CN112322719A - 循环血外泌体miRNA作为视网膜静脉阻塞疾病诊断标志物中的应用 - Google Patents
循环血外泌体miRNA作为视网膜静脉阻塞疾病诊断标志物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种循环血外泌体miRNA作为视网膜静脉阻塞疾病诊断标志物中的应用，循环血外泌体miR‑378d、miR‑146a‑5p、miR‑148a‑3p、miR‑24‑3p、miR‑221‑3p、miR‑28‑3p、miR‑652‑3p、miR‑532‑5p、miR‑223‑5p、miR‑148b‑3p、miR‑143‑3p、miR‑361‑3p、miR‑199a‑3p、miR‑7‑5p、miR‑382‑5p、miR‑27b‑3p、miR‑222‑3p、miR‑425‑5p、miR‑152‑3p、miR‑4326中的单个或多个miRNA组合能够作为一种更加精准稳定的标记物，具有稳定性好、取材便捷、灵敏性和特异性高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及到循环血外泌体miRNA作为视网膜静脉阻塞生物标志物及其应用。
背景技术
视网膜静脉阻塞(retina vein occlusion，RVO)作为一种常见的视网膜血管性疾病，是全球范围内导致视力损害的重要原因。根据阻塞部位的不同，RVO分为视网膜中央静脉阻塞(central retina vein occlusion，CRVO)与视网膜分支静脉阻塞(branch retinavein occlusion，BRVO)，其共同的发病原因包括动脉硬化压迫、血管内皮损伤诱发血栓形成以及血管炎症等。此外，血流动力学改变诸如高脂血症、多发性骨髓瘤和甲状腺功能亢进等引起血液粘滞性升高的疾病也可能是诱发RVO的原因。视网膜毛细血管无灌注、黄斑水肿和视网膜出血等病理变化是造成视力损害的主要原因。RVO患者的眼底可见视网膜内出血、黄斑囊样水肿、渗出和棉绒斑。已有研究表明，RVO会引起血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)、胎盘生长因子(placental growth factor，PGF)、血小板源生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)及白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)等炎症因子的增多，从而导致黄斑水肿、血管渗漏甚至虹膜新生血管等病理改变。虽已有许多关于RVO发病诱因的研究，但其确切的发病原因和分子机制尚未有明确的结论。
外泌体是一种可由多种细胞分泌的具有磷脂双分子层的分泌型囊泡样小体，电镜下观察其直径在30-150nm，在细胞内由多泡体(multivesicular body，MVB)的外膜内陷形成，可包裹多种如表面蛋白受体、脂质、mRNA、microRNA(miRNA)及其它非编码RNA等细胞内基因信息。当MVB外膜与细胞膜融合，其内的外泌体从细胞中释放，进入细胞间质，可以被临近的受体细胞吸收，或随体液运输到远端作用于不同的细胞。不同类型的多种活细胞在生理或病理状态下均能分泌外泌体，因此，外泌体广泛存在于生物体的如血液、尿液、唾液、脑脊液、腹水和胸水等多种体液中，且其内容物和膜表面标志物等更具供体细胞的特性。由于外泌体的磷脂双分子层结构，且富含RNA，能较为容易地将核酸转移到受体细胞中，是一种良好的信息传递工具。外泌体的磷脂双分子层使外泌体中的分子不容易被破坏，能相对稳定地存在于体液中，因此外泌体携带的特异性的分子信息，可以作为理想的生物标志物。
血液是人类所有疾病最好的信使，外泌体携带细胞内信使释放到各种体液中，为体液检测提供了新思路。在已有的临床标志物中，特异性良好的血液游离miRNA并未发现。外泌体miRNA比游离的miRNA更具有标志物的潜质。我们收集了患者血浆外泌体，通过高通量测序并生物信息学分析，筛选外泌体miRNA在RVO疾病中的表达差异，进一步通过实时荧光定量PCR验证表达水平，探讨其作为生物标志物的可能。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于循环血外泌体miRNA作为视网膜静脉阻塞生物标志物及其应用，为视网膜静脉阻塞诊断提供更加精准，便捷的方式。
本发明的目的在于提供一种与视网膜静脉阻塞辅助诊断相关的循环血外泌体miRNA标志物。
本发明的另一目的在于提供上述循环血外泌体miRNA及其引物在制备视网膜静脉阻塞辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的又一目的在于提供用于视网膜静脉阻塞辅助诊断试剂盒。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种与视网膜静脉阻塞辅助诊断相关的循环血外泌体miRNA标志物，该标志物为miR-378d、miR-146a-5p、miR-148a-3p、miR-24-3p、miR-221-3p、miR-28-3p、miR-652-3p、miR-532-5p、miR-223-5p、miR-148b-3p、miR-143-3p、miR-361-3p、miR-199a-3p、miR-7-5p、miR-382-5p、miR-27b-3p、miR-222-3p、miR-425-5p、miR-152-3p、miR-4326中的一个或者至少2个组合。
上述的循环血外泌体miRNA标志物在辅助诊断视网膜静脉阻塞中的应用。
上述的循环血外泌体miRNA标志物在制备视网膜静脉阻塞辅助诊断试剂盒中的应用。
一种与视网膜静脉阻塞辅助诊断相关的循环血外泌体miRNA标志物的引物，该引物包含miR-378d、miR-146a-5p、miR-148a-3p、miR-24-3p、miR-221-3p、miR-28-3p、miR-652-3p、miR-532-5p、miR-223-5p、miR-148b-3p、miR-143-3p、miR-361-3p、miR-199a-3p、miR-7-5p、miR-382-5p、miR-27b-3p、miR-222-3p、miR-425-5p、miR-152-3p、miR-4326中的一种或多种miRNA的引物；
上述的引物在辅助诊断视网膜静脉阻塞或制备视网膜静脉阻塞辅助诊断试剂盒中的应用。
一种视网膜静脉阻塞辅助诊断试剂盒，该试剂盒中含有miR-378d、miR-146a-5p、miR-148a-3p、miR-24-3p、miR-221-3p、miR-28-3p、miR-652-3p、miR-532-5p、miR-223-5p、miR-148b-3p、miR-143-3p、miR-361-3p、miR-199a-3p、miR-7-5p、miR-382-5p、miR-27b-3p、miR-222-3p、miR-425-5p、miR-152-3p、miR-4326中的一种或多种miRNA的引物。
该试剂盒中还包括PCR技术常用的试剂。
该试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。
本发明所涉及的与视网膜静脉阻塞诊断相关的循环血外泌体miRNA标志物miR-378d、miR-146a-5p、miR-148a-3p、miR-24-3p、miR-221-3p、miR-28-3p、miR-652-3p、miR-532-5p、miR-223-5p、miR-148b-3p、miR-143-3p、miR-361-3p、miR-199a-3p、miR-7-5p、miR-382-5p、miR-27b-3p、miR-222-3p、miR-425-5p、miR-152-3p、miR-4326中的每种miRNA的序列均已公开，其序列如SEQ ID NO.1-20所示，对应关系如表1所示，
表1
| SEQ ID NO.1 | hsa-miR-7-5p |
| SEQ ID NO.2 | hsa-miR-652-3p |
| SEQ ID NO.3 | hsa-miR-532-5p |
| SEQ ID NO.4 | hsa-miR-425-5p |
| SEQ ID NO.5 | hsa-miR-382-5p |
| SEQ ID NO.6 | hsa-miR-378d |
| SEQ ID NO.7 | hsa-miR-361-3p |
| SEQ ID NO.8 | hsa-miR-28-3p |
| SEQ ID NO.9 | hsa-miR-27b-3p |
| SEQ ID NO.10 | hsa-miR-24-3p |
| SEQ ID NO.11 | hsa-miR-223-5p |
| SEQ ID NO.12 | hsa-miR-222-3p |
| SEQ ID NO.13 | hsa-miR-221-3p |
| SEQ ID NO.14 | hsa-miR-199a-3p |
| SEQ ID NO.15 | hsa-miR-152-3p |
| SEQ ID NO.16 | hsa-miR-148a-3p |
| SEQ ID NO.17 | hsa-miR-148b-3p |
| SEQ ID NO.18 | hsa-miR-146a-5p |
| SEQ ID NO.19 | hsa-miR-143-3p |
| SEQ ID NO.20 | hsa-miR-4326 |
各miRNA标志物进行组合作为视网膜静脉阻塞辅助诊断标志物，需要本领域技术人员付出创造性劳动。各miRNA标志物的扩增引物均可通过市场购买获得，本发明实施例中使用的循环血外泌体miRNA标志物的引物为购自广州复能基因有限公司所合成生产的特异性miRNA茎环PCR引物。
本发明的有益效果在于：相较于传统的外周血游离miRNA检测，外泌体作为新型的生物标志物的代表，具有稳定性好、灵敏性和特异性高的特点。外泌体的磷脂双分子层使外泌体中的分子不容易被破坏，能相对稳定地存在在体液中，其受到外界干扰性低，能够作为一种更加精准稳定的标记物。另外，外泌体由供体细胞的内质网产生，并非细胞死亡破碎产生，因此相比于血液游离RNA，外泌体更具有标志物的潜质。本申请对视网膜静脉阻塞和对照组血清及血浆中的差异表达miRNA进行严密、多阶段的验证和评价，证实了这组miRNA作为诊断视网膜静脉阻塞的无创标记物的可靠性以及可重复性，外周血外泌体检测取材便捷，检测成本低，可作为理想的辅助诊断方法。本发明为诊断视网膜静脉阻塞提供了新的研究方向。
附图说明
图1：血浆外泌体miRNA表达，与对照组比较，RVO组患者血浆外泌体miRNA表达差异；
图2：302个差异表达miRNA的候选靶基因生物信息学分析，A：GO生物过程分析富集度，灰色代表本物种内该功能区域的背景基因，黑色代表目的样本该功能区域的基因富集数量(P＜0.01)；B：KEGG分析结果，横坐标(Rich factor)表示候选靶基因在纵坐标所代表的通路背景中所占比例，点的大小表示候选靶基因数目，颜色深度表示P值大小；
图3：20个高频出现的基因实时荧光qPCR表达量检测，(独立样本t检验，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001，****：P＜0.0001)。
具体实施方式
下面将结合附图以及实施例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明。
收集温州医科大学附属眼视光医院，40-80岁，经临床检查确诊为RVO，伴有或不伴有继发的黄斑水肿的病人，详细病例资料，及外周血10mL；
同时收集年龄匹配的单纯性白内障病例作为对照组；
外周血采血使用一次性EDTA真空采血管，以2000×g，4℃离心10分钟，分离血浆与血细胞，分别于-80℃超低温冰箱冷冻保存。
其中RVO的诊断标准为：眼底表现：视网膜静脉迂曲扩张，伴有或不伴有火焰状出血，部分可见及灰白色棉絮斑；FFA：动静脉期阻塞的静脉迂曲、充盈迟缓，血管壁着色，荧光渗漏，黄斑区荧光增强，部分患者可见无灌注区；OCT：黄斑水肿，视网膜内积液等。
RVO收集病例排除了以下几种情况的病例：
①患有其它眼底疾病，包括糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)、视网膜脱离、黄斑裂孔、色素性视网膜炎、视神经炎以及葡萄膜炎等；
②出现严重并发症，如玻璃体积血、严重白内障、新生血管性青光眼等；
③既往已接受过视网膜光凝或糖皮质激素玻璃体腔注药术；
④患有马凡氏综合征等特殊遗传病或白血病、甲状腺功能亢进症或多发性骨髓瘤等特殊全身性疾病；
⑤患有病毒性肝炎、梅毒或艾滋等感染性疾病；
⑥患有严重心脑血管疾病，严重肝肾功能不全或凝血功能异常。
样品处理
抽取8份RVO患者血浆，对血浆外泌体进行分离：
(1)去除细胞碎片：冻存的血浆冰上解冻后，2000g，4℃离心10分钟，上清转移至新的离心管。10000×g，4℃离心40分钟，上清转移到新的离心管中。为方便操作，使用1.5mL离心管时，使用的血浆体积一般不超过1.2mL。
(2)分离外泌体：加入1/3血浆体积的广州锐博生物公司生产的ExosomeIsolation Reagent外泌体提取试剂，用移液枪吹打充分混匀后，4℃静置30分钟。不宜剧烈震荡，以免影响得率。
(3)外泌体收集：15000×g，4℃离心15分钟，弃去上清，沉淀即获得的外泌体。
RVO患者血浆外泌体总RNA提取
血浆外泌体总RNA提取均使用Omega Bio-tek生产的E.Z.N.A
Total RNA Kit。
(1)裂解：在外泌体沉淀中加入1mL RNA-
reagent，研磨器充分研磨后室温静置1-2分钟充***解。
(2)萃取：在匀浆中加入200μL三氯甲烷，上下颠倒充分混匀后，冰上静置10分钟。12000×g，4℃离心15分钟，样品将分为三层。
(3)过柱：将上层无色透明水相液体的70％转移至新的离心管中，避免吸入中层杂质和下层液体。加入等体积70％乙醇，上下颠倒充分混匀。将混合的液体加入
RNAColumn，每次不超过700μL，12000×g，室温离心1分钟，弃去收集管中的液体，Column继续使用，再次将余下混合液加入Column中，离心，可反复多次直到混合液全部过柱。
(4)洗膜：在Column中加入Wash buffer I 500μL，12000×g，室温离心30秒，弃去收集管中液体。向Column中加入预先按比例添加无水乙醇的Wash buffer II 500μL，12000×g，室温离心30秒，弃去收集管中液体，重复两次。
(5)甩干：20000×g室温离心两分钟，甩干洗涤液。
(6)溶解：靠近滤过膜加入40μL DEPC水，室温孵育5分钟后，更换收集管，最大转速室温离心1分钟，收集滤过的液体。
(7)检测浓度：酶标仪检测RNA浓度和纯度，RNA纯度检测结果：吸光度260/280比值在1.8-2.1之间为合格。若浓度过低，可使用滤过的液体再次加入滤过膜孵育5min，再次离心收集后检测RNA浓度和纯度。或提前预热DEPC水，增加RNA溶解度。
RVO患者血浆外泌体RNA测序
收集8个RVO患者的血浆外泌体中的RNA，反转录为cDNA后进行非特异性PCR扩增，再使用Illumina HiSeq 2500进行miRNA高通量测序，去除反转录时使用的接头，过滤＜17nt的片段(由广州复能基因有限公司提供)。将得到的测序结果与实验室已有的白内障患者血浆外泌体miRNA测序数据进行比对，得到差异表达的miRNA。比较结果使用edgeR检验工具检验，以|log(Fold Change)|＞1位阈值，P＜0.05为显著差异，结果显示，有302个基因的表达有显著差异，其中115个表达量上调miRNA，187个表达量下调的miRNA，结果如图1所示。
差异表达miRNA的靶基因预测
通过miRNA的种子序列互补配对反向预测其作用位点，再参考miRNA物种中的保守型和miRNA-mRNA双链热稳定性进行预测靶点的检验。为减少假阳性结果，使用miRTarBase(carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tool)、Targetscan(targetscan.org/vert_72)、miRWALK(mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)和miRDB(mirdb.org)四种工具预测靶基因位点，再将不同软件的靶基因预测位点结果做Venn图，取至少有三个预测结果覆盖的靶基因作为该miRNA的候选靶基因。将候选靶基因通过基因本体论(GO)进行生物功能注释(图2A)，分析其相对于背景的高频功能注释，预测差异表达带来的生物学效应。结果显示，相较于对照组，RVO患者差异表达miRNA的作用位点主要功能区域为：细胞凋亡进程、RNA合成过程、细胞增殖调控、生长因子刺激下的细胞迁移、内吞作用、Wnt通路和细胞因子等。另外，在神经生长和新生血管也有一定的基因富集。我们同时还对KEGG通路注释进行富集度分析，得到相对于背景具有统计意义的信号转导及疾病通路，从而预测与疾病可能相关的基因集合在KEGG类别上的分布信息(图2B)。结果显示，相关度最高的几个通路有：轴突导向、生物代谢、癌症、Wnt通路、胰岛素抵抗路径、神经营养因子信号转导通路和干细胞多能性调控信号。另外，AMPK信号通路和胰岛素受体信号通路也有较多的基因富集。RVO患者差异表达的miRNA主要参与了细胞凋亡、内吞、细胞增殖、迁移和新生血管等过程，这与RVO的病理变化相符合。
外泌体miRNA作为RVO生物标志物的筛选
在与RVO可能相关生物过程及疾病通路相关的miRNA中，挑选20个高频出现的miRNA进行下一步的筛选验证，其中19个miRNA，包括miR-146a-5p、miR-148a-3p、miR-24-3p、miR-221-3p、miR-28-3p、miR-652-3p、miR-532-5p、miR-223-5p、miR-148b-3p、miR-143-3p、miR-361-3p、miR-199a-3p、miR-7-5p、miR-382-5p、miR-27b-3p、miR-222-3p、miR-425-5p、miR-152-3p、miR-4326下调，miR-378d表达上调。
我们对这20个差异miRNA进行荧光定量PCR检测验证。在其他RVO病患的外周血样品中随机提取20个RVO疾病组患者和20个对照组血浆外泌体总RNA，对上述20个miRNA进行定量验证。患者病例基本资料如表2所示，二组基本资料无差异(t检验，p＝0.5518)。结果显示，20个miRNA的定量PCR验证结果与测序结果趋势一致，且具有显著差异(图3)，能够很好的区分白内障和RVO患者，可作为RVO诊断潜在的生物标志物。
表2入组病人基本资料
上述研究表明，循环血外泌体miR-378d、miR-146a-5p、miR-148a-3p、miR-24-3p、miR-221-3p、miR-28-3p、miR-652-3p、miR-532-5p、miR-223-5p、miR-148b-3p、miR-143-3p、miR-361-3p、miR-199a-3p、miR-7-5p、miR-382-5p、miR-27b-3p、miR-222-3p、miR-425-5p、miR-152-3p、miR-4326中的单个或多个miRNA组合，可作为RVO生物标志物。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 循环血外泌体miRNA作为视网膜静脉阻塞疾病诊断标志物中的应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uggaagacua gugauuuugu uguu 24
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aauggcgcca cuaggguugu g 21
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caugccuuga guguaggacc gu 22
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaugacacga ucacucccgu uga 23
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaguuguuc gugguggauu cg 22
<210> 6
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acuggacuug gagucagaaa 20
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
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<400> 7
ucccccaggu gugauucuga uuu 23
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<211> 22
<212> RNA
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cacuagauug ugagcuccug ga 22
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<211> 21
<212> RNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agcuacauug ucugcugggu uuc 23
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<400> 14
acaguagucu gcacauuggu ua 22
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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<211> 22
<212> RNA
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ucagugcacu acagaacuuu gu 22
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<211> 22
<212> RNA
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<400> 17
ucagugcauc acagaacuuu gu 22
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<211> 22
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<400> 18
ugagaacuga auuccauggg uu 22
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ugagaugaag cacuguagcu c 21
<210> 20
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
uguuccucug ucucccagac 20
Claims (4)
1.检测循环血外泌体miRNA表达水平的试剂用于制备视网膜静脉阻塞诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述miRNA标记物包括：
miR-378d、miR-146a-5p、miR-148a-3p、miR-24-3p、miR-221-3p、miR-28-3p、miR-652-3p、miR-532-5p、miR-223-5p、miR-148b-3p、miR-143-3p、miR-361-3p、miR-199a-3p、miR-7-5p、miR-382-5p、miR-27b-3p、miR-222-3p、miR-425-5p、miR-152-3p、miR-4326中的一个或者至少2个组合。
2.根据权利要求1所述检测循环血外泌体miRNA表达水平的试剂用于制备视网膜静脉阻塞诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述视网膜静脉阻塞包括视网膜中央静脉阻塞和视网膜分支静脉阻塞。
3.根据权利要求1所述检测循环血外泌体miRNA表达水平的试剂用于制备视网膜静脉阻塞诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒中包含至少一种特异性扩增miR-378d、miR-146a-5p、miR-148a-3p、miR-24-3p、miR-221-3p、miR-28-3p、miR-652-3p、miR-532-5p、miR-223-5p、miR-148b-3p、miR-143-3p、miR-361-3p、miR-199a-3p、miR-7-5p、miR-382-5p、miR-27b-3p、miR-222-3p、miR-425-5p、miR-152-3p、miR-4326的引物。
4.根据权利要求3所述检测循环血外泌体miRNA表达水平的试剂用于制备视网膜静脉阻塞诊断试剂盒中的应用，其特征在于，试剂盒中还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、荧光探针、RNA酶抑制剂和Taq酶。
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