CN112316156B - 具抗氧化和抗菌性的胶原蛋白修复膜、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具抗氧化和抗菌性的胶原蛋白修复膜、其制备方法及应用,该胶原蛋白修复膜是由胶原蛋白与儿茶醛、氨基糖苷类抗生素进行席夫碱反应形成。本发明胶原蛋白修复膜中,儿茶醛和氨基糖苷两者协同加和,产生了远优于两者本身的抗氧化和抗菌效果。本发明的胶原蛋白复合修复膜可以更加迅速地清除过量的活性氧,并且能够更好的抑制细菌的生长;而且由于胶原蛋白的引入,其具有良好的生物相容性和体内可降解性。并且经过动物试验验证,该复合修复膜可促进口腔创伤愈合。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域,具体涉及具抗氧化和抗菌性的胶原蛋白修复膜、其制备方法及应用。
背景技术
口腔创伤溃疡一直是医院临床上的常见问题,此类口腔疾病不仅会引起血肿、水肿等不适,还会造成口腔感染,进而影响身心健康。近年来,人们普遍认为,调节活性氧(ROS)和抑菌生长是解决这一问题的关键。尽管人们为了解决这一问题做出了很大的努力,例如:抗氧化水凝胶和抗菌薄膜的制备等,但是仍然存在创伤再感染、不能同时兼顾抗氧化和抗菌性等潜在问题。因此,开发具有协同作用的抗氧化和抗菌材料薄膜,更加优异的清除ROS,迅速抑制细菌生长已被认为是解决口腔创伤的可行策略。
胶原蛋白是动物体最常见的蛋白质,常常提取来自牛,猪,鱼等动物的皮和骨,具有良好的成膜性。同时胶原蛋白也是临床生物医学中应用最广泛的一类蛋白质,具有良好的生物相容性,已经被广泛的应用在皮肤伤口愈合、生物支架、组织工程等领域,其在生物医用领域前景广阔,具有很大的社会应用价值。
儿茶醛作为一种同时具有醛基和酚羟基的茶多酚化学物质,具有抗氧化、抗菌、抗紫外线辐射、抗衰老等功效。儿茶醛等茶多酚常常来自于茶叶,其是一类天然的、安全的、稳定的抗氧化剂和抗菌剂。由于酚羟基的存在,其不仅具有较好的ROS清除能力,而且能够杀死大量细菌,达到同时杀菌和抗氧化的效果。
氨基糖苷类抗生素的分子结构都有多个胺基和一个或多个氨基糖环分子,并由化学键连接成苷而得名。氨基糖苷作为一种抗菌药,可以作用于细菌,破坏细胞膜的形成,抑制细菌的繁衍,预防身体的感染,具有很强的特异性和光谱性杀菌作用。
发明内容
本发明目的是提供具抗氧化和抗菌性的胶原蛋白修复膜、其制备方法及应用。
本发明提供的具抗氧化和抗菌性的胶原蛋白修复膜,其由胶原蛋白与儿茶醛、氨基糖苷类抗生素进行席夫碱反应形成。
进一步的,氨基糖苷类抗生素为妥布霉素、硫酸新霉素、硫酸庆大霉素、硫酸帕罗霉素、硫酸核糖霉素、硫酸奈替米星中的一种或多种。
本发明还提供了上述胶原蛋白修复膜的一种制备方法,包括步骤:
(1)将1-100质量份的胶原蛋白溶解酸溶液,常温搅拌直至完全溶解;
(2)加入1-100质量份的氨基糖苷类抗生素,常温搅拌分散;
(3)加入1-100质量份的儿茶醛,常温搅拌以进行反应,直至反应结束;
(4)对步骤(3)所得溶液进行透析、冷冻、成膜。
本发明还提供了上述胶原蛋白修复膜的另一种制备方法,包括步骤:
(1)将1-100质量份的胶原蛋白溶解酸溶液,常温搅拌直至完全溶解;
(2)将1-100质量份的氨基糖苷类抗生素溶解于水中;
(3)将1-100质量份的儿茶醛溶解于水中;
(4)将步骤(1)-(3)所制备溶液混合,常温搅拌以进行反应,直至反应结束;
(5)对步骤(4)所得溶液进行透析、冷冻、成膜。
进一步的,步骤(1)中的酸溶液为醋酸或稀盐酸,优选为醋酸。
进一步的,胶原蛋白来自动物组织。
作为优选,胶原蛋白的用量60质量份,氨基糖苷类抗生素用量20质量份,儿茶醛用量20质量份。
进一步的,成膜温度为35℃-37℃,成膜时间为20h-24h。
本发明所提供胶原蛋白修复膜同时具备优异的抗氧化性和抗菌性,可达到快速修复口腔创伤的目的,因此可用作口腔创伤敷料膜。
本发明将胶原蛋白与儿茶醛、氨基糖苷进行席夫碱反应,形成新型的胶原蛋白复合修复膜。在该复合修复膜中,儿茶醛的大量酚羟基本身就能产生抗菌效果,又能够促进氨基糖苷的抗菌作用;反过来,氨基糖苷的结合使儿茶醛结构更加不规整,从而改变了分子结构的相互作用,使得儿茶醛更多的酚羟基暴露出来,从而进一步促进抗氧化、抗菌性。儿茶醛和氨基糖苷两者协同加和,产生了远优于两者本身的抗氧化和抗菌效果。
和现有技术相比,本发明具有如下特点和有益效果:
本发明胶原蛋白复合修复膜可以更加迅速地清除过量的活性氧,并且能够更好的抑制细菌的生长;而且由于胶原蛋白的引入,其具有良好的生物相容性和体内可降解性。并且经过动物试验验证了,该复合修复膜可达到促进口腔创伤愈合的目的,能满足临床需要。
附图说明
图1为实施例1-4所制备水凝胶材料的DPPH自由基清除能力曲线图;
图2为实施例1-4所制备水凝胶材料的葡萄球菌清除直观图,其中,图(a)-(d)分别为实施例1-4所制备水凝胶材料的细菌清除直观图;
图3为实施例1-4所制备水凝胶材料的大肠杆菌清除直观图,其中,图(a)-(d)分别为实施例1-4所制备水凝胶材料的细菌清除直观图;
图4为实施例1-4所制备水凝胶材料的细菌存活率柱状图;
图5为实施例6中显微镜下的活细胞荧光染色图,其中,图(a)-(d)分别为实施例1-4所制备水凝胶材料对应的活细胞荧光染色图;
图6为实施例6中显微镜下的死细胞荧光染色图,其中,图(a)-(d)分别为实施例1-4所制备水凝胶材料对应的死细胞荧光染色图;
图7为实施例6中显微镜下的活死细胞荧光染色图,其中,图(a)-(d)分别为实施例1-4所制备水凝胶材料对应的活死细胞荧光染色图;
图8为实施例1-4所制备水凝胶材料的细胞存活率示意图。
图9为实施例1-4所制备水凝胶材料的动物伤口愈合面积曲线图。
具体实施方式
以下将结合实施例来进一步说明本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式,并不对本发明保护范围做任何形式的限定。除非特别说明,实施例中所采用的试剂、方法和设备均为本技术领域的常规试剂、方法和设备。除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
需要说明的是,下述实施例中抗生素氨基糖苷均采用妥布霉素。
实施例1
胶原蛋白溶解于醋酸溶液,过夜常温搅拌,直到完全溶解。然后置于冷冻机冻干2天制备冻干海绵。最后用有机玻璃框模具将冻干海绵碾压成膜,获得厚度1mm的水凝胶材料,装袋密封。经检测,本实施例水凝胶材料对自由基的清除基本上没有作用。
实施例2
将80质量份的胶原蛋白溶解于醋酸溶液,过夜常温搅拌,直到完全溶解。将20质量份儿茶醛加入到上述溶液,常温搅拌24小时,直到反应完全。将上述溶液置于透析袋(分子量(MW)截止值14000,)中,用去离子水搅拌一周,之后放在冷冻机冻干2天制备冻干海绵。最后用有机玻璃框模具将冻干海绵碾压成膜,获得厚度1mm的水凝胶材料,装袋密封。经检测,本实施例水凝胶材料对自由基的清除率为55%。
实施例3
将80质量份的胶原蛋白溶解于醋酸溶液,过夜常温搅拌,直到完全溶解。将20质量份占抗生素氨基糖苷加入到上述溶液,搅拌至分散均匀。将上述溶液置于透析袋(分子量(MW)截止值14000,)中,用去离子水搅拌一周,之后放在冷冻机冻干2天制备冻干海绵。最后用有机玻璃框模具将冻干海绵碾压成膜,获得厚度1mm的水凝胶材料,装袋密封。经检测,本实施例水凝胶材料对自由基的清除率为35%。
实施例4
将60质量份的胶原蛋白溶解于醋酸溶液,过夜常温搅拌,直到完全溶解。将20质量份抗生素氨基糖苷加入到上述溶液,搅拌至分散均匀。再将20质量份儿茶醛加入到上述溶液,常温搅拌24小时。将上述溶液置于透析袋(分子量(MW)截止值14000,)中,用去离子水搅拌一周,之后放在冷冻机冻干2天制备冻干海绵。最后用有机玻璃框模具将冻干海绵碾压成膜,获得厚度1mm的水凝胶材料,装袋密封。经检测,本实施例水凝胶材料对自由基的清除率为80%。
使用2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)方法评定实施例1-4所制备水凝胶材料的DPPH自由基清除效果,检测结果见图1,从图中可以看出,胶原蛋白、儿茶醛复合的水凝胶材料、以及胶原蛋白、抗生素氨基糖苷复合的水凝胶材料均具有自由基清除能力,但胶原蛋白、儿茶醛、抗生素氨基糖苷三者复合的水凝胶材料明显具有更优异的自由基清除能力,见实施例4曲线。相对于胶原蛋白、儿茶醛复合的水凝胶材料,本发明三者复合的水凝胶材料,其自由基清除能力提高了约45%;相对于胶原蛋白、抗生素氨基糖苷复合的水凝胶材料,本发明三者复合的水凝胶材料,其自由基清除能力提高了约130%。因此,本发明三者复合的水凝胶材料产生了显著的技术效果。
实施例5
分别用实施例1-4所制备水凝胶材料对金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)和大肠杆菌(ATCC8739)进行抗菌活性测定。具体来说,将水凝胶材料制备成48孔微孔板。将10mL无菌PBS中的细菌悬浮液添加到48孔培养板的每个膜材料表面上。将接种的膜材料在37℃下孵育2小时,微孔板内部的相对湿度不小于90%。在该时间结束时,将1mL无菌PBS加到每个孔中,以重新悬浮任何细菌幸存者。将悬浮于1mL PBS中的10mL细菌悬浮液用作阴性对照。在37℃下孵育24小时后,计数琼脂平板上的菌落形成单位。每组至少测试三个样品,结果表示为细菌存活率%:细菌存活率%=实验组存活细菌数/对照组细菌数100%。
实施例1-4所制备水凝胶材料对金黄色葡萄球菌清除效果的显微镜直观图见图2,对大肠杆菌清除效果的显微镜直观图见图3。从图2-3中可以看出,胶原蛋白水凝胶材料几乎无细菌清除能力,胶原蛋白、儿茶醛复合的水凝胶材料、以及胶原蛋白、抗生素氨基糖苷复合的水凝胶材料均具有优异的细菌清除能力,但显然本发明胶原蛋白、儿茶醛、抗生素氨基糖苷三者复合的水凝胶材料清除细菌效果更显著,几乎可以完全清除细菌。
本实施例所测水凝胶材料的细菌存活率见图4,该图所显示结果同图2-3一致。胶原蛋白、儿茶醛复合的水凝胶材料对应的细菌存活率约50%,胶原蛋白、抗生素氨基糖苷复合的水凝胶材料对应的细菌存活率约20%,本发明胶原蛋白、儿茶醛、抗生素氨基糖苷三者复合的水凝胶材料对应的细菌存活率几乎为0。
实施例6
分别以实施例1-4所制备水凝胶材料为培养载体,将成纤维细胞悬浮进行表面接种在该膜材料上。
(1)将成纤维细胞接种在培养瓶中,培养至细胞覆盖达80%~90%时,用含0.125%EDTA的0.25%胰蛋白酶对其进行消化传代,并制成细胞悬液;其中培养基中包含如下组分:100μg/ml青霉素,100μg/ml链霉素,10%胎牛血清,余量为L-DMEM和/或DMEM/F12;
(2)将水凝胶材料表面接种成纤维细胞培养:
将上述灭菌处理的水凝胶材料平铺于6孔板中,接种纯化后的成纤维细胞悬液,孵育10~60min后加适量的培养基置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
显微镜观察细胞存活死亡的荧光染色图,见图5-7所示;并检测细胞存活率,见图8所示。从图5-7可以看出,细胞在水凝胶材料表面贴附良好,生长状态良好,随着培养时间延长,细胞逐渐覆盖于材料表面,说明该水凝胶材料对细胞无明显毒性,具有很好的安全性和细胞相容性,且对细胞的细胞核和细胞膜影响不大,有利于细胞的诱导和生长。图8的柱状图也进一步佐证了实施例1-4所制备水凝胶材料均对细胞具有优良的安全性和细胞相容性,以实施例3-4所制备水凝胶材料为更优。
实施例7
将实施例1-4所制备水凝胶材料用来促进口腔创伤修复的动物试验:
(1)从中山大学动物中心购买15只SD大鼠(200±20mg);
(2)口腔损伤模型的建立:先用活性氧和细菌对小鼠的牙齿口腔进行感染,创伤造成伤口;
(3)试验分组和上样方法;取口腔损伤模型的小鼠15只,按体重随机分为5组,对照组3只(不加任何处理),抗氧化膜1组3只(伤口处涂覆由实施例1制备的水凝胶材料),抗氧化膜2组3只(伤口处涂覆由实施例2制备的水凝胶材料),抗氧化膜3组3只(伤口处涂覆由实施例3制备的水凝胶材料),抗氧化膜4组3只(伤口处涂覆由实施例4制备的水凝胶材料)。上样方式为外敷,创伤模型制备完成后立即敷料。
(4)口腔伤口涂覆样品后每天观察创口愈合的情况,并近距离对小鼠口腔创伤面进行拍照,计算其伤口面积,绘制伤口愈合面积曲线。
图9所示为伤口愈合面积随着时间变化的曲线,结果显示,随着时间的延长,伤口逐渐愈合。但是根据伤口的面积大小可知,同时加入儿茶醛和氨基糖苷的伤口愈合曲线(即实施例4对应的曲线)斜率更大,愈合更快,效果更好,这说明同时加入儿茶醛和氨基糖苷能够起到协同作用,同时增强抗氧化和抗菌效果,有利于消除炎症反应和清除活性氧细菌,加速伤口愈合。
本领域的普通技术人员将会意识到,在本发明各方法实施例中,所述各步骤的序号并不能用于限定各步骤的先后顺序,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,对各步骤的先后变化也在本发明的保护范围之内。这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的实施方法,应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合,这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.具抗氧化和抗菌性的胶原蛋白修复膜,其特征是:
由胶原蛋白与儿茶醛、氨基糖苷类抗生素进行席夫碱反应形成。
2.如权利要求1所述的具抗氧化和抗菌性的胶原蛋白修复膜,其特征是:
所述氨基糖苷类抗生素为妥布霉素、硫酸新霉素、硫酸庆大霉素、硫酸帕罗霉素、硫酸核糖霉素、硫酸奈替米星中的一种或多种。
3.权利要求1所述胶原蛋白修复膜的制备方法,其特征是,包括步骤:
(1)将1-100质量份的胶原蛋白溶解于酸溶液,常温搅拌直至完全溶解;
(2)加入1-100质量份的氨基糖苷类抗生素,常温搅拌分散;
(3)加入1-100质量份的儿茶醛,常温搅拌以进行反应,直至反应结束;
(4)对步骤(3)所得溶液进行透析、冻干、成膜。
4.权利要求1所述胶原蛋白修复膜的制备方法,其特征是,包括步骤:
(1)将1-100质量份的胶原蛋白溶解于酸溶液,常温搅拌直至完全溶解;
(2)将1-100质量份的氨基糖苷类抗生素溶解于水中;
(3)将1-100质量份的儿茶醛溶解于水中;
(4)将步骤(1)-(3)所制备溶液混合,常温搅拌以进行反应,直至反应结束;
(5)对步骤(4)所得溶液进行透析、冻干、成膜。
5.如权利要求3或4所述的制备方法,其特征是:
步骤(1)中的酸溶液为醋酸或稀盐酸。
6.如权利要求3或4所述的制备方法,其特征是:
所述胶原蛋白来自动物组织。
7.如权利要求3或4所述的制备方法,其特征是:
胶原蛋白的用量60质量份,氨基糖苷的用量20质量份,儿茶醛的用量20质量份。
8.如权利要求3所述的制备方法,其特征是:
成膜温度为35℃-37℃,成膜时间为20h-24h。
9.权利要求1或2所述胶原蛋白修复膜用于制备 口腔创伤敷料膜的应用。
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