等进入；入水后在显示屏上会看到一条具有方波的基线，在显微镜下慢慢调节微操纵仪，使记录电极靠近细胞；当电极碰到细胞方波减小至1/2左右，给予一定的负压，使之与细胞形成封接，当封接电阻达到100GΩ以上，将档位调至patch档，holding电压为-80mV，此时基线方波继续变小封接电阻逐渐变大；当基线接近水平，电极与细胞之间呈GΩ稳定封接电阻时予以负压将细胞膜吸破，形成全细胞模式；破膜后电极界面“cell”键，在全细胞电流钳模式下，根据需要设置相关的protocol程序，记录电压门控钠电流。

数据处理：根据实验需要，将记录点电流信号复制到Execl中处理，用Origin、PPT作图，用SSPS的T检验分析数据间的差异性，两数据间分析结果为P＜0.05即判断出其具有显著性差异。

图1示出了显微镜下的细胞和膜片钳针尖接近细胞膜过程；图2示出了加入前述混合物前后的电流变换，峰高高的曲线为未加混合物的电流变化，峰高低的曲线为加混合物后的电流变化，证明本申请的混合物对Nav1.4具有抑制作用，宏观上表现为对于皮肤皱纹的舒展作用，其中对应的细胞外液中植物提取物的含量为8mg/ml。图3示出了混合物对于Nav1.4的灌流抑制作用，加药阶段显示加混合物后的电流显著变小，但清洗去除混合物后电流恢复，宏观上亦表现为对于皮肤皱纹的舒展作用，其中对应的细胞外液中植物提取物的含量为8mg/ml。

此外，对下表中的各配比形成的植物提取物采用上述方式进行细胞膜片钳实验，以明确提取物对Nav1.4通道的阻滞作用，其中加药前后电流变化(|加药前最大值-加药后最小值|)记录在下表中。

实施例2辅料筛选

称取单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、液体石蜡加热融化，保温86℃，作为油相。称取甘油、三乙醇胺、十二烷基硫酸钠和超纯水加热溶解至86℃，缓缓加入油相，搅拌均匀，加入金桔提取物搅拌均匀至冷凝，进行预实验。

预实验结果的辅料，外观良好，均匀细腻，无颗粒感，涂布性良好，且易于清洗。并且通过志愿者的试验，也并没有出现过敏现象，说明该辅料是可行的，可以进行下一步的实验。

辅料最佳配方的筛选

根据乳剂常规配置方法进行实验研究，将硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡、白凡士林放入烧杯作油相，于86℃水浴温度下隔水加热；将每个配方的另外后几样物质放入另一烧杯中，同隔水加热；再将水相缓慢倒入油相，搅拌均匀，放冷即可。

辅料的稳定性直接决定了产品的稳定性，实验需对辅料处方进行筛选。本次实验决定采用O/W乳剂型基质类型来进行实验研究。水相基质确认采用超纯水和甘油；油相基质选择硬脂酸、白凡士林、羊毛脂、液体石蜡、单硬脂酸甘油酯其中的几种或混合物；乳化剂选择三乙醇胺或十二烷基硫酸钠或吐温80其中的一中或混合物。乳化剂的选择由单因素水平决定，油相的选择在单因素水平基础上由正交试验来决定。

辅料选择以下5种配方：

配方1：单硬脂酸甘油酯1-1.5g，硬脂酸2-3g，液体石蜡2.2g，白凡士林0.7，甘油2.3g，三乙醇胺50-70mg，超纯水7.2g，羊毛脂(0.14g)。

配方2：单硬脂酸甘油酯1-1.5g，硬脂酸2-3g，液体石蜡2.2g，白凡士林0.7，甘油2.3g，三乙醇胺50-70mg，超纯水7.2g，吐温80 0.14g，十二烷基硫酸钠(0.14g)。

配方3：单硬脂酸甘油酯1-1.5g，硬脂酸2-3g，液体石蜡2.2g，白凡士林0.7，甘油2.3g，三乙醇胺50-70mg，超纯水7.2g，吐温80 0.14g，吐温80(0.14ml)。

配方4：单硬脂酸甘油酯1-1.5g，硬脂酸2-3g，液体石蜡2.2g，白凡士林0.7，甘油2.3g，三乙醇胺50-70mg，超纯水7.2g，吐温80 0.14g，羊毛脂(0.14g)。

配方5：单硬脂酸甘油酯1-1.5g，硬脂酸2-3g，液体石蜡2.2g，白凡士林0.7，甘油2.3g，三乙醇胺50-70mg，超纯水7.2g，吐温80 0.14g，十二烷基硫酸钠(0.14g)。

5种辅料配置完毕，对5种辅料的外观进行考察，并选用多名志愿者进行皮肤过敏性实试验，并将每种辅料分别装进3个离心管中，分别在60℃恒定烘箱中6h以上进行高温稳定性试验，-25℃～-27℃冰箱中24h进行低温稳定性试验，以及在离心机中进行离心稳定性试验。

实验结果及分析

(1)外观及性状

五种乳剂外观性状良好，均无颗粒感，无刺激性气味，五种乳剂均可。

(2)离心稳定性试验

配方编号	1	2	3	4	5
						30min 4000r/min	无变化	无变化	无变化	无变化	无变化
45min 4000r/min	无变化	无变化	无变化	无变化	无变化
						60min 4000r/min	无变化	无变化	无变化	无变化	无变化
30min 7000r/min	无变化	无变化	无变化	分层	分层
						60min 7000r/min	无变化	分层	无变化	-	-

分析：4000r/min情况下，均无水油分离情况，推测是乳化情况均较好。在30min7000r/min情况下，4、5分层，弃去，保留未分层的1、2、3。在60min7000r/min情况下，2也分层，弃去，保留仍未分层的1、3。表明1、3的乳化情况更高，因而更不容易分层

(3)高温稳定性试验

分析：1号略有水油分层，5号水油分层明显，2、3、4号硬度无变化，也未出现水油分层的情况，结果更优。

(4)低温稳定性试验

分析：1号和5号硬度稍***，2、3、4号硬度无变化，也未出现水油分层的情况，结果更优。

(5)五种配方经过志愿者试验，均未出现过敏性反应，均可认为合格。

正交试验设计优化处方油相基质比例

辅料的剂量确定

筛选出最优配方为配方3后，确定油相单硬脂酸甘油酯(A)、硬脂酸(B)、三乙醇胺(C)的处方量，每个因素设3水平，选用L9(34)正交表进行试验。经过外观性状、离心稳定性、高低温稳定性、过敏性测验及其评分结果的方差分析，最终确定金桔醇提物为原料的混合物制成辅料的最佳配比为单硬脂酸甘油酯1-1.3g，硬脂酸2-2.6g，三乙醇胺70-100mg；以金桔水提物为原料的混合物制成辅料的最佳配比为单硬脂酸甘油酯1-1.5g，硬脂酸2-3g，三乙醇胺50-70mg。

抗皱霜的制备

抗皱霜的总剂量为20g，主成分混合提取物的占比如下：黄精提取物∶山茱萸提取物∶金桔提取物＝5∶5∶1，占抗皱霜总重量的5％。

(1)以实施例1制备的黄精提取物、山茱萸提取物、金桔水提取物为原料，制备抗皱霜：称取单硬脂酸甘油酯1-1.5g，硬脂酸2-3g，液体石蜡2.2g，白凡士林0.7g加热融化，搅拌均匀后保温至85℃-87℃作为油相，称取甘油2.3g，三乙醇胺50-70mg，超纯水7.2g，吐温800.14g加热溶解，搅拌均匀至85-87℃，缓缓加入油相，搅拌均匀，加入提取物1ml搅拌均匀至冷凝。

(2)以实施例1制备的黄精提取物、山茱萸提取物、金桔醇提取物为抗皱霜，制备乳剂：单硬脂酸甘油酯1-1.3g，硬脂酸2-2.6g，液体石蜡2.2g，白凡士林0.7g加热融化，搅拌均匀后保温至85℃-87℃作为油相，称取甘油2.3g，三乙醇胺70-100mg，超纯水7.2g，吐温800.14g加热溶解，搅拌均匀至85-87℃，缓缓加入油相，搅拌均匀，加入提取物1ml搅拌均匀至冷凝。

综上，决定选用配方3的辅料为最优配方，具体是：硬脂酸(2～3g)单硬脂酸甘油酯(1～1.3g)液体石蜡(1.0～2.2g)白凡士林(0.2～1.0g)甘油(1.0～2.5g)超纯水(2～8mL)三乙醇胺0.050-0.1mL)吐温80(0.14～0.2mL)。在外观性状良好和无过敏性反应的情况下，剂型稳定性最佳，既无离心后水油分层的情况，也无高低温试验下的硬度变化与水油分层，综合评分最高。

抗皱霜质量评价

(1)外观及性状

各抗皱霜颜色均为乳白色、无刺激性气味、易于涂抹、延展性好，无颗粒感。

(2)离心稳定性试验

分别称取抗皱霜1g，置于离心管中，以4000r/min的转速，离心30min后，均无油水分层破乳现象。

(3)热、低恒温稳定性试验

分别将抗皱霜装入离心管中，密塞，置于+50℃恒温箱中(置于-20℃冰箱中)，放置6h后(放置24h后)，均无油水分层破乳和软化现象(均无油水分层破乳和硬化现象)。

(4)皮肤过敏性测试

健康志愿者20名，选择胳膊、耳后等处的皮肤为受试区，每人均涂抹制成的抗皱霜。观察受试区的皮肤状况，然后继续给药，连续观察3天。观察20名志愿者均无无红斑、水肿、瘙痒、过敏等现象。

实施例3

采用实施例1制备的黄精提取物、山茱萸提取物和金桔水提物进行混合形成抗皱有效成分，且黄精提取物、山茱萸提取物和金桔水提物的重量比为6∶4∶1。

辅料组成为：硬脂酸(1g)单硬脂酸甘油酯(0.5g)液体石蜡(1.5g)白凡士林(0.5g)甘油(1.6g)超纯水(5ml)三乙醇胺(0.02ml)吐温80(0.02ml)。抗皱有效成分和辅料按照实施例2的过程混合形成实施例3的抗皱霜，抗皱霜中抗皱有效成分的重量百分含量为5％。

实施例4

与实施例3区别在于，黄精提取物、山茱萸提取物和金桔水提物的重量比为7∶3∶1。

实施例5

与实施例3区别在于，黄精提取物、山茱萸提取物和金桔水提物的重量比为5∶6∶1。

实施例6

与实施例3区别在于，抗皱霜中抗皱有效成分的重量百分含量为10％。

实施例7

与实施例3区别在于，抗皱霜中抗皱有效成分的重量百分含量为3％。

实施例8

与实施例3区别在于，抗皱霜中抗皱有效成分的重量百分含量为1％。

实施例9

与实施例3区别在于，抗皱霜中抗皱有效成分的重量百分含量为15％。

实施例10

与实施例3区别在于，采用实施例1制备的黄精提取物、山茱萸提取物和金桔醇提物进行混合形成抗皱有效成分，且黄精提取物、山茱萸提取物和金桔水提物的重量比为6∶4∶1。

实施例11

与实施例10区别在于，采用实施例1制备的黄精提取物、山茱萸提取物和金桔醇提物进行混合形成抗皱有效成分，且黄精提取物、山茱萸提取物和金桔水提物的重量比为7∶3∶1。

实施例12

与实施例10的区别在于，采用实施例1制备的黄精提取物、山茱萸提取物和金桔醇提物进行混合形成抗皱有效成分，且黄精提取物、山茱萸提取物和金桔水提物的重量比为5∶6∶1。

实施例13

与实施例10的区别在于，抗皱霜中抗皱有效成分的重量百分含量为10％。

实施例14

与实施例10的区别在于，抗皱霜中抗皱有效成分的重量百分含量为3％。

实施例15

与实施例10的区别在于，抗皱霜中抗皱有效成分的重量百分含量为1％。

实施例16

与实施例10的区别在于，抗皱霜中抗皱有效成分的重量百分含量为15％。

对比例1

与实施例3区别在于，黄精提取物、山茱萸提取物和金桔水提物的重量比为1∶1∶1。

对比例2

与实施例3区别在于，没有使用金桔水提物，黄精提取物和山茱萸提取物的重量比为6∶5。

对比例3

与实施例3区别在于，没有使用黄精提取物，山茱萸提取物和金桔水提物的重量比为10∶1。

对比例4

与实施例3区别在于，没有使用山茱萸提取物，黄精提取物和金桔水提物的重量比为10∶1。

抗皱实验

测试人员：自愿者180名，年龄在23-60岁；将自愿者分为18组，每组10名，尽可能使各组内初始皮肤皱纹状况相近，分别测试上述实施例3至16及对比例1至4的抗皱霜的抗皱能力。

入选标准：皮肤出现皱纹等存在肌肤问题的志愿者，但无任何皮肤和***性疾病患史，近一个月内未使用激素类药物；

产品使用规则：测试前2-3天及整个测试期间，不更换护肤品，每天早晚各1次。选择额头皮肤为受试区，每人额头的左半部分涂抹制成的抗皱霜，右半部分涂抹不含药物的空白霜，观察受试区的皮肤状况，继续使用本产品，连续观察3个月。对比使用前和使用一周、三个月后皱纹改善情况，每次每个区域测3次，求平均值，然后组内求平均值。

评估标准：

10分，没有皱纹；

7-9分，有1-2条皱纹，长度小于1.5cm；

4-6分，有3-5条皱纹，长度小于3cm；

1-3分，有数条主皱纹，长度大于3cm。

最终评分见下表：

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗皱组合物，其特征在于，所述抗皱组合物包括重量比为5～7∶3～6∶1的黄精提取物、山茱萸提取物和金桔提取物。

2.根据权利要求1所述的抗皱组合物，其特征在于，所述金桔提取物为金桔水提物和/或金桔醇提物。

3.根据权利要求2所述的抗皱组合物，其特征在于，所述金桔水提物的制备方法包括：

采用水对金桔皮进行加热回流提取，得到水提取液；

对所述水提取液进行固液分离和旋转蒸发，得到所述金桔水提物，所述金桔水提物的体积为所述水提取液体积的1/8～1/3，

优选所述水与所述金桔皮的重量比为7～14∶1，优选所述加热回流提取的时间为1～5h。

4.根据权利要求2所述的抗皱组合物，其特征在于，所述金桔醇提物的制备方法包括：

采用乙醇溶液对金桔皮进行加热回流提取，得到醇提取液；

对所述醇提取液进行固液分离和旋转蒸发，得到所述金桔醇提物，所述金桔醇提物的体积为所述醇提取液体积的1/8～1/3，

优选以浓度为20％的乙醇溶液计，所述乙醇溶液与所述金桔皮的重量比为7～14∶1，所述加热回流提取的时间为1～5h。

5.根据权利要求1所述的抗皱组合物，其特征在于，所述黄精提取物和所述山茱萸提取物各自独立地为醇提物或水提物。

6.根据权利要求5所述的抗皱组合物，其特征在于，所述黄精提取物或所述山茱萸提取物的制备方法包括：

将黄精或山茱萸以1g∶20～30mL的比例与水混合，在50～90℃下浸提50～90min，得到所述黄精提取物或所述山茱萸提取物。

7.一种抗皱霜，包括抗皱有效成分和辅料，其特征在于，所述抗皱有效组分为权利要求至6中任一项所述的抗皱组合物混合而成。

8.根据权利要求7所述的抗皱霜，其特征在于，所述抗皱霜中所述抗皱有效成分的重量百分含量为3～10％。

9.根据权利要求8所述的抗皱霜，其特征在于，所述辅料包括硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡、白凡士林、甘油、超纯水、三乙醇胺和吐温80。

10.根据权利要求9所述的抗皱霜，其特征在于，所述硬脂酸、所述单硬脂酸甘油酯、所述液体石蜡、所述白凡士林、所述甘油、所述超纯水、所述三乙醇胺和所述吐温80的比例为2～3g∶1～1.5g∶1.0～2.2g∶0.2～1.0g∶1.0～2.5g∶2～8mL∶0.05～0.1mg∶0.14～0.2mL。