CN112300283B

CN112300283B - 一种抗人胰腺癌单克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112300283B
Application number: CN201910689751.1A
Authority: CN
Inventors: 黄谧; 马莹莹; 丁权; 李新洋; 刘楚新; 杨乃波
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2019-07-29
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2024-01-02
Anticipated expiration: 2039-07-29
Also published as: CN112300283A

Abstract

本申请公开了一种抗人胰腺癌单克隆抗体及其制备方法和应用。本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体，由Seq ID No.1所示的重链序列‑GPC1‑VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列‑GPC1‑VK克隆表达。本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体，能够与天然GPC1蛋白结合，可用于检测GPC1蛋白的表达，对胰腺癌进行早期诊断，为胰腺癌的早期诊断筛查提供了一种新的可选方案。

Description

一种抗人胰腺癌单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及胰腺癌检测领域，特别是涉及一种抗人胰腺癌单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

胰腺癌是一种病因及发病机制至今不明的高度恶性的消化系肿瘤，其临床症状隐匿，发展迅速，预后极差。在全球范围内，胰腺癌的发病率呈逐渐上升趋势，2014年，美国胰腺癌术后5年生存率＜6％，在恶性肿瘤病死率中居第4位。我国肿瘤流行病学调查显示，2011年胰腺癌在恶性肿瘤病死率中占第7位，而2015年我国胰腺癌死亡率上升至第6位。过去的20年里，胰腺癌的治疗没有取得实质性进步。由于胰腺癌早期无特异性临床症状及体征，大多数患者诊断时已失去手术切除最佳时期，因此，如何提高胰腺癌的早期诊断率一直是肿瘤临床所面临的艰巨任务。近年来，随着生物技术的迅速发展和基因组学、蛋白组学的诞生，大量肿瘤标志物的应用使得胰腺癌的早期诊断成为了现实。相对于影像学而言，血清中的标志物具有更高的敏感性和前瞻性，可在病变部位发生影像学改变之前表现出显著的变化，可有效弥补影像学诊断的滞后性。

外泌体(exosomes)是大多数细胞都能分泌的一种微小囊泡，直径大约在40-100nm。外泌体在1983年首次被发现，但仅被认为是细胞***的一种方式，如今，随着对外泌体研究的不断深入，发现其携带大量特异性蛋白、脂质、核酸等生物信息分子，在细胞间通讯起着重要的作用。由于外泌体在体液中的稳定性以及能够被有效分离的特性，在研究癌症相关的早期检测标志物方面具有巨大潜力。

2015年发表在nature上的一篇文章(Glypican-1 identifies cancer exosomesand detects early pancreatic cancer)发现在胰腺癌患者的血清外泌体中显著高表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1)，而相比之下胰腺炎、良性胰腺病变和正常对照组中的血清外泌体GPC1的表达水平较低，这提示GPC1可能作为胰腺癌早期诊断的肿瘤标志物，因此，设计一种针对GPC1的抗体可用作胰腺癌早期诊断。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的抗人胰腺癌单克隆抗体及其制备方法和应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种抗人胰腺癌单克隆抗体，该抗人胰腺癌单克隆抗体由Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK克隆表达。

需要说明的是，本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体由Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK克隆表达获得；其中，Seq IDNo.1所示的重链序列-GPC1-VH和Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK，是本申请采用流式细胞分选法筛选得到抗人胰腺癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的单个B细胞克隆，然后以单个B细胞起始扩增天然配对的抗体重轻链序列，再按照人细胞表达***的偏爱性对扩增出的重轻链基因进行密码子优化，最终根据优化的密码子获得的重链序列-GPC1-VH序列和轻链序列-GPC1-VK序列。因此，本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体可以与天然GPC1结合，可以用于检测GPC1蛋白的表达，对胰腺癌进行早期诊断和筛查。

可以理解，本申请的关键在于重链序列-GPC1-VH序列和轻链序列-GPC1-VK序列的研究，至于具体如何表达，可以参考现有的重链轻链克隆表达***和方法。

优选的，克隆表达采用的载体为商品化的哺乳细胞表达载体。

优选的，克隆表达采用的载体为pFUSE-mouse Fc。

需要说明的是，pFUSE-mouse Fc只是本申请的一种实现方式中证实可行的一种哺乳细胞表达载体，不排除还可以采用其它的克隆表达载体。

本申请的另一面公开了一种用于制备抗人胰腺癌单克隆抗体的克隆质粒，该克隆质粒中含有Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK。

优选的，克隆质粒为商品化的哺乳细胞表达载体。更优选为，pFUSE-mouse Fc。

需要说明的是，本申请的关键在于研发获得了重链序列-GPC1-VH序列和轻链序列-GPC1-VK序列，根据该配对的重轻链序列，可以克隆表达获得本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体；因此，克隆有本申请重链序列-GPC1-VH序列和轻链序列-GPC1-VK序列的克隆质粒可以单独作为一个产品使用或售卖。

本申请的再一面公开了一种用于制备抗人胰腺癌单克隆抗体的人工合成核酸，该人工合成核酸包括Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH核酸和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK核酸。

需要说明的是，本申请的Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH核酸和Seq IDNo.2所示的轻链序列-GPC1-VK核酸，这两个核酸作为一组独立的产品，也可以单独使用或售卖；至于后续的表达载体和表达体系可以参考现有的载体构建和表达。

本申请的再一面公开了本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体，或者本申请的克隆质粒，或者本申请的人工合成核酸在制备胰腺癌检测试剂盒或装置中的应用。

需要说明的是，本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体，其作用就是用于胰腺癌检测，因此，可以制成相应的胰腺癌特异性检测试剂盒，用于胰腺癌的早期诊断或筛查；当然，试剂盒中还可以包括其它免疫检测相关的试剂，在此不作具体限定。基于本申请抗人胰腺癌单克隆抗体对胰腺癌的检测原理，同样可以将本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体制成相应的检测装置，例如层析试纸条或类似的结构装置。本申请的克隆质粒和人工合成核酸，能够制备出本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体，因此，同样可以用于制备胰腺癌检测试剂盒。

本申请的再一面公开了本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤，

B细胞筛选步骤，包括对获取的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1免疫的动物的外周血单核细胞进行细胞染色，并采用流式细胞仪对染色的细胞进行筛选，获得单个的抗人胰腺癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的B细胞；

抗体序列扩增步骤，包括对获得的单个的抗人胰腺癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的B细胞进行裂解和逆转录，并采用抗体扩增引物对逆转录产物进行PCR扩增；

抗体序列克隆和测序验证步骤，包括对PCR扩增产物进行回收，并与pMD载体连接，转入感受态大肠杆菌细胞中，用于含氨苄青霉素的LB固体培养基进行筛选培养，挑选单克隆菌落在培养液中进行培养，然后对菌液进行Sanger测序，验证抗体序列的准确性以及是否含有重链和轻链配对信息；

密码子优化步骤，根据Sanger测序结果，按照人细胞表达***的偏爱性对扩增出的重链和轻链基因进行密码子优化，获得Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK；

抗人胰腺癌单克隆抗体表达步骤，将合成的重链序列-GPC1-VH和轻链序列-GPC1-VK克隆到商品化的哺乳细胞表达载体中，表达出的抗体即抗人胰腺癌单克隆抗体。本申请的一种实现方式中，具体采用商品化的哺乳细胞表达载体pFUSE-mouse Fc克隆重链序列-GPC1-VH和轻链序列-GPC1-VK，并由人肾上皮细胞HEK293T细胞表达产生本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体。

优选的，本申请的制备方法中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1免疫的动物的外周血单核细胞的制备方法包括，采用磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1和弗氏佐剂的混合液对健康的兔子进行皮下多点注射免疫，至少进行四次免疫后，采集兔耳缘静脉血，采用小型哺乳动物淋巴细胞分离试剂液对兔耳缘静脉血进行分离，获得所述外周血单核细胞。本申请的一种实现方式中，具体采用6周龄的健康新西兰雌性白兔进行试验，每两周免疫一次，总计免疫四次，并且，第一次免疫使用弗氏完全佐剂(sigma F5881)，其余三次使用弗氏不完全佐剂(sigmaF5506)，从第二次免疫开始，每次免疫前采集耳缘静脉血，第四次免疫结束后两周，采集兔耳缘静脉血。

优选的，本申请的制备方法中，细胞染色包括，采用异硫氰酸荧光素对GPC1抗原进行标记，然后采用异硫氰酸荧光素标记的GPC1抗原对外周血单核细胞进行染色。本申请的一种实现方式中，将异硫氰酸荧光素(缩写FITC)用DMSO溶解，形成FITC-DMSO溶液，然后将FITC-DMSO溶液缓慢加入抗原溶液中，制备异硫氰酸荧光素标记的GPC1抗原。

优选的，本申请的制备方法中，逆转录采用的引物为TSO引物和oligo-dT引物，抗体扩增引物包括用于巢式PCR扩增的第一轮扩增引物和第二轮扩增引物；TSO引物为Seq IDNo.3所示序列，oligo-dT引物为Seq ID No.4所示序列；第一轮扩增引物包括Ld引物和配对的C区下游引物，Ld引物为rIgH-Ld1、rIgK-Ld1、rIgL-Ld1-1和rIgL-Ld1-2中的至少一条，C区下游引物为rIgHG-C1、rIgK-C1和rIgL-C1中的至少一条，rIgH-Ld1为Seq ID No.5所示序列，rIgK-Ld1为Seq ID No.6所示序列，rIgL-Ld1-1为Seq ID No.7所示序列，rIgL-Ld1-2为Seq ID No.8所示序列，rIgHG-C1为Seq ID No.9所示序列，rIgK-C1为Seq ID No.10所示序列，rIgL-C1为Seq ID No.11所示序列；第二轮扩增引物包括FR引物和配对的J引物，FR引物为rIgH-FR1和/或rIgK-FR1，J引物为rIgH-J、rIgK-J-1、rIgK-J-2和rIgL-J中的至少一条，rIgH-FR1为Seq ID No.12所示序列，rIgK-FR1为Seq ID No.13所示序列，rIgH-J为Seq IDNo.14所示序列，rIgK-J-1为Seq ID No.15所示序列，rIgK-J-2为Seq ID No.16所示序列，rIgL-J为Seq ID No.17所示序列。

本申请的再一面公开了一种用于抗人胰腺癌单克隆抗体制备中抗体序列克隆的试剂，包括逆转录引物和抗体扩增引物；逆转录引物为TSO引物和oligo-dT引物，抗体扩增引物包括用于巢式PCR扩增的第一轮扩增引物和第二轮扩增引物；TSO引物为Seq ID No.3所示序列，oligo-dT引物为Seq ID No.4所示序列；第一轮扩增引物包括Ld引物和配对的C区下游引物，Ld引物为rIgH-Ld1、rIgK-Ld1、rIgL-Ld1-1和rIgL-Ld1-2中的至少一条，C区下游引物为rIgHG-C1、rIgK-C1和rIgL-C1中的至少一条，rIgH-Ld1为Seq ID No.5所示序列，rIgK-Ld1为Seq ID No.6所示序列，rIgL-Ld1-1为Seq ID No.7所示序列，rIgL-Ld1-2为SeqID No.8所示序列，rIgHG-C1为Seq ID No.9所示序列，rIgK-C1为Seq ID No.10所示序列，rIgL-C1为Seq ID No.11所示序列；第二轮扩增引物包括FR引物和配对的J引物，FR引物为rIgH-FR1和/或rIgK-FR1，J引物为rIgH-J、rIgK-J-1、rIgK-J-2和rIgL-J中的至少一条，rIgH-FR1为Seq ID No.12所示序列，rIgK-FR1为Seq ID No.13所示序列，rIgH-J为Seq IDNo.14所示序列，rIgK-J-1为Seq ID No.15所示序列，rIgK-J-2为Seq ID No.16所示序列，rIgL-J为Seq ID No.17所示序列。

需要说明的是，Seq ID No.3至Seq ID No.17所示序列的引物，是本申请抗人胰腺癌单克隆抗体的制备方法中涉及到的引物，这些引物同样可以单独作为一个产品使用或售卖。可以理解，Seq ID No.3至Seq ID No.17所示序列的引物只是本申请的一种实现方式中具体采用的引物序列，在此基础上可以适当增加或减少碱基，只要不影响PCR扩增以及最终的扩增效果即可。

本申请的有益效果在于：

本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体，能够与天然GPC1蛋白结合，可以用于检测GPC1蛋白的表达，对胰腺癌进行早期诊断，为胰腺癌的早期诊断筛查提供了一种新的可选方案。

附图说明

图1是本申请实施例中免疫或未免疫的兔外周血单核细胞染色前后的荧光强度范围分析图；

图2是本申请实施例中免疫或未免疫的兔外周血单核细胞的流式细胞仪分析散点图；

图3是本申请实施例中抗体序列扩增产物的凝胶电泳结果图；

图4是本申请实施例中抗体与表达抗原亲和力检测结果图；

图5是本申请实施例中抗体与细胞表明天然蛋白结合检测结果图。

具体实施方式

目前，现有的常规诊断方法对胰腺癌的早期诊断效果不理想。精准医疗的出现，实现了从肿瘤分子机制诊断疾病的目标。其新技术“液体活检”是通过检测血液、尿液及唾液等体液中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)、循环肿瘤DNA(circulatingtumor DNA，ctDNA)和外泌体的这种相对无创的方法，为癌症的早期诊断、病情监控及疗效评估等提供一种简便快捷的手段。该技术的优势在于：(1)液体活检属于相对的无创性检查；(2)敏感性高，有利于肿瘤的早期发现；(3)能够从分子水平检测肿瘤信号。

肿瘤细胞来源的外泌体作为液体活检的主要生物学标志物，主要由以下特性所决定：(1)外泌体体积小，通过体内组织屏障的能力强；(2)外泌体在体液中含量高，每毫升血液中超过10⁹个；(3)外泌体稳定的膜结构对其内容物起到了有效保护作用；(4)外泌体成分的复杂程度比体液更低，有利于识别和鉴定；(5)外泌体含有与疾病相关的特异性蛋白质和RNA。

研究发现，检测血液循环中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC-1)阳性的外泌体(Glypican-1+circulating exosomes，GPC1+crExos)可作为一种胰腺癌早期的无创性诊断方法。GPC1是一种在胰腺癌中过表达的膜锚定蛋白，在肿瘤细胞来源的外泌体中含量较多。研究通过对比100例正常人和190例PDAC患者资料，发现所有PDAC患者GPC1+crExos的水平均高于正常人。这表明PDAC与GPC1+crExos水平有明显的相关性。进一步的研究发现，胰腺癌前病变(pancreatic cancer precursor lesions，PCPL)患者GPC1+crExos水平明显高于正常人及胰腺良性病变(benignpancreatic disease，BPD)患者，而其在正常人和BPD患者血液循环中的水平并无差异。研究表明远处转移患者的GPC1+crExos水平明显高于淋巴转移和无转移患者。与CAl99比较，GPC1+crExos的优势在于：虽然，CAl99水平在BPD患者中同样会升高；但是，CAl99水平并不能区分PCPL患者和正常人；并且，GPC1+crExos的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值均高于CA199；术后患者GPC1+crExos水平明显下降，而CAl99水平只有部分患者下降；此外，术后患者的总体生存率与GPC1+crExos下降水平呈正相关，而与CAl99下降水平无明显关联。小鼠体内研究实验表明，GPC1+crExos水平的升高要早于MRI的检查发现，并与肿瘤体积呈正相关。因此，GPC1+crExos是一种可靠的早期胰腺癌的诊断指标。

基于以上认识，本申请创造性的研发了一种新的抗人胰腺癌单克隆抗体，该抗体由Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK克隆表达，能够特异性的结合GPC1蛋白，可以可靠的用于早期胰腺癌诊断筛查。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、实验步骤

本例采用流式细胞分选法筛选得到抗人胰腺癌GPC1的单个B细胞克隆，然后以单个B细胞起始扩增天然配对的抗体重轻链序列，随后将其优化成人哺乳细胞偏好的密码子，基因合成后构建表达载体，转染进入人肾上皮细胞HEK293T细胞表达产生抗体蛋白，以流式细胞法验证抗体与抗原的结合活性，以酶联免疫吸附试验抗体与抗原GPC1之间的亲和动力学特征。详细如下：

1.动物免疫

选取两只6周龄的健康新西兰雌性白兔，采集白兔耳缘静脉血作为未免疫抗原的阴性对照，保存于-80℃超低温冰箱中。将500μg GPC1蛋白作为抗原与弗氏佐剂按1:1比例混匀乳化，采取背部皮下多点注射方式免疫，每两周免疫一次，一共免疫四次，第一次免疫使用弗氏完全佐剂(sigma F5881)，其余三次使用弗氏不完全佐剂(sigma F5506)，从第二次免疫开始，每次免疫前采集耳缘静脉血，第四次免疫结束后两周，采集兔耳缘静脉血。所有采血过程均使用真空抗凝采血管。

2.ELISA检测血清效价

将GPC1抗原按适当浓度溶解于包被液中，其中包被液为浓度50mM、pH 9.6的Na₂CO₃；在对应的孔中加入100μL抗原，4℃过夜；倒空液体并拍干残留液体，洗涤液PBST冲洗3次；每孔加200μL封闭液，37℃孵育2小时；倒空液体并拍干残留液体，PBST洗涤液冲洗3次；每孔加100μL倍比稀释的血清或抗体，37℃孵育1小时；倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；每孔加100μL二抗，37℃孵育1小时；倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗5次；拍干孔中残留液体，每孔加100μL显色液，37℃避光显色10min；每孔加50μL的浓度为2M的HCL终止显色，并立即读取450nm OD值。

其中，PBST为1×PBS pH 7.4中加入0.05％的吐温20；封闭液为3％的牛血清白蛋白；二抗为1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。

本例分别设计了空白组、阴性组和四个免疫组；其中，空白组指的是不加血清而加100μL PBS的空白对照，阴性组指的是加免疫前的100μL血清的阴性对照，本例的阴性对照具体采用的是免疫前的血清的1:1000稀释液进行试验；四个免疫组分别是对第四次免疫后的血清依序进行1:1000稀释、1:4000稀释、1:16000稀释和1:32000稀释，然后用于试验。

3.分离免疫前后兔外周血淋巴细胞

利用小型哺乳动物淋巴细胞分离试剂液(sigma 1083)分离抗原免疫后兔外周血淋巴细胞。具体操作步骤为：将抗凝血与PBS(gibco C14190500BT)按照体积1:1混匀，取一支15mL离心管，加入与稀释前样本等量的分离试剂。用移液管小心吸取稀释后的血液样本加入分离液面上，400g离心30min，注意将离心机的升降速率调至最低。离心结束后，小心取出离心管，此时离心管由上至下分为4层。第一层为血清和PBS，第二层为云雾状的乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。用移液器小心吸取第二层云雾状的淋巴细胞转移至另一个15mL离心管中，加入5倍体积PBS，混匀，300g离心10min弃上清。加入10mL的PBS重悬所得细胞，300g离心10min弃上清。加入10mL的PBS重悬所得细胞，300g离心10min弃上清。最后用0.5mL的PBS重悬细胞，即获得分离的外周血单核细胞。

4.FITC标记抗原

将1mg GPC1抗原将溶于0.5mL的pH9.0的0.1M碳酸盐缓冲液中。用DMSO溶解FITC(sigma F4274)，使得FITC终浓度为1mg/mL。将FITC-DMSO溶液缓慢加入抗原溶液中，每1mL抗原溶液加入50μL的FITC-DMSO溶液。4℃避光反应8h。加入终浓度为50mM的NH₄Cl终止反应，4℃反应2h。超滤除去未反应的FITC。

5.细胞染色

将分离后的兔外周血单核细胞(缩写PBMC)重悬至终体积20μL的PBS中，加入2μL的GPC1-FITC，轻柔吹打混匀，室温避光反应1小时；同时，预留少量不加GPC1-FITC细胞作为阴性对照。反应结束后，加入1mL的PBS，400g离心5分钟弃上清，用1mL的PBS重悬沉淀。400g离心5分钟弃上清，用1mL的PBS重悬沉淀。400g离心5分钟，弃上清，以500μL的PBS重悬沉淀，制备成样本，样本密度约为1×10⁷个细胞/mL。

6.流式细胞术分选GPC1-FITC+细胞

常规进行流式细胞仪校准，再进行分选参数校准，调整侧液流和液滴延迟值，调整压电振幅值，使侧液流窗中的左侧亮点最远、最集中；接着在坐标窗口上下左右调整细胞分选坐标值，确保鞘液可以打到PCR管管底，细胞不能打在侧管壁上，否则将影响扩增成功率；最后进行分选细胞得率检查，如设置分选10个细胞，显微镜下查看实际可获得细胞个数，90％以上的细胞得率为合格，可进行下一步分选，以上步骤全部进行完之后，开始分选GPC1-FITC阳性的单个活细胞。

7.引物设计

本例为配合单细胞扩增技术的开发，专门设计和整理了一套针对cDNA的巢式扩增引物，用于对抗体序列进行扩增，即抗体扩增引物。同时，设计了将mRNA逆转录为cDNA的引物，即TSO引物和oligo-dT引物。各引物序列见表1。其中，TSO和oligo-dT引物在逆转录阶段使用，即用于逆转录扩增cDNA，两者混合后使用，混合引物中TSO和oligo-dT的浓度均为100μmol/L。

巢式扩增引物，即抗体扩增引物，包括第一轮扩增引物和第二轮扩增引物。第一轮扩增引物由Ld引物和配对的重轻链C区下游引物组成，Ld引物包括rIgH-Ld1、rIgK-Ld1、rIgL-Ld1-1和rIgL-Ld1-2，C区下游引物包括rIgHG-C1、rIgK-C1和rIgL-C1。Ld和C引物在第一轮PCR使用，分别退火至TSO上游序列和抗体各亚型的CH1区下游。其中，各Ld引物等量混合使用，工作液浓度均为10μmol/L，即混合引物中，各条Ld引物的浓度都是10μmol/L；各C区下游引物等量混合使用，工作液浓度均为10μmol/L。

第二轮扩增引物由FR引物和配对的J引物组成，FR引物包括rIgH-FR1和rIgK-FR1，J引物包括rIgH-J、rIgK-J-1、rIgK-J-2和rIgL-J。同样的，各FR引物等量混合，工作液浓度均为10μmol/L；各J引物等量混合，工作液浓度均为10μmol/L。

表1引物名称以及引物序列

引物名称	序列(5'→3')	Seq ID No.
			TSO	AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+G^a	3
oligo-dT₁₈	TTTTTTTTTTTTTTTTTT	4
			rIgH-Ld1	CTTCTCCTGGTCGCTGTGCT	5
rIgH-FR1	CACTCACCTGCACAGYCTCTGGA	12
			rIgK-Ld1	CTGCTGGGGCTCCTGCT	6
rIgK-FR1	GCTGTGGGAGGCACAGTCAC	13
			rIgL-Ld1-1	CCTCACAGTCCTGGCTCACTGCACA	7
rIgL-Ld1-2	CCYCCTCCTCKCTCACTGCACA	8
			rIgH-J	TGARGAGAYRGTGACSAGGGT	14
rIgK-J-1	CGACGACCACCTYGGTCC	15
			rIgK-J-2	TGATTTCCACCTTGGTGCC	16
rIgL-J	CTGTGACGGTCAGCTKGGTC	17
			rIgHG-C1	GAAGACTGAYGGAGCCTTAGGT	9
rIgK-C1	GGTGGGAAGATGAGGACAGTAG	10
			rIgL-C1	CCTCTGAGGAGGGCGGRAACA	11

8.细胞裂解和逆转录

配制细胞裂解液：配制4μL裂解液，将裂解液置于0.2mL的PCR管中，直接将细胞分选至该细胞裂解液中。标记清楚，预留出2管阴性孔，即0个细胞，也就是不分选细胞的孔；1管阳性孔，即分选10个细胞，作为对照；10管单个细胞孔。其中，裂解液包括1.86μL无核酸酶水、1μL的浓度10μmol/L的Oligo dT18、0.1μL的浓度40U/μL的RNase inhibitor、0.04μL的浓度100mL/L的Triton X-100。

将分好细胞的含有裂解液的PCR管置于PCR仪内，72℃温浴3min；热盖设置为75℃，裂解结束后，立即置于冰上1min；10000r/min 4℃离心30s。配制6μL反转录体系，包括：2μLSuperScriptⅡFirst-Stand Buffer(5×)、2μL甜菜碱(betaine)(5mol/L)、0.9μL MgCl₂(100mmol/L)、0.25μL DTT(100mmol/L)、0.1μLTSO和oligo-dT₁₈(100μmol/L)、0.25μL RNAseinhibitor(40U/μL)、0.5μL SuperScript II Reverse Transcriptase(200U/μL)。

按照如下条件进行逆转录：42℃90min；然后进入10个循环：50℃2min，42℃2min；循环结束后，70℃15min；12℃待机；即获得cDNA。

9.抗体序列扩增

以上述方法获得的单管cDNA体系产物为模板进行两轮巢式PCR。第一轮使用Ld引物和重轻链C区下游引物；Ld引物由等量混合的rIgH-Ld1、rIgK-Ld1、rIgL-Ld1-1和rIgL-Ld1-2组成，各引物的工作液浓度为10μmol/L；重轻链C区下游引物由等量混合的rIgHG-C1、rIgK-C1和rIgL-C1组成，各引物的工作液浓度为10μmol/L。

第一轮PCR扩增的反应体系为25μL，包括：12.5μL的KAPAReady mix(2×)、0.5μL的Ld引物(10μmol/L)、0.5μL的C引物(10μmol/L)、10μL逆转录产物、1.5μL无核酸酶水。

第二轮PCR扩增使用FR引物和J引物。FR引物由等量混合的rIgH-FR1和rIgK-FR1组成，各引物的工作液浓度为10μmol/L；J引物由等量混合的rIgH-J、rIgK-J-1、rIgK-J-2和rIgL-J组成，各引物的工作液浓度为10μmol/L。

第二轮PCR扩增的反应体系也为25μL，包括：12.5μL的KAPAReady mix(2×)、0.5μL的FR引物(10μmol/L)、0.5μL的J引物(10μmol/L)、1μL第一轮PCR产物、10.5μL无核酸酶水。

两轮PCR扩增的反应条件相同，具体如下：95℃3min；然后进入25个循环：98℃15s，60℃20s，72℃2min；循环结束后，72℃5min；12℃待机。

10.TA克隆、基因合成和表达载体构建

使用10g/L的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测，并对目的条带，约350bp，进行切割，用凝胶回收试剂盒进行回收。随后，使用rTaq酶对PCR产物的末端进行加A，然后将产物经PCR产物纯化试剂盒纯化之后，与pMD18 T载体在16℃下连接过夜，将连接产物转入感受态细胞DH5α中，37℃无抗生素培养1h后，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上过夜。次日，挑选状态良好的单克隆菌落进行摇菌培养3～5h后，将菌液送至上海生工生物公司进行Sanger测序，验证是否为抗体序列及是否含有重链和轻链配对信息。

按照人细胞表达***的偏爱性对扩增出的重轻链基因进行密码子优化，然后进行可变区的全基因合成，将合成的基因序列直接克隆至商品化哺乳细胞表达载体pFUSE-mouse Fc中，该载体其含有小鼠抗体的Fc恒定区表达区域，将载体转染入人肾上皮细胞HEK293T细胞，表达产生抗体蛋白，即为含有特异性结合GPC1的兔源抗体，也就是本例的抗人胰腺癌单克隆抗体。

(1)哺乳动物细胞转染以及抗体纯化

胰酶消化细胞计数铺板，37℃，5％CO₂过夜培养，细胞在转染时汇合度为70％-80％。用Opti-MEM(invitrogen 11058-021)稀释质粒，小心混匀，标记为A液；用相同体积的Opti-MEM稀释转染试剂PEI(polyscience 23966-2)，小心混匀，标记为B液。质粒和PEI的质量比为1:2。室温静置15min。将B液缓慢加入到A液中并混匀，室温静置20min。将DNA-PEI混合物缓慢加入细胞培养基中，轻轻混匀。

转染48h后收集细胞上清，300g离心收上清去除细胞，2000g离心10min收上清去除细胞碎片。用偶联了GPC1抗原的亲和纯化柱纯化抗体。

(2)抗原抗体结合动力学测定，即亲和力测定：

以酶联免疫吸附验证抗体与抗原GPC1之间的亲和动力学特征，具体的，将GPC1抗原溶解于包被液中；在对应的孔中加入100μL抗原，4℃过夜；倒空液体并拍干残留液体，洗涤液PBST冲洗3次；每孔加200μL封闭液，37℃孵育2小时；倒空液体并拍干残留液体，PBST洗涤液冲洗3次；每孔加100μL稀释抗体，37℃孵育1小时；倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；每孔加100μL二抗，37℃孵育1小时；倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗5次；拍干孔中残留液体，每孔加100μL显色液，37℃避光显色10min；每孔加50μL的2M HCL终止显色，并立即读取450nm OD值。

其中，包被液为浓度50mM的Na₂CO₃，pH 9.6；PBST为1×PBS pH7.4加0.05％的吐温20；封闭液为3％的牛血清白蛋白；二抗为1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。

(3)抗体与细胞表面天然GPC1结合检测

根据Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects earlypancreatic cancer文献报道，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的外泌体高表达GPC1，因此，本例选择该细胞株进行检测。本例的MDA-MB-231获取自中国典型培养物保藏中心，其编号为GDC297。取对数生长期的MDA-MB-231用胰酶消化成单细胞悬液，计数，离心去除培养基。用PBS重悬细胞，将细胞悬液按照50μL/管分入3个EP管中，1号不加抗体，2号加0.5μL阳性GPC1抗体(Genetex GTX42664)，3号加1μL纯化后GPC1单抗，室温孵育30min。每管加入1mL的PBS，300g离心5min，期上清。1mL的PBS重悬细胞沉淀，300g离心5min，弃上清。1mL的PBS重悬细胞沉淀，300g离心5min，弃上清。50μL的PBS重悬细胞沉淀，加入对应的荧光标价二抗，室温孵育30min。每管加入1mL的PBS，300g离心5min，期上清。1mL的PBS重悬细胞沉淀，300g离心5min，弃上清。1mL的PBS重悬细胞沉淀，300g离心5min，弃上清。采用流式细胞仪，验证抗体与抗原的结合活性。

二、结果

1.血清转阳效价检测结果

根据“2.ELISA检测血清效价”对免疫前后兔子的血清转阳效价进行检测，结果如表2所示。

表2血清转阳效价检测

表2中，“兔号”是指进行试验的两只兔子的编号，“检测抗原”即阳性组。表2的结果显示，阴性组免疫前血清和空白对照的OD450值表现一致，符合预期；免疫组，从1:1000稀释度开始，4倍梯度稀释至1:32000仍有较高的吸光值，且其吸光值与阴性组的吸光值之比大于8，一般该值大于4即判定为免疫血清转阳，这表明两只兔子体内都已有特异性抗体产生，可以用于分选GPC1+的B细胞，用于抗体重轻链基因的扩增。

2.流式细胞术分选GPC1-FITC+细胞的结果

如图1所示，NC-为未免疫的兔子淋巴细胞不加GPC1-FITC染色，即NC-.fcs；NC+为未免疫兔子淋巴细胞加GPC1-FITC染色，即NC+.fcs；GPC1-为免疫后兔子淋巴细胞不加GPC1-FITC染色，即GPC1-.fcs；GPC1+为免疫后兔子淋巴细胞加GPC1-FITC染色，即GPC1+.fcs。从图中可以看出不加GPC1-FITC染色的淋巴细胞，不论是否免疫都处于同一荧光强度范围，两个不加GPC1-FITC的曲线重叠在一起，即图1中由左至右的第一个曲线峰，第一个曲线峰中虚线为NC-.fcs，实线为GPC1-.fcs；而未免疫兔子的淋巴细胞加GPC1-FITC染色后也出现了阳性偏移，即图1的NC+.fcs，存在非特异性结合，但是荧光强度低于免疫后的兔子淋巴细胞，即图1的GPC1+.fcs，因此，这部分为分选所需要的细胞，如图2所示。

图2为免疫和未免疫的兔外周血单核细胞的流式细胞仪分析散点图，流式细胞仪的统计结果如表3所示。

表3免疫和未免疫的兔外周血单核细胞的统计数据

	FSC-H，SSC-H
		GPC1+.fcs	27.8％
NC+.fcs	7.74％

3.抗体序列扩增产物的电泳结果

采用琼脂糖凝胶电泳对“9.抗体序列扩增”的PCR扩增产物进行检测，结果如图3所示。图3中，泳道2至15分别为分选一个细胞作为PCR模板的扩增产物，即本例分选了14个单细胞分别作为单细胞模板进行扩增电泳；泳道18和19为阳性对照，即分别分选了10个细胞作为模板的扩增产物；泳道20和21为阴性对照，即没有细胞；泳道1和22为DNAmarker 2000；泳道16和17分别为抗体重链序列和抗体轻链序列。目标基因大小为350bp左右，图3的结果可以看出，泳道11、12和14，以及阳性对照都能扩增出目的条带。

4.密码子优化结果

根据上海生工生物公司的Sanger测序结果，本例按照人细胞表达***的偏爱性对扩增出的重轻链基因进行密码子优化，最终获得重链序列-GPC1-VH和与之配对的轻链序列-GPC1-VK，重链序列-GPC1-VH为Seq ID No.1所示序列，轻链序列-GPC1-VK为Seq IDNo.2所示序列。合成重链序列-GPC1-VH和轻链序列-GPC1-VK，将其克隆至哺乳细胞表达载体pFUSE-mouse Fc中。

Seq ID No.1：

TTCGATATCTCGTGCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCGTCGACCCAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGACCCCAGGAGGCACCCTGACACTGACCTGCACAGTGTCCGGCTTCACAATCTCTGGCTACCACATGTGCTGGGTGCGGCAGGCACCTGGCAAGGGCCTGGAGTCTATCGGCTATATCGCCAGCTCCGGCAACACCTACTATGCCAATTGGGCCAAGGGCAGATTCACCATCTCTAAGACAAGCACCACAGTGGACCTGAAGATCACCAGCCTGACAGCCGCCGATACCGCCACATACTTTTGCGCCAGAGGCGGCAGCGTGGGCGACGACATCTGGGGACCAGGCACCCTGGTGACAGTGTCCtcCTCGAGTGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATGAGCGCTGCTAGCTCTAGACCTAGCTGGCCAGAC

Seq ID No.2：

CGGAATTCGATATCCTCGAGGGACGTGGTCATGACCCAGACACCCAGCTCCAAGAGCGCCGCCGTGGGAGGCACCGTGACAATCAAGTGCCAGGCCTCCGAGTCTATCTCTAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGCCCCCTAAGCGGCTGATCTATAAGGCCAGCACCCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCAAGGGCAGCGGCTCCGGCACAGAGTTTACCCTGACAATCTCTGACCTGGAGTGTGCCGATGCCGCCACCTACTATTGCCAGTGTACCTACGGCTCCACATCCTCTAGCTACGGCTATGCCTTCGGCGGCGGCACAAAGGTGGTGGTGAAGCCATGGGGTACCAAGGTGGAAATCAAACGGGATCCAGTTGCGCCTTCTGTCCTCCTCTTCCCACCATCTAAGGAGGAGCTGACAACTGGAACAGCCACCATCGTGTGCGTGGCGAATAAATTCTATCCCAGTGACATCACCGTCACCTGGAAGGTGGATGGCACCACCCAACAGAGCGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAGCCCCGAAGACAATACCTACAGCCTGAGCAGCACTCTGTCACTGACCAGCGCACAGTACAACAGCCACAGCGTGTACACCTGCGAGGTGGTCCAAGGCTCAGCCTCACCGATCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGCTAGAGACAAAGGTCCTGAGAGCTAGCTGGCCAGAC

5.抗体与表达抗原亲和力检测结果

抗原抗体结合动力学测定，即亲和力测定，结果如图4所示。图4的结果显示，抗体可以与表达蛋白很好的结合，并且随着浓度上升结合增强呈浓度依赖。用软件拟合曲线计算亲和力常数Kd可得，抗体的亲和力大约在2×10^-7M。如图4所示，计算获得的Kd为2.631×10^-7M，EC50为2.086×10^-7M。

6.抗体与细胞表明天然蛋白结合检测结果

抗体与细胞表面天然GPC1结合检测结果如图5所示。图5中，黑色实线为本例的GPC1单抗，即GPC1mAb；灰色实线为购买的阳性商品化抗体，即阳性对照；灰色虚线为作为对比的阴性对照。图5的结果显示，本例的GPC1单抗可以与细胞很好的结合，相比阳性商品化抗体结合稍弱，但是对比阴性对照有明显阳性偏移；说明本例的抗体能够与细胞表面天然GPC1蛋白结合，可用于胰腺癌的检测。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 一种抗人胰腺癌单克隆抗体及其制备方法和应用

<130> 19I27943

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> 重链序列-GPC1-VH序列

<400> 1

ttcgatatct cgtgcaccat gtacaggatg caactcctgt cttgcattgc actaagtctt 60

gcacttgtca cgaattcgtc gacccaggag cagctgaagg agtccggagg aggactggtg 120

accccaggag gcaccctgac actgacctgc acagtgtccg gcttcacaat ctctggctac 180

cacatgtgct gggtgcggca ggcacctggc aagggcctgg agtctatcgg ctatatcgcc 240

agctccggca acacctacta tgccaattgg gccaagggca gattcaccat ctctaagaca 300

agcaccacag tggacctgaa gatcaccagc ctgacagccg ccgataccgc cacatacttt 360

tgcgccagag gcggcagcgt gggcgacgac atctggggac caggcaccct ggtgacagtg 420

tcctcctcga gtgggcaacc taaggctcca tcagtcttcc cactggcccc ctgctgcggg 480

gacacaccca gctccacggt gaccctgggc tgcctggtca aaggctacct cccggagcca 540

gtgaccgtga cctggaactc gggcaccctc accaatgggg tacgcacctt cccgtccgtc 600

cggcagtcct caggcctcta ctcgctgagc agcgtggtga gcgtgacctc aagcagccag 660

cccgtcacct gcaacgtggc ccacccagcc accaacacca aagtggacaa gaccgttgcg 720

ccctcgacat gcagcaagcc cacgtgccca ccccctgaac tcctgggggg accgtctgtc 780

ttcatcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cacgcacccc cgaggtcaca 840

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggatgac cccgaggtgc agttcacatg gtacataaac 900

aacgagcagg tgcgcaccgc ccggccgccg ctacgggagc agcagttcaa cagcacgatc 960

cgcgtggtca gcaccctccc catcgcgcac caggactggc tgaggggcaa ggagttcaag 1020

tgcaaagtcc acaacaaggc actcccggcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaga 1080

gggcagcccc tggagccgaa ggtctacacc atgggccctc cccgggagga gctgagcagc 1140

aggtcggtca gcctgacctg catgatcaac ggcttctacc cttccgacat ctcggtggag 1200

tgggagaaga acgggaaggc agaggacaac tacaagacca cgccggccgt gctggacagc 1260

gacggctcct acttcctcta cagcaagctc tcagtgccca cgagtgagtg gcagcggggc 1320

gacgtcttca cctgctccgt gatgcacgag gccttgcaca accactacac gcagaagtcc 1380

atctcccgct ctccgggtaa atgagcgctg ctagctctag acctagctgg ccagac 1436

<210> 2

<211> 737

<212> DNA

<213> 轻链序列-GPC1-VK序列

<400> 2

cggaattcga tatcctcgag ggacgtggtc atgacccaga cacccagctc caagagcgcc 60

gccgtgggag gcaccgtgac aatcaagtgc caggcctccg agtctatctc tagctggctg 120

gcctggtatc agcagaagcc aggccagccc cctaagcggc tgatctataa ggccagcacc 180

ctggcctccg gcgtgccctc cagattcaag ggcagcggct ccggcacaga gtttaccctg 240

acaatctctg acctggagtg tgccgatgcc gccacctact attgccagtg tacctacggc 300

tccacatcct ctagctacgg ctatgccttc ggcggcggca caaaggtggt ggtgaagcca 360

tggggtacca aggtggaaat caaacgggat ccagttgcgc cttctgtcct cctcttccca 420

ccatctaagg aggagctgac aactggaaca gccaccatcg tgtgcgtggc gaataaattc 480

tatcccagtg acatcaccgt cacctggaag gtggatggca ccacccaaca gagcggcatc 540

gagaacagta aaacaccgca gagccccgaa gacaatacct acagcctgag cagcactctg 600

tcactgacca gcgcacagta caacagccac agcgtgtaca cctgcgaggt ggtccaaggc 660

tcagcctcac cgatcgtcca gagcttcaat aggggtgact gctagagaca aaggtcctga 720

gagctagctg gccagac 737

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagcagtggt atcaacgcag agtacggg 28

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttttttttt tttttttt 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cttctcctgg tcgctgtgct 20

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgctggggc tcctgct 17

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctcacagtc ctggctcact gcaca 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccycctcctc kctcactgca ca 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaagactgay ggagccttag gt 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggtgggaaga tgaggacagt ag 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cctctgagga gggcggraac a 21

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cactcacctg cacagyctct gga 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gctgtgggag gcacagtcac 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgargagayr gtgacsaggg t 21

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cgacgaccac ctyggtcc 18

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgatttccac cttggtgcc 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctgtgacggt cagctkggtc 20

Claims

1.一种抗人胰腺癌单克隆抗体，其特征在于：所述抗人胰腺癌单克隆抗体由Seq IDNo.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK克隆表达。

2.根据权利要求1所述的抗人胰腺癌单克隆抗体，其特征在于：所述克隆表达采用的载体为商品化的哺乳细胞表达载体。

3.根据权利要求2所述的抗人胰腺癌单克隆抗体，其特征在于，所述载体为pFUSE-mouse Fc。

4.一种用于制备抗人胰腺癌单克隆抗体的克隆质粒，其特征在于：所述克隆质粒中含有Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK。

5.根据权利要求4所述的克隆质粒，其特征在于：所述克隆质粒为商品化的哺乳细胞表达载体。

6.根据权利要求5所述的克隆质粒，其特征在于，所述载体为pFUSE-mouse Fc。

7.一种用于制备抗人胰腺癌单克隆抗体的人工合成核酸，其特征在于：所述人工合成核酸包括Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH核酸和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK核酸。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的抗人胰腺癌单克隆抗体，或者权利要求4-6中任一项所述的克隆质粒，或者权利要求7所述的人工合成核酸在制备胰腺癌检测试剂盒或装置中的应用。

9.一种用于抗人胰腺癌单克隆抗体制备中抗体序列克隆的试剂，其特征在于：包括逆转录引物和抗体扩增引物；所述抗人胰腺癌单克隆抗体由Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK克隆表达；

逆转录引物为TSO引物和oligo-dT引物，抗体扩增引物包括用于巢式PCR扩增的第一轮扩增引物和第二轮扩增引物；

所述TSO引物为Seq ID No.3所示序列，oligo-dT引物为Seq ID No.4所示序列；

所述第一轮扩增引物包括Ld引物和配对的C区下游引物，Ld引物为rIgH-Ld1、rIgK-Ld1、rIgL-Ld1-1和rIgL-Ld1-2中的至少一条，C区下游引物为rIgHG-C1、rIgK-C1和rIgL-C1中的至少一条，

rIgH-Ld1为Seq ID No.5所示序列，rIgK-Ld1为Seq ID No.6所示序列，rIgL-Ld1-1为Seq ID No.7所示序列，rIgL-Ld1-2为Seq ID No.8所示序列，rIgHG-C1为Seq ID No.9所示序列，rIgK-C1为Seq ID No.10所示序列，rIgL-C1为Seq ID No.11所示序列；

所述第二轮扩增引物包括FR引物和配对的J引物，FR引物为rIgH-FR1和/或rIgK-FR1，J引物为rIgH-J、rIgK-J-1、rIgK-J-2和rIgL-J中的至少一条，

rIgH-FR1为Seq ID No.12所示序列，rIgK-FR1为Seq ID No.13所示序列，rIgH-J为SeqID No.14所示序列，rIgK-J-1为Seq ID No.15所示序列，rIgK-J-2为Seq ID No.16所示序列，rIgL-J为Seq ID No.17所示序列。