CN112353734A - 一种积雪草发酵产物的发酵方法及其在修复功效化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

发明属于天然植物有效成分分离及化妆品添加剂领域，特别是涉及积雪草发酵产物在制备修复功效产品中的应用。本发明提供了积雪草发酵产物在修复功效方面的应用，积雪草发酵产物具有良好的体内细胞修复活性。本发明还提供了积雪草发酵产物的发酵方法，使发酵液中有效成分积雪草多糖含量高达0.54%。

Description

一种积雪草发酵产物的发酵方法及其在修复功效化妆品中的 应用

技术领域

本发明属于天然植物有效成分分离及化妆品添加剂领域，特别是涉及一种含有积雪草发酵产物的修复功效化妆品及其制备方法。

背景技术

积雪草（Centella asiatica (L.)Urb.）作为一种传统中药，味苦、性寒，归肝、脾、肾经，具有清热利湿、解毒消肿的功效，来源于伞形科积雪草属的植物积雪草的干燥全草，又称老鸦碗、马蹄草、铜钱草、钱齿草、铁灯盏和大金钱草等。目前主要分布在我国安徽、浙江、湖南、湖北、江西、广东等地，生长环境多位潮湿地或低草丛，喜湿耐阴，全年可收。积雪草最早记载于《神农本草经》中，有内服和外用两种用法，已经有2000多年历史，主要的有效成分包括积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸、羟基积雪草酸等成分。

通过微生物发酵工艺制备天然产物提取物，可以有效降低一些天然产物本身固有的毒性，在发酵过程也可以酶解药材细胞壁结构，更充分的释放天然产物的有效成分，提高其利用率。微生物在发酵过程中，亦会产生次生代谢产物，其中就包括多种生物酶，可以有效的把蛋白质、多糖等生物大分子分解为分子量较小的物质，以蛋白质为例，会被蛋白酶水解为具有与其功能性蛋白质相同序列的特异性小的不同分子量的生物活性肽，其特点是分子量低、结构简单且毒副作用低，故易于被人体吸收发挥更强的生物活性，但又具有更高的安全性。有研究表明，发酵后的提取液可以提高有效成分的物质含量，从而使各种药理活性得到显著提高。此外，微生物发酵还具有成本低、不易致敏等特点是当今研究和开发的热点。

皮肤作为人体最大的器官，暴露在体外会遭受各种不同的损伤，其中又以紫外辐射带来的急性损伤和慢性损伤最为严重，当皮肤过度暴露于来自太阳光内UVA( 400 ～315 nm)和UVB( 315 ～ 280 nm) 时，会引发急性皮炎，其症状包括瘙痒、疼痛、红斑、水肿、脱皮等等，长期暴露于紫外辐射下甚至会导致皮肤癌变。研究表明日光性皮炎是正常皮肤经暴晒后引发的一直急性炎症，对皮肤有极大损伤，而目前市面上售卖的一类晒后修复产品主要有效成分为一类细胞活化因子，并不能减少和修复晒后损伤，缺乏针对日光性急性皮炎和继发性光敏性皮炎的修复功能。

发明内容

针对目前普遍存在一系列肌底问题，本发明提供了一种积雪草发酵产物制备方法及其在修复功效化妆品中的应用。本发明提供的积雪草发酵产物具有显著的修复功效。本发明还提供了积雪草发酵产物的制备方法，该制备方法有发酵工艺简单、能够降低发酵成本和易于扩大生产的优势。积雪草发酵液中富含以多糖为主的多种植物次生代谢产物，并在微生物发酵条件下转变为分子量更小的有效成分，使其变得更易于被人体吸收利用，同时该方法发酵得到的积雪草发酵产物是一种安全性高的修复功效化妆品原料。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了积雪草发酵产物在制备修复功效产品中的应用。

本发明还提供了积雪草发酵产物在制备具有修复功效的化妆品中的应用。

本发明提供的积雪草发酵产物具有减缓常用化妆品防腐剂（如苯氧乙醇）的细胞毒性的功效，能够大幅提高具有修复功效功效的化妆品的安全性。

本发明提供了一种积雪草发酵产物，所述积雪草发酵产物中积雪草多糖含量为0.54%。

本发明提供的发酵方法发酵工艺简单，发酵成本低廉，易于扩大生产；可以提高发酵产物中有效成分积雪草多糖的含量，能够极大程度的提高对积雪草的利用程度。具体发酵工艺如下：精确称取积雪草叶片，进行粉碎过筛处理得到积雪草叶片粉末，所述粉末的粒径优选为过120目筛，然后按料液比1：（10~12）（g/mL）加入无菌的去离子水，并调节pH为6.0~6.5；在本发明中，所述发酵的料液比进一步优选为1：10，去离子水灭菌条件进一步优选为在121℃、0.1Mpa的条件下灭菌20min。

得到积雪草夜片粉末和去离子水的混合物后，按照1‰投料比例接种酿酒酵母种子液（Saccharomyces cerevisiae），通过充分搅拌使其混合均匀，发酵罐设定温度30℃，发酵时间60~72 h，开始发酵；在本发明中，所述的酿酒酵母种子液制备方法优选为：将麦芽汁培养基培养基在121℃，0.1 MPa条件下灭菌后，接种酿酒酵母菌，设置培养温度为 28℃，摇床转速为 120 r/min，培养24 h；使菌体浓度达到 108CFU/mL，发酵时间进一步优选为72h。

发酵完成后，在8000~10000rpm/min条件下进行离心，取上清液在1150~1200Bar条件下完成破壁，冷却后通过0.45μm微孔滤膜过滤得到发酵产物滤渣和滤液，取其中发酵产物滤液即为积雪草发酵产物；在本发明中，离心条件进一步优化为8000rpm/min，破壁条件进一步优化1200Bar。

本发明通过对发酵工程的各步骤进行优化，多个优化步骤相互配合能够有效提高发酵的效率和效果。经过上述发酵方法发酵得到的积雪草发酵产物中积雪草多糖的含量为0.54%。

本发明对上述发酵原料等物品的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。

本发明还提供了一种含有积雪草发酵产物的修复功效化妆品，所述修复功效产品包括上述发酵方法得到的积雪草发酵产物。本发明提供的修复功效产品具有优越的修复功效效果，可以显著减少斑马鱼受紫外辐射所导致的损失，并对紫外辐射引起的损伤有良好的修复功效。

本发明还提供了一种基于上述的积雪草发酵产物或上述发酵方法发酵得到的积雪草发酵产物的修复功效化妆品，包括以下质量份的组分：鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯/山梨坦橄榄油酸酯2.00%、季戊四醇二硬脂酸酯1.00%、棕榈酸乙基己酯5.00%、辛酸/癸酸甘油三酯3.00%、生育酚0.5%、C18-C21烷烃5.00%、黄原胶0.25%、尿囊素0.30%、甘油3.00%、积雪草发酵产物0.50%、苯氧乙醇/乙基己基甘油0.50%、香精0.30%，余量为去离子水。

在本发明中，上述化妆品的制备步骤优选包括以下步骤：

1）制备油相：首先准确称取鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯/山梨坦橄榄油酸酯、季戊四醇二硬脂酸酯、棕榈酸乙基己酯、辛酸/癸酸甘油三酯、生育酚、C18-C21烷烃，加热至80℃完全熔化；

2）制备水相：准确称取黄原胶、尿囊素、甘油，加入体系所需去离子水中，加热至80℃，搅拌溶解至透明；

3）将水相加入至油相以10000 rpm/min的速度均质30s~1min；

4)将体系搅拌降温至室温，依次加入积雪草发酵产物、苯氧乙醇/乙基己基甘油、香精，继续搅拌均匀；冷却，无菌静置24h后，灌装即得成品。

本发明对上述辅料的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的积雪草发酵产物在制备修复功效产品中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

附图说明

图1 积雪草发酵流程。

具体实施方式

实施例1

积雪草发酵产物的安全性实验

1 实验方法

1.1 实验用鱼及其受精卵的采集

将性成熟斑马鱼雌雄分缸饲养于斑马鱼养殖单元中。水温：26±2℃；pH 7.2；电导率：520 µs/cm；光照/黑暗周期：14 h:10 h。暴露实验开始前一天将斑马鱼以雌雄比为1:2配对，光照刺激下自然交配产卵。

1.2 暴露实验

1）挑选发育至0~3 hpf (hours post-fertilization)的健康斑马鱼鱼胚置于6孔细胞培养板中，20尾/孔，每孔加入5 mL实验溶液。以斑马鱼养殖水为空白对照组。

2）分别于24、48和72 hpf时在体视显微镜下观察并统计鱼胚的孵化、畸形和死亡数量。其中畸形形态包括：头部畸形、心包水肿、卵黄囊水肿、血液堵塞、脊柱弯曲、尾部弯曲、发育迟缓等；死亡状态判断为：卵黄囊凝结、心跳停止。

2 实验结果

积雪草发酵产物对鱼胚死亡率、孵化率和畸形率的影响见表1、表2和表3。

表1积雪草发酵产物对鱼胚死亡率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

表2积雪草发酵产物对鱼胚孵化率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

表3积雪草发酵产物对鱼胚畸形率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

注：死亡率% =死亡胚胎数/N*100%；孵化率%=孵化胚胎数/存活胚胎数*100%；畸形率%=（死亡胚胎数+畸形胚胎数）/N*100%

通过分析表1、表2、表3可知，积雪草发酵产物浓度一直至8%时在致死量、孵化率及畸形率三方面均无显著性差异，可以得出结论即本配方中使用的0.2%-1%积雪草发酵产物绝对是安全的，无任何毒副作用。

实施例2

积雪草发酵产物减缓传统防腐剂负面作用实验

1 实验方法

一般地，化妆品配方中需加入防腐剂进行防腐。防腐剂存在一定毒性。本实验选用常用防腐剂苯氧乙醇进行积雪草发酵产物的防腐效果测试。参见实施例4实验方法，设定空白对照组、1%苯氧乙醇组和添加1%苯氧乙醇的积雪草发酵产物组（下面简称样品），探究其对鱼胚死亡率和畸形率的影响。

2 实验结果

2.1样品对鱼胚安全性的影响

（1）1%苯氧乙醇对鱼胚死亡率和畸形率的影响见表4、表5。

表4 1%苯氧乙醇对鱼胚死亡率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

表5 1%苯氧乙醇对鱼胚畸形率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）

2.2 样品对鱼胚死亡率和畸形率的影响见表6、表7。

表6 样品对鱼胚死亡率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

表7 样品对鱼胚畸形率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）

死亡率% =死亡胚胎数/N*100%；畸形率%=（死亡胚胎数+畸形胚胎数）/N*100%

通过分析表4、表6可知，积雪草发酵产物和苯氧乙醇协同作用时对苯氧乙醇致死率无影响，但是对比表5、表7可知，两者在协同作用时，积雪草发酵产物在一定程度上可以减弱传统防腐剂苯氧乙醇的致畸作用。

实施例3

积雪草发酵产物的修复功效实验

1 晒后修复活性研究实验

挑选受精卵后72 hpf的健康AB系斑马鱼胚胎用于实验研究，置于6孔细胞培养板，1枚/孔，每孔加入实验溶液5ml。实验另设空白对照组（斑马鱼养殖水）模型对照组，每组设3个复孔；

（2）用紫外分析仪（305 nm波长）辐射，在2.5小时内，每半小时辐射30 s，辐射完后吸尽样品液，换成养殖水，置于培养箱中孵育；

（3）紫外辐射后第1天、2天，在倒置显微镜下观察斑马鱼鱼腹鳍、尾鳍和背鳍的损伤情况并拍照记录；

（4）使用软件分析斑马鱼幼鱼尾鳍的损伤程度和修复程度并计算。

2 晒后修复活性实验结果

积雪草发酵产物对斑马鱼晒后损伤及其修复效果见表8。由表8可知，空白对照组斑马鱼胚胎在收到紫外辐射后产生大面积损伤，且48小时候自我修复效果较差；而不同浓度积雪草发酵产物处理组斑马鱼胚胎所受损伤显著减少，且48h后修复率也明显提高，其中随着积雪草发酵产物浓度增大，其效果也随之增强，即当积雪草发酵产物浓度大于等于0.2%时，对斑马鱼胚胎与抗紫外辐射及晒后修复作用，且与浓度呈正相关性。

表8 积雪草发酵产物对晒后损伤及修复的影响

（注：**表示具有统计学差异，**P＜0.01）。

Claims (9)

1.积雪草发酵产物在制备修复功效产品中的应用。

2.积雪草发酵产物在制备具有修复功效的化妆品中的应用。

3.一种积雪草发酵产物，其特征在于，所述积雪草发酵产物中积雪草多糖含量为0.54%。

4.权利要求1或2所述应用中的积雪草发酵产物或权利要求3所述积雪草发酵产物的发酵方法，包括以下步骤：所述积雪草发酵产物由以下微生物发酵方法制备，具体步骤如下：（1）积雪草叶片准确称量后粉碎，过120目筛；（2）按1：（10~12）（g/mL）的料液比加入灭菌的去离子水，调pH为6.0~6.5；

（3）按照1‰投料比例接种酿酒酵母种子液（Saccharomyces cerevisiae），搅拌均匀，发酵罐设定温度30℃，发酵时间60~72 h，开始发酵；（4）发酵完成后在8000~10000rpm/min条件下离心，取上清液在1150~1200Bar条件下完成破壁，冷却后通过0.45μm微孔滤膜过滤除渣，得发酵产物滤液。

5.根据权利要求（2）所述的灭菌去离子水，其灭菌方法为在121℃，0.1Mpa的条件下灭菌20min。

6.根据权利要求（3）所述的酿酒酵母种子液培养基的配置方法，其特征在于将麦芽汁培养基培养基在121℃，0.1 MPa条件下灭菌20min后，接种酿酒酵母菌，设置培养温度为 28℃，摇床转速为 120 r/min，培养24 h；分别使菌体浓度达到 108CFU/mL。

7.一种含有积雪草发酵产物的修复功效产品，其特征在于，所述修复功效产品包括权利要求3所述的积雪草发酵方法发酵得到的积雪草发酵产物和辅料。

8.一种基于权利要求3所述的积雪草发酵产物含有积雪草发酵产物的修复功效化妆品，包括以下质量份的组分：鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯/山梨坦橄榄油酸酯2.00%、季戊四醇二硬脂酸酯1.00%、棕榈酸乙基己酯5.00%、辛酸/癸酸甘油三酯3.00%、生育酚0.5%、C18-C21烷烃5.00%、黄原胶0.25%、尿囊素0.30%、甘油3.00%、积雪草发酵产物0.50%、苯氧乙醇/乙基己基甘油0.50%、香精0.30%，余量为去离子水。

9.一种基于权利要求3所述的积雪草发酵产物的修复功效化妆品的制备方法，包括如下步骤：

1）制备油相：首先准确称取鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯/山梨坦橄榄油酸酯、季戊四醇二硬脂酸酯、棕榈酸乙基己酯、辛酸/癸酸甘油三酯、生育酚、C18-C21烷烃，加热至80℃完全熔化；

2）制备水相：准确称取黄原胶、尿囊素、甘油，加入体系所需去离子水中，加热至80℃，搅拌溶解至透明；

3）将水相加入至油相以10000 rpm/min的速度均质30s~1min；

4)将体系搅拌降温至室温，依次加入积雪草发酵产物、苯氧乙醇/乙基己基甘油、香精，继续搅拌均匀；冷却，无菌静置24h后，灌装即得成品。

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