CN112326849A - 一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于代谢组学分析技术领域，具体涉及一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法。针对现有技术中，缺少合适的代谢物检测及分析方法，使得利用代谢组学分析研究东革阿里的减肥降脂特性难以进行的问题，本发明的技术方案是：提取并分离为水溶性代谢物样品和脂质样品后通过液相色谱‑串联质谱对水溶性代谢物样品和/或脂质样品进行检测。本发明对检测的色谱条件和质谱条件进行了优化。本发明对血浆与组织样品中的水溶性代谢物和脂质代谢物进行了很好的分离，从而实现了准确的检测。基于上述准确的检测结果，得到东革阿里促进减肥降脂过程中的代谢路径，实现了利用代谢组学分析研究东革阿里的减肥降脂特性。
Description
技术领域
本发明属于代谢组学分析技术领域，具体涉及一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法。
背景技术
作为一种具有多种独有特征和显著优势的经典检测和分析技术，代谢组学技术及其相关原理和应用方面目前已引起了巨大的关注，同时对该技术进一步创新和发展的研究也持续了多年且成果***。由于其引人瞩目的各项特征(如与表型的生物相容性，高通量分析过程，低廉的检测成本和信息丰富的分析结果，代谢组学已广泛用于微生物，细胞，植物，哺乳动物和环境等各类生命体系，同时在毒理学评价，新药物开发，临床诊断，疾病治疗，食品安全和环境化学等研究领域得到了许多先进而有意义的结果。近期关于代谢组学的研究主要集中于基于代谢组学的技术改进和新型研究领域的开发，因此这无疑要求相应的检测手段和技术细节朝着覆盖更多的代谢产物种类与更高的灵敏度的方向快速发展。
为了实现这一目标，将高分辨率分析技术与化学计量学统计软件相结合的新型代谢组学研究平台成功实现了代谢物的有效检测以及后续数据的整合处理同时也揭示了内源性和异源性代谢过程。现有的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术正发挥着重要的作用，成为代谢组学的几种主要检测手段之一，其高灵敏度，有效的检测过程，简单的样品处理方法和良好的普适性使其相对于其他几种手段具有不可比拟的优点。目前基于LC-MS/MS和数据统计软件的组学分析平台已被广泛用于非靶向或靶向代谢组学研究，该平台以高效省时的流程实现了数千种代谢物的鉴定，为以后的实际应用和技术改进提供了宝贵的理论与实践参考。然而，代谢组学分析平台与其它先进的研究领域(如药用植物)的进一步合作报道甚少，使得代谢组学更深层次的探索成为目前需要面对的巨大挑战，同时也为基于代谢组学的交叉学科发展提供了广阔空间。
作为该挑战的一个杰出的解决方案，在过去的几十年中，研究者正致力于开发一种名为东革阿里的亚洲草药，而基于其生物学特性与药理活性的研究成果在化学和医学领域产生了巨大影响。一般来说，东革阿里的根，茎和树皮常被用作民间药物来治疗癌症，疟疾，发烧，阳痿和疲劳。最近，人们对这种药物在治疗肥胖和减轻体重的研究领域产生了兴趣，已成为时下基于东革阿里的前沿研究。因此，通过代谢组学研究平台分析检测各代谢物种类与数量而***地评价东革阿里的降脂减肥特性的新理念，已逐渐显示出其独特的魅力和光明的未来。
然而，在三大组学中，代谢组学的分析难度是相对较高的。其中一个原因就在于代谢物检测和分析的困难。这是由于不同生物物种在不同的实验条件下的代谢物数量多且差异较大。因而对于不同的动物实验模型，其生物样品中的代谢物的检测条件也不相同。虽然，人们已经发现了东革阿里所具有的减肥降脂特性，但是现有的研究还未有提出基于东革阿里治疗肥胖的相关分子生物信息，且相关特征代谢物和东革阿里干预下的代谢原理之间的内在联系也不清楚。因而，人们无法预期在利用代谢组学分析研究东革阿里的减肥降脂特性过程中具体需要分析哪些代谢物，进而也就不清楚什么样的检测方法和检测条件适用于相关的生物样本。因此，通过进一步的检测方法改进和检测条件优化从而将传统的代谢组学的应用拓展至东革阿里的减肥降脂特性研究中，已成为代谢组学研究者需要解决的重大任务，具有巨大的潜在价值与深远意义。
发明内容
针对现有技术中，缺少合适的代谢物检测及分析方法，使得利用代谢组学分析研究东革阿里的减肥降脂特性难以进行的问题，本发明提供一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法，目的在于：提供优化的检测方法和检测条件，实现对东革阿里减肥作用的动物模型的生物样本中的代谢物检测，进而实现代谢组学分析方法在东革阿里减肥降脂特性研究中的应用。
一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法，包括如下步骤：
(1)取用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品，提取并分离为水溶性代谢物样品和脂质样品；
(2)通过液相色谱-串联质谱对水溶性代谢物样品和/或脂质样品进行检测；
所述水溶性代谢物样品检测时溶于体积分数60-70％的乙腈水溶液，色谱条件为：流动相以体积分数5-10％的乙腈水溶液为A相，体积分数90-95％的乙腈水溶液为B相；色谱柱采用BEH HILIC色谱柱；
和/或，所述脂质样品检测时溶于体积比50：50的二氯甲烷/甲醇混合溶液中，色谱条件为：流动相以体积分数90-95％的乙腈水溶液为A相，体积分数50-55％的乙腈水溶液为B相；色谱柱采用BEH HILIC色谱柱。
优选的，所述水溶性代谢物样品检测时的洗脱梯度为：
0-0.10min，体积分数10％A相+90％B相；
0.10-1.50min，体积分数10％A相+90％B相；
1.50-5.00min，体积分数55％A相+45％B相；
5.00-10.0min，体积分数55％A相+45％B相；
10.0-12.0min，体积分数10％A相+90％B相；
12.0-20.0min，体积分数10％A相+90％B相；
和/或，所述脂质样品检测时的洗脱梯度为：
0-10.0min，体积分数80％A相+20％B相；
10.0-11.0min，体积分数2％A相+98％B相；
11.0-13.0min，体积分数2％A相+98％B相；
13.0-13.1min，体积分数99.1％A相+0.9％B相；
13.1-17.0min，体积分数0％A相+0％B相。
优选的，所述生物样品采集自东革阿里降脂减肥的动物模型，所述东革阿里降脂减肥的动物模型的建模方法为：采用东革阿里的提取物的水溶液对高脂饮食的实验动物进行灌胃，优选的，所述实验动物为小白鼠，小黑鼠或裸鼠。
优选的，生物样品是东革阿里降脂减肥的动物模型的血浆和/或组织样品，优选的，所述组织样品为肝、肾、肺、心或胰样品。
优选的，步骤(1)中，提取并分离血浆样品的过程包括如下步骤：
(1.1)将血浆样品与甲醇、甲基叔丁基醚和水混合均匀；
(1.2)静置分层，收集下层清液干燥后得到水溶性代谢物样品，收集上层清液干燥后得到脂质样品；
优选的，血浆样品、甲醇、甲基叔丁基醚和水的体积比为4:30:100:35；和/或，步骤(1.1)的具体过程为将血浆样品与甲醇和甲基叔丁基醚混合均匀后，在黑暗处静置1-2h，然后与水混合均匀；和/或，步骤(1.2)中静置分层的时间为10-20min。
优选的，步骤(1)中，提取并分离组织样品的过程包括如下步骤：
(1.1)将组织样品破碎并加入甲醇匀浆得到悬浊液；
(1.2)将匀浆后的悬浊液与甲醇、甲基叔丁基醚和水混合均匀；
(1.3)静置分层，收集下层清液干燥后得到水溶性代谢物样品，收集上层清液干燥后得到脂质样品；
优选的，步骤(1.1)的具体过程为将组织样品、钢珠和体积分数80-90％的甲醇混合进性组织匀浆；和/或，所述组织样品和体积分数80-90％的甲醇的用量比例为10mg：200μl；和/或，组织样品与步骤(1.2)中所用的甲醇、甲基叔丁基醚和水的用量比例为10mg：160μl：1000μl：300μl；和/或，步骤(1.2)的具体过程为将浆液与甲醇和甲基叔丁基醚混合均匀后，在黑暗处静置1-2h，然后与水混合均匀；和/或，步骤(1.3)中静置分层的时间为10-20min。
优选的，所述水溶性代谢物样品检测时溶于包含有5-10mM甲酸铵的体积分数60-70％的乙腈水溶液，色谱条件为：流动相以包含有10-20mM乙酸铵和体积分数0.2-0.5％乙酸的体积分数10-20％的乙腈水溶液为A相，包含有10-20mM乙酸铵和体积分数0.2-0.5％乙酸的体积分数80-90％的乙腈水溶液为B相；
所述脂质样品检测时溶于包含有10-20mM乙酸铵的体积比50：50的二氯甲烷/甲醇混合溶液中，色谱条件为：流动相以包含有10-20mM乙酸铵的体积分数90-95％的乙腈水溶液为A相，包含有10-20mM乙酸铵的体积分数50-60％的乙腈水溶液为B相。
优选的，所述水溶性代谢物样品的色谱条件为：流动相流速为200-300μl/min，进样量为5-15μl，色谱柱温度设置为30-40℃；
所述脂质样品的色谱条件为：流动相流速为400-500μl/min，进样量为2-3μl，色谱柱温度设置为35-40℃。
优选的，所述水溶性代谢物样品的质谱条件为：毛细管温度保持在600-650℃，鞘气压力为50-60psi，辅助气压力为40-50psi，一级扫描范围为5-1250m/z，正模式喷雾电压为4-5kV，负模式喷雾电压为-4到-5kV；
所述脂质样品的质谱条件为：毛细管温度保持在400-500℃，鞘气压力为50-60psi，辅助气压力为60-65psi，一级扫描范围为5-1250m/z，正模式喷雾电压为5-6kV，负模式喷雾电压为-4到-5kV。
优选的，步骤(2)中，通过液相色谱-串联质谱检测得到的结果用于代谢途径的分析。
优选的，代谢途径的分析包括如下步骤：
(3.1)基于R语言算法对液相色谱-串联质谱检测得到的结果进行代谢物分析与鉴定得到统计结果；
(3.2)对统计结果归一化后，执行主成分分析、偏最小二乘判别分析或正交偏最小二乘判别分析对代谢物进行分组；
(3.3)通过R语言MetaboAnalyst进行代谢途径分析，以鉴别代表性的代谢途径。
本发明提供的生物样品的检测方法中，分别对水溶性代谢物样品和脂质样品的检测条件进行了优化，能够满足对生物样本中各种特征代谢物的分离和检测。提高了代谢物的检测和鉴定的准确性，进而提高了后续代谢途径分析的准确进行。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是本发明基于东革阿里降脂减肥特性的代谢组学分析方法的流程示意图；
图2是本发明基于东革阿里降脂减肥特性的代谢组学分析方法的逻辑示意图；
图3是本发明实施例中得到的水溶性代谢物的总离子流图；
图4是本发明实施例中得到的脂质代谢物的总离子流图。
其中，1-东革阿里原药，2-东革阿里水溶性提取物，3-注射器，4-小白鼠，5-血浆，6-肝，7-肾，8-液相色谱-三重四级杆质谱，9-统计结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。若无特殊说明，所用实验方法为常规实验方法，所使用的仪器，试剂和原材料等均可通过商业途径获得。
实施例
本实施例为基于东革阿里降脂减肥特性的代谢组学分析方法研究，图1为本实施例中基于东革阿里降脂减肥特性的代谢组学分析方法的流程示意图，图2为本实施例中基于东革阿里降脂减肥特性的代谢组学分析方法的逻辑示意图。本实施例提供的基于东革阿里降脂减肥特性的代谢组学分析方法，包括东革阿里水溶性提取物制备、东革阿里降脂减肥的小鼠模型构建、血浆与组织样品采集、水溶性代谢物与脂质提取、液相色谱-三重四级杆质谱检测以及生物信息学统计分析六个步骤。
(1)东革阿里水溶性提取物制备
首先通过将27g东革阿里原药1研磨成细粉，然后在黑暗中于80℃剧烈搅拌1h将其溶于200ml纯水中，过滤并收集上层液体。接下来，再加入200ml纯水添加到先前的底物中再次进行萃取。在黑暗中于80℃剧烈搅拌1h后，将所有液体混合并冷冻干燥。将最后得到的粉末(约0.9g)在4℃的冰箱中保存。
东革阿里水溶性提取物使用前，在剧烈搅拌下将粉末重新溶解于纯水中得到东革阿里水溶性提取物，东革阿里水溶性提取物加热至与小鼠体温一致。
(2)东革阿里降脂减肥的小鼠模型构建
使用15只成熟的雄性BALB/c小白鼠(5周)，体重在22-28g之间。这些小白鼠被饲养于室温(22-24℃)，通风良好，明暗循环12h，湿度约50±5％的标准笼子中。每笼饲养5只。小白鼠食物和水保持充足。在开始干预之前，使小白鼠适应居住条件7天。然后，将这些小白鼠随机分为3组，每组5只。用高脂饮食(高脂饮食组和东革阿里灌胃组)或普通饮食(对照组)喂养12天后，随后的20天干预方法如下：对照组只供给普通饮食和纯水；高脂饮食组只供给高脂饮食和纯水；东革阿里灌胃组供给高脂饮食和纯水，并每天利用装有200μl，120mg/ml东革阿里水溶性提取物的注射器进行灌胃。上述东革阿里水溶性提取物的浓度源于已报道的能够保持最佳生物活性的剂量，同时该浓度对小白鼠无毒性并能够形成有效刺激。
(3)血浆与组织样品采集及水溶性代谢物与脂质提取
血浆的水溶性代谢物与脂质提取步骤如下：所有实验组中的小白鼠在全麻状态下从颈静脉取血，所得血液进行离心处理(2000rpm，10min，8℃)以收集血浆。然后吸取每个样品的40μl血浆(每组实验平行六次)分别与300μl甲醇混合，并以1500rpm涡旋振荡10s。此后，在1500rpm的涡旋下再加入1ml甲基叔丁基醚，在黑暗处相互作用1h。然后，加入350μl纯水并以1500rpm涡旋20s，随后在室温下分层10min。经离心(14000rpm，10min，4℃)处理后，将800μl上清液(脂质)和250μl下清液(水溶性代谢物)分别真空干燥12h。即得到脂质样品和水溶性代谢物样品。
组织(包括肝6和肾7)的水溶性代谢物与脂质提取步骤如下：所述所有实验组中的小白鼠4在全麻状态下取出肝6和肾7，并用磷酸缓冲液(PBS)冲洗。接下来称取每个样品的10mg肝6或肾7(每组实验平行六次)分别与6颗钢珠和200μl预冷的80％甲醇混合进行3次组织匀浆(每次30s)。在1500rpm涡旋10s后，加入160μl甲醇与上述悬浊液混合并在1500rpm涡旋下混合10s。然后，在1500rpm的涡旋下再加入1ml甲基叔丁基醚。在黑暗处相互作用1h后，加入300μl纯水，并以1500rpm涡旋振荡20s，然后在室温下分层10min。经离心(14000rpm，10min，4℃)处理后，将800μl上清液(脂质)和250μl下清液(水溶性代谢物)分别真空干燥12h。即得到脂质样品和水溶性代谢物样品。
(4)液相色谱-三重四级杆质谱检测
所述水溶性代谢物样品首先复溶于750μl HILIC溶液(体积分数60％的乙腈和5mM甲酸铵水溶液)中并离心除去沉淀，取100μl上清液装瓶进入液相色谱-三重四级杆质谱进行检测。液相色谱设置条件为：流动相流速为300μl/min，流动相组成为(A)10％乙腈溶于水中(包括10mM乙酸铵和0.2％乙酸)和(B)90％乙腈溶于水中(包含10mM乙酸铵和0.2％乙酸)，相关洗脱梯度如表1所示。色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)温度设置为40℃，进样量为5μl(正模式)或15μl(负模式)。质谱由加热电喷雾电离源(H-ESI)和Orbitrap质量分析仪组成，质谱设置条件为：对于正模式，毛细管温度保持在650℃，鞘气压力为50psi，辅助气压力为40psi，喷雾电压为4kV，一级扫描范围为5-1250m/z；对于负模式，毛细管温度保持在650℃，鞘气压力为50psi，辅助气压力为40psi，喷雾电压为-4kV，一级扫描范围为5-1250m/z。
表1水溶性代谢物样品色谱分析中的洗脱梯度
所述脂质样品首先复溶于含有10mM乙酸铵的100μl体积分数50％二氯甲烷和体积分数50％甲醇的混合溶液中，随后进行涡旋(1500rpm，10℃，10s)并离心(14000rpm，10min，4℃)处理，提取65μl上清液装瓶进入液相色谱-三重四级杆质谱进行检测。液相色谱设置条件为：流动相流速为500μl/min流动相组成为(A)90-95％，优选为95％乙腈溶于水中(含有10mM乙酸铵)和(B)50％乙腈溶于水中(包括10mM乙酸铵)，相关洗脱梯度如表2所示，Acquity UPLC BEH HILIC色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)温度设置为35℃，进样量为2μl。质谱设置条件为：对于正模式，毛细管温度保持在500℃，鞘气压力为50psi，辅助气压力为60psi，喷雾电压为5.3kV；对于负模式，毛细管温度保持在500℃，鞘气压力为50psi，辅助气压力为60psi，喷雾电压为-4.5kV，一级扫描范围为5-1250m/z。
表2脂质样品色谱分析中的洗脱梯度
在本实施例的测试条件下，对照组，高脂饮食组和东革阿里灌胃组的总离子流图均检测到大量色谱峰且峰形良好。其中，这三组实验组之间无论在水溶性代谢物(图3)或者脂质代谢物(图4)范畴内其峰强度和面积均有明显的变化，组间差异明显。因而完全能够用于后续的生物信息学统计分析。同时，在正模式和负模式条件下，色谱峰的数量和面积差异明显且彼此独立。该结果不仅为优化后的测试条件的有效性提供了有力证明，同时也证明了东革阿里对生命体的影响在代谢组学层面具有明显的表现。
(5)生物信息学统计分析
生物信息学统计分析步骤中，所述统计分析过程通过软件进行数据整合处理。将获得的水溶性代谢物样品和脂质样品的液相色谱-三重四级杆质谱的原始数据导入到MultiQuant(v2.0.3)软件中进行预处理，获取样品信息、峰保留时间和强度。此后，基于R语言算法进行代谢物分析与鉴定得到统计结果，其过程包括多元统计分析，差异代谢物统计与定量，差异代谢通路分析等。这些代谢物中缺失值>50％和变异系数>20％将被去除，其中缺失值归因通过KNN算法进行进一步数据处理。统计结果经中值归一化后，执行主成分分析(PCA)，偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和/或正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)来区分不同组别的样品。最后通过R语言MetaboAnalyst实现代谢途径分析，以鉴定东革阿里促进减肥降脂过程中的代表性的代谢途径。本实施例研究表明，东革阿里水溶性提取物对生物体代谢物与代谢路径均有显著影响，同时东革阿里的摄入能有效促进甘油脂的分解并抑制甘油脂的生成，从而达到降脂减肥的效果。
上述实施例的分析方法基于代谢组学测试与分析平台考察东革阿里水溶性提取物与小鼠的相互作用，通过优化液相色谱-三重四级杆质谱检测时的样品前处理条件、色谱条件和质谱条件，对血浆与组织样品中的水溶性代谢物和脂质代谢物进行了很好的分离，从而实现了准确的检测。基于上述准确的检测结果，得到东革阿里促进减肥降脂过程中的代谢路径。同时对比不同实验条件下血浆与组织的代谢物种类含量与代谢路径，揭示东革阿里对于小鼠代谢组学的影响原理，从而评估东革阿里降脂减肥特性，为后续药物的改性与临床应用提供理论依据。
Claims (10)
1.一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品，提取并分离为水溶性代谢物样品和脂质样品；
(2)通过液相色谱-串联质谱对水溶性代谢物样品和/或脂质样品进行检测；
所述水溶性代谢物样品检测时溶于体积分数60-70％的乙腈水溶液，色谱条件为：流动相以体积分数5-10％的乙腈水溶液为A相，体积分数90-95％的乙腈水溶液为B相；色谱柱采用BEH HILIC色谱柱；
和/或，所述脂质样品检测时溶于体积比50：50的二氯甲烷/甲醇混合溶液中，色谱条件为：流动相以体积分数90-95％的乙腈水溶液为A相，体积分数50-55％的乙腈水溶液为B相；色谱柱采用BEH HILIC色谱柱。
2.按照权利要求1所述的一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法，其特征在于：
所述水溶性代谢物样品检测时的洗脱梯度为：
0-0.10min，体积分数10％A相+90％B相；
0.10-1.50min，体积分数10％A相+90％B相；
1.50-5.00min，体积分数55％A相+45％B相；
5.00-10.0min，体积分数55％A相+45％B相；
10.0-12.0min，体积分数10％A相+90％B相；
12.0-20.0min，体积分数10％A相+90％B相；
和/或，所述脂质样品检测时的洗脱梯度为：
0-10.0min，体积分数80％A相+20％B相；
10.0-11.0min，体积分数2％A相+98％B相；
11.0-13.0min，体积分数2％A相+98％B相；
13.0-13.1min，体积分数99.1％A相+0.9％B相；
13.1-17.0min，体积分数0％A相+0％B相。
3.按照权利要求1所述的一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法，其特征在于，所述生物样品采集自东革阿里降脂减肥的动物模型，所述东革阿里降脂减肥的动物模型的建模方法为：采用东革阿里的提取物的水溶液对高脂饮食的实验动物进行灌胃，优选的，所述实验动物为小白鼠，小黑鼠或裸鼠。
4.按照权利要求1所述的一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法，其特征在于：所述生物样品是东革阿里降脂减肥的动物模型的血浆和/或组织样品，优选的，所述组织样品为肝、肾、肺、心或胰样品。
5.按照权利要求4所述的一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取并分离血浆样品的过程包括如下步骤：
(1.1)将血浆样品与甲醇、甲基叔丁基醚和水混合均匀；
(1.2)静置分层，收集下层清液干燥后得到水溶性代谢物样品，收集上层清液干燥后得到脂质样品；
优选的，血浆样品、甲醇、甲基叔丁基醚和水的体积比为4:30:100:35；和/或，步骤(1.1)的具体过程为将血浆样品与甲醇和甲基叔丁基醚混合均匀后，在黑暗处静置1-2h，然后与水混合均匀；和/或，步骤(1.2)中静置分层的时间为10-20min。
6.按照权利要求4所述的一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取并分离组织样品的过程包括如下步骤：
(1.1)将组织样品破碎并加入甲醇匀浆得到悬浊液；
(1.2)将匀浆后的悬浊液与甲醇、甲基叔丁基醚和水混合均匀；
(1.3)静置分层，收集下层清液干燥后得到水溶性代谢物样品，收集上层清液干燥后得到脂质样品；
优选的，步骤(1.1)的具体过程为将组织样品、钢珠和体积分数80-90％的甲醇混合进性组织匀浆；和/或，所述组织样品和体积分数80-90％的甲醇的用量比例为10mg：200μl；和/或，组织样品与步骤(1.2)中所用的甲醇、甲基叔丁基醚和水的用量比例为10mg：160μl：1000μl：300μl；和/或，步骤(1.2)的具体过程为将浆液与甲醇和甲基叔丁基醚混合均匀后，在黑暗处静置1-2h，然后与水混合均匀；和/或，步骤(1.3)中静置分层的时间为10-20min。
7.按照权利要求1所述的一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法，其特征在于：
所述水溶性代谢物样品检测时溶于包含有5-10mM甲酸铵的体积分数60-70％的乙腈水溶液，色谱条件为：流动相以包含有10-20mM乙酸铵和体积分数0.2-0.5％乙酸的体积分数10-20％的乙腈水溶液为A相，包含有10-20mM乙酸铵和体积分数0.2-0.5％乙酸的体积分数80-90％的乙腈水溶液为B相；
所述脂质样品检测时溶于包含有10-20mM乙酸铵的体积比50：50的二氯甲烷/甲醇混合溶液中，色谱条件为：流动相以包含有10-20mM乙酸铵的体积分数90-95％的乙腈水溶液为A相，包含有10-20mM乙酸铵的体积分数50-60％的乙腈水溶液为B相。
8.按照权利要求1或7所述的一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法，其特征在于：
所述水溶性代谢物样品的色谱条件为：流动相流速为200-300μl/min，进样量为5-15μl，色谱柱温度设置为30-40℃；
所述脂质样品的色谱条件为：流动相流速为400-500μl/min，进样量为2-3μl，色谱柱温度设置为35-40℃。
9.按照权利要求1所述的一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法，其特征在于：
所述水溶性代谢物样品的质谱条件为：毛细管温度保持在600-650℃，鞘气压力为50-60psi，辅助气压力为40-50psi，一级扫描范围为5-1250m/z，正模式喷雾电压为4-5kV，负模式喷雾电压为-4到-5kV；
所述脂质样品的质谱条件为：毛细管温度保持在400-500℃，鞘气压力为50-60psi，辅助气压力为60-65psi，一级扫描范围为5-1250m/z，正模式喷雾电压为5-6kV，负模式喷雾电压为-4到-5kV。
10.按照权利要求1所述的一种用于东革阿里的减肥降脂特性研究的生物样品分析方法，其特征在于，步骤(2)中，通过液相色谱-串联质谱检测得到的结果用于代谢途径的分析，所述代谢途径的分析包括如下步骤：
(3.1)基于R语言算法对液相色谱-串联质谱检测得到的结果进行代谢物分析与鉴定得到统计结果；
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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