CN112322546B - 一种多粘类芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种多粘类芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种多粘类芽孢杆菌及其应用。本发明所述的多粘类芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20534，其可以用于甜瓜的生物防治，尤其是尖孢镰刀菌甜瓜专化型病菌、黑点根腐病菌、蔓枯病菌、层生镰刀菌、亚洲镰刀菌和链格孢病菌等病菌的防治，同时其还可以用于促进甜瓜的生长。

Description

一种多粘类芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种多粘类芽孢杆菌及其应用。
背景技术
甜瓜(Cucumis melo)是我国重要的经济作物，是传统的夏食水果之一。但是在设施栽培中，甜瓜病害一直是生产上的难题，特别是尖孢镰刀菌甜瓜专化型病菌(Fusariumoxysporum)引起的甜瓜枯萎病、黑点根腐病菌(Monosporascus cannonballus)引起的甜瓜黑点根腐病、蔓枯病菌(Didymalla bryoniae)引起的甜瓜蔓枯病、亚洲镰刀菌(F.asiaticum)引起的甜瓜果腐病、层生镰刀菌(F.proliferatum)引起的甜瓜根茎腐和链格孢菌(Alternaria alternata)引起的甜瓜叶斑病等。
目前对于大棚甜瓜病害的防治，主要依赖于化学防治，但是长期使用农药，病原菌会产生耐药性，而且还会造成环境污染和农药残留等问题。因此，需要一些对环境友好的替代防治措施，而生物防治就是其中之一。
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是一种革兰氏阳性菌，对植物根部有益的一类细菌，对植物的生防和促生都有一定的作用。近年来，关于多粘类芽孢杆菌用于植物生防和促生方面的报道很多，但是同时拮抗甜瓜多种病原菌的多粘类芽孢杆菌较少，因此，筛选能高效抑制甜瓜多种病原菌的多粘类芽孢杆菌是当前甜瓜生物防治的一个重要方向，具有重要的研究意义。
有鉴于此，特提出本发明申请。
发明内容
本发明的目的首先在于提供一种多粘类芽孢杆菌，其可以同时用于甜瓜的生物防治和促生。
本发明所述的多粘类芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20534。
本发明所述的多粘类芽孢杆菌的16S rDNA序列的序列表如SEQ ID NO：1所示。
本发明涉及如上所述的多粘类芽孢杆菌的分离方法，所述分离方法包括：将发病甜瓜的根部切块，置于无菌水中捣碎，稀释、涂平板，挑取单菌落摇培，然后再进行划线纯化。
本发明还涉及如上所述的多粘类芽孢杆菌在甜瓜生物防治方面的应用。
进一步地，在所述在甜瓜生物防治方面的应用中，利用所述的多粘类芽孢杆菌抑制包括尖孢镰刀菌甜瓜专化型病菌、黑点根腐病菌、蔓枯病菌、层生镰刀菌、亚洲镰刀菌和链格孢菌的多种病菌。
进一步地，在所述在甜瓜生物防治方面的应用中，将用所述多粘类芽孢杆菌配制成的悬浮菌液沿着甜瓜幼苗的根部灌入。
本发明还涉及如上所述的多粘类芽孢杆菌在促进甜瓜生长方面的应用。
进一步地，在所述在促进甜瓜生长方面的应用中，将用所述多粘类芽孢杆菌配制成的悬浮菌液沿着甜瓜幼苗的根部灌入。
本发明技术方案和现有技术相比具有如下优点：
1、本发明的多粘类芽孢杆菌NBmelon-1对甜瓜的多种病原菌，例如尖孢镰刀菌甜瓜专化型(F.oxysporum)、黑点根腐病菌(M.cannonballus)、蔓枯病菌(D.bryoniae)、层生镰刀菌(F.proliferatum)、亚洲镰刀菌(F.asiaticum)和链格孢(A.alternata)等，均有抑制作用，在平板上拮抗活性很强，盆栽实验也表明其对甜瓜枯萎病具有良好的生防潜力，可以很好地防治甜瓜枯萎病。
2、本发明的多粘类芽孢杆菌NBmelon-1对甜瓜幼苗的生长具有促进生长的作用，该菌株处理甜瓜幼苗后，甜瓜幼苗的茎粗、叶片大小、鲜重与空白对照组(CK)相比均明显提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明菌株NBmelon-1在NA培养基上的菌落形态图。
图2为本发明菌株NBmelon-1基于16S-rRNA构建的***进化树。
图3为本发明菌株NBmelon-1对甜瓜的不同病原菌进行平板拮抗试验的效果图。
图4为本发明菌株NBmelon-1对甜瓜幼苗的促生试验结果；其中，(a)是实物的促生效果图，(b)是茎粗、鲜重以及最大一片真叶的长和宽的促生效果分析柱状图。
图5为本发明菌株NBmelon-1对甜瓜枯萎病生防试验的实物效果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明涉及一种多粘类芽孢杆菌，其生物样品保藏信息具体如下：
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)菌株NBmelon-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年8月20日，保藏编号为CGMCCNo.20534。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所。
本发明涉及上述的多粘类芽孢杆菌在甜瓜的生物防治方面的应用。
进一步地，该应用具体为：利用所述的多粘类芽孢杆菌抑制尖孢镰刀菌甜瓜专化型病菌、黑点根腐病菌、蔓枯病菌、层生镰刀菌、亚洲镰刀菌和链格孢病菌等多种病菌。
本发明还涉及上述的多粘类芽孢杆菌在促进甜瓜生长方面的应用。
实施例1：多粘类芽孢杆菌NBmelon-1的分离和鉴定
(1)分离
多粘类芽孢杆菌NBmelon-1(也可简称为：拮抗细菌)是从发病的甜瓜根部分离得到的，具体做法为：将发病的甜瓜根部切成小块，放在无菌水中，进行捣碎，然后稀释、涂平板，挑取单菌落摇培，再次进行划线纯化。纯化后采用甘油保存在-70℃的冰箱内。
(2)鉴定
对拮抗细菌的分子鉴定过程包括：采用50μL的PCR反应体系进行16S rDNA的扩增、测序及***发育进化分析。
图1为本发明菌株NBmelon-1在NA培养基上的菌落形态，图2为本发明菌株NBmelon-1基于16S-rRNA构建的***进化树。
拮抗细菌的基因组DNA用全式金细菌基因组试剂盒提取。扩增菌株的16S rDNA，采用细菌通用引物(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行扩增，扩增的PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳法检测，对阳性PCR产物进行纯化、克隆和测序。
拮抗细菌的16S rDNA序列具体参见附件的序列表。
鉴定结果分析如下：
以菌株NBmelon-1的基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到1517bp的扩增产物，经连接、转化、测序后，将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，结果表明其与菌株多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)YC0136(ITS，GenBankAcc.CP017967.3)的同源性最高，为99.54％。
利用MEGA7对测序获得的序列和其他相近的序列进行***发育树的构建，如图2，***发育树结果表明菌株NBmelon-1与菌株聚为一支，所以认为NBmelon-1属于多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)。
实施例2：抑菌效果
通过实验观察菌株NBmelon-1对甜瓜多种病原菌的抑制效果。实验结果证明抑制作用明显有效，具有良好的防治效果。
具体的实验方法如下：
采用平板对峙的方法进行防病拮抗菌株的筛选，在PDA培养基上活化尖孢镰刀菌甜瓜专化型菌、蔓枯病菌、黑点根腐病菌、亚洲镰刀菌、层生镰刀菌和链格孢菌等病原菌，用直5mm的打孔器在新鲜的菌落边缘打孔，挑取新鲜菌丝块接种在距新的PDA平板一端1.5em处，用接种环挑取少量新鲜NBmelon-1菌液于PDA培养基的另一端划线，划线处距PDA端部距离为2em，封口膜封好后置于25℃培养箱中黑暗培养，10d之后统计试验结果，每个菌株3个皿，对照组只接病原菌，不接NBmelon-1。
在对峙培养10d后，如图3，可以看到NBmelon-1对尖孢镰刀菌甜瓜专化型(F.oxysporum)、蔓枯病菌(D.bryoniae)、黑点根腐病菌(M.cannonballus)、层生镰刀菌(F.proliferatum)和链格孢(A.destruens)等病原菌的生长均有抑制作用，在对峙培养过程中，培养皿中均出现了明显的拮抗带，后期对峙的病原菌也无法再生长。
实施例3：甜瓜幼苗的促生试验
在温室大棚中，利用盆栽试验进行拮抗细菌对甜瓜幼苗的促生试验，在甜瓜种子播种第7d和第9d后，用拮抗细菌配置的108cfu/mL悬浮菌液对甜瓜幼苗进行灌根：用移液器将悬浮菌液沿甜瓜幼苗根部灌入，每棵幼苗用1mL菌液处理，共计150棵，同时用NB培养基处理的甜瓜幼苗作为对照。
15d后，完整拔出甜瓜幼苗，每个处理取30棵幼苗，只保留地上部分，参见图4(a)，测量幼苗的茎粗、每颗幼苗中最大一片真叶的长、宽及鲜重，统计并分析数据得到图4(b)所示的结果。
结合图4的实物图和柱状图可知，用NBmelon-1菌悬液处理的甜瓜幼苗，其在茎粗、鲜重及最大一片真叶的长和宽方面都有显著提升，表明NBmelon-1对甜瓜幼苗有促生作用。
实施例4：对甜瓜枯萎病的盆栽生防作用
空白对照：CK组。
处理组：NBmelon-1处理的甜瓜。在甜瓜播种第7d、第9d，用108cfu/mL的NBmelon-1悬浮菌液对甜瓜幼苗进行灌根，每棵幼苗用1 mL菌液处理。每个处理对应1个穴盘，每个穴盘50株，设置3次重复。
甜瓜枯萎病接种：选用的甜瓜品种为对甜瓜枯萎病感病品种，在两叶一心时，以50株幼苗为1组，重复3次，左边一半接种，右边一半不接种。
将幼苗从穴盘中取出，轻度损伤根系，洗净根部，在4×106个/mL的枯萎病菌孢子液中浸根15min，根系全部浸入，中间摇动2次，不接种的在清水中浸根15min。再移栽至营养土中，接种后前3d遮阴，温度保持在25℃，3d缓苗后撤掉遮阳网，在温室正常管理，15d后调查发病情况，统计分析病情指数和相对防治效果。
病情指数＝∑(级数×该级株数)/(总株数×最高级数)×100。
相对防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％。
图5是本发明菌株NBmelon-1对甜瓜枯萎病生防试验的实物效果图，从该图可以看出NBmelon-1处理的甜瓜的枯萎病病情明显优于CK组的甜瓜。
下表是统计分析得到的甜瓜病情指数和防治效果。
表1
组别 病情指数 相对防治效果
NBmelon-1处理 45 52.76％
CK组 95.26 /
用NBmelon-1预处理的甜瓜病情指数为45，而对照组的病情指数为95.26，用NBmelon-1预处理相对防治效果为52.76％，表明NBmelon-1对甜瓜枯萎病具有一定的生防作用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 宁波市农业科学研究院
<120> 一种多粘类芽孢杆菌及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1517
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 1
agagtttgat catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
ggggttattt agaagcttgc ttctaaataa cctagcggcg gacgggtgag taacacgtag 120
gcaacctgcc cacaagacag ggataactac cggaaacggt agctaatacc cgatacatcc 180
ttttcctgca tgggcgaagg aggaaagacg gagcaatctg tcacttgtgg atgggcctgc 240
ggcgcattag ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 300
agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 360
tagggaatct tccgcaatgg gcgaaagcct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 420
ttttcggatc gtaaagctct gttgccaggg aagaacgtct tgtagagtaa ctgctacaag 480
agtgacggta cctgagaaga aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 540
tagggggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gctctttaag 600
tctggtgttt aatcccgagg ctcaacttcg ggtcgcactg gaaactgggg agcttgagtg 660
cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca 720
ccagtggcga aggcgactct ctgggctgta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag 780
caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttaggg 840
gtttcgatac ccttggtgcc gaagttaaca cattaagcat tccgcctggg gagtacggtc 900
gcaagactga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcagtggag tatgtggttt 960
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat ccctctgacc ggtctagaga 1020
tagatctttc cttcgggaca gaggagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tgcttagttg ccagcaggtc 1140
aagctgggca ctctaagcag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1200
aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtacta caatggccgg tacaacggga 1260
agcgaagccg cgaggtggag ccaatcctag aaaagccggt ctcagttcgg attgtaggct 1320
gcaactcgcc tacatgaagt cggaattgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa 1380
tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttaca acacccgaag 1440
tcggtggggt aacccgcaag ggagccagcc gccgaaggtg gggtagatga ttggggtgaa 1500
gtcgtaacaa ggtaacc 1517

Claims (5)

1.一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 20534。
2.如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌在甜瓜生物防治方面的应用，其特征在于，利用所述的多粘类芽孢杆菌抑制尖孢镰刀菌甜瓜专化型病菌、黑点根腐病菌、蔓枯病菌、层生镰刀菌、亚洲镰刀菌或链格孢病菌。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将用所述多粘类芽孢杆菌配制成的悬浮菌液沿着甜瓜幼苗的根部灌入。
4.如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌在促进甜瓜生长方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将用所述多粘类芽孢杆菌配制成的悬浮菌液沿着甜瓜幼苗的根部灌入。
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