CN112292030A - 进行性骨化性纤维发育不良的啮齿类动物模型 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含经修饰的Acvr1基因的经遗传修饰的啮齿类动物，所述基因包含侧翼为位点特异性重组酶识别位点、处于反义方向的编码R258G的条件改变的外显子7，其中所述改变的外显子在重组酶作用下被倒位为有义方向，导致异位骨形成。

Description

进行性骨化性纤维发育不良的啮齿类动物模型
相关申请的变叉引用
本申请要求于2018年6月13日提交的美国临时申请号62/684,582、以及于2019年4月3日提交的美国临时申请号62/828,532的优先权权益，所述美国临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本公开内容涉及经遗传修饰的啮齿类动物和人疾病的啮齿类动物模型。更具体而言，本公开内容涉及其基因组包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的经遗传修饰的啮齿类动物；显示出进行性骨化性纤维发育不良(FOP)的表型特点，例如异位骨形成的啮齿类动物；其基因组包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的经分离的啮齿类动物组织和细胞；包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的经分离的核酸；制备经遗传修饰的啮齿类动物的组合物和方法；育种方法；以及使用经遗传修饰的啮齿类动物的方法。
以引用的方式并入的序列表
4KB的命名为36190_10461US01__SequenceListing.txt，于2019年6月6日创建，并且经由EFS-Web提交给美国专利及商标局(United States Patent and TrademarkOffice)的ASCII文本文件中序列表，以引用的方式并入本文。
背景技术
在说明书自始至终引用了各种出版物，包括专利、专利申请、公开的专利申请、登录号、技术文章和学术文章。这些引用的出版物各自整体且为了所有目的以引用的方式并入本文件中。
Acrvl是骨形态发生蛋白(BMP)的I型受体。人ACVRl基因中的某些突变，包括引起氨基酸修饰R206H或R258G的突变，与疾病进行性骨化性纤维发育不良(FOP)强相关(参见例如，美国专利申请公开号2009/0253132；Pignolo，R.J.(2011)Orphanet Journal of RareDiseases，6：80，1-6；以及Kaplan等人，Am J Med Genet A.2015；167(10)：2265-2271)。在Acvrl中携带R206H突变的嵌合小鼠发展FOP样表型(参见例如，Chakkalakal等人(2012)J.Bone and Mineral Res.27：1746-1756)。Acvrl基因中的某些突变，例如导致R206HAcvrl蛋白变体的突变，在小鼠中是围产期致死的，并且对通过啮齿类动物的种系传递包含该突变的敲入基因提出了挑战。
发明内容
本公开内容涉及经遗传修饰的啮齿类动物，其在其种系中包括包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的核酸序列。
本发明提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其在其种系中包括包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的核酸序列，其中经修饰的啮齿类动物Acvrl基因包含啮齿类动物Acvrl基因的条件性改变，其中所述改变致使啮齿类动物易受异位骨形成影响。
本发明提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其在其种系中包括包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的核酸序列，所述基因包含条件改变的Acvrl外显子，其中所述条件改变的Acvrl外显子的表达诱导对啮齿类动物赋予对异位骨形成的易感性。在一个实施例中，改变的Acvrl外显子是外显子7。在一个具体实施例中，改变的Acvrl外显子7包括导致Acvrl蛋白中的R258G氨基酸变异的改变。
本发明提供了有条件地表达改变的Acvrl等位基因的啮齿类动物。在各个方面，改变的Acvrl等位基因是对表达该等位基因的啮齿类动物赋予病理表型的等位基因。在各个方面，啮齿类动物包含在上游和下游侧翼为位点特异性重组酶识别位点(SRRS)的Acvrl等位基因的改变的外显子，并且所述啮齿类动物包含识别SRRS的重组酶，其中所述重组酶的活性是可诱导的。
本发明提供了包含啮齿类动物Acvrl基因的修饰的啮齿类动物，其，所述修饰引起(在一个实施例中，在杂合子中；在一个实施例中，在纯合子中)、促进或使得啮齿类动物易受异位骨形成影响。
本发明提供了包含啮齿类动物Acvrl基因的条件改变的啮齿类动物，其中所述改变的Acvrl等位基因不在子宫内表达，并且不在围产期表达，并且其中所述啮齿类动物以条件方式表达改变的Acvrl等位基因，其中通过向啮齿类动物施用目的化合物来诱导条件表达。
在一个方面，本发明提供了其基因组包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因座的啮齿类动物，所述基因座包含以反义方向的改变的Acvrl外显子，其中所述改变的Acvrl外显子在上游和下游侧翼为SRRS，所述SRRS定向为当通过识别SRRS的重组酶作用时指导倒位。
在一些实施例中，本发明提供了啮齿类动物，其基因组包含在内源性啮齿类动物Acvrl基因座内的经修饰的啮齿类动物Acvrl基因，经修饰的啮齿类动物Acvrl基因包含处于有义方向、并且在上游和下游侧翼为第一对SRRS′的功能性Acvrl外显子7，以及处于反义方向、并且在上游和下游侧翼为第二对SRRS′的改变的Acvrl外显子7，其中所述第一对SRRS′和第二对SRRS′这样定向，使得重组酶可以将改变的Acvrl外显子7倒位成有义方向，并且缺失功能性Acvrl外显子7，导致改变的Acvrl等位基因(即，包含改变的Acvrl等位基因)。在各个实施例中，除了外显子7之外，经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的剩余外显子是内源性啮齿类动物Acvrl基因的功能性外显子，例如在内源性啮齿类动物Acvrl基因座处存在的野生型啮齿类动物外显子。在各个实施例中，改变的Acvrl等位基因是对表达该等位基因的啮齿类动物赋予病理表型的等位基因。
在一些实施例中，本文提供的是经遗传修饰的啮齿类动物，其基因组包含在内源性啮齿类动物Acvrl基因座内的经修饰的啮齿类动物Acvrl基因，其中所述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因包含：(a)在上游和下游侧翼为第一对SRRS′、处于有义方向的编码R258的功能性Acvrl外显子7，以及(b)侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G变异的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；其中第一对SRRS’和第二对SRRS’这样定向，使得重组酶可以将改变的啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，缺失功能性Acvrl外显子7，并且允许表达包含改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因。在一些实施例中，包含改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因的表达导致异位骨形成。在各个实施例中，除了外显子7之外，经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的剩余外显子是内源性啮齿类动物Acvrl基因的功能性外显子，例如在内源性啮齿类动物Acvrl基因座处存在的野生型啮齿类动物外显子。
在一些实施例中，编码R258的功能性Acvrl外显子7是天然存在的、功能性啮齿类动物Acvrl外显子7，即野生型啮齿类动物Acvrl外显子7。在一些实施例中，编码R258的功能性Acvrl外显子7是基本上人的ACVRl外显子7。在一些实施例中，基本上人的ACVRl外显子7是天然存在的、功能性人ACVRl外显子7，即野生型人ACVRl外显子7。在其它实施例中，基本上人的ACVRl外显子7与野生型人ACVRl外显子7相差至少一个核苷酸(即，一个或多个核苷酸)，并且与野生型人ACVRl外显子7和改变的啮齿类动物Acvrl外显子7之间的序列同一性相比，与改变的啮齿类动物Acvrl外显子7具有降低的序列同一性。在一些实施例中，基本上人的ACVRl外显子7编码与野生型人ACVRl外显子7相同的氨基酸。
在一些实施例中，第一对SRRS′包括第一SRRS和第二SRRS，其中第一SRRS′和第二SRRS′彼此相容，并且定向为指导倒位。在一些实施例中，第二对SRRS′包括第三SRRS和第四SRRS，其中第三SRRS′和第四SRRS′彼此相容，定向为指导倒位，但与第一SRRS或第二SRRS不相容。
在一些实施例中，本发明提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其在啮齿类动物的种系中的Acvrl基因座处包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因，其中就Acvrl基因的转录方向而言，经修饰的啮齿类动物Acvrl基因包含：(i)处于有义方向的功能性外显子7(例如，基本上人的外显子7)，以及(ii)处于反义方向的改变的外显子7；并且包含由第一SRRS(SRRS1)和第二SRRS(SRRS2)组成的第一对SRRS′，以及由第三SRRS(SRRS3)和第四SRRS(SRRS4)组成的第二对SRRS′；其中SRRSl与SRRS2相容，SRRS3与SRRS4相容，但SRRSl和SRRS2均与SRRS3或SRRS4不相容，其中SRRS1位于功能性外显子7的上游，SRRS2位于反义改变的外显子7的紧下游(相对于Acvrl基因的转录方向)，其中SRRS1和SRRS2定向为指导倒位；其中SRRS3设置在功能性外显子7和改变的反义外显子7之间，并且SRRS4位于SRRS2的下游(相对于Acvrl基因的定向方向)，其中SRRS3和SRRS4定向为指导倒位。在一些实施例中，SRRS′1-4各自由相同的重组酶例如Cre识别。
在一些实施例中，第一对SRRS′是一对Lox2372位点，而第二对SRRS′是一对LoxP位点。在其它实施例中，第一对SRRS′是一对LoxP位点，而第二对SRRS′是一对Lox2372位点。
在一些实施例中，经遗传修饰的啮齿类动物还包含可诱导的重组酶，其识别SRRS，并且能够将反义改变的Acvrl外显子倒位成有义方向。在一个实施例中，编码可诱导的重组酶的基因在啮齿类动物的种系中，例如整合在内源性啮齿类动物ROSA26基因座处。
重组酶的诱导性可以在转录(基因表达)水平或蛋白质活性水平上实现。在一些实施例中，重组酶基因的表达是可诱导的、和/或发育调节的、和/或对某些组织或细胞类型特异性的。在其它实施例中，重组酶基因的表达是组成性的，并且重组酶的活性是可诱导的。
在一些实施例中，重组酶是Cre。在一些实施例中，SRRS是由Cre识别的lox位点或其变体。在一些实施例中，重组酶(例如，Cre)融合至响应由配体的结合的配体结合结构域。在一些实施例中，重组酶(例如Cre)融合至配体结合结构域，所述配体结合结构域是受体的配体结合结构域或源自受体的配体结合结构域，所述受体例如类固醇受体、糖皮质激素受体、类视黄醇受体、甲状腺受体或***受体(ER)。在一些实施例中，Cre融合至包含T2突变的ER配体结合结构域(本文称为Cre-ERT2)。Cre-ERT2融合蛋白响应由配体例如他莫昔芬或其功能类似物/衍生物的结合(即，被其激活)。在一个实施例中，编码CreERT2的基因存在于经遗传修饰的啮齿类动物的ROSA26基因座处。
在一些实施例中，本发明提供了突变型啮齿类动物，其源自上述经遗传修饰的啮齿类动物(即，源自包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的经遗传修饰的啮齿类动物，所述基因包含处于反义方向的条件性Acvrl改变)，其中所述突变型啮齿类动物具有这样的基因组，所述基因组包含处于有义方向的Acvrl改变，并且其中包含该改变的Acvrl基因在突变型啮齿类动物中表达，在一些实施例中，所述表达导致异位骨形成。
在一个实施例中，经遗传修饰的啮齿类动物是具有基因型Acvrl[R258G]FlEx/+；Gt(ROSA26)SorCreERt2/+的小鼠。
在一些实施例中，本发明提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达包含功能性Acvrl外显子7的Acvrl等位基因(例如，在子宫内和围产期)，其中在经遗传修饰的啮齿类动物通过重组酶的作用下，所述啮齿类动物表达包含R258G氨基酸变异的变体Acvrl蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了成年啮齿类动物，其表达特征在于R258G变异的Acvrl基因产物，其中至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的啮齿类动物细胞包含编码R258G变异的改变的Acvrl基因。在其它实施例中，本发明提供了成年啮齿类动物，其表达特征在于特异性组织或细胞类型中的R258G变异的Acvrl基因产物。
在一些实施例中，本发明提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物在其种系中包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因座，其在通过重组酶的作用下表达包含R258G变异的Acvrl蛋白。
在一些实施例中，本发明提供了表达包含R258G变异的蛋白质变体的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是非嵌合的(即，所述啮齿类动物中的所有细胞都表达变体蛋白质)。在一些实施例中，本发明提供了表达包含R258G变异的蛋白质变体的啮齿类动物，其中至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的啮齿类动物细胞表达蛋白质变体。
在一些实施例中，本发明提供了啮齿类动物，其在所述啮齿类动物的种系中表达来自经修饰的啮齿类动物Acvrl基因座的蛋白质变体，其中所述啮齿类动物的所有表达Acvrl的细胞都包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因，其编码包含R258G变异的Acvrl蛋白。在一个实施例中，啮齿类动物的所有生殖细胞都包含经修饰的啮齿类动物Acrvl基因座，其包含编码具有R258G变异的Acvrl蛋白的条件遗传修饰。
在一些实施例中，经遗传修饰的啮齿类动物对于遗传修饰是杂合的，所述遗传修饰即包含条件改变的经修饰的啮齿类动物Acvrl基因。在一些实施例中，啮齿类动物对于遗传修饰是纯合的。
在各个实施例中，经遗传修饰的啮齿类动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一些具体实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一些具体实施例中，啮齿类动物是大鼠。
在另一个方面，本文公开的是包含本文所述的经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的核酸。
在一些实施例中，经修饰的啮齿类动物Acvrl基因在核酸中包含在上游和下游侧翼为第一对SRRS′、处于有义方向的功能性Acvrl外显子7，以及在上游和下游侧翼为第二对SRRS′、处于反义方向的改变的Acvrl外显子7，其中所述第一对SRRS′和第二对SRRS′这样定向，使得重组酶可以将改变的Acvrl外显子7倒位成有义方向，并且缺失功能性Acvrl外显子7。在各个实施例中，除了外显子7之外，经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的剩余外显子是啮齿类动物Acvrl基因的功能性外显子，例如内源性啮齿类动物Acvrl基因的野生型外显子。
在一些实施例中，经修饰的啮齿类动物Acvrl基因在核酸中包含：(a)在上游和下游侧翼为第一对SRRS′、处于有义方向的编码R258的功能性Acvrl外显子7，以及(b)侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G变异的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；其中第一对SRRS'和第二对SRRS’这样定向，使得重组酶可以将改变的啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，缺失功能性Acvrl外显子7，并且允许表达包含改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因。在一些实施例中，包含改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因的表达导致异位骨形成。在各个实施例中，除了外显子7之外，经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的剩余外显子是啮齿类动物Acvrl基因的功能性外显子，例如啮齿类动物Acvrl基因的野生型外显子。
在一些实施例中，编码R258的功能性Acvrl外显子7是野生型啮齿类动物Acvrl外显子7。在一些实施例中，编码R258的功能性Acvrl外显子7是基本上人的ACVRl外显子7。在一些实施例中，基本上人的ACVRl外显子7是野生型人ACVRl外显子7。在其它实施例中，基本上人的ACVRl外显子7与野生型人ACVRl外显子7相差至少一个核苷酸，并且与野生型人ACVRl外显子7和改变的啮齿类动物Acvrl外显子7之间的序列同一性相比，与改变的啮齿类动物Acvrl外显子7具有降低的序列同一性。在一些实施例中，基本上人的ACVRl外显子7编码与野生型人ACVRl外显子7相同的氨基酸。
在一些实施例中，第一对SRRS′包括第一SRRS和第二SRRS，其中第一SRRS′和第二SRRS′彼此相容，并且定向为指导倒位。在一些实施例中，第二对SRRS′包括第三SRRS和第四SRRS，其中第三SRRS′和第四SRRS′彼此相容，定向为指导倒位，但与第一SRRS或第二SRRS不相容。
在一些实施例中，相对于Acvrl基因的转录方向，经修饰的啮齿类动物Acvrl基因在核酸中包含：(i)处于有义方向的功能性外显子7(例如，基本上人的外显子7)，以及(ii)处于反义方向的改变的外显子7；并且包含由第一SRRS(SRRS1)和第二SRRS(SRRS2)组成的第一对SRRS′，以及由第三SRRS(SRRS3)和第四SRRS(SRRS4)组成的第二对SRRS′；其中SRRS1与SRRS2相容，SRRS3与SRRS4相容，但SRRS1和SRRS2均与SRRS3或SRRS4不相容，其中SRRS1位于功能性外显子7的上游，SRRS2位于反义改变的外显子7的紧下游(相对于Acvrl基因的转录方向)，其中SRRS1和SRRS2定向为指导倒位；其中SRRS3设置在功能性外显子7和改变的反义外显子7之间，并且SRRS4位于SRRS2的下游(相对于Acvrl基因的定向方向)，其中SRRS3和SRRS4定向为指导倒位。在一些实施例中，SRRS′1-4各自由相同的重组酶例如Cre识别。
在另一个方面，本文公开的是啮齿类动物基因组，其包括包含上述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的核酸。
在一些实施例中，啮齿类动物基因组还包含编码可诱导的重组酶的基因，所述可诱导的重组酶识别SRRS′，并且能够使改变的外显子7倒位，并且缺失功能性外显子7。
在一些实施例中，重组酶是Cre。在一些实施例中，SRRS是由Cre识别的lox位点或其变体。在一些实施例中，重组酶(例如，Cre)融合至响应由配体的结合的配体结合结构域，例如响应由他莫昔芬或其功能类似物/衍生物的结合(即，被其激活)的Cre-ERT2。在一个实施例中，编码CreERT2的基因整合到啮齿类动物基因组的ROSA26基因座内。
在一个进一步方面，本文公开的是其基因组包含上述核酸的分离的啮齿类动物组织或细胞，即，组织或细胞的基因组包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因。在一些实施例中，分离的啮齿类动物组织或细胞包含在内源性啮齿类动物Acvrl基因座内的经修饰的Acvrl基因。在一些实施例中，分离的啮齿类动物细胞是胚胎干(ES)细胞。在一些实施例中，分离的啮齿类动物组织或细胞是啮齿类动物卵或啮齿类动物胚胎。分离的啮齿类动物组织或细胞包括例如小鼠或大鼠的组织或细胞。
在一些实施例中，分离的啮齿类动物组织或细胞在其基因组中包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因，所述基因包含处于有义方向、并且在上游和下游侧翼为第一对SRRS′的功能性Acvrl外显子7，以及处于反义方向、并且在上游和下游侧翼为第二对SRRS′的改变的Acvrl外显子7，其中所述第一对SRRS′和第二对SRRS′这样定向，使得重组酶可以将改变的Acvrl外显子7倒位成有义方向，并且缺失功能性Acvrl外显子7。在各个实施例中，除了外显子7之外，经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的剩余外显子是内源性啮齿类动物Acvrl基因的功能性外显子，例如在内源性啮齿类动物Acvrl基因座处存在的野生型外显子。
在一些实施例中，分离的啮齿类动物组织或细胞在其基因组中包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因，所述基因包含：(a)在上游和下游侧翼为第一对SRRS′、处于有义方向的编码R258的功能性Acvrl外显子7，以及(b)侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G变异的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；其中第一对SRRS’和第二对SRRS’这样定向，使得重组酶可以将改变的啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，缺失功能性Acvrl外显子7，并且允许表达包含改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因。在一些实施例中，包含改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因的表达导致异位骨形成。在各个实施例中，除了外显子7之外，经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的剩余外显子是内源性啮齿类动物Acvrl基因的功能性外显子，例如在内源性啮齿类动物Acvrl基因座处存在的野生型外显子。
在一些实施例中，编码R258的功能性Acvrl外显子7是野生型啮齿类动物Acvrl外显子7。在一些实施例中，编码R258的功能性Acvrl外显子7是基本上人的ACVRl外显子7。在一些实施例中，基本上人的ACVRl外显子7是野生型人ACVRl外显子7。在其它实施例中，基本上人的ACVRl外显子7与野生型人ACVRl外显子7相差至少一个核苷酸，并且与野生型人ACVRl外显子7和改变的啮齿类动物Acvrl外显子7之间的序列同一性相比，与改变的啮齿类动物Acvrl外显子7具有降低的序列同一性。在一些实施例中，基本上人的ACVRl外显子7编码与野生型人ACVRl外显子7相同的氨基酸。
在一些实施例中，第一对SRRS′包括第一SRRS和第二SRRS，其中第一SRRS′和第二SRRS′彼此相容，并且定向为指导倒位。在一些实施例中，第二对SRRS′包括第三SRRS和第四SRRS，其中第三SRRS′和第四SRRS′彼此相容，定向为指导倒位，但与第一SRRS或第二SRRS不相容。
在一些实施例中，分离的啮齿类动物组织或细胞在其基因组中包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因，相对于Acvrl基因的转录方向，所述基因包含：(i)处于有义方向的功能性外显子7(例如，基本上人的外显子7)，以及(ii)处于反义方向的改变的外显子7；并且包含由第一SRRS(SRRS1)和第二SRRS(SRRS2)组成的第一对SRRS′，以及由第三SRRS(SRRS3)和第四SRRS(SRRS4)组成的第二对SRRS′；其中SRRS1与SRRS2相容，SRRS3与SRRS4相容，但SRRS1和SRRS2均与SRRS3或SRRS4不相容，其中SRRS1位于功能性外显子7的上游，SRRS2位于反义改变的外显子7的紧下游(相对于Acvrl基因的转录方向)，其中SRRS1和SRRS2定向为指导倒位；其中SRRS3设置在功能性外显子7和改变的反义外显子7之间，并且SRRS4位于SRRS2的下游(相对于Acvrl基因的定向方向)，其中SRRS3和SRRS4定向为指导倒位。在一些实施例中，SRRS′1-4各自由相同的重组酶例如Cre识别。
在一个进一步方面，本文公开的是用于啮齿类动物基因组中的Acvrl基因的靶向修饰的核酸构建体，也称为“靶向核酸”。
在一些实施例中，靶向核酸包含：(a)在上游和下游侧翼为第一对SRRS′、处于有义方向的编码R258的功能性Acvrl外显子7，以及(b)侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G变异的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；其中第一对SRRS’和第二对SRRS’这样定向，使得重组酶可以将改变的啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，并且缺失功能性Acvrl外显子7。在一些实施例中，功能性外显子7和改变的外显子7各自侧翼为内含子序列。通常，靶向核酸构建体包含5′和3′同源臂(与在待靶向的基因座处的核苷酸序列同源的核苷酸序列)，其介导同源臂之间的核酸序列的同源重组和整合。在一些实施例中，靶向核酸构建体还包含选择标记物基因，以促进正确靶向克隆的鉴定和选择。
在一些实施例中，编码R258的功能性Acvrl外显子7是野生型啮齿类动物Acvrl外显子7。在一些实施例中，编码R258的功能性Acvrl外显子7是基本上人的ACVRl外显子7。在一些实施例中，基本上人的ACVRl外显子7是野生型人ACVRl外显子7。在其它实施例中，基本上人的ACVRl外显子7与野生型人ACVRl外显子7相差至少一个核苷酸，并且与野生型人ACVRl外显子7和改变的啮齿类动物Acvrl外显子7之间的序列同一性相比，与改变的啮齿类动物Acvrl外显子7具有降低的序列同一性。在一些实施例中，基本上人的ACVRl外显子7编码与野生型人ACVRl外显子7相同的氨基酸。
在一些实施例中，第一对SRRS′包括第一SRRS和第二SRRS，其中第一SRRS′和第二SRRS′彼此相容，并且定向为指导倒位。在一些实施例中，第二对SRRS′包括第三SRRS和第四SRRS，其中第三SRRS′和第四SRRS′彼此相容，定向为指导倒位，但与第一SRRS或第二SRRS不相容。
在一些实施例中，相对于Acvrl基因的转录方向，靶向核酸包含：(i)处于有义方向的功能性外显子7(例如，基本上人的外显子7)，以及(ii)处于反义方向的改变的外显子7；并且包含由第一SRRS(SRRS1)和第二SRRS(SRRS2)组成的第一对SRRS′，以及由第三SRRS(SRRS3)和第四SRRS(SRRS4)组成的第二对SRRS′；其中SRRS1与SRRS2相容，SRRS3与SRRS4相容，但SRRS1和SRRS2均与SRRS3或SRRS4不相容，其中SRRS1位于功能性外显子7的上游，SRRS2位于反义改变的外显子7的紧下游(相对于Acvrl基因的转录方向)，其中SRRS1和SRRS2定向为指导倒位；其中SRRS3设置在功能性外显子7和改变的反义外显子7之间，并且SRRS4位于SRRS2的下游(相对于Acvrl基因的定向方向)，其中SRRS3和SRRS4定向为指导倒位。在一些实施例中，SRRS′1-4各自由相同的重组酶例如Cre识别。
在另一个方面，本文公开的是制备经遗传修饰的啮齿类动物的方法，其包括如本文所述的修饰啮齿类动物基因组，以包含在内源性啮齿类动物Acvrl基因座内的经修饰的啮齿类动物Acvrl基因。
在一些实施例中，通过包括以下的方法修饰啮齿类动物基因组：将本文所述的靶向核酸构建体引入啮齿类动物胚胎干(ES)细胞内；获得其基因组包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的啮齿类动物ES细胞；并且通过使用包含经修饰的基因组的啮齿类动物ES细胞，来制备经遗传修饰的啮齿类动物。例如，将靶向核酸引入啮齿类动物ES细胞内，其中所述靶向核酸包含：(a)在上游和下游侧翼为第一对SRRS′、处于有义方向的编码R258的功能性Acvrl外显子7，以及(b)侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G变异的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；其中第一对SRRS’和第二对SRRS’这样定向，使得重组酶可以将改变的啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，并且缺失功能性Acvrl外显子7。可以选择这样的啮齿类动物ES细胞，其基因组已进行修饰，并且包含在上游和下游侧翼为第一对SRRS′、处于有义方向的编码R258的功能性Acvrl外显子7，以及侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G变异的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7。此类啮齿类动物ES细胞可以用于制备啮齿类动物。
在一些实施例中，通过本方法制备，并且包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的经遗传修饰的啮齿类动物，还包含可诱导的重组酶(例如，Cre)。在一些实施例中，编码可诱导的重组酶的核酸存在于啮齿类动物ES细胞的基因组中，在所述ES细胞内引入靶向核酸构建体。在一些实施例中，首先制备在其基因组中包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的啮齿类动物，然后与在其基因组中包含编码可诱导的重组酶的核酸的另一个啮齿类动物杂交。
在一些实施例中，可诱导的重组酶在啮齿类动物中被激活，并且作用于使改变的外显子7倒位，并且缺失功能性外显子，以允许表达包含改变(例如，R258G)的Acvrl蛋白。
在一个进一步方面，本文公开的是育种啮齿类动物和获得的啮齿类动物后代的方法。
在一些实施例中，本文公开的是包括以下的方法：使其基因组包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的第一啮齿类动物与第二啮齿类动物育种，得到其基因组包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的后代啮齿类动物。本文已描述了经修饰的啮齿类动物Acvrl基因；例如，经修饰的啮齿类动物Acvrl基因可以包含处于有义方向、并且在上游和下游侧翼为第一对SRRS′的功能性Acvrl外显子7，以及处于反义方向、并且在上游和下游侧翼为第二对SRRS′的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7，其中所述第一对SRRS′和第二对SRRS′这样定向，使得重组酶可以将改变的Acvrl外显子7倒位成有义方向，并且缺失功能性Acvrl外显子7。在一些实施例中，改变的啮齿类动物Acvrl外显子7编码R258G变异，并且功能性Acvrl外显子7是编码R258的基本上人的ACVRl外显子7。
在一些实施例中，第二啮齿类动物包含可诱导的重组酶。在一些实施例中，可诱导的重组酶是可诱导的Cre重组酶。在一些实施例中，可诱导的Cre重组酶是可通过配体，例如他莫昔芬或其功能衍生物或类似物的结合诱导的Cre-ERT2重组酶。
在一些实施例中，后代啮齿类动物包含可诱导的重组酶。在一些实施例中，可诱导的重组酶是可诱导的Cre重组酶。在一些实施例中，诱导型Cre重组酶是Cre-ERT2重组酶，
在一些实施例中，可诱导的重组酶在细胞或组织，例如后代啮齿类动物的选定细胞或组织中表达。在一些实施例中，表达的重组酶在细胞或组织中起作用，以将改变的Acvrl外显子7倒位成有义方向，并且缺失功能性Acvrl外显子7，从而允许表达包含改变的外显子7的改变的Acvrl等位基因。
本文还提供的是从本文公开的育种方法获得的后代啮齿类动物。
在另外一个方面，表达改变的Acvrl等位基因的经遗传修饰的啮齿类动物用作异位骨化病症的模型。在一个实施例中，异位骨化病症是进行性骨化性纤维发育不良(FOP)。在一些实施例中，表达改变的Acvrl等位基因的经遗传修饰的啮齿类动物用于评估候选治疗化合物，用于确定候选化合物是否可以抑制啮齿类动物中的异位骨形成的发展。
附图说明
图1示出了Acvrl野生型至R258G FlEx的示意图。顶部示意图显示了在敲入和Neo缺失后的Acvrl基因组区域。底部示意图显示了在Cre介导的倒位和缺失后的基因组区域，所述倒位和缺失将突变型外显子以正常位置和方向放置。使用人外显子(空心框)和侧翼内含子(空心条)序列，以降低在转录过程中用倒位的小鼠外显子/内含子(条纹框/条纹条)序列的发夹形成。对人外显子进行另外的核苷酸改变，以进一步降低与小鼠外显子的序列同一性。
图2显示了在他莫昔芬治疗后，Acvrrl[R258G]FlEx/+；Gt(ROSA26)SorrCreERt2/+小鼠发展异位骨化(HO)。四只Acvrl[R258G]FlEx/+；Gt(ROSA26)SorCreERt2/+小鼠给予每天5次的40mg/kg他莫昔芬注射。在2周后，所有小鼠都显示了HO形成。
图3显示了抗激活素A阻断抗体抑制AcvrlR258G条件性敲入小鼠中的HO形成。
具体实施方式
进行性骨化性纤维发育不良(FOP)是异位骨形成的常染色体显性病症。大约95％的FOP由I型激活素A受体(Acvrl)中的R206H突变引起。然而，已报道GS或激酶结构域中的其它几个突变，包括R258G，引起具有更严重表型的非典型FOP。具有R258G突变的两个患者除在出生后发展异位骨化之外，还具有严重的发育异常(Kaplan等人，Am J Med GenetA.2015；167(10)：2265-2271)。
本发明提供了能够表达Acvrl蛋白的经遗传修饰的啮齿类动物，所述Acvrl蛋白包含导致特征在于异位骨形成的病症例如FOP的改变。在一些实施例中，表达改变的Acvrl蛋白的啮齿类动物包括并非嵌合的啮齿类动物，例如其基因组携带包含条件改变的经修饰的Acvrl基因的啮齿类动物，一旦表达，所述基因导致啮齿类动物中的异位骨形成。
本发明提供了包含FlEx设计的经遗传修饰的啮齿类动物，所述FlEx设计提供了功能性外显子的条件缺失和功能性外显子由改变的外显子的替换。功能性外显子编码蛋白质的氨基酸，所述蛋白质是有功能的，即执行其预计的生物学功能。在一些实施例中，功能性外显子是天然存在的野生型外显子。在一些实施例中，功能性外显子编码与野生型外显子相同的氨基酸。FlEx允许通过将编码改变的外显子的核酸序列置于反义链中紧靠功能性外显子来形成条件等位基因，所述功能性外显子后来被缺失。通过利用选定的位点特异性重组酶识别位点(SRRS)，在其同源重组酶的存在下，将倒位的改变的外显子带到有义链，并且因此也与基因的剩余部分一起在框内，而功能性外显子被缺失。这种FlEx方法依赖在功能性外显子和改变的外显子周围放置不相容的SRRS(例如lox2372和loxP)。因此，FlEx方法的一个优点在于：除非FlEx等位基因受到所选重组酶的作用，否则(围产期/胚胎)致死突变不表达。这种FlEx方法的另一个优点在于：在暴露于所选重组酶后功能性外显子的永久去除，并且因此反向重复不再保留在倒位后的基因组中，其消除了使野生型等位基因再生的可能性。FlEx方法的另外一个优点在于：有义链中改变的外显子的永久固定，其起因于两种不同类型的SRRS各自之一(例如，两个lox2372位点之一和loxP位点之一)的去除。通过野生型啮齿类动物外显子的人源化衍生的功能性外显子还使反向重复序列降到最低，因此促进克隆步骤，并且减轻在靶向过程中以及在靶向后、以及在相应mRNA的成熟期间的RNA剪接伪像的担忧。在一些实施例中，在FlEx设计中使用基本上人的野生型外显子。“人野生型外显子”或“人外显子”指来自人的天然存在的功能性外显子。术语“基本上人的野生型外显子”或“基本上人的外显子”包括天然存在的、功能性人外显子及其修饰形式两者，其中天然存在的人外显子的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个)核苷酸已被改变。在具体实施例中，一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个)核苷酸已被改变，而未改变编码的氨基酸(基本上改变的密码子选择)，以降低与啮齿类动物外显子的序列同一性，其进一步使反向重复序列降到最低，并且降低了重排的可能性。
如果使携带FlEx等位基因的啮齿类动物与含有重组酶的啮齿类动物育种，则改变的等位基因将在子代中的子宫内表达；并且如果改变是围产期/胚胎致死性改变，则可能损害制备可以研究表达等位基因的动物的目标。因此，携带FlEx等位基因的啮齿类动物不与未调节的含重组酶的啮齿类动物育种。相反，使携带FlEx等位基因的啮齿类动物与表达重组酶的啮齿类动物育种，所述重组酶的活性是可诱导的(例如，响应诱导物)(即，可诱导的重组酶)。可以通过将重组酶与蛋白质的配体结合结构域融合来制备可诱导的重组酶，在结合其同源配体或同源配体的功能性衍生物时，所述配体结合结构域致使蛋白质有功能(例如，通过使蛋白质稳定)。同源配体的功能性衍生物指这样的化合物，其与同源配体在结构上类似，并且执行基本上相同的功能(即，与相同的受体结合)。此类配体结合结构域的例子包括但不限于类固醇受体、糖皮质激素受体、类视黄醇受体和甲状腺受体的配体结合结构域(Eilers等人(1989)Nature 340：66-68；Picard等人(1988)Cell 54：1073-1080)。在一些实施例中，可诱导的重组酶是Cre与由T2突变(由Cre-ERT2等位基因编码)修饰的***受体(ER)之间的融合蛋白。对于这种融合蛋白，在不存在ER配体的情况下，Cre重组酶是无活性的(参见Indra，A.等人(1999)，Nucleic Acids Res.27(22)：4324-4327；Feil，R.等人(1997)Biochem.Biophys.Res.Commun.237：752-757；美国专利号7,112,715)，并且当提供ER的配体例如他莫昔芬或他莫昔芬的功能性衍生物时，Cre重组酶变得有活性。因此，包含如本文所述用Cre-响应性SRRS构建的条件等位基因，且含有Cre-ERT2等位基因的啮齿类动物，因此表达包含功能性外显子的等位基因，除非且直到啮齿类动物暴露于ER的配体以诱导Cre活性。以这种方式，生成了这样的啮齿类动物，其在其种系中含有经修饰的Acvrl基因，但并不表达相应的变体Acvrl蛋白，除非且直到啮齿类动物暴露于ER的配体(例如他莫昔芬)。在暴露于配体之后，Cre-ERT2融合蛋白被激活，并且条件等位基因被转换为相应的改变的等位基因。
可以经由各种途径将配体施用于啮齿类动物，以诱导重组酶的活性，所述途径包括肠胃外和非肠胃外的施用途径。肠胃外途径包括例如静脉内、动脉内、门静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊柱内、鞘内、脑室内、颅内、胸膜内或其它注射途径。非肠胃外途径包括例如经口、经鼻、经皮、经肺、经直肠、经颊、经***、经眼。在具体实施例中，经由腹膜内注射将配体施用于啮齿类动物。
在各个实施例中，对改变的等位基因的转换是不可逆的，伴随功能性外显子的缺失。以这种方式，含有否则致命的Acvrl突变的啮齿类动物系可以基本上无限期地得到维持，每当需要时产生所需的遗传损伤和伴随的表型。
本文提供的啮齿类动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在具体实施例中，啮齿类动物是小鼠。Acvrl跨越物种是高度保守的，其中R258是保守的，并且对于小鼠和大鼠在相同的位置处。
在一些实施例中，啮齿类动物是C57BL品系的小鼠，例如选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系。在其它实施例中，啮齿类动物是129品系的小鼠，例如选自129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2的129品系(参见例如Festing等人(1999)，Mammalian Genome 10：836；Auerbach等人(2000)，Biotechniques 29(5)：1024-1028，1030，1032)。在一些实施例中，啮齿类动物是其为前述129品系和前述C57BL/6品系的混合物的小鼠。在某些实施例中，小鼠是前述129品系的混合物(即杂种)、或前述C57BL品系的混合物、或C57BL品系和129品系的混合物。在某些实施例中，小鼠是C57BL/6品系与129品系的混合物。在具体实施例中，小鼠是VGF1品系，也称为F1H4，其为C57BL/6和129的杂种。在其它实施例中，小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在一些实施例中，小鼠是BALB品系和另一个前述品系的混合物。
在一些实施例中，啮齿类动物是大鼠。在某些实施例中，大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和Dark Agouti。在其它实施例中，大鼠是选自以下的两个或更多个品系的混合物：Wistar、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti。
包含R258G变异的条件Acvrl等位基因可以通过利用FlEx方法进行改造。参见例如，Schnutgen，F.等人(2003)Nat.Biotech.21：562-565；以及美国专利号7,205,148。FlEx采用一对突变型Lox位点--称为FlEx阵列--其被相同的重组酶(Cre)识别，但并不相互反应，并且以A-B/[A-B]构型排列，其中″[A-B]″处于相对于″A-B”的相反链中，以致使侧翼为阵列的DNA序列的倒位。在一些实施例中，LoxP-Lox2372对用作本文所述的条件等位基因的突变型Lox位点的组合。这两个突变型Lox位点并未显示出交叉反应性。每个阵列内--即每个阵列的LoxP和Lox2372位点之间的包含的序列在通过Cre作用后被缺失。条件等位基因的一个实施例在图1中示出。
小鼠Acvrl展示了各种剪接变体(例如Acvrl-201、202、203、204)。FOP中突变的外显子由Acvrl的所有编码蛋白质的剪接变体共享。在一个实施例中，本文公开的是条件Acvrl等位基因，其包含同种型Acvrl-201的外显子7(ENSMUSE00001232449)的修饰。
可以通过将啮齿类动物Acvrl的编码氨基酸258的外显子的改变版本(例如，ENSMUSE00001232449)置于反义链中，来改造Acvrl[R258G]FlEx等位基因，使得改变的外显子并不掺入Acvrl的转录物内。由于由外显子7编码的序列是Acvrl功能所需的，因此这使得需要将功能性外显子7也掺入设计内(外显子7由Acvrl的所有编码蛋白质的剪接变体共享)。此外，由于外显子如果没有附属内含子序列本身不能被识别，因此外显子的上游序列和下游序列两者也掺入改变的和功能性的编码氨基酸258的外显子两者内。然而，这样做将生成大的反向重复，并且在构建靶向载体所需的遗传工程步骤以及靶向后两个过程中，此类DNA结构固有地倾向于在体内重组(Holkers，M.等人(2012)Nucleic Acids Res.40：1984-1999)。此外，如果编码氨基酸258的外显子的野生型啮齿类动物序列、以及与该外显子相关的上游和下游内含子序列，被完整保留并且位于改变的啮齿类动物外显子之前，则该野生型区域可以充当同源臂，并且在啮齿类动物ES细胞中的靶向过程中加以利用，从而导致改变的外显子从靶向等位基因中排除。
因此，可以以这样的方式设计Acvrl[R258G]FlEx等位基因，使得：
a)避免大的反向重复。为了实现这点，编码R258的外显子(例如ENSMUSE00001232449)以及相关的上游和下游内含子序列，可以替换为来自人ACVRl的相应区域。
b)编码R258的外显子(例如ENSMUSE00001232449)的野生型啮齿类动物序列在蛋白质水平上得到保存。分别由外显子ENSMUSE00001232449和ENSE00001009617编码的小鼠和人蛋白质序列是等同的。然而，当可能时，可以改变人外显子序列(例如，ENSE00001009617)内的密码子，以进一步降低啮齿类动物和人外显子之间的核苷酸序列同一性，而不改变由外显子编码的氨基酸。
c)引入的人序列在通过Cre作用后整体去除。因此，在“条件开启”状态下-其中Acvrl[R258G]突变基因被转录-没有人序列残留，并且因此，任何所得到的表型都不能归于外来序列的存在。
更具体而言，作为例子，以这样的方式将mmuAcvrl中由核苷酸58468399至58468770限制的区域(即，小鼠染色体2，GRCm38/mm10的核苷酸58468399至58468770)替换为由hsaACVRl的核苷酸157770252至157770625组成的核酸(即，人染色体2，GRCh38/hg38的核苷酸157770252至157770625)，使得包括hsaACVRl外显子ENSE00001009617的引入序列作为所得到的经修饰的Acvrl[R258G]FlEx基因座的部分转录。另外，通过改变密码子选择，改变了人外显子ENSE00001009617的核苷酸序列，以降低小鼠和人外显子之间的序列同一性，而不改变蛋白质编码。这种引入的人序列在下文中称为hsa_e7+。因此，在FlEx元素(改变的外显子ENSMUSE00001232449以及相关的上游和下游内含子序列-参见下文)的倒位之前，所得到的基因座Acvrl[R258G]FlEx应该充当野生型。
通过将由核苷酸58468530至58468532定义的密码子从AGG(编码精氨酸)改变为GGG(编码甘氨酸)，通过改变相应位置中的外显子ENSMUSE00001232449来模拟R258G变异。将所得到的突变型外显子，连同侧翼内含子序列一起，置于hsa_e7+的3′和mmuAcvrl的反义链中。另外，mmuAcvrl的核苷酸58468771-58468815被缺失，以便产生容纳LOA探针的小缺失(Gomez-Rodriguez，J.等人(2008)Nucleic Acids Res.36：e117；Valenzuela，D.等人(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis，Nat.Biotech.21：652-659)。这种引入的突变的小鼠序列在下文中称为mmu_e7R258G+。
人外显子7的示例性序列、编码R258G的改变的小鼠外显子7、以及改变的人外显子7、连同上游和下游内含子序列一起概括于下文，并且在序列表中阐述。
SEQ ID NO描述
1 人外显子7
2 具有密码子改变的人外显子7
3 包括密码子改变的外显子7和周围内含子的人序列
4 编码R258G的小鼠改变的外显子7
5 小鼠改变的外显子7(与构建体中相反)
6 包括改变的外显子7和周围内含子的小鼠序列
7 包括改变的外显子7和周围内含子(与构建体中相反)的小鼠序列
8 大鼠外显子7
为了使得mmu_e7R258G+的Cre依赖性倒位和hsa_e7+的同时缺失成为可能，这样使用FlEx样Lox阵列的组合，使得：
a)hsa_e7+之前为LoxP位点，且随后为Lox2372位点。在这方面，hsa_e7+与5′LoxP-Lox2372 FlEx样阵列一起包含。
b)mmu_e7R258G+随后为3′LoxP-Lox2372 FlEx样阵列，但这个阵列这样进行改造，使得其与5′LoxP-Lox2372 FlEx样阵列处于镜像配置。这使得能够通过Cre将mmu_e7R258G+永久倒位到有义链内。
当所得到的等位基因Acvrl[R258G]FlEx暴露于Cre时，hsa_e7+被缺失，而mmu_e7R258G+被倒位到有义链内。结果，Acvrl[R258G]将代替Acvrl表达。
可以制备上述包含Acvrl FlEx等位基因的靶向核酸构建体，用于将Acvrl FlEx等位基因引入啮齿类动物基因组内。除Acvrl FlEx序列(处于有义方向的基本上人的外显子7和周围内含子序列，处于反义方向的编码R258G的改变的啮齿类动物外显子7和周围内含子序列，以及重组识别位点)之外，核酸构建体还可以包括侧翼序列，其具有合适的长度，并且与在内源性啮齿类动物Acvrl基因座处的啮齿类动物Acvrl基因序列同源，以便能够介导Acvrl FlEx序列的同源重组和整合到内源性啮齿类动物Acvrl基因座内。
在一些实施例中，将包含Acvrl FlEx等位基因的靶向核酸构建体引入啮齿类动物胚胎干(ES)细胞内，以修饰ES细胞的基因组。小鼠ES细胞和大鼠ES细胞两者在本领域中已得到描述。参见例如，美国专利号7,576,259、7,659,442和7,294,754，以及美国公开号2008/0078000 A1(所述专利全部以引用的方式并入本文)，描述了小鼠ES细胞和用于制备经遗传修饰的小鼠的
Figure BDA0002823803340000191
方法；并且美国公开号2014/0235933 A1和美国公开号2014/0310828 A1(所述专利全部以引用的方式并入本文)，描述了大鼠ES细胞和用于制备经遗传修饰的大鼠的方法。
可以选择具有整合在内源性啮齿类动物Acvrl基因座中的Acvrl FlEx等位基因的ES细胞。然后，通过使用
Figure BDA0002823803340000192
方法(参见例如，美国专利号7,576,259、7,659,442和7,294,754，以及美国公开号2008/0078000 A1)，或者美国公开号2014/0235933A1和2014/0310828 A1中描述的方法，将具有整合在基因组中的Acvrl FlEx等位基因的ES细胞用作供体ES细胞，用于注射到桑椹前期胚胎(例如，8细胞期胚胎)内。使包含供体ES细胞的胚胎温育直到胚泡期，然后植入***母体内，以产生完全源自供体ES细胞的F0啮齿类动物。可以通过使用例如等位基因缺失测定(Valenzuela等人，同上)，通过从尾巴剪断中分离的DNA的基因分型，来鉴定携带FlEx等位基因的啮齿类动物幼仔。
在各个实施例中，包含Acvrl FlEx等位基因的经遗传修饰的啮齿类动物通过以下进行制备：修饰啮齿类动物ES细胞以含有FlEx等位基因，并且修饰相同ES细胞以含有编码可诱导的重组酶(例如，Cre-ERT2)的基因，并且使用ES细胞作为供体细胞来制备含有FlEx等位基因和编码可诱导的重组酶的基因的啮齿类动物。在一些实施例中，包含Acvrl FlEx等位基因的经遗传修饰的啮齿类动物通过以下进行制备：使用已经包含编码可诱导的重组酶(例如，Cre-ERT2)的基因的啮齿类动物ES细胞，并且修饰此类啮齿类动物ES细胞以包含FlEx等位基因。在其它实施例中，制备包含Acvrl FlEx等位基因的经遗传修饰的啮齿类动物，并且与含有编码可诱导的重组酶(例如，Cre-ERT2)的基因的啮齿类动物杂交，以获得含有FlEx等位基因和编码可诱导的重组酶的基因的子代。
AcvrlR258GFlEx/+；Gt(ROSA26)SorCreERt2/+成年小鼠是表型正常的；然而，编码R258G的Acvrl等位基因的全身激活导致渐进性骨化，早在用他莫昔芬给药后2周用射线照相显而易见，其方式类似于用美国专利号9,510,569中所述的Acvrl R206H Flex小鼠可见的那种。还参见图2。
本文提供的啮齿类动物允许更好地理解异位骨病症例如FOP发展的基础分子机制。另外，此类啮齿类动物可以用于治疗性化合物的筛选和开发中，所述治疗性化合物用于抑制、预防和/或治疗异位骨病症包括FOP。
在一些实施例中，通过将化合物施用于本文公开的啮齿类动物，即，携带AcvrlFlEx等位基因的啮齿类动物，在体内测试候选治疗化合物。
候选治疗化合物可以是但不限于小分子化学化合物、抗体、抑制性核酸或其任何组合。在一个具体实施例中，化合物是抗体或其抗原结合片段，例如抗Acvrl抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，化合物包含激活素受体1、2A型激活素受体和2B型激活素受体中的一种或多种的拮抗剂。任何此类拮抗剂均可以包含抗体。在一些实施例中，化合物包含针对激活素A的抗体。针对激活素受体1、2A型激活素受体、2B型激活素受体或激活素A的拮抗剂或抗体可以是美国公开号2018/0111983中描述或例示的任何拮抗剂或抗体，所述专利以引用的方式并入本文。
化合物的施用可以在啮齿类动物中诱导重组酶活性，以允许表达突变型Acvrl等位基因之前、过程中或之后执行。候选治疗化合物可以经由任何所需的施用途径来给药，所述途径包括肠胃外和非肠胃外的施用途径。肠胃外途径包括例如静脉内、动脉内、门静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊柱内、鞘内、脑室内、颅内、胸膜内或其它注射途径。非肠胃外途径包括例如经口、经鼻、经皮、经肺、经直肠、经颊、经***、经眼。施用也可以通过连续输注、局部施用、从植入物(凝胶、膜或类似物)的持续释放和/或静脉内注射。
使用得自所述啮齿类动物的样品，可以执行各种测定，以确定所施用化合物的药代动力学特性。药代动力学特性包括但不限于非人动物如何将化合物加工成各种代谢产物(或检测一种或多种代谢产物，包括但不限于毒性代谢产物的存在或不存在)、化合物的半衰期、循环水平(例如血清浓度)、抗化合物应答(例如抗体)、吸收和分布、施用途径、***途径和/或清除率。
在一些实施例中，执行测定包括确定施用化合物的突变型啮齿类动物和未施用化合物的突变型啮齿类动物之间的差异，并且确定化合物是否可以抑制啮齿类动物中的异位骨形成的发展和/或进展。
本说明书通过下述实例进一步示出，所述实例不应以任何方式解释为限制性的。所有引用的参考文献(包括如本申请自始至终引用的文献引用、授权专利和公开的专利申请)的内容在此明确地以引用的方式并入。
实例1
以这样的方式将mmuAcvrl中由核苷酸58468399至58468770限制的区域(即，小鼠染色体2，GRCm38/mm10的核苷酸58468399至58468770)替换为由hsaACVRl的核苷酸157770252至157770625组成的核酸(即，人染色体2，GRCh38/hg38的核苷酸157770252至157770625)，使得包括hsaACVRl外显子ENSE00001009617的引入序列作为所得到的经修饰的Acvrl[R258G]FlEx基因座的部分转录。另外，通过改变密码子选择，改变了人外显子ENSE00001009617的核苷酸序列，以降低小鼠和人外显子之间的序列同一性，而不改变蛋白质编码。这种引入的人序列在下文中称为hsa_e7+。因此，在FlEx元素(改变的外显子ENSMUSE00001232449以及相关的上游和下游内含子序列-参见下文)的倒位之前，所得到的基因座Acvrl[R258G]FlEx应该充当野生型。
通过将由核苷酸58468530至58468532定义的密码子从AGG(编码精氨酸)改变为GGG(编码甘氨酸)，通过改变相应位置中的外显子ENSMUSE00001232449来模拟R258G变异。将所得到的改变的外显子，连同侧翼内含子序列一起，置于hsa_e7+的3′和mmuAcvrl的反义链中。另外，mmuAcvrl的核苷酸58468771-58468815被缺失，以便产生容纳LOA探针的小缺失(Gomez-Rodriguez，J.等人(2008)Nucleic Acids Res.36：e117；Valenzuela，D.等人(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis，Nat.Biotech.21：652-659)。这种引入的突变的小鼠序列在下文中称为mmu_e7R258G+。
为了使得mmu_e7R258G+的Cre依赖性倒位和hsa_e7+的同时缺失成为可能，这样使用FlEx样Lox阵列的组合，使得：
a)hsa_e7+之前为LoxP位点，且随后为Lox2372位点。在这方面，hsa_e7+与5′LoxP-Lox2372 FlEx样阵列一起包含。
b)mmu_e7R258G+随后为3′LoxP-Lox2372 FlEx样阵列，但这个阵列这样进行改造，使得其与5′LoxP-Lox2372 FlEx样阵列处于镜像配置。这使得能够通过Cre将mmu_e7R258G+永久倒位到有义链内。
当所得到的等位基因Acvrl[R258G]FlEx暴露于Cre时，hsa_e7+被缺失，而mmu_e7R258G+被倒位到有义链内。结果，Acvrl[R258G]将代替Acvrl表达。
纯合的Acvrl[R258G]FlEx/R258G]FlEx]小鼠以预计的孟德尔比率出生，提示剪接在该小鼠中是正常的，并且正在表达野生型Acvrl。
实例2
在Acvrl[R258G]FlEx小鼠中诱导FOP
为了使得时间控制的Acvrl[R258G]FlEx等位基因的甚至全身倒位成为可能，使Acvrl[R258G]FlEx小鼠与Gt(ROSA26)SorCreERT2/+小鼠交配，以生成Acvrl[R258G]FlEx；Gt(ROSA26)SorCreERT2/+。它们维持在混合的-C57BL/6NTac-129S6/SvEvTac背景下的杂合性。所有实验都根据Regeneron的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)执行。雄性和雌性小鼠两者均在8至11周龄之间使用，然而，小鼠在各组之间进行年龄和性别匹配。并未注意到年龄或性别相关的表型。通过将编码R258G的外显子倒位到有义链内来启动该模型，所述倒位通过用在油中的40mg/kg他莫昔芬(Sigma)腹膜内(i.p.)治疗Acvrl[R258G]FlEx；Gt(ROSA26)SorCreERT2/+小鼠，每天一次，共5天来完成(以激活CreERT2)。为了评价异位骨形成，通过异氟烷使小鼠麻醉，并且使用体内μCT(Quantum FX，PerkinElmer，Hopkinton，MA，USA)，用以60mm x 120mm的视野进行全身扫描。X射线源设定为160μA的电流，90kVp的电压，伴随以120或240μm的体素大小。
AcvrlR258GFlEx/+；Gt(ROSA26)SorCreERt2/+成年小鼠是表型正常的；然而，R258G突变型Acvrl等位基因的全身激活导致渐进性骨化，早在用他莫昔芬给药后2周用射线照相显而易见，其方式类似于用美国专利号9,510,569中所述的AcvrlR206HFlex小鼠可见的那种。还参见图2。
小鼠的抗体给药
对于治疗研究，将Acvrl[R258G]FlEx/+；RosaCreERT2小鼠分开，以确保组间的年龄和性别匹配，治疗在与他莫昔芬施用的同一天开始。小鼠用25mg/kg的针对人激活素A生成的中和抗体(美国专利申请2015/0037339)或同种型对照抗体进行皮下注射(s.c.)，每周一次，共6周。每周一次通过体内μCT成像监测异位骨形成。
如图3中所示，接受同种型对照抗体的小鼠在第4周时发展HO，并且接受激活素A阻断抗体的小鼠在4周后没有可检测到的高于μCT背景的HO形成。
总之，ACVRlR206H或ACVRlR258G的条件开启型敲入等位基因忠实地模拟了啮齿类动物例如小鼠中的进行性骨化性纤维发育不良(FOP)；并且激活素A中和抗体阻断了此类啮齿类动物模型的异位骨化发展。
进一步的实施例
1.一种经遗传修饰的啮齿类动物，其基因组包含在内源性啮齿类动物Acvrl基因座内的经修饰的啮齿类动物Acvrl基因，其中所述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因包含
a)侧翼为第一对位点特异性重组酶识别位点(SRRS′)、处于有义方向的基本上人的ACVRl外显子7，其中所述基本上人的ACVRl外显子7编码与人ACVRl外显子7相同的氨基酸；和
b)侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；
其中所述第一SRRS’和第二SRRS'这样定向，使得重组酶能够将突变型啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，缺失基本上人的ACVRl外显子7，并且允许表达包含所述改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因。
2.项目1的经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述基本上人的ACVRl外显子7与人ACVRl外显子7相差至少一个核苷酸，并且与人ACVRl外显子7和改变的啮齿类动物Acvrl外显子7之间的序列同一性相比，与改变的啮齿类动物Acvrl外显子7具有降低的序列同一性。
3.项目1的经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述编码重组酶的基因在所述经遗传修饰的啮齿类动物的基因组中，并且所述重组酶的活性是可诱导的。
4.根据项目1-3中任何一个的经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述重组酶是Cre。
5.项目4的经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述Cre融合至***受体(ER)的配体结合结构域，使得所述Cre的活性通过与ER的配体结合加以诱导。
6.项目5的经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述ER的配体结合结构域包含T2突变。
7.项目5或6的经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述配体是他莫昔芬。
8.项目1-7中任何一个的经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述经遗传修饰的啮齿类动物对于所述经修饰的Acvrl基因是纯合的。
9.一种源自项目1-8中任一个的经遗传修饰的啮齿类动物的突变型啮齿类动物，其中所述突变型啮齿类动物具有包含改变的Acvrl等位基因的基因组，所述等位基因包含处于有义方向的改变的外显子7，并且其中所述改变的Acvrl等位基因在突变型啮齿类动物中表达，导致异位骨形成。
10.根据前述项目中任一个的啮齿类动物，其选自小鼠或大鼠。
11.一种核酸，其包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因，其中所述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因包含
a)侧翼为第一对位点特异性重组酶识别位点(SRRS′)、处于有义方向的基本上人的ACVRl外显子7，其中所述基本上人的ACVRl外显子7编码与人ACVRl外显子7相同的氨基酸；和
b)侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；
其中所述第一SRRS’和第二SRRS'这样定向，使得重组酶能够将突变型啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，缺失基本上人的ACVRl外显子7。
12.项目11的核酸，其中所述基本上人的ACVRl外显子7与人ACVRl外显子7相差至少一个核苷酸，并且与人ACVRl外显子7和改变的啮齿类动物Acvrl外显子7之间的序列同一性相比，与改变的啮齿类动物Acvrl外显子7具有降低的序列同一性。
13.项目11的核酸，其中所述重组酶的活性是可诱导的。
14.项目11-13中任何一个的核酸，其中所述重组酶是Cre。
15.项目14的核酸，其中所述Cre融合至***受体(ER)的配体结合结构域，使得所述Cre的活性通过与ER的配体结合加以诱导。
16.项目15的核酸，其中所述ER的配体结合结构域包含T2突变。
17.项目15或16的核酸，其中所述配体是他莫昔芬。
18.项目11-17中任何一个的核酸，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
19.一种啮齿类动物基因组，其包含项目11或12的核酸。
20.项目19的啮齿类动物基因组，其还包含编码识别SRRS′且使改变的外显子倒位的所述重组酶的基因。
21.项目20的啮齿类动物基因组，其中所述重组酶的活性是可诱导的。
22.项目21的啮齿类动物基因组，其中所述重组酶是Cre。
23.项目22的啮齿类动物基因组，其中所述Cre融合至***受体(ER)的配体结合结构域，使得所述Crc的活性通过与ER的配体结合加以诱导。
24.项目23的啮齿类动物基因组，其中所述ER的配体结合结构域包含T2突变。
25.项目23或24的啮齿类动物基因组，其中所述配体是他莫昔芬。
26.项目19-25中任何一个的啮齿类动物基因组，其中所述啮齿类动物基因组对于所述经修饰的Acvrl基因是纯合的。
27.项目19-26中任何一个的啮齿类动物基因组，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
28.一种分离的啮齿类动物组织或细胞，其包含项目19-27中任何一个的啮齿类动物基因组。
29.项目28的分离的啮齿类动物组织或细胞，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
30.项目28或29的分离的啮齿类动物组织或细胞，其中所述啮齿类动物细胞是胚胎干细胞。
31.一种用于啮齿类动物基因组中的Acvrl基因的靶向修饰的核酸构建体，其包含：
a)侧翼为第一对位点特异性重组酶识别位点(SRRS′)、处于有义方向的基本上人的ACVRl外显子7，其中所述基本上人的ACVRl外显子7编码与人ACVRl外显子7相同的氨基酸；和
b)侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；
其中所述第一SRRS’和第二SRRS'这样定向，使得重组酶能够将突变型啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，缺失基本上人的ACVRl外显子7，并且允许表达包含所述改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因。
32.项目31的核酸构建体，其中所述基本上人的ACVRl外显子7与人ACVRl外显子7相差至少一个核苷酸，并且与人ACVRl外显子7和改变的啮齿类动物Acvrl外显子7之间的序列同一性相比，与改变的啮齿类动物Acvrl外显子7具有降低的序列同一性。
33.项目31的核酸构建体，其中所述第一对SRRS和第二对SRRS是Lox2372和LoxP，或反之亦然。
34.项目31的核酸构建体，其中所述重组酶是Cre。
35.项目34的核酸构建体，其中所述Cre融合至***受体(ER)，使得所述Cre的活性通过与ER的配体结合加以诱导。
36.项目35的核酸构建体，其中所述ER包含T2突变。
37.项目35的核酸构建体，其中所述配体是他莫昔芬。
38.根据项目31-37中任何一个的核酸构建体，其中所述啮齿类动物选自小鼠或大鼠。
39.一种制备经遗传修饰的啮齿类动物的方法，其包括修饰啮齿类动物基因组，以包含在内源性啮齿类动物Acvrl基因座内的经修饰的啮齿类动物Acvrl基因，其中所述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因包含
a)侧翼为第一对位点特异性重组酶识别位点(SRRS′)、处于有义方向的基本上人的ACVRl外显子7，其中所述基本上人的ACVRl外显子7编码与人ACVRl外显子7相同的氨基酸；和
b)侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；
其中所述第一SRRS’和第二SRRS’这样定向，使得重组酶能够将改变的啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，缺失基本上人的ACVRl外显子7，并且允许表达包含所述改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因。
40.项目39的方法，其中通过包括以下的方法修饰所述啮齿类动物基因组：
a)将核酸构建体引入啮齿类动物胚胎干(ES)细胞内，其中所述核酸构建体包含：
侧翼为第一对SRRS′、处于有义方向的基本上人的ACVRl外显子7，和
侧翼为第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；
其中所述核酸构建体靶向所述内源性啮齿类动物Acvrl基因座，得到在所述内源性啮齿类动物Acvrl基因座内的经修饰的啮齿类动物Acvrl基因；
b)获得经遗传修饰的啮齿类动物ES细胞，其基因组包含所述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因；和
c)通过使用来自b)的经遗传修饰的啮齿类动物ES细胞来制备经遗传修饰的啮齿类动物。
41.项目39或40的方法，其中所述经遗传修饰的啮齿类动物对于所述经修饰的Acvrl基因是纯合的。
42.项目40或41的方法，其中所述啮齿类动物ES细胞还包含编码重组酶的基因。
43.项目39-42中任何一个的方法，其中所述重组酶的活性是可诱导的。
44.根据项目39-43中任何一个的方法，其中所述重组酶是Cre。
45.项目44的方法，其中所述Cre融合至***受体(ER)的配体结合结构域，使得所述Cre的活性通过与ER的配体结合加以诱导。
46.项目45的方法，其中所述ER的配体结合结构域包含T2突变。
47.项目45或46的方法，其中所述配体是他莫昔芬。
48.项目43-47中任何一个的方法，其还包括在所述啮齿类动物的细胞或组织中诱导所述重组酶的活性，其中所述重组酶使改变的外显子7倒位，缺失基本上人的外显子7，从而允许所述改变的Acvrl等位基因包含待在细胞或组织中表达的改变的外显子7。
49.根据项目40-48中任何一个的方法，其中所述啮齿类动物选自小鼠或大鼠。
50.一种育种方法，其包括使其基因组包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的第一啮齿类动物与第二小鼠育种，得到其基因组包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的后代啮齿类动物，其中所述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因包含：
a)侧翼为第一对位点特异性重组酶识别位点(SRRS′)、处于有义方向的基本上人的ACVRl外显子7，其中所述基本上人的ACVRl外显子7编码与人ACVRl外显子7相同的氨基酸；和
b)侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；
其中所述第一SRRS’和第二SRRS’这样定向，使得重组酶能够将改变的啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，缺失基本上人的ACVRl外显子7，并且允许表达包含所述改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因。
51.项目50的方法，其中所述第一啮齿类动物对于所述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因是纯合的。
52.项目50或51的方法，其中所述第二啮齿类动物包含可诱导的重组酶。
53.项目52的方法，其中所述可诱导的重组酶是可诱导的Cre重组酶。
54.项目53的方法，其中所述可诱导的Cre重组酶包含他莫昔芬可诱导的Cre-ERT2重组酶。
55.项目52-54中任何一个的方法，其还包括在后代啮齿类动物的细胞或组织中诱导可诱导的重组酶，使得经诱导的重组酶将改变的啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，并且缺失所述细胞或组织中的基本上人的ACVRl外显子7，从而产生包含所述改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因。
56.项目50-55中任何一个的方法，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
57.一种后代啮齿类动物，其根据项目50-56中任何一个的方法产生。
58.一种测试用于治疗异位骨形成的候选治疗化合物的方法，其包括：
提供根据项目1-8和10中任何一个的经遗传修饰的啮齿类动物；
诱导所述啮齿类动物中的重组酶活性，以允许表达包含所述改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因；
向所述啮齿类动物施用所述候选化合物；和
确定所述候选化合物是否抑制所述啮齿类动物中的异位骨形成的发展。
59.项目58的方法，其中所述候选化合物在所述重组酶活性诱导之前、过程中或之后施用于所述啮齿类动物。
60.项目58的方法，其中所述候选化合物是小分子化合物。
61.项目58的方法，其中所述候选化合物是核酸。
62.项目58的方法，其中所述候选化合物是抗体或其抗原结合片段。
63.项目62的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是针对激活素受体1的抗体或其抗原结合片段。
64.项目62的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是针对2A型激活素受体的抗体或其抗原结合片段。
65.项目62的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是针对2B型激活素受体的抗体或其抗原结合片段。
66.项目62的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是针对激活素A的抗体或其抗原结合片段。
67.根据项目58-66中任何一个的方法，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
<120> 进行性骨化性纤维发育不良的啮齿类动物模型
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<210> 1
<211> 147
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
ggaaaggcag gtatggtgag gtgtggaggg gcagctggca aggggagaat gttgccgtga 60
agatcttctc ctcccgtgat gagaagtcat ggttcaggga aacggaattg tacaacactg 120
tgatgctgag gcatgaaaat atcttag 147
<210> 2
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 2
ggaaagggag atacggtgag gtgtggcgcg gatcttggca gggagagaac gttgccgtca 60
aaatttttag cagccgtgat gaaaaaagct ggtttagaga aacagagctc tataatacag 120
tcatgctgag gcacgagaac attctgg 147
<210> 3
<211> 374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 3
agcaatggag ggattaagag ttgcatgcac taaattaatt attcttaatg atgggctggc 60
tgcctccaaa atgactactg ttctgtgtca cctatgtttt gcttttcata gggaaaggga 120
gatacggtga ggtgtggcgc ggatcttggc agggagagaa cgttgccgtc aaaattttta 180
gcagccgtga tgaaaaaagc tggtttagag aaacagagct ctataataca gtcatgctga 240
ggcacgagaa cattctgggt aagtacaagg ataaccccct cattaattgt atctagggag 300
aaacaattgt ctgcctttgc tctctccgtt ttggtgaatg tgaattcgag agtgtctcct 360
aaaaagcaat atag 374
<210> 4
<211> 147
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 4
ggaagggccg gtatggagaa gtatggaggg gcagctggca aggcgaaaat gtcgctgtga 60
agatcttctc ctcccgagac gagaagtcat ggttcaggga gacggaattg tacaacactg 120
tgatgttggg gcatgaaaat atcttag 147
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<211> 147
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 5
ctaagatatt ttcatgcccc aacatcacag tgttgtacaa ttccgtctcc ctgaaccatg 60
acttctcgtc tcgggaggag aagatcttca cagcgacatt ttcgccttgc cagctgcccc 120
tccatacttc tccataccgg cccttcc 147
<210> 6
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 6
gagaagagca ggaggttcaa atataaggac actgtcgggt tcactgtgtt tgagaggaaa 60
aggaaagcca acccatttct tacatatatc atctgttttg ctgtccacag ggaagggccg 120
gtatggagaa gtatggaggg gcagctggca aggcgaaaat gtcgctgtga agatcttctc 180
ctcccgagac gagaagtcat ggttcaggga gacggaattg tacaacactg tgatgttggg 240
gcatgaaaat atcttaggtg agtaccaggt gagctttcac cagctggtct ccatagagat 300
aagggccggc cctttctctc tcccatttgc caaatctgag gtgtgtggag tctcttctgg 360
aaaacaacat ag 372
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<211> 372
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 7
ctatgttgtt ttccagaaga gactccacac acctcagatt tggcaaatgg gagagagaaa 60
gggccggccc ttatctctat ggagaccagc tggtgaaagc tcacctggta ctcacctaag 120
atattttcat gccccaacat cacagtgttg tacaattccg tctccctgaa ccatgacttc 180
tcgtctcggg aggagaagat cttcacagcg acattttcgc cttgccagct gcccctccat 240
acttctccat accggccctt ccctgtggac agcaaaacag atgatatatg taagaaatgg 300
gttggctttc cttttcctct caaacacagt gaacccgaca gtgtccttat atttgaacct 360
cctgctcttc tc 372
<210> 8
<211> 147
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 8
ggaagggccg gtatggagaa gtgtggaggg gcagctggca aggcgaaaat gttgctgtga 60
agatcttctc ctcccgtgat gagaagtcgt ggttcaggga gacagaattg tacaacacgg 120
tgatgctgag gcatgagaat atcttag 147

Claims (67)

1.一种经遗传修饰的啮齿类动物，其基因组包含在内源性啮齿类动物Acvrl基因座内的经修饰的啮齿类动物Acvrl基因，其中所述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因包含
a.侧翼为第一对位点特异性重组酶识别位点(SRRS′)、处于有义方向的基本上人的ACVRl外显子7，其中所述基本上人的ACVRl外显子7编码与人ACVRl外显子7相同的氨基酸；和
b.侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；
其中所述第一SRRS’和第二SRRS'这样定向，使得重组酶能够将突变型啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，缺失基本上人的ACVRl外显子7，并且允许表达包含所述改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因。
2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述基本上人的ACVRl外显子7与人ACVRl外显子7相差至少一个核苷酸，并且与人ACVRl外显子7和改变的啮齿类动物Acvrl外显子7之间的序列同一性相比，与改变的啮齿类动物Acvrl外显子7具有降低的序列同一性。
3.根据权利要求1所述的经遗传修饰的啮齿类动物，其中编码重组酶的基因在所述经遗传修饰的啮齿类动物的基因组中，并且所述重组酶的活性是可诱导的。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述重组酶是Cre。
5.根据权利要求4所述的经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述Cre融合至***受体(ER)的配体结合结构域，使得所述Cre的活性通过与ER的配体结合加以诱导。
6.根据权利要求5所述的经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述ER的配体结合结构域包含T2突变。
7.根据权利要求5或6所述的经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述配体是他莫昔芬。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的经遗传修饰的啮齿类动物，其中所述经遗传修饰的啮齿类动物对于所述经修饰的Acvrl基因是纯合的。
9.一种源自根据权利要求1-8中任一项所述的经遗传修饰的啮齿类动物的突变型啮齿类动物，其中所述突变型啮齿类动物具有包含改变的Acvrl等位基因的基因组，所述等位基因包含处于有义方向的改变的外显子7，并且其中所述改变的Acvrl等位基因在所述突变型啮齿类动物中表达，导致异位骨形成。
10.根据前述权利要求中任一项所述的啮齿类动物，其选自小鼠或大鼠。
11.一种核酸，其包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因，其中所述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因包含
a.侧翼为第一对位点特异性重组酶识别位点(SRRS′)、处于有义方向的基本上人的ACVRl外显子7，其中所述基本上人的ACVRl外显子7编码与人ACVRl外显子7相同的氨基酸；和
b.侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；
其中所述第一SRRS’和第二SRRS'这样定向，使得重组酶能够将突变型啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，缺失基本上人的ACVRl外显子7。
12.根据权利要求11所述的核酸，其中所述基本上人的ACVRl外显子7与人ACVRl外显子7相差至少一个核苷酸，并且与人ACVRl外显子7和改变的啮齿类动物Acvrl外显子7之间的序列同一性相比，与改变的啮齿类动物Acvrl外显子7具有降低的序列同一性。
13.根据权利要求11所述的核酸，其中所述重组酶的活性是可诱导的。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的核酸，其中所述重组酶是Cre。
15.根据权利要求14所述的核酸，其中所述Cre融合至***受体(ER)的配体结合结构域，使得所述Cre的活性通过与ER的配体结合加以诱导。
16.根据权利要求15所述的核酸，其中所述ER的配体结合结构域包含T2突变。
17.根据权利要求15或16所述的核酸，其中所述配体是他莫昔芬。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的核酸，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
19.一种啮齿类动物基因组，其包含根据权利要求11或12所述的核酸。
20.根据权利要求19所述的啮齿类动物基因组，其还包含编码识别SRRS′且使改变的外显子倒位的所述重组酶的基因。
21.根据权利要求20所述的啮齿类动物基因组，其中所述重组酶的活性是可诱导的。
22.根据权利要求21所述的啮齿类动物基因组，其中所述重组酶是Cre。
23.根据权利要求22所述的啮齿类动物基因组，其中所述Cre融合至***受体(ER)的配体结合结构域，使得所述Cre的活性通过与ER的配体结合加以诱导。
24.根据权利要求23所述的啮齿类动物基因组，其中所述ER的配体结合结构域包含T2突变。
25.根据权利要求23或24所述的啮齿类动物基因组，其中所述配体是他莫昔芬。
26.根据权利要求19-25中任一项所述的啮齿类动物基因组，其中所述啮齿类动物基因组对于所述经修饰的Acvrl基因是纯合的。
27.根据权利要求19-26中任一项所述的啮齿类动物基因组，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
28.一种分离的啮齿类动物组织或细胞，其包含根据权利要求19-27中任一项所述的啮齿类动物基因组。
29.根据权利要求28所述的分离的啮齿类动物组织或细胞，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
30.根据权利要求28或29所述的分离的啮齿类动物组织或细胞，其中所述啮齿类动物细胞是胚胎干细胞。
31.一种用于啮齿类动物基因组中的Acvrl基因的靶向修饰的核酸构建体，其包含：
a.侧翼为第一对位点特异性重组酶识别位点(SRRS′)、处于有义方向的基本上人的ACVRl外显子7，其中所述基本上人的ACVRl外显子7编码与人ACVRl外显子7相同的氨基酸；和
b.侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；
其中所述第一SRRS’和第二SRRS’这样定向，使得重组酶能够将突变型啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，缺失基本上人的ACVRl外显子7，并且允许表达包含所述改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因。
32.根据权利要求31所述的核酸构建体，其中所述基本上人的ACVRl外显子7与人ACVRl外显子7相差至少一个核苷酸，并且与人ACVRl外显子7和改变的啮齿类动物Acvrl外显子7之间的序列同一性相比，与改变的啮齿类动物Acvrl外显子7具有降低的序列同一性。
33.根据权利要求31所述的核酸构建体，其中第一对SRRS和第二对SRRS是Lox2372和LoxP，或反之亦然。
34.根据权利要求31所述的核酸构建体，其中所述重组酶是Cre。
35.根据权利要求34所述的核酸构建体，其中所述Cre融合至***受体(ER)，使得所述Cre的活性通过与ER的配体结合加以诱导。
36.根据权利要求35所述的核酸构建体，其中所述ER包含T2突变。
37.根据权利要求35所述的核酸构建体，其中所述配体是他莫昔芬。
38.根据权利要求31-37中任一项所述的核酸构建体，其中所述啮齿类动物选自小鼠或大鼠。
39.一种制备经遗传修饰的啮齿类动物的方法，其包括修饰啮齿类动物基因组，以包含在内源性啮齿类动物Acvrl基因座内的经修饰的啮齿类动物Acvrl基因，其中所述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因包含
a.侧翼为第一对位点特异性重组酶识别位点(SRRS′)、处于有义方向的基本上人的ACVRl外显子7，其中所述基本上人的ACVRl外显子7编码与人ACVRl外显子7相同的氨基酸；和
b.侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；
其中所述第一SRRS’和第二SRRS’这样定向，使得重组酶能够将改变的啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，缺失基本上人的ACVRl外显子7，并且允许表达包含所述改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因。
40.根据权利要求39所述的方法，其中通过包括以下的方法修饰所述啮齿类动物基因组：
a.将核酸构建体引入啮齿类动物胚胎干(ES)细胞内，其中所述核酸构建体包含：
侧翼为第一对SRRS′、处于有义方向的基本上人的ACVRl外显子7，和
侧翼为第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；
其中所述核酸构建体靶向所述内源性啮齿类动物Acvrl基因座，得到在所述内源性啮齿类动物Acvrl基因座内的经修饰的啮齿类动物Acvrl基因；
b.获得经遗传修饰的啮齿类动物ES细胞，其基因组包含所述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因；和
c.通过使用来自b)的经遗传修饰的啮齿类动物ES细胞来制备经遗传修饰的啮齿类动物。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述经遗传修饰的啮齿类动物对于所述经修饰的Acvrl基因是纯合的。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述啮齿类动物ES细胞还包含编码重组酶的基因。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述重组酶的活性是可诱导的。
44.根据权利要求39-43中任一项所述的方法，其中所述重组酶是Cre。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述Cre融合至***受体(ER)的配体结合结构域，使得所述Cre的活性通过与ER的配体结合加以诱导。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述ER的配体结合结构域包含T2突变。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述配体是他莫昔芬。
48.根据权利要求43-47中任一项所述的方法，其还包括在所述啮齿类动物的细胞或组织中诱导所述重组酶的活性，其中所述重组酶使改变的外显子7倒位，缺失基本上人的外显子7，从而允许改变的Acvrl等位基因包含待在细胞或组织中表达的改变的外显子7。
49.根据权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述啮齿类动物选自小鼠或大鼠。
50.一种育种方法，其包括使其基因组包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的第一啮齿类动物与第二小鼠育种，得到其基因组包含经修饰的啮齿类动物Acvrl基因的后代啮齿类动物，其中所述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因包含：
a.侧翼为第一对位点特异性重组酶识别位点(SRRS′)、处于有义方向的基本上人的ACVRl外显子7，其中所述基本上人的ACVRl外显子7编码与人ACVRl外显子7相同的氨基酸；和
b.侧翼为与第一对SRRS′不同的第二对SRRS′、处于反义方向的编码R258G的改变的啮齿类动物Acvrl外显子7；
其中所述第一SRRS’和第二SRRS'这样定向，使得重组酶能够将改变的啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，缺失基本上人的ACVRl外显子7，并且允许表达包含所述改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述第一啮齿类动物对于所述经修饰的啮齿类动物Acvrl基因是纯合的。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述第二啮齿类动物包含可诱导的重组酶。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述可诱导的重组酶是可诱导的Cre重组酶。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述可诱导的Cre重组酶包含他莫昔芬可诱导的Cre-ERT2重组酶。
55.根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其还包括在后代啮齿类动物的细胞或组织中诱导可诱导的重组酶，使得经诱导的重组酶将改变的啮齿类动物Acvrl外显子7倒位成有义方向，并且缺失所述细胞或组织中的基本上人的ACVRl外显子7，从而产生包含所述改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因。
56.根据权利要求50-55中任一项所述的方法，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
57.一种后代啮齿类动物，其根据权利要求50-56中任一项所述的方法产生。
58.一种测试用于治疗异位骨形成的候选治疗化合物的方法，其包括：
提供根据权利要求1-8和10中任一项所述的经遗传修饰的啮齿类动物；
诱导所述啮齿类动物中的重组酶活性，以允许表达包含所述改变的啮齿类动物Acvrl外显子7的改变的Acvrl等位基因；
向所述啮齿类动物施用所述候选化合物；和
确定所述候选化合物是否抑制所述啮齿类动物中的异位骨形成的发展。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述候选化合物在所述重组酶活性诱导之前、过程中或之后施用于所述啮齿类动物。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述候选化合物是小分子化合物。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述候选化合物是核酸。
62.根据权利要求58所述的方法，其中所述候选化合物是抗体或其抗原结合片段。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是针对激活素受体1的抗体或其抗原结合片段。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是针对2A型激活素受体的抗体或其抗原结合片段。
65.根据权利要求62所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是针对2B型激活素受体的抗体或其抗原结合片段。
66.根据权利要求62所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是针对激活素A的抗体或其抗原结合片段。
67.根据权利要求58-66中任一项所述的方法，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
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