CN112280748B

CN112280748B - 绵羊源羊副流感病毒3型疫苗株、由该疫苗株制备的疫苗组合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112280748B
Application number: CN202011061189.7A
Authority: CN
Inventors: 王炜; 马艳华
Original assignee: Inner Mongolia University
Current assignee: Inner Mongolia University
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2040-09-30
Also published as: CN112280748A

Abstract

本发明公开了一株羊副流感病毒3型疫苗株、由该疫苗株制备的疫苗组合物及其制备方法和应用。所述的羊副流感病毒3型疫苗株是从绵羊分离得到的，与目前的山羊源副流感病毒株属于不同谱系。本发明还提供了一种用该毒株为抗原制备的疫苗组合物及其制备方法。经灭活疫苗免疫原性试验证明，该副流感病毒3型灭活疫苗具有良好的免疫效力。本发明的提出为预防和治疗羊副流感病毒3型感染提供了有效的技术手段。

Description

绵羊源羊副流感病毒3型疫苗株、由该疫苗株制备的疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一株绵羊源的羊副流感病毒3型疫苗株，还涉及由该疫苗株制备的疫苗组合物及其制备方法和应用。本发明属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

我国是养羊大国，养羊数量居世界首位，其中绵羊存栏约1.6亿只，山羊存栏约1.4亿只，年出栏绵羊和山羊共计约3亿只。疫病是制约我国养羊业绿色、健康、优质发展的重要瓶颈。随着羊集约化养殖的发展，疫病的危害逐渐增加。

临床调研发现，除***、小反刍兽疫、羊痘等羊的重大疫病外，羊呼吸道疾病是危害羊的最重要疫病，给羊养殖业造成了巨大的经济损失。副流感病毒3型(Parainfluenzavirus type 3，PIV3)是引起羊呼吸道疾病最重要的病原之一，能引起山羊和绵羊发生严重肺炎。流行病学调查表明，该病在我国呼吸道疾病羊中流行十分广泛。研究证实，该病毒也是引起羊呼吸道疾病的重要病原之一，而且临床上往往与支原体混合感染，加重呼吸道疾病。

副流感病毒3型是羊呼吸道疾病的重要病原之一(Fischman 1967,Belak andPalfi 1974,Lyon,Leroux et al.1997)。作为羊呼吸道疾病的病原是感染绵羊的重要病毒病，PIV3感染羊能引起明显的呼吸道症状，出现病毒血症和排毒，并在肺脏引发病变(Yener,Saglam et al.2005)。

日本北海道副流感病毒3型抗体的阳性率是14.92％(Giangaspero,Savini etal.2013)。墨西哥调查了副流感病毒3型(Contreras-Luna,Ramirez-Martinez etal.2017)。2013年，我国首次报道在发生严重呼吸道疾病的山羊中分离到了山羊副流感病毒。流行病学调查发现，我国山羊和绵羊的抗体阳性率都比较高，最高达到60％，抗原阳性率20％(Mao,Yang et al.2019)。2019年，本发明发明人所属课题组从发生呼吸道疾病的绵羊中分离到了羊副流感病毒3型。进一步经流行病学调查，副流感病毒3型在山羊和绵羊的抗体阳性率较高，证实该病在羊呼吸道疾病发生和其他病原协同致病中具有重要的作用。

目前，山羊副流感对山羊的致病性进行了一些研究。研究表明，羊副流感病毒人工攻毒后，攻毒羊出现体温升高、咳嗽、流鼻涕等临床症状。攻毒后1d就可以检测到排毒。剖解观察攻毒组山羊肺组织出现增生实变、肿大，组织病理学检测发现肺组织出现肺泡间隔增宽、肺泡结构消失、炎性细胞浸润。证实山羊副流感攻毒能导致山羊发生肺炎(郝飞,李文良et al.2016)。绵羊分离副流感与山羊副流感的遗传关系和致病性还没有研究。因此，有必要对绵羊分离副流感病毒进行深入的研究。

目前，国内外还没有羊副流感病毒3型疫苗商品化应用的报道。因此，鉴于我国副流感病毒3型的流行性和危害，急需研制一种预防羊副流感病毒3型的疫苗。

鉴于此，本发明提供了一种能预防羊副流感病毒3型的灭活疫苗，通过该制品进行免疫接种，可有效保障羊免受羊副流感病毒3型的感染。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株绵羊源的羊副流感病毒3型疫苗株；

本发明的目的之二是提供由上述的羊副流感病毒3型疫苗株制备得到的羊副流感病毒3型灭活疫苗组合物及其制备方法。

本发明的目的之三是提供所述的羊副流感病毒3型灭活疫苗在在制备预防或治疗羊副流感病毒3型药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明发明人从患有呼吸道疾病绵羊的鼻拭子和血清样本中分离得到了一株绵羊源的羊副流感病毒3型疫苗株，命名为CRV3-TX01株，分类命名为山羊副流感病毒。根据国际病毒分类委员会2019年最新分类报告，该病毒为副黏病毒科(Paramyxoviridae)，呼吸道病毒属(Respirovirus)，山羊呼吸道病毒3型(Caprine respirovirus 3)。该病毒原也称为羊副流感病毒3型病毒(Caprine parainfluenza virus 3，CPIV3)。因此，本发明中所提到的CRV3和CPIV3为同一病毒。该疫苗株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.19970，保藏时间为2020年8月21日。

进一步的，本发明还提出了所述的羊副流感病毒3型疫苗株在制备预防和治疗羊副流感病毒3型感染的疫苗组合物中的用途。

其中，优选的，所述的疫苗组合物为灭活疫苗组合物。

一种疫苗组合物，所述的疫苗组合物中包括本发明所述的羊副流感病毒3型疫苗株。

其中，优选的，所述的疫苗组合物中包括灭活的所述的羊副流感病毒3型疫苗株以及佐剂。

进一步的，本发明还提出了一种制备所述的疫苗组合物的方法，包括以下步骤：

(1)将所述的羊副流感病毒3型疫苗株接种于传代细胞系，进行传代和培养；

(2)将培养获得的羊副流感病毒3型疫苗株CRV3-TX01株接种长满90％～100％细胞的介质上，用细胞维持液培养，制备生产种毒；

(3)将所制备的生产种毒接种长满90％～100％细胞的介质，用细胞维持液培养，得到羊副流感病毒3型疫苗株CRV3-TX01株的病毒抗原液；

(4)将羊副流感病毒3型疫苗株CRV3-TX01株的病毒抗原液加入灭活剂灭活，加入中和剂中和，加入佐剂，乳化，即得；

其中，所述的细胞维持液为含3.5％v/v马血清的DMEM，pH 7.0-7.2。

其中，优选的，步骤(1)中所述的传代细胞系包括MDBK细胞系、BT细胞系及其他牛羊传代细胞系或原代细胞系，步骤(1)中所述的传代和培养包括：将细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，细胞长满90％～100％时，用于继续传代或接种病毒；其中，所述的细胞生长液含有92％～94％v/vDMEM液以及6％～8％v/v的牛血清，pH值为7.0～7.2；所述的培养方法为以下任意一种：在转瓶中培养，使其细胞密度达到2×10⁵～6×10⁵/ml；或在生物反应器中添加附着载体进行悬浮培养或纯悬浮培养，使细胞密度达到2×10⁶～5×10⁶/ml，所述的附着载体为微载体或纸片。

其中，优选的，步骤(1)、(2)或(3)中所述的培养温度为33～37℃，细胞培养环境是5％CO₂；病毒培养时间为30-72小时；步骤(2)或(3)中所述的羊副流感3型病毒TX01株的病毒接种量MOI为0.01-0.05。

其中，优选的，步骤(4)中所述的灭活剂为二乙烯亚胺(BEI)，其终浓度为0.001-0.003M；所述的中和剂为硫代硫酸钠，硫代硫酸钠的终浓度为0.03M。

其中，优选的，步骤(4)中羊副流感病毒3型疫苗株CRV3-TX01株的病毒抗原液为54体积份数，所述的佐剂是206佐剂，所述的206佐剂为46体积份数，优选的，每剂量内羊副流感病毒3型疫苗株CRV3-TX01株病毒抗原液含灭活前的病毒含量为10^7.5TCID₅₀。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明首次从绵羊体内分离得到了一种羊副流感病毒3型毒株，该毒株与目前的山羊源副流感病毒株属于不同谱系。本发明还提供了一种用该毒株为抗原制备的疫苗组合物及其制备方法。经灭活疫苗免疫原性试验证明，该副流感病毒3型灭活疫苗具有良好的免疫效力，对强毒攻击的保护率为100％。

附图说明

图1为细胞培养物的细胞病变结果；

其中：A.病毒接种细胞；B.正常细胞

图2为MDBK细胞分离株PCR扩增结果；

其中：1、阴性对照；2、MDBK细胞分离毒；M、Marker DL2000

图3为基于羊副流感病毒3型CRV3-TX01株全基因组和M基因的***进化树；

其中：(a)全基因组序列的进化分析表明，TX01与CPIV3有显著的聚集性，但形成了一个分支；(b)基于M基因序列的进化分析；圆表示新分离到的羊副流感病毒序列；

图4为病毒攻毒后的肺脏病理变化；

其中：A正常组B、C、D攻毒组；攻毒组表现为肺泡沫细胞增多、肺泡壁增厚、肺泡上皮增生、淋巴细胞及浆细胞浸润、支气管上皮细胞***状增生、代偿性肺气肿；

图5为病毒攻毒后的大体解剖；

其中：A、E为正常组，其他为攻毒组，攻毒组表现为纤维素肺炎，全部病变(左右肺，小叶，隔叶)大叶性肺炎，肺粘连严重；

图6为试验动物攻毒后体温变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1羊副流感病毒3型CRV3-TX01株的分离鉴定

(1)病毒分离

发明人采集患有呼吸道疾病绵羊的鼻拭子和血清样本，4℃，6 000r/min离心10min，取上清液经0.45μm的滤器过滤除菌后，接种于长满80％单层的MDBK细胞上，置于37℃5％CO2培养箱培养。显微镜下观察，该病毒在MDBK细胞上可产生典型病变(CPE)，表现为细胞脱落，聚集皱缩形成网孔。如图1所示。

(2)RT-PCR鉴定

根据CPIV3 M基因序列设计合成CPIV3的特异性引物，用于检测CPIV3病毒的特异性引物。

上游引物：5’-CATTGAATTCATACTCAGCAC-3’；

下游引物：5’-AGATTGTCGCATTT(AG)CCTC3-3’，

结果表明MDBK细胞第6代细胞培养物经PCR扩增可得到约400bp的特异性目的片段，阴性对照无条带。

(3)病毒含量(TCID50)的测定

将分离株F6代病毒液用维持培养液10倍倍比稀释至10^-8，每个稀释度做8孔重复，接种长成单层的96孔细胞培养板中的MDBK细胞，并设正常细胞对照，100μL/孔，37℃、5％CO₂培养，每天观察细胞病变，共培养4d，记录CPE孔数，根据Reed-Muench法计算病毒的TCID50。病毒滴度为10^7.8TCID50/mL。

(4)全基因测序

采用Illumina测序技术完成毒株的基因组扫描测序，其中CRV3-TX01毒株M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。测序结果表明病毒全长15738bp，编码6种结构蛋白，分别为：血凝素-神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase protein,HN)、融合蛋白(Fusionprotein,F)、基质蛋白(Matrx protein，M)、大蛋白(Large protein，L)，核蛋白(Nucleoprotein，N)，磷蛋白(phosphoprotein，P)。

利用DNAStar软件将该病毒株基因序列与GenBank上公开发表的有代表性的毒株序列进行核苷酸与氨基酸同源性分析，分析结果参见表1。

将该毒株与GenBank中山羊副流感(CPIV3)，牛副流感3型(BPIV3)和人副流感3型(HPIV3)全基因进行同源性分析，分析结果表明，该毒株与CPIV3毒株同源性较高为97.5％-97.7.0％，与BPIV3同源性为74.2％-75.4.％，与人副流感3型同源性为72.6.％-73.0％。利用MEGA 7软件绘制全基因***和M基因进化树，如图3所示。亲缘关系均较远，且在***进化树上处于独立的分支。全基因序列分析PIV3毒株来源见表2，M基因序列分析所用PIV3毒株来源见表3。

表1 CRV3-TX01毒株核苷酸与氨基酸同源性分析

注：1：核苷酸；2：氨基酸。

表2 PIV3毒株全基因来源记录表

表3 PIV3毒株M基因来源记录表

(5)毒力鉴定

用3-4月龄健康易感羊5只，各气管注射CRV3-TX01株培养物4ml(10^7.5TCID₅₀/ml)作为实验组，另以相同条件下培养的正常绵羊5只作为正常对照，接种后21日，取肺脏进行病理以及解剖学检测。

图4为病毒攻毒后的肺脏病理变化，其中：A正常组B、C、D实验组；实验组可见肺泡沫细胞增多、肺泡壁增厚、肺泡上皮增生、淋巴细胞及浆细胞浸润、支气管上皮细胞***状增生、代偿性肺气肿。图5为病毒攻毒后的大体解剖，其中：A、E为正常组，其他为实验组，实验组表现为纤维素肺炎，全部病变(左右肺，小叶，隔叶)大叶性肺炎，肺粘连严重。

以上实验结果表明，该分离毒株为羊副流感病毒3型，命名为CRV3-TX01株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.19970，保藏时间为2020年8月21日。

实施例2利用MDBK细胞系生产羊副流感灭活疫苗

(1)将羊副流感病毒3型CRV3-TX01株按MOI为0.01的接毒量接种于长满的MDBK细胞，40h左右收获细胞培养物，-70℃冻融1次，在MDBK细胞上进行连续繁殖和噬斑克隆纯化，获得了纯净的种毒。

(2)选择MDBK细胞系作为制苗用细胞；

(3)MDBK细胞经胰酶消化、传代，加细胞生长液，37℃、5％CO₂培养箱中培养，细胞长满90％-100％时，用于传代或接毒；微载体或纸片悬浮培养时，向细胞培养反应器中接种1×10⁵-2×10⁵细胞/mL的细胞，80-90％贴满细胞，实现细胞的连续传代或接毒；

(4)毒种的繁殖：取生长良好的MDBK细胞，用PBS洗1次，将种毒按MOI 0.01的接毒量进行接种；加入维持液(含3.5％v/v马血清的DMEM，pH 7.0)30-48小时细胞80％出现CPE时收细胞培养毒液作为生产用毒种；

毒种鉴定：按照《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌、支原体检验，毒种应纯净，且毒价不低于10^7.5TCID₅₀。

(5)制苗毒液的繁殖：当上述细胞已长满90-100％时，弃去细胞生长液，用PBS洗2次，分别按MOI 0.01的接种量接入毒种，加入维持液(3.5％v/v马血清的DMEM，pH 7.0)，30-48小时细胞80％出现CPE时收细胞培养毒液作为制苗用毒液；收获的毒液置-20℃以下保存；

制苗毒液的检验：按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。

(6)灭活及乳化：将0.2mol/L BEA和0.4mol/L NaOH以体积比2：1比例在适当容器内混合。37±2℃环化1h，生成BEI，调节pH至7.2～7.6。将检验合格的病毒培养液，置于容器内，加入BEI灭活剂终浓度为3mM，灭活36-40小时，充分摇匀，再加入终浓度为0.03M的硫代硫酸钠进行中和。将灭活的抗原缓缓注入206佐剂内，保持30℃，按抗原为54/100体积份数，206佐剂为46/100体积份数进行混合乳化。迅速降温至15℃,4℃放置24小时勿摇动，分装即得成品。每剂量疫苗中两种抗原含量不低于10^7.5TCID₅₀。

成品检验：按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌和支原体生长。

本实施例制备的灭活疫苗，性状检验、安全检验、效力检验等均合格。

实施例3疫苗的安全性试验

试验使用1-2月龄健康易感羊15只，分为3组，每只羊肌肉注射实施例2制备的灭活疫苗4ml，另以与免疫羊相同条件下饲养的绵羊5只作为对照。连续观察14日，应无局部和全身不良反应。

结果如表4所示，该结果表明，所有试验羊在接种疫苗后均无局部和全身不良反应。

表4安全性试验

实施例4免疫原性试验

用1-2月龄健康易感羊15只，分为3组，每组各颈部皮下注射或肌肉注射实施例2制备的灭活疫苗2ml，另以与免疫羊相同条件下饲养的绵羊5只作为对照，接种后21日，各气管注射CRV3-TX01株培养物4ml(10^7.5TCID₅₀/ml)，连续观察21日。对照羊应全部发病，免疫羊应至少保护4只，或对照羊至少4只发病，免疫羊全部保护。

结果如表5及图6所示，该结果表明，使用该灭活疫苗免疫试验动物后，对强毒攻击可产生较好的保护作用，保护率为100％。

表5免疫原性试验

序列表

<110> 内蒙古大学

<120> 绵羊源羊副流感病毒3型疫苗株、由该疫苗株制备的疫苗组合物及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1059

<212> DNA

<213> Parainfluenza virus type 3

<400> 1

atggagaata taacaagccc agcaatatac acttttccta agtcatcatt cactgagaat 60

ggtgatttgg aaccactacc acttaaagtc aatgaaaata agaaagctat tcctcatata 120

agagttgtca aggtaggcaa tccaccaaag catggggtaa gataccttga tgttttctta 180

cttggcttct ttgaaatgga aaggactaaa gataagtatg gaagtattag tgatctagat 240

gaggacctag gatacaagat ctgtggatca ggttctttac caatcgggct agccaagtat 300

ggtgggagcg acaaggaact tctacaggct gcaaccaaac tagacataga agtaaggagg 360

acagttaagg ctacagaaat gattgtatat actgtacaaa acataaaacc tgagttatat 420

ccatgggcca gtagattgag aaaagggatg atctttgatg ctcaaaaagt agcacttgct 480

cctcaatgtc ttccgttgga cagaggaata aaattcagag tcatattcgt taattgtacg 540

gctattggct cagtaacact atttaagatc ccaaaatcaa tggcgatgtt gtcattacca 600

aatacaatat caataaatct acaagttcac attaaaacag gggtacagac agattcaaag 660

ggggttgttc agatactaga tgaaaagggc gaaaaatcac ttaatttcat gattcatctt 720

ggcttgatca agcgaaaaat tgggaagatg tattcaattg aatactgcaa gcaaaaaatt 780

gaaaagatga gattgatatt ctcattagga ttgattggag gaatcagctt ccatatcaat 840

gcaactggat caatatccaa aaccttagca agccagttaa cattcaaacg agagatttgc 900

tatcctctta tggatcttaa tccacattta aacattgtta tatgggcatc ctcggttgag 960

attacaagag tagatgcaat tttccaaccc tcattacctg gcgaattcag atactaccca 1020

aatataatag caaagggggt cggcaagatt aaacaataa 1059

Claims

1.绵羊源的羊副流感病毒3型疫苗株，命名为CRV3-TX01株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.19970。

2.权利要求1所述的羊副流感病毒3型疫苗株在制备预防和治疗羊副流感病毒3型感染的疫苗组合物中的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的疫苗组合物为灭活疫苗组合物。

4.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物中包括权利要求1所述的羊副流感病毒3型疫苗株。

5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物中包括灭活的权利要求1所述的羊副流感病毒3型疫苗株以及适宜的油佐剂或水佐剂。

6.一种制备权利要求5所述的疫苗组合物的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将权利要求1所述的羊副流感病毒3型疫苗株接种于传代细胞系，进行传代和培养；

（2）将培养获得的羊副流感病毒3型疫苗株CRV3-TX01株接种长满90%～100%细胞的介质上，用细胞维持液培养，制备生产种毒；

（3）将所制备的生产种毒接种长满90%～100%细胞的介质，用细胞维持液培养，得到羊副流感病毒3型疫苗株CRV3-TX01株的病毒抗原液；

（4）将羊副流感病毒3型疫苗株CRV3-TX01株的病毒抗原液加入灭活剂灭活，加入中和剂中和，加入佐剂，乳化，即得；

其中，所述的细胞维持液为含3.5%v/v马血清的DMEM，pH 7.0-7.2。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的传代细胞系包括MDBK细胞系、BT细胞系及其他牛羊传代细胞系或原代细胞系，步骤（1）中所述的传代和培养包括：将细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，细胞长满90%～100%时，用于继续传代或接种病毒；其中，所述的细胞生长液含有92%～94%v/v DMEM液以及6%～8%v/v的牛血清，pH值为7.0～7.2；所述的培养方法为以下任意一种：在转瓶中培养，使其细胞密度达到2×10⁵～6×10⁵/ml；或在生物反应器中添加附着载体进行悬浮培养或纯悬浮培养，使细胞密度达到2×10⁶～5×10⁶/ml，所述的附着载体为微载体或纸片。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）、（2）或（3）中所述的培养温度为33～37℃，细胞培养环境是5% CO₂；病毒培养时间为30-72小时；步骤（2）或（3）中所述的羊副流感3型病毒TX01株的病毒接种量MOI为0.01-0.05。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的灭活剂为二乙烯亚胺，其终浓度为0.001-0.003M；所述的中和剂为硫代硫酸钠，硫代硫酸钠的终浓度为0.03M。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（4）中羊副流感病毒3型疫苗株CRV3-TX01株的病毒抗原液为54体积份数，所述的佐剂是206佐剂，所述的206佐剂为46体积份数。

11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，每剂量内羊副流感病毒3型疫苗株CRV3-TX01株病毒抗原液含灭活前的病毒含量为10^7.5TCID₅₀。