CN112322566A - 牛分枝杆菌弱毒株及其应用 - Google Patents

牛分枝杆菌弱毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种牛分枝杆菌弱毒株及其应用。该弱毒株是利用基因工程手段，对牛分枝杆菌Rv3671c基因进行定点突变，使得该基因功能缺失，得到的重组牛分枝杆菌，或者利用基因工程手段敲除牛分枝杆菌Rv3671c基因得到的重组牛分枝杆菌。该弱毒株可作为动物结核病疫苗的候选株。

Description

牛分枝杆菌弱毒株及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和免疫学领域，具体地说，涉及一种牛分枝杆菌弱毒株及其应用。
背景技术
动物结核病是主要由分枝杆菌复合群的成员—牛分枝杆菌感染所引起的慢性传染性疾病，该菌也可以通过未彻底灭菌的奶及奶制品等感染人，属于人畜共患疾病。对于动物而言，目前尚无有效的动物结核病疫苗。目前世界范围内的牛结核病疫情形势严峻，约有5000万头牛感染了结核病，造成的经济损失每年达30多亿美元，野生动物带菌状况更是无法精确统计，给畜牧业带来巨大经济损失和贸易限制。该病能传染给人，严重威胁人类健康。据调查，2003年结核病患者中约有3.4％是由牛分支杆菌感染引起的，2011年则上升至5.4％，在墨西哥，有38％的结核病患儿是由牛分支杆菌感染引起。因此动物结核病的疫苗及诊断制品的研制、综合防控等的相关研究刻不容缓。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛分枝杆菌弱毒株及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种牛分枝杆菌弱毒株，该弱毒株是利用基因工程手段，对牛分枝杆菌(牛型结核分枝杆菌Mycobacterium bovis)Rv3671c基因进行定点突变，使得该基因功能缺失，得到的重组牛分枝杆菌；或者，
利用基因工程手段敲除牛分枝杆菌Rv3671c基因得到的重组牛分枝杆菌。
牛型结核分枝杆菌Rv3671c基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述弱毒株采用同源重组的方法构建得到。
优选地，所述牛分枝杆菌为Mycobacterium bovis AN5。
第二方面，本发明提供牛分枝杆菌弱毒株(牛结核病疫苗株KO3671)的构建方法，包括：
1、引物设计
针对Rv3671c基因的上下游基因片段，分别设计左臂(LFP/LRP)和右臂(RFP/RRP)引物对，扩增左臂和右臂，其中引物LRP和RFP需包含待敲除基因左端和右端的少许DNA。验证引物(LYZ/RYZ)用于后续PCR验证，在LFP的上游和RRP的下游设计验证引物。
引物序列如下：
左臂引物：
LFP：5'-TTTTTTTTGGCCTAAATGGCCCCTGCAAGCGGGAGCGACC-3'
LRP：5'-TTTTTTTTGGCCTTTCTGGCCCAGCATTGAGCCCAGCGCA-3'
右臂引物：
RFP：5'-TTTTTTTTCCATAGATTGGCAGGTGCTCGGTGTGGTGTTC-3'
RRP：5'-TTTTTTTTCCATCTTTTGGCGAGGCCGCTGGTCATACTG-3'
左、右臂的DNA序列分别如SEQ ID NO:2-3所示。
2、噬菌粒的构建及酶切验证
左、右臂的PCR产物测序验证后进行酶切回收，与酶切、回收的质粒p0004s长片段进行连接，转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆子。将鉴定出阳性克隆子进一步进行酶切，使用Cycle-pure回收。回收片段与质粒phAE159的酶切片段进行连接、包装，获得噬菌粒。
3、构建分枝杆菌噬菌体
取适量构建好的噬菌粒电转感受态耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatismc2155，铺板，培养2-3后观察噬菌斑的形成。筛选空斑，制备高滴度的噬菌体裂解液。
4、噬菌体感染牛分枝杆菌获得基因敲除菌株
用高滴度噬菌体感染牛分枝杆菌Mycobacterium bovis AN5后，涂布7H10固体平板(含75μg/ml HygB)，37℃培养4周后，挑取单克隆接种至7H9液体培养基，37℃培养3-4周后，提取基因组，进行PCR验证。
验证引物序列如下：
LYZ：5'-GTTAGCGGCTTGAAGAGGA-3'
RYZ：5'-AACGGCATCCGATTCCAC-3'
第三方面，本发明提供一种组合物，其包含所述牛分枝杆菌弱毒株或灭活后的毒株，以及药学上可接受的载体。
第四方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含上述组合物。
第五方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含上述免疫原性组合物。
第六方面，本发明提供一种结核疫苗，其有效成分为所述牛分枝杆菌弱毒株。
第七方面，本发明提供一种抗结核药物，其有效成分包括以所述牛分枝杆菌弱毒株作为免疫原，免疫实验动物，制备的多克隆抗体；或者，
以所述牛分枝杆菌弱毒株作为免疫原，免疫实验动物，采用杂交瘤技术制备的单克隆抗体。
第八方面，本发明提供所述牛分枝杆菌弱毒株或所述组合物或所述免疫原性组合物或所述疫苗组合物的以下任一应用：
1)用于制备治疗或预防牛分枝杆菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品；
2)用于制备结核检测试剂或试剂盒。
所述生物制品包括牛结核疫苗或抗结核药物。
本发明提供的牛分枝杆菌弱毒株是利用基因工程手段敲除牛分枝杆菌Rv3671c基因得到的重组牛分枝杆菌。该弱毒株可作为动物结核病疫苗的候选株，且可以实现感染与免疫的鉴别诊断，弥补动物结核病尚无有效疫苗候选株的空白。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中结核分枝杆菌分泌蛋白质芯片检测结果。
图2为本发明较佳实施例中MarP纯化及MS/MS鉴定结果。
图3为本发明较佳实施例中Western blot检测针对MarP的单克隆抗体与重组及天然MarP蛋白的反应性；其中，泳道M:蛋白分子量标准；泳道1-5：细胞株1G5、4D7、8G2、9A4、10H4的细胞上清分别为一抗，与纯化的MarP蛋白反应性；泳道6：MarP免疫小鼠血清为一抗与纯化的MarP蛋白反应性；泳道7：DMEM为一抗与纯化的MarP蛋白反应性；泳道8：9A4单抗与M.bovis 68001总蛋白的反应性；泳道9：9A4单抗与耻垢分枝杆菌mc2155总蛋白的反应性；泳道10：9A4单抗与大肠杆菌总蛋白的反应性；泳道11：9A4单抗与重组表达的MarP的反应性。
图4为本发明较佳实施例中菌株的PCR鉴定结果；其中，泳道M：DL2000 plus分子量标准；泳道1-6：扩增牛分枝杆菌特异性基因Rv3873，分别为KO3671菌株、野生型M.bovisAN5菌株、pMV3671表达菌株、COMP3671回补菌株、H37Rv菌株和空白对照；泳道7-12：扩增Rv3671c基因片段，分别为KO3671菌株、野生型M.bovis AN5菌株、pMV3671表达菌株、COMP3671回补菌株、H37Rv菌株和空白对照。
图5为本发明较佳实施例中菌株的western blot鉴定结果；其中，泳道M：蛋白分子量标准；泳道1-5：以抗MarP单克隆抗体9A4为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG为二抗，样品分别为回补菌株、回补菌株、pMV3671表达菌株、KO3671菌株和野生型M.bovis AN5菌株。
图6为本发明较佳实施例中KO3671、COMP3671、pMV3671和AN5菌株的胞内活菌数。
图7为本发明较佳实施例中小鼠感染不同菌株后的肺、脾系数比以及组织载菌量情况。
图8为本发明较佳实施例中不同菌株感染小鼠的左肺HE染色及抗酸染色结果(400×)。
图9为本发明较佳实施例中小鼠体重及脏器比。
图10为本发明较佳实施例中小鼠脾肺载菌量情况。
图11为本发明较佳实施例中小鼠的左肺HE染色及抗酸染色结果(400×)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的牛型结核菌素(PPD-B)和提纯禽型结核菌素(PPD-A)购自哈药六厂。重组蛋白CFP-10/ESAT-6、CFP-10、ESAT-6由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所结核病和宠物疫病诊断实验室制备，已在文献(Xin T,Jia H,Ding J,Li P,Yang H,Hou S,Yuan W,Guo X,Wang H,Liang Q,Li M,Wang B,Zhu H.2013.Assessment of a proteincocktail-based skin test for bovine tuberculosis in a double-blind field testin cattle.Clin Vaccine Immunol 20:482-90)中公开。
实施例1临床样本的检测及采集
1、结核菌素皮试试验
根据《牛结核病诊断标准》(GB/T 18645-2002)进行结核菌素皮试试验。在牛颈部上1/3处剃毛，皮内注射提纯牛型结核菌素(PPD-B，250IU/头份)0.1mL。分别于注射前和注射后72h由同一操作人员用游标卡尺测量注射部位皮肤厚度，计算皮厚差。当皮厚差大于或等于4mm时，该牛为结核病阳性；当皮厚差小于2mm时，则判定为结核病阴性；当皮厚差介于2-4mm之间时，判定为可疑，需在第一次检测结束后的60天再进行皮试试验，若第二次检测皮厚差大于或等于2mm，则判定为结核病阳性。
2、基于CFP-10/ESAT-6/TB10.4的皮试试验，参见Ting Xin,Hong Jia,JiaboDing,Pingjun Li,Hongjun Yang,Shaohua Hou,Weifeng Yuana Xiaoyu Guo,HaichunWang,Qianqian Liang,Ming Li,Bin Wang,Hongfei Zhu,Assessment of a ProteinCocktail-Based Skin Test for Bovine Tuberculosis in a Double-Blind FieldTest,Frontiers in Veterinary Science,2013,Jan，20(4):482-490.doi:10.1128/CVI.00592-12。
在牛颈部上1/3处剃毛，皮内注射重组蛋白CFP-10/ESAT-6/TB10.4(重组蛋白的浓度为0.5mg/ml，CFP-10、ESAT-6和TB10.4之间比例为1:1:1)0.1mL。分别于注射前和注射后72h由同一操作人员用游标卡尺测量注射部位皮肤厚度，计算皮厚差。当皮厚差大于或等于2mm时，该牛为结核病阳性；当皮厚差小于2mm时，则判定为结核病阴性。
3、γ-干扰素释放试验
采集肝素锂抗凝血10ml，16h内室温(22±4℃)运送到实验室，首先将抗凝血加入到24孔组织培养板，1.5ml/孔，各孔分别无菌加入提纯牛型结核菌素(PPD-B)、提纯禽型结核菌素(PPD-A)、PBS各100μl，震荡混匀后37℃CO2培养箱中孵育20-24h。小心吸取200μl的上层血浆，转入1.5ml离心管中备用(血浆可在2～8℃贮存7天，-20℃可贮存几个月)，按照牛IFN-γ检测试剂盒(购自Prionics公司)说明书进行操作，PPD-B、PPD-A和PBS刺激样品的OD450nm值分别记作OD450nm(PPD-B)、OD450nm(PPD--A)、OD450nm(PBS)，当OD450nm(PPD-B)－OD450nm(PPD--A)≥0.1且OD450nm(PPD-B)－OD450nm(PBS)≥0.1时，判定为牛结核病阳性，当OD450nm(PPD-B)－OD450nm(PPD--A)＜0.1或OD450nm(PPD-B)－OD450nm(PBS)＜0.1时，判定为牛结核病阴性。
4、基于CFP-10/ESAT-6的γ-干扰素释放试验
采集肝素锂抗凝血10ml，16h内室温(22±4℃)运送到实验室，首先将抗凝血加入到24孔组织培养板，1.5ml/孔，各孔分别无菌加入重组蛋白CFP-10/ESAT-6(简写CE)20μg/ml，内毒素＜10EU/mg)、PBS各100μl，震荡混匀后37℃CO2培养箱中孵育20-24h。小心吸取200μl的上层血浆，转入1.5ml离心管中备用(血浆可在2-8℃贮存7天，-20℃可贮存几个月)，按照牛IFN-γ检测试剂盒(购自Prionics公司)说明书进行操作，CFP-10/ESAT-6和PBS刺激样品的OD450nm值分别记作OD450nm(CE)、OD450nm(PBS)，当OD450nm(CE)－OD450nm(PBS)≥0.1时，判定为牛结核病阳性，当OD450nm(CE)－OD450nm(PBS)＜0.1时，判定为牛结核病阴性。
5、鼻拭子分泌物的巢氏PCR检测
将无菌管中放入2-4ml无菌PBS，用植绒拭子伸入牛鼻腔内部，转动5-8圈，立即放于无菌管中，将拭子头浸入PBS中，折断拭子头，旋紧盖子，低温保存。4℃13000r/min离心15min，弃去上清，用细菌基因组提取试剂盒(购自TAKARA公司)提取基因组，冻存于-20℃备用。以提取的基因组DNA为模板，用M70F和M70R扩增结核分枝杆菌复合群mpb70基因的特异性目的序列(372bp)，反应体系：DDW 19μL(DDW为超纯水)，2×PCR Mix 25μL，M70F(10μM)2μL，M70R(10μM)2μL，基因组DNA模板2μL。
PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min。分别取1μL的PCR产物作为第二轮PCR反应的模板。50μL PCR反应体系：DDW 20μL，2×PCR Mix 25μL，M22F(10μM)2μL，M22R(10μM)2μL，PCR产物模板1μL。第二轮PCR采用touch down循环参数扩增。
引物信息见表1。
表1巢氏PCR引物名称、序列及扩增产物大小
Figure BDA0002783753770000061
6、利用上述步骤1-4的方法进行检测，筛选结核病阳性牛和结核病阴性牛，利用上述步骤5方法将结核病牛分为PCR阳性牛和PCR阴性牛。临床样品分组情况见表2。
表2临床样品分组
Figure BDA0002783753770000062
7、样品采集及制备
无菌采集牛的静脉血10ml，注入促进采血管，5000r/min离心20min后，小心吸取上层血清，分装于1.5ml离心管中，冻存于备用-80℃。
实施例2目标基因的筛选
利用包含结核分枝杆菌231个分泌蛋白质的芯片，以小鼠抗牛IgG单克隆抗体(BG-18株)为一抗，以Cy3标记羊抗鼠IgG多抗为二抗，分别检测结核病牛PCR阳性(bTB PCR-P，20份血清)、结核病牛PCR阴性(bTB PCR-N，20份血清)以及结核病阴性牛(NC，20份血清)中针对各分泌蛋白的IgG抗体水平，研究发现，bTB PCR-N组血清中针对Rv3671c蛋白的抗体水平显著低于bTB PCR-P组，表明该基因及其产物在牛分枝杆菌的潜伏感染中可能起重要作用(图1)。
实施例3 Rv3671c基因包浆区的表达及其单克隆抗体的制备
以M.bovis AN5基因组为模板，pET-32a(+)为载体，克隆Rv3671c的胞浆区142-397aa，重组表达MarP，通过亲和层析、MarP的自酶切去除载体标签蛋白Trx-His、分子筛和离子交换层析，成功获得大小约为25kDa的MarP蛋白，SDS-PAGE检测其纯度大于90％(图2，A)，BCA蛋白定量检测，其浓度大于1mg/ml，MS/MS鉴定发现，MarP的自剪切主要位于159位精氨酸(R)和160位亮氨酸(L)之间(图2，B和C)。
用高纯度MarP蛋白免疫小鼠，取脾细胞进行融合，共获得5株能够稳定分泌抗MarP抗体的杂交瘤细胞株，Western blot检测发现，5株单抗均能够特异性地识别重组MarP蛋白。提取耻垢分枝杆菌mc2155、M.bovis 68001以及大肠杆菌的总蛋白进行Western blot检测，结果显示9A4的单克隆抗体能够特异性识别M.bovis 68001的MarP，而不与耻垢分枝杆菌mc2155、大肠杆菌的菌体蛋白发生交叉反应，且其目的条带与Rv3671c全长的表达产物(含有跨膜区和包浆区MarP)大小相符(42KDa)(图3)。
实施例4牛分枝杆菌KO3671菌株、过表达株以及回补株的构建及鉴定
构建同源交换位点，随后将其整合到分枝杆菌噬菌体基因组，获得噬菌粒；将噬菌粒导入耻垢分枝杆菌，获得整合有同源交换位点的重组噬菌体，经体外扩增获得高滴度的重组噬菌体，对M.bovis AN5进行转染；将转染后的菌涂布到潮霉素抗性的固体培养基，37℃培养4-5周，挑取单克隆进行扩培。对扩培菌液分别进行PCR和Western blot鉴定，结果表明Rv3671c基因成功敲除(图4和图5)。将其命名为M.bovis AN5 KO3671(牛结核病疫苗株KO3671)。
构建pMV261-Rv3671c重组质粒，将其分别电转化至M.bovis AN5和M.bovisAN5KO3671菌株的感受态细胞，挑取单克隆，测序鉴定后，成功获得过表达菌株pMV3671和回补菌株COMP3671(图4)，提取菌体总蛋白，以单克隆抗体9A4检测MarP蛋白的表达情况，结果显示，成功构建Rv3671c基因的敲除、过表达以及回补菌株(图5)。
实施例5牛分枝杆菌KO3671菌株在RAW264.7细胞中的存活
将培养至早期对数期的野生型M.bovis AN5、Rv3671c基因敲除菌株KO3671、过表达菌株pMV3671、回补菌株COMP3671离心收集菌体，用PBS洗涤2次去除培养基，DMEM培养基稀释菌液，以MOI＝10分别感染RAW264.7和IFN-γ刺激16h的RAW264.7细胞。在感染4h后，弃上清，用PBS轻柔洗涤2-3次，加入含2％血清的2mL DMEM培养液分别培养48h、96h和144h，每个时间段做三个重复，每48小时更换一次培养液。培养至相应的时间后弃上清，用PBS洗涤2-3次，加入灭菌TritonX-100 0.1％吹打细胞，充***解细胞，将裂解液梯度稀释后检测CFU。结果显示，在相近的感染剂量下，KO3671菌株在细胞内的存活数最低，其次是COMP3671、pMV3671，而野生型的AN5的存活数最高；AN5在无IFN-γ激活的巨噬细胞内存活数高于IFN-γ激活的细胞，而pMV3671菌株在IFN-γ激活的巨噬细胞内的存活数略高于未刺激的细胞；COMP3671菌株在巨噬细胞内的活菌数略高于KO3671菌株(图6)。
实施例6 KO3671菌株、过表达菌株以及回补菌株对小鼠致病力研究
将60只6-8周龄的balb/c小鼠随机分为5组，即野生型菌株感染对照组(AN5)、KO3671感染组、pMV3671感染组、COMP3671感染组和健康对照组，每组12只小鼠。将培养至早期对数期的野生型M.bovis AN5菌株、Rv3671c基因敲除菌株KO3671、过表达菌株pMV3671、回补菌株COMP3671离心，收集菌体，用PBS洗涤2次以去除培养基，用PBS分别稀释菌液至浓度为5×106个菌/ml。经尾静脉接种小鼠，每只注射0.1ml，健康对照组接种无菌PBS。每组取6只小鼠，分别于感染后4w和8w，采血致死并剖检。准确称量每只小鼠的体重、肺脏和脾脏重量，左肺用于病理检测，右肺和全脾用1ml DMEM培养基匀浆后，用于CFU测定。
结果显示M.bovis AN5对小鼠的致病力最强，感染小鼠的脾、肺载菌量显著高于同期的KO3671、pMV3671和COMP3671感染小鼠。pMV3671和COMP3671菌株对小鼠具有一定的致病力，但是其感染后的脾、肺载菌量均显著低于M.bovis AN5感染组(图7)。M.bovis AN5、pMV3671和COMP3671感染小鼠后，左肺的病理检测结果显示，血管、支气管周围淋巴细胞浸润，可见上皮样结节形成，抗酸染色阳性。值得关注的是，KO3671的对小鼠的致病力非常弱，静脉注射感染小鼠8w后，其体重、脾和肺的系数比与健康对照组相当，感染小鼠肺脏无病变、抗酸染色呈阴性(图8)，且小鼠感染KO3671菌株4w时，脾、肺载菌量均低于104个菌，感染8w后，肺部载菌量低于检测限(5个菌/肺，图7)。
实施例7 KO3671株的免疫-攻毒保护研究
将36只6-8周龄的balb/c小鼠随机分为6组，每组6只小鼠，即KO3671免疫组、KO3671免疫-攻毒组、BCG免疫组、BCG免疫-攻毒组、健康对照组、M.bovis AN5感染组。将培养至对数期的KO3671株和BCG菌株(BCG菌株来源于中国兽医药品监察所)分别以5×106/ml经腹股沟皮下免疫小鼠，每只小鼠注射0.1ml。免疫4周后，用M.bovis AN5毒株经尾静脉进行攻毒，感染剂量为5×106/ml，每只注射0.1ml，同时设立感染对照组和健康对照组。于感染后6周，采血致死并剖检。准确称量每只小鼠的体重、肺脏和脾脏重量，左肺用于病理检测，右肺和全脾用1ml DMEM培养基匀浆后，用于CFU测定。
结果显示不同菌株感染或免疫小鼠后，其体重没有显著差异，M.bovis AN5感染小鼠的脾肺系数比显著高于其他组。KO3671免疫-攻毒小鼠和BCG免疫-攻毒小鼠的脾肺系数比相近，肺系数比与健康对照组和KO3671、BCG免疫组相当；脾系数比低于M.bovis AN5感染小鼠，显著高于健康对照组和KO3671、BCG免疫组。表明KO3671免疫后，不影响小鼠增重，且其对脾肺系数比影响与BCG相当(图9)。
BCG和KO3671免疫组的脾、肺载菌量均低于检测限(5个菌/脏器)。在感染M.bovisAN5 6w后，M.bovis AN5感染组的脾、肺载菌量显著高于KO3671免疫-攻毒组和BCG免疫-攻毒组，KO3671免疫-攻毒组和BCG免疫-攻毒组的脾肺载菌量无显著性差异(图10和图11)。结果表明，KO3671免疫小鼠10w后，脾肺的KO3671菌株低于检测限，在免疫4w时，经尾静脉注射M.bovis AN5强毒株，能够产生和BCG相当的免疫保护作用，其肺脾载菌量与BCG免疫-攻毒组相近，较M.bovis AN5降低了1个数量级以上，可以作为牛结核病疫苗的候选菌株。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 牛分枝杆菌弱毒株及其应用
<130> KHP201112319.0
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 397
<212> PRT
<213> 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)
<400> 1
Met Thr Pro Ser Gln Trp Leu Asp Ile Ala Val Leu Ala Val Ala Phe
1 5 10 15
Ile Ala Ala Ile Ser Gly Trp Arg Ala Gly Ala Leu Gly Ser Met Leu
20 25 30
Ser Phe Gly Gly Val Leu Leu Gly Ala Thr Ala Gly Val Leu Leu Ala
35 40 45
Pro His Ile Val Ser Gln Ile Ser Ala Pro Arg Ala Lys Leu Phe Ala
50 55 60
Ala Leu Phe Leu Ile Leu Ala Leu Val Val Val Gly Glu Val Ala Gly
65 70 75 80
Val Val Leu Gly Arg Ala Val Arg Gly Ala Ile Arg Asn Arg Pro Ile
85 90 95
Arg Leu Ile Asp Ser Val Ile Gly Val Gly Val Gln Leu Val Val Val
100 105 110
Leu Thr Ala Ala Trp Leu Leu Ala Met Pro Leu Thr Gln Ser Lys Glu
115 120 125
Gln Pro Glu Leu Ala Ala Ala Val Lys Gly Ser Arg Val Leu Ala Arg
130 135 140
Val Asn Glu Ala Ala Pro Thr Trp Leu Lys Thr Val Pro Lys Arg Leu
145 150 155 160
Ser Ala Leu Leu Asn Thr Ser Gly Leu Pro Ala Val Leu Glu Pro Phe
165 170 175
Ser Arg Thr Pro Val Ile Pro Val Ala Ser Pro Asp Pro Ala Leu Val
180 185 190
Asn Asn Pro Val Val Ala Ala Thr Glu Pro Ser Val Val Lys Ile Arg
195 200 205
Ser Leu Ala Pro Arg Cys Gln Lys Val Leu Glu Gly Thr Gly Phe Val
210 215 220
Ile Ser Pro Asp Arg Val Met Thr Asn Ala His Val Val Ala Gly Ser
225 230 235 240
Asn Asn Val Thr Val Tyr Ala Gly Asp Lys Pro Phe Glu Ala Thr Val
245 250 255
Val Ser Tyr Asp Pro Ser Val Asp Val Ala Ile Leu Ala Val Pro His
260 265 270
Leu Pro Pro Pro Pro Leu Val Phe Ala Ala Glu Pro Ala Lys Thr Gly
275 280 285
Ala Asp Val Val Val Leu Gly Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Phe Thr Ala
290 295 300
Thr Pro Ala Arg Ile Arg Glu Ala Ile Arg Leu Ser Gly Pro Asp Ile
305 310 315 320
Tyr Gly Asp Pro Glu Pro Val Thr Arg Asp Val Tyr Thr Ile Arg Ala
325 330 335
Asp Val Glu Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Asp Leu Asn Gly
340 345 350
Gln Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ala Ala Val Asp Asp Ala Glu Thr
355 360 365
Gly Phe Val Leu Thr Ala Gly Glu Val Ala Gly Gln Leu Ala Lys Ile
370 375 380
Gly Ala Thr Gln Pro Val Gly Thr Gly Ala Cys Val Ser
385 390 395
<210> 2
<211> 903
<212> DNA
<213> 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)
<400> 2
cctgcaagcg ggagcgaccc ccaccggttc acgggggacg gttgccctgc ggcctgatgc 60
cggcccgtcc tggctgcgtc cactggtcga caacgttggc cagatacccg acgcctaccg 120
gcgtcggttg cccgccgatg tgctagcgat ggtgacggcc gccggggctg tgtcggcaat 180
gacatcgtcg cgccgggatc accgcgaggc ggccgttctg gtgctgtttt ctggcccgga 240
ggccgggcca ggcgacggtg gtgtcccaga cgacgccgac ctactgctga ccgtgcgggc 300
ctcgacattg cgccaccatg ccggccaggc ggcttttccc ggcggtgtgg tcgaccccgc 360
cgacgacggg ccggtggcca ccgccttgcg tgaggcgaac gaagaaaccg ggattgaccc 420
gtccaggctg catccgctgg ccaccatgga gcggacgttc attgcgccgt cgcggttcca 480
tgttgtcccg gtgctggcgt actcgccgga tcccgggccg gtggccgtcg tcaacgaggc 540
cgaaacggcg atcgtcgcgc gggtaccggt gcgcgccttc atcaatccgg ccaatcggct 600
catggtgtac cgccgcccgc acactcgtcg ctgggccggg ccggcgttcc tgttaaacca 660
gatgctggta tggggcttca ctggccaggt gatttccgcg gtgctcgatg tcgcgggctg 720
ggcacaaccc tgggacaccg gtgacatccg cgagttggac gcggcaatgg tgctgatcga 780
cgacgagagt gacccgcgat gaattcgatg accccgtcgc agtggctgga tatcgccgtc 840
ttggcggtcg catttattgc agccatctcc ggctggcgtg ccggtgcgct gggctcaatg 900
ctg 903
<210> 3
<211> 957
<212> DNA
<213> 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)
<400> 3
caggtgctcg gtgtggtgtt cggcgcagcc atcgacgacg ccgaaactgg gtttgtgctg 60
acggccggcg aggtggcggg gcagcttgcc aaaatcggtg ctacccaacc ggtcggcacc 120
ggggcctgcg tcagctgagc tggtgcacct gctcgaggaa acgcatcaga tgtcggttga 180
cttcctccgg cgcctcttcg tgactgaaat gtcctgcgcc ggcaatggat atgtaccgcc 240
cgtgtggtgc gtagcgctgg gtgcgctcta ccgggtcggc cagcacgtaa gggtcggcgt 300
cgcctcgtaa gtgcagcagc ggcatcccca gttgctgtgt catcgccctg atgaatcgcc 360
gcccttcgct gcgcagctgg ctgcgcaccg cccagcgctg gtactcgagt gcgcaatgcg 420
ccgccgccgg gatctggatc gcctgtcgaa ggtggtcgat tgcttgcgag aagtcctcgg 480
atgcaagcca tttggcgcag ccacgggcgc gcacgaggcg ctcgatctcc gctgcgttgt 540
tgcgggtcag caagcgctcc ggccagatcg gcagctggta acgcagcaat gtcggtaaca 600
gtgcgtgccg ctgatcacgc cgggtcagcg tggatcgccg tagcgcggcg gggtgcggtg 660
agctgatcag cgctatggcg cgcaccagcc gcgaatgcag cagcgcggtg gtccagcagg 720
ccagtccgcc atcggcgtgg ccgaccagcg tcgccgatgg gtgcccgagc gcacggatga 780
gaccggccgt atcgccggcc agcgtccagc cgtcgtaccc gcggggcggt ttgtcgctgc 840
cgccgtagcc gcgcagatcg accgcgacca cccgcgcccc ggtcaggccg cacaactgat 900
gacgccagga ccaccagaac gagccgaaac catggagcag tatgaccagc ggcctcg 957

Claims (10)

1.牛分枝杆菌弱毒株，其特征在于，该弱毒株是利用基因工程手段，对牛分枝杆菌Rv3671c基因进行定点突变，使得该基因功能缺失，得到的重组牛分枝杆菌；或者，
利用基因工程手段敲除牛分枝杆菌Rv3671c基因得到的重组牛分枝杆菌。
2.根据权利要求1所述的牛分枝杆菌弱毒株，其特征在于，所述弱毒株采用同源重组的方法构建得到。
3.根据权利要求1或2所述的牛分枝杆菌弱毒株，其特征在于，所述牛分枝杆菌为Mycobacterium bovis AN5。
4.一种组合物，其包含权利要求1-3任一项所述牛分枝杆菌弱毒株或灭活后的毒株，以及药学上可接受的载体。
5.一种免疫原性组合物，其包含权利要求4所述的组合物。
6.一种疫苗组合物，其包含权利要求5所述的免疫原性组合物。
7.一种牛结核病疫苗，其有效成分为权利要求1-3任一项所述牛分枝杆菌弱毒株。
8.一种抗结核药物，其有效成分包括以权利要求1-3任一项所述牛分枝杆菌弱毒株作为免疫原，免疫实验动物，制备的多克隆抗体；或者，
以权利要求1-3任一项所述牛分枝杆菌弱毒株作为免疫原，免疫实验动物，采用杂交瘤技术制备的单克隆抗体。
9.权利要求1-3任一项所述牛分枝杆菌弱毒株或权利要求4所述组合物或权利要求5所述免疫原性组合物或权利要求6所述疫苗组合物的以下任一应用：
1)用于制备治疗或预防牛分枝杆菌感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品；
2)用于制备结核检测试剂或试剂盒。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生物制品包括牛结核疫苗或抗结核药物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113884685A (zh) * 2021-10-18 2022-01-04 中国农业大学 牛结核病血清学诊断标志物及其临床应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989009261A1 (en) * 1988-03-31 1989-10-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Or Diagnosis of mycobacterium bovis infection
CN101438166A (zh) * 2006-03-14 2009-05-20 俄勒冈健康科学大学 产生针对结核病的免疫应答的方法
US8951992B2 (en) * 2008-07-18 2015-02-10 Cornell University Mycobacterium membrane protease as a target for inhibitors of intrabacterial pH homeostasis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989009261A1 (en) * 1988-03-31 1989-10-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Or Diagnosis of mycobacterium bovis infection
CN101438166A (zh) * 2006-03-14 2009-05-20 俄勒冈健康科学大学 产生针对结核病的免疫应答的方法
US8951992B2 (en) * 2008-07-18 2015-02-10 Cornell University Mycobacterium membrane protease as a target for inhibitors of intrabacterial pH homeostasis

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D A ENARSON ET AL.: "Non-respiratory tuberculosis in Canada. Epidemiologic and bacteriologic features", 《AM J EPIDEMIOL》 *
HELENE BOTELLA ET AL.: "Mycobacterium tuberculosis protease MarP activates a peptidoglycan hydrolase during acid stress", 《EMBO J》 *
OMAR H VANDAL ET AL.: "A membrane protein preserves intrabacterial pH in intraphagosomal Mycobacterium tuberculosis", 《NAT MED》 *
TAPAN BISWAS ET AL.: "Structural insight into serine protease Rv3671c that protects M. tuberculosis from oxidative and acidic stress", 《STRUCTURE》 *
蒯守刚等: "结核分枝杆菌Rv3671c基因的克隆表达及免疫印迹检测", 《临床检验杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113884685A (zh) * 2021-10-18 2022-01-04 中国农业大学 牛结核病血清学诊断标志物及其临床应用

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