CN112345765A - 基于均相化学发光法鉴别诊断猪瘟病毒野毒感染的试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
基于均相化学发光法鉴别诊断猪瘟病毒野毒感染的试剂盒及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于均相化学发光法鉴别诊断猪瘟病毒野毒感染的试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂R3和阳性对照、阴性对照，本发明还公开了一种该试剂盒的制备方法和应用，本发明所述供体微球能够在激发状态产生活性氧，所述受体微球能够与活性氧反应生成可检测的化学发光信号。因此在检测时不需要清洗和分离，可以直接检测化学发光信号，从而实现猪瘟病毒鉴别诊断。另外，本发明的试剂盒10min内即可完成抗体检测，且本发明的试剂盒的特异性、敏感性、重复性都很好。
Description
技术领域
本发明属于生物诊断试剂技术领域，尤其涉及基于均相化学发光法鉴别诊断猪瘟病毒野毒感染的试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever,CSF或Hog cholera,HC)，又称经典猪瘟或古典猪瘟，是猪的一种高传染性疾病。猪瘟会导致患病猪发烧、厌食、腹泻、死亡等，并可能伴有神经症状。母猪可能会流产或产下死猪崽。猪瘟为世界动物卫生组织所列的A类中16种法定传染病之一。古典猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)为黄病毒科瘟疫病毒属。同属的病毒还有感染反刍动物的牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhoea virus,BVDV)及羊的边界病病毒(Border Disease virus,BDV)。猪是古典猪瘟病毒的唯一宿主和传播源。受到感染的猪在发病前和发病期间都会排毒。
CSFV为有囊膜病毒，40-60nm，单股正链RNA。CSFV基因组长约123kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)，此ORF翻译成含3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白。CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码，ORF两侧是5’-端非翻译区(5’-UTR)和3’-端非翻译区(3’-UTR)，且5’-端无帽子结构，3’-端无poly(A)尾巴。这一大前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异蛋白酶作用下，加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、c、Erns(E0)、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80)，除c、E0、E1和E2为结构蛋白外.其余均为非结构蛋白。
Erns是病毒的一种囊膜糖蛋白，旧称E0。有9个可能的糖基化位点，去糖基的蛋白骨架分子量约26KDa，由病毒ORF中Glu168-Ala494组成。在感染细胞中Erns在内质网内积累，并可存在于细胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中Erns以97KDa的同源二聚体形式存在于囊膜表面。由于其分子内缺乏疏水的膜锚定区，与病毒囊膜结合力弱.易从囊膜上游离下来。Erns可诱导产生猪瘟的中和抗体，免疫猪可诱导产生对致死量CSFV的保护性免疫。由于编码Erns的核酸序列在属内比编码E2的序列保守程度高，因此E rns可作为防治和检测猪瘟的一种靶蛋白。
在大约1810年，美国田纳西州最早报道了猪瘟这种疾病。1822年，猪瘟在法国爆发，1833年在德国爆发。1903年，猪瘟血清被开发出来。1913年至1934年，美国农业部的Marion Dorset、W.B.Niles及C.N.McBryde对疫苗进行测试和验证。之后，Dorset申请了猪瘟血清制备过程的专利，并让政府在全国范围使用。1951年，美国农业部批准使用猪瘟兔化弱毒疫苗。1961年，美国通过公法87-209《猪瘟的净化》(Eradication of hog cholera)。美国于1962年启动了猪瘟的净化工作并于1976年完成净化。目前，虽然猪瘟在一些国家已经得到净化，但在世界范围内仍然属于重要的一种猪的传染性疾病。目前全世界约50个国家和地区仍然存在有猪瘟，其中非洲3个、美洲13个、亚洲14个(中国为主要国家之一)以及欧洲20个。
中国是生猪饲养、猪肉供应大国，中国政府对猪瘟的防控高度重视，积极采取措施，制定防控预防猪瘟的方案。早在1955年，我国成功研制出猪瘟兔化弱毒疫苗，经过研究人员不断的研究和优化，已成为世界上普遍使用的猪瘟疫苗。政府对猪瘟疫情的也高度重视，不断强化猪瘟疫情的防疫工作，使猪瘟得到有效控制，大规模猪瘟病的暴发基本消失。当前我国猪瘟的流行形势和发病特点主要表现为：流行范围广，全国范围内均有流行，但以散发流行为主。目前猪瘟多见于仔猪，成年猪很少出现发病症状，但可持续带毒，并且可通过水平和垂直传播在猪场内恶性循环。非典型症状和繁殖障碍型猪瘟增多，临床上持续性感染(亚临床感染)和隐性感染增多，成为猪瘟流行最危险的传染源。另外，猪瘟与猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病、猪细小病毒病、猪圆环病毒病等混合感染十分严重和普遍。
截止目前，国内上市的猪瘟单苗有6种，分别为猪瘟病毒Erns蛋白重组杆状病毒灭活疫苗、猪瘟活疫苗(传代细胞源)、猪瘟活疫苗(兔源)、猪瘟活疫苗(细胞源)、猪瘟耐热保护剂活疫苗(脾淋源)、猪瘟耐热保护剂活疫苗(细胞源)。其中猪瘟活疫苗(细胞源)、猪瘟活疫苗(传代细胞源)和猪瘟活疫苗(兔源)的份额占了总量的80％以上，2017年占比为89.9％，2018年为85.7％，2019年为84.8％。2017年3月20日，农业农村部发布《国家猪瘟防治指导意见(2017-2020年)》，明确提出“到2020年底，全国所有种猪场和部分区域达到猪瘟净化标准”。已上市的活疫苗能够起到良好的保护作用，但是不能够通过抗体检测区分野毒感染和疫苗免疫，达不到猪场净化该病的目的。因此，未来，猪瘟疫苗将实现由活疫苗到猪瘟病毒Erns蛋白重组亚单位疫苗的转变。
在疾病净化过程中，持续监测：包括主动监测和被动监测，及时、快速地查出和清除感染猪，特别是持续感染带毒猪是必不可少的环节。但目前为止，国内还没有上市配套的用于区分猪瘟野毒感染和疫苗接种的鉴别诊断试剂盒。因此，开发猪瘟病毒鉴别诊断试剂具有广阔的市场和重要的现实意义及社会价值。此外，为配套猪瘟鉴别诊断试剂，研究开发用于猪瘟病毒疫苗临床免疫评价的诊断试剂，也具有较大的现实意义和市场价值。
国内外许多实验室已经研发出许多猪瘟病毒抗体的检测方法，例如酶联免疫吸附实验法，胶体金免疫层析法，荧光免疫层析法等等。ELISA检测方法耗时耗力；胶体金和荧光免疫层析法属于定性和半定量检测，结果准确度不高。迫切需要精准、快速的检测产品，化学发光法是最好的选择，但磁微粒化学发光成本较高，且对仪器设备的要求就高，因此均相化学发光技术是一个合适的选择。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种鉴别诊断猪瘟病毒野毒感染的试剂盒(免疫猪瘟E2蛋白疫苗时)，目的之二在于解决现有试剂盒的成本高、耗时长、精度低等问题，从而提供一种高灵敏度、高特异性的猪瘟鉴别诊断试剂盒。
因此，本发明一方面提供了一种基于均相化学发光法鉴别诊断猪瘟病毒野毒感染的试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂R3以及阳性对照和阴性对照，其中：所述试剂R1包括供体微球以及与之结合的链霉亲和素的缓冲液，所述供体微球能够在激发状态产生活性氧；所述试剂R2包括受体微球以及与之结合的抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体的缓冲液，所述受体微球能够与活性氧反应生成可检测的化学发光信号；所述试剂R3包括生物素化的猪瘟病毒Erns蛋白的缓冲液。
优选地，本发明所述阳性对照为猪瘟病毒中和抗体效价为1:64的猪血清；所述阴性对照为猪瘟病毒中和抗体效价为1:4的猪血清。
优选地，本发明所述的供体微球和受体微球的直径均为150nm。
优选地，本发明所述的试剂R1中供体微球的浓度为5μg/mL。
优选地，本发明所述的试剂R2中受体微球的浓度为2μg/mL。
优选地，本发明所述的试剂R3中的生物素化的猪瘟病毒Erns蛋白的浓度为0.5μg/mL，所述的缓冲液为0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH为7.2。
优选地，本发明所述试剂R1的缓冲液组分为0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH 7.2。
优选地，本发明所述试剂R2的缓冲液组分为0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH为7.2。
另一方面，本发明还提供了一种制备所述的试剂盒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)试剂R1制备：
a)供体微球准备：量取10mg 150nm的的供体微球和1mg链霉亲和素，迅速混匀，再加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液调节供体微球浓度至10mg/mL；b)反应：加入100μL pH值为6.0的0.05M MES配制的50mg/mL的NaBH3CN溶液，迅速混匀，室温旋转反应12～16h；c)封闭：加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液配制的浓度为100mg/mL的BSA溶液，其与反应液体积比为1:4，迅速混匀，室温旋转反应3小时；d)清洗：反应好的溶液4℃12000rpm离心60min，弃去上清，加入2mL pH值为6.0的0.05M MES缓冲液超声悬浮，再次离心，弃去上清，最后用0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin300、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH 7.2的缓冲液溶解清洗好的供体微球，使其终浓度为5μg/mL，超声分散后置于4℃保存备用；
2)试剂R2制备：
a)受体微球准备：量取10mg 150nm的受体微球和2mg的抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体，迅速混匀，再加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液调节受体微球浓度至10mg/mL；b)反应：加入100μL的pH值为6.0的0.05M MES配制的浓度为50mg/mL的NaBH3CN溶液，混匀，室温旋转反应12～16h；c)封闭：加入pH值为6.0的0.05M MES配制的浓度为100mg/mL的BSA溶液进行封闭，其与反应液体积比为1:4，迅速混匀，室温旋转反应3小时；d)清洗：反应好的溶液4℃12000rpm离心60min，弃去上清，加入2mL pH值为6.0的0.05M MES缓冲液超声悬浮，再次离心，弃去上清，最后用0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH为7.2的缓冲液溶解上述步骤中制备的受体微球，使其终浓度为2μg/ml，超声分散后置于4℃保存备用；
3)试剂R3制备：
a)生物素活化：量取1mg生物素加入到100μL DMF溶液中并充分混匀，再用PBS溶液定容到0.5mL，准确称取EDC 2mg，加入该溶液中，室温活化1h；b)反应：量取一定量的猪瘟病毒Erns蛋白，使用PBS溶液稀释，测定蛋白浓度并调节至2mg/mL，将活化好的生物素溶液加入猪瘟病毒Erns蛋白溶液中，充分混匀并在室温反应6h；c)纯化：将生物素化猪瘟病毒Erns蛋白溶液加入载留分子量为10KD的透析袋中，用PBS溶液作为缓冲液，在4℃透析24小时，取样测定蛋白浓度，将合格的生物素化猪瘟病毒Erns蛋白浓度用0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH为7.2的缓冲液调节至0.5μg/mL，4℃保存备用。
再一方面，本发明还提供了一种使用所述试剂盒检测猪瘟病毒Erns蛋白抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将阳性血清、阴性血清或者样本与试剂盒中的试剂R1、试剂R2、试剂R3按照体积比为10μL:30μL:30μL:30μL的量混合，混合液置于37℃下温育5-10min，优选地为8min；
2)在温育后，立即通过光电倍增管检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s，记录阳性对照、阴性对照和样本的化学发光值；
3)根据化学发光值，计算S/N值，其中S/N值＝样品化学发光值/阴性对照化学发光值；当S/N值＞0.7时，判为猪瘟病毒Erns蛋白抗体阴性；当阻断率≤0.6时，判为猪瘟病毒Erns蛋白抗体阳性，当0.6＜S/N值≤0.7时，判为可疑。
再一方面，本发明还提供了所述的试剂盒在检测猪瘟病毒Erns蛋白抗体中的应用。
本发明所述供体微球能够在激发状态产生活性氧，所述受体微球能够与活性氧反应生成可检测的化学发光信号(供体微球和受体微球在分散状态下是不能发出化学发光信号，只有两者临近时才能发出可以检测的化学发光信号)。因此在检测时不需要清洗和分离，可以直接检测化学发光信号，从而实现猪瘟病毒Erns蛋白抗体的检测。另外，本发明的试剂盒10min内即可完成抗体检测，且本发明的试剂盒的特异性、敏感性、重复性都很好。另外，本发明所述的试剂盒既可以应用于管式化学发光，也可以应用于板式化学发光。当然，在现有发明的基础上删除链霉亲和素-生物素***，也应属于本发明的保护范围之内。
本发明的试剂盒是检测猪瘟病毒Erns蛋白的抗体，在猪群免疫猪瘟E2蛋白疫苗时，如果检测的抗体为阳性，则说明该猪群现在或以前存在猪瘟野毒的感染，从而实现猪瘟病毒野毒感染的鉴别诊断，为猪瘟病毒净化提供一种高灵敏、快速的鉴别诊断试剂盒。
基于竞争法的猪瘟病毒鉴别诊断均相化学发光检测反应体系中，标记链霉亲和素的供体微球，标记抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体的受体微球，生物素化的猪瘟病毒Erns蛋白。当样品中没有猪瘟病毒Erns蛋白抗体时，待测样品池中的标记链霉亲和素的供体微球、生物素化的猪瘟病毒Erns蛋白、标记抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体的受体微球结合，就会形成标记链霉亲和素的供体微球-生物素化的猪瘟病毒Erns蛋白-标记抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体的受体微球这样一个复合体，在激光(680nm)的照射下，供体微球上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧，单体氧扩散至受体微球，与其上的化学发光剂反应，进一步激活了同样在受体微球上的发光基团，使之产生化学发光，波长为615nm，此时发光值最高，单体氧在其4μs的半衰期内可扩散的距离为200nm左右，光信号可被高通量化学发光检测仪检测到；如果不存在抗原抗体的特异性反应，也就说如果未形成标记链霉亲和素的供体微球-生物素化的猪瘟病毒Erns蛋白-标记抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体的受体微球的复合体，单体氧将无法扩散至距离较远的受体微球，则不会产生化学发光作用；如果样品中有猪瘟病毒Erns蛋白抗体时，样品中的猪瘟病毒Erns蛋白抗体将与标记抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体的受体微球竞争生物素化的猪瘟病毒Erns蛋白的结合位点，样品中存在的猪瘟病毒Erns蛋白抗体将与生物素化的猪瘟病毒Erns蛋白结合，减少抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体(受体微球)与生物素化的猪瘟病毒Erns蛋白结合的数量，这将使得溶液中形成的标记链霉亲和素的供体微球-生物素化的猪瘟病毒Erns蛋白-标记抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体的受体微球的复合体数量减少，从而导致化学发光强度减小，仪器所读取的光子数值将减小。竞争性均相化学发光检测猪瘟病毒Erns蛋白抗体的原理如图1所示。
附图说明
图1竞争性均相化学发光检测猪瘟病毒Erns蛋白抗体的原理图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明所涉及的化学试剂均为国产试剂。猪瘟病毒Erns蛋白由杭州洪晟生物科技有限公司惠赠。抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体由杭州洪晟生物科技有限公司惠赠。供体微球和受体微球由杭州洪桥中科基因技术有限公司惠赠。
实施例1基于均相化学发光技术猪瘟病毒鉴别诊断试剂盒的建立
1试剂R1制备：
a)供体微球准备：量取10mg 150nm的的供体微球和1mg链霉亲和素，迅速混匀，再加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液调节供体微球浓度至10mg/mL；b)反应：加入100μL pH值为6.0的0.05M MES配制的50mg/mL的NaBH3CN溶液，迅速混匀，室温旋转反应12～16h；c)封闭：加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液配制的浓度为100mg/mL的BSA溶液，其与反应液体积比为1:4，迅速混匀，室温旋转反应3小时；d)清洗：反应好的溶液4℃12000rpm离心60min，弃去上清，加入2mL pH值为6.0的0.05M MES缓冲液超声悬浮，再次离心，弃去上清，最后用0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin300、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH 7.2的缓冲液溶解清洗好的供体微球，使其终浓度为5μg/mL，超声分散后置于4℃保存备用；
2试剂R2制备：
a)受体微球准备：量取10mg 150nm的受体微球和2mg的抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体，迅速混匀，再加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液调节受体微球浓度至10mg/mL；b)反应：加入100μL的pH值为6.0的0.05M MES配制的浓度为50mg/mL的NaBH3CN溶液，混匀，室温旋转反应12～16h；c)封闭：加入pH值为6.0的0.05M MES配制的浓度为100mg/mL的BSA溶液进行封闭，其与反应液体积比为1:4，迅速混匀，室温旋转反应3小时；d)清洗：反应好的溶液4℃12000rpm离心60min，弃去上清，加入2mL pH值为6.0的0.05M MES缓冲液超声悬浮，再次离心，弃去上清，最后用0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH为7.2的缓冲液溶解上述步骤中制备的受体微球，使其终浓度为2μg/ml，超声分散后置于4℃保存备用；
3试剂R3制备：
a)生物素活化：量取1mg生物素加入到100μL DMF溶液中并充分混匀，再用PBS溶液定容到0.5mL，准确称取EDC 2mg，加入该溶液中，室温活化1h；b)反应：量取一定量的猪瘟病毒Erns蛋白，使用PBS溶液稀释，测定蛋白浓度并调节至2mg/mL，将活化好的生物素溶液加入猪瘟病毒Erns蛋白溶液中，充分混匀并在室温反应6h；c)纯化：将生物素化猪瘟病毒Erns蛋白溶液加入载留分子量为10KD的透析袋中，用PBS溶液作为缓冲液，在4℃透析24小时，取样测定蛋白浓度，将合格的生物素化猪瘟病毒Erns蛋白浓度用0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH为7.2的缓冲液调节至0.5μg/mL，4℃保存备用。
4阳性对照和阴性对照配制
a)阳性对照配制：
免疫用仔猪的筛选：选择28日龄仔猪采血进行下列抗体筛查，挑选符合如下标准的抗体阴性仔猪作为免疫用健康仔猪。标准为：猪流行性腹泻病毒抗体：ELISA试剂盒检测阴性；猪***病毒抗体(O型)：ELISA检测试剂盒检测阴性；猪传染性胃肠炎病毒抗体：ELISA检测试剂盒检测阴性；猪瘟病毒抗体：ELISA检测试剂盒检测阴性；猪伪狂犬病毒抗体：ELISA检测试剂盒检测阴性；猪圆环病毒抗体：ELISA检测试剂盒检测阴性；猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体：ELISA检测试剂盒检测阴性。
免疫方法：取健康仔猪3头，颈部肌肉多点注射商品化的猪瘟病毒活疫苗(购自洛阳普莱柯生物)，14日后加强免疫一次。
血清效价测定：二免后每隔7日进行采血，采用中和法进行血清抗体检测，当抗体≥1:128时采血，分离血清，4℃保存待检。
阳性血清的制备：对满足条件的实验猪进行颈动脉放血，每头猪的血液保存在一个灭菌的三角烧瓶中，将析出的血清转移到离心瓶中，3,000r/min离心5分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌。定量分装，1mL/瓶，标记为“阳性血清”，注明收获日期和批号等，之后进行性状检验、无菌检验、特异性及中和抗体效价测定，检验合格后封口后置-20℃以下保存。
阳性对照制备：用含2％BSA的PBST缓冲液(含0.1％的Proclin300)将检验合格的阳性血清稀释成1:50、1:100、1:200、1:400共4个稀释度，各稀释度均用中和进行检测，选择中和效价＝1:64的最高稀释倍数，用2％BSA的PBST缓冲液(含0.1％的Proclin300)按该稀释倍数将阳性血清进行稀释，混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装(1mL/管、3mL/管)，置﹣20℃以下保存备用。
b)阴性对照配制
阴性猪的筛查：选择28日龄仔猪采血进行下列抗体筛查，挑选符合如下标准的抗体阴性仔猪作为免疫用健康仔猪。标准为：猪流行性腹泻病毒抗体：ELISA试剂盒检测阴性；猪***病毒抗体(O型)：ELISA检测试剂盒检测阴性；猪传染性胃肠炎病毒抗体：ELISA检测试剂盒检测阴性；猪瘟病毒抗体：ELISA检测试剂盒检测阴性；猪伪狂犬病毒抗体：ELISA检测试剂盒检测阴性；猪圆环病毒抗体：ELISA检测试剂盒检测阴性；猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体：ELISA检测试剂盒检测阴性。
效价测定：各实验猪采血分离血清，测中和抗体效价，如效价≤1:4，则将猪用于阴性对照制备。
阴性对照制备：对猪进行颈动脉放血致死，血液置于灭菌洁净的三角烧瓶中，将析出的血清转移到离心瓶中，3,000r/min离心5分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌，并加入0.1％的Proclin300。定量分装(1mL/管、3mL/管)，注明批号、收获日期等，置﹣20℃以下保存备用。
5使用1-4制备的试剂盒检测猪瘟病毒Erns蛋白抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将阳性血清、阴性血清或者样本与试剂盒中的试剂R1、试剂R2、试剂R3按照体积比为10μL:30μL:30μL:30μL的量混合，混合液置于37℃下温育5-10min，优选地为8min；
2)在温育后，立即通过光电倍增管检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s，记录阳性对照、阴性对照和样本的化学发光值；
3)根据化学发光值，计算S/N值，其中S/N值＝样品化学发光值/阴性对照化学发光值；当S/N值＞0.7时，判为猪瘟病毒Erns蛋白抗体阴性；当阻断率≤0.6时，判为猪瘟病毒Erns蛋白抗体阳性，当0.6＜S/N值≤0.7时，判为可疑。
实施例2基于均相化学发光技术猪瘟病毒鉴别诊断试剂盒的性能验证
(1)特异性实验
用实施例1建立的试剂盒分别检测PPV、PRV、PCV2、PRRSV阳性血清各1份，大肠杆菌阳性血清2份，验证本方法的特异性。
建立的试剂盒检测PPV、PRV、PCV2、PRRSV、大肠杆菌阳性血清均为阴性，S/N值均大于1.0或以下，无交叉反应，试剂盒特异性良好。
(2)敏感性试验
将阳性质控样本用PBST按1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096稀释，用实施例1建立的试剂盒进行检测，同时以血清抗体中和试验进行鉴定，验证建立方法的敏感性。
建立的试剂盒与中和试验检测结果一致，均可检测到最大稀释倍数为1：2048的阳性质控样品。
(3)重复性试验
按照实施例1制备的3批试剂盒并按照其检测方法对已知强阳性血清、阳性血清、弱阳性血清和阴性血清(各5份)进行重复性检验，计算批内变异系数；再从3批试剂盒中按批次分别各随机挑选出2个试剂盒，每个试剂盒分别对已知强阳性血清、阳性血清、弱阳性血清和阴性血清进行重复性检验，计算批间变异系数。结果显示，3批试剂盒对阳性血清检测结果批内变异系数在4％～7％，批间变异系数在5％～9％；对阴性血清检测结果批内变异系数在6％～11％，批间变异系数在7％～11％。实验结果表明试剂盒的重复性良好。
综上所述，本发明的试剂盒操作简单，可以在10分钟左右出检测报告，大大缩短了临床检验标本周转时间，适合兽医急诊检测需求。使用本发明的试剂盒在基于均相化学发光免疫竞争法的基础上检测猪瘟病毒抗体，其结果准确，精密度高，耗时短。本发明的样品在进行检测时，无需稀释，不存在HOOK效应。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于均相化学发光法鉴别诊断猪瘟病毒野毒感染的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂R3以及阳性对照和阴性对照，其中：
所述试剂R1包括供体微球以及与之结合的链霉亲和素的缓冲液，所述供体微球能够在激发状态产生活性氧；
所述试剂R2包括受体微球以及与之结合的抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体的缓冲液，所述受体微球能够与活性氧反应生成可检测的化学发光信号；
所述试剂R3包括生物素化的猪瘟病毒Erns蛋白的缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为猪瘟病毒中和抗体效价为1:64的猪血清；所述阴性对照为猪瘟病毒中和抗体效价为1:4的猪血清。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的供体微球和受体微球的直径均为150nm。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中供体微球的浓度为5μg/mL；所述试剂R2中受体微球的浓度为2μg/mL。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R3中的生物素化的猪瘟病毒Erns蛋白的浓度为0.5μg/mL，所述缓冲液组分为0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH值为7.2。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的缓冲液组分为0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH值为7.2。
7.根据权利要求1或2或3或4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2的缓冲液组分为0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH值为7.2。
8.一种制备如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
8-1)试剂R1制备：
a)供体微球准备：量取10mg 150nm的的供体微球和1mg链霉亲和素，迅速混匀，再加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液调节供体微球浓度至10mg/mL；
b)反应：加入100μL pH 6.0的0.05M MES配制的50mg/mL的NaBH3CN溶液，迅速混匀，室温旋转反应12～16h；
c)封闭：加入pH 6.0的0.05M MES缓冲液配制的浓度为100mg/mL的BSA溶液，其与反应液体积比为1:4，迅速混匀，室温旋转反应3小时；
d)清洗：反应好的溶液4℃12000rpm离心60min，弃去上清，加入2mL pH 6.0的0.05MMES缓冲液超声悬浮，再次离心，弃去上清，最后用0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin300、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH值为7.2的缓冲液溶解清洗好的供体微球，使其终浓度为5μg/mL，超声分散后置于4℃保存备用；
8-2)试剂R2制备：
a)受体微球准备：量取10mg 150nm的受体微球和2mg的抗猪瘟病毒Erns蛋白单克隆抗体，迅速混匀，再加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液调节受体微球浓度至10mg/mL；
b)反应：加入100μL的pH值为6.0的0.05M MES配制的浓度为50mg/mL的NaBH3CN溶液，混匀，室温旋转反应12～16h；
c)封闭：加入pH值为6.0的0.05M MES配制的浓度为100mg/mL的BSA溶液进行封闭，其与反应液体积比为1:4，迅速混匀，室温旋转反应3小时；
d)清洗：反应好的溶液4℃12000rpm离心60min，弃去上清，加入2mL pH值为6.0的0.05MMES缓冲液超声悬浮，再次离心，弃去上清，最后用0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH值为7.2的缓冲液溶解上述步骤中制备的受体微球，使其终浓度为2μg/ml，超声分散后置于4℃保存备用；
8-3)试剂R3制备：
a)生物素活化：量取1mg生物素加入到100μL DMF溶液中并充分混匀，再用PBS溶液定容到0.5mL，准确称取EDC 2mg，加入该溶液中，室温活化1h；
b)反应：量取一定量的猪瘟病毒Erns蛋白，使用PBS溶液稀释，测定蛋白浓度并调节至2mg/mL，将活化好的生物素溶液加入猪瘟病毒Erns蛋白溶液中，充分混匀并在室温反应6h；
c)纯化：将生物素化猪瘟病毒Erns蛋白溶液加入载留分子量为10KD的透析袋中，用PBS溶液作为缓冲液，在4℃透析24小时，取样测定蛋白浓度，将合格的生物素化猪瘟病毒Erns蛋白浓度用0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH值为7.2的缓冲液调节至0.5μg/mL，4℃保存备用。
9.一种使用如权利要求1-8任一项所述的试剂盒检测猪瘟病毒Erns蛋白抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
9-1)将阳性血清、阴性血清或者样本与试剂盒中的试剂R1、试剂R2、试剂R3按照体积比为10μL:30μL:30μL:30μL的量混合，混合液置于37℃下温育8min；
9-2)在温育后，立即通过光电倍增管检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s，记录阳性对照、阴性对照和样本的化学发光值；
9-3)根据化学发光值，计算S/N值，其中S/N值＝样品化学发光值/阴性对照化学发光值；当S/N值＞0.7时，判为猪瘟病毒Erns蛋白抗体阴性；当阻断率≤0.6时，判为猪瘟病毒Erns蛋白抗体阳性，当0.6＜S/N值≤0.7时，判为可疑。
10.一种如权利要求1-8任一项所述的试剂盒在检测猪瘟病毒Erns蛋白抗体中的应用。
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