CN112274630A - 一种提高甲壳类免疫能力及抗病能力的方法及该藻红蛋白的用途及其组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高甲壳类免疫能力及抗病能力的方法及该藻红蛋白的用途及其组合物，该方法涉及对甲壳类施加一组合物；其中该组合物包含一藻红蛋白；使用本发明所提供的方法可提高甲壳类的免疫能力，更具体地说，可提高甲壳类的吞噬作用或原酚氧化酵素***能力，并可提高甲壳类的抗病能力，特别是甲壳类对抗病原体的能力；本发明另外提供一种藻红蛋白用于作为免疫刺激物的用途以及其饲料组合物。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖领域，特别是涉及一种提高甲壳类免疫能力及抗病能力的方法及该藻红蛋白的用途及其组合物。
背景技术
甲壳类为高单价水产食品，具有高市场价值，也是为世界各国的重点人工养殖对象。然而，甲壳类本身的免疫能力容易因环境不良而下降，当养殖环境不良时，水中一些病原菌常会大量增殖并伺机感染甲壳类，造成感染疾病爆发。1992年，福建一带爆发虾白点病，重创整个东南亚养殖区。2016年，澳洲东岸也发生相同的情况，大规模的虾白点病疫情爆发，导致重大的经济损失。全球水产养殖联盟(Global aquaculture alliance，GAA)在2016年的调查报告中指出，水产养殖产业目前所面临最大挑战即为疾病问题。
现今各国用于预防或控制疾病扩散的策略仍偏向于使用抗生素或化学药品，然而抗生素或化学药品可能引起的环境伤害及食品安全问题实在不容小觑。因此，水产养殖产业目前急需一个可提升甲壳类抗病能力，且不会对环境产生伤害及造成食品安全问题的免疫刺激物(immunostimulant)。
从表1可看出，自2004年起，便有学者开始提出可增加甲壳类抗病能力的免疫刺激物。表中的时间及存活率(survival rate)表示以溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)攻毒(challenge)后和对照组相比有显著时间差异与当时的存活率。由表1可看出，多数天然免疫刺激物至少需要3～4日后才能明显提升甲壳类的抗病能力。因此，提供一个天然且可快速提升甲壳类抗病能力的免疫刺激物即为水产养殖领域想要解决的另一个问题。
表1、各种免疫刺激物对甲壳类抗病能力的影响
| 免疫刺激物 | 时间(日) | 存活率(％) | 数据源 |
| 海藻酸(Sodium alginate) | 4 | 43.30 | Cheng et al.2004 |
| 硫酸铜(Copper sulfate) | 2 | 46.70 | Yeh et al.2004 |
| 卡拉胶(Carrageenans) | 3 | 60 | Yeh and Chen 2008 |
| Gracilaria tenuistipitata | 3 | 63.63 | Hou and Chen 2004 |
| Gracilaria tenuistipitata | 3 | 63 | Yeh and Chen 2009 |
| 褐藻醣胶(Fucoidan) | 3 | 60 | Suwaree et al.2013 |
藻红蛋白(phycoerythrin，PE)为藻胆蛋白(phycobiliprotein)的一种，其为存在于红藻、绿藻、蓝藻、隐藻等藻类中的水溶性荧光蛋白。藻红蛋白因其多种特性，已被广泛应用于各种领域的开发研究中，包含化学药品与生物制剂、肿瘤治疗药物、体外诊断等，尤其以应用于荧光研究试剂为最多。然而，目前对于藻红蛋白是否可作为免疫刺激物，用以提高甲壳类的免疫能力及抗病能力还不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高甲壳类免疫能力及抗病能力的方法，该方法包含对甲壳类施加一组合物；其中该组合物包含一藻红蛋白。
为达到上述发明目的，所述免疫能力为吞噬作用或原酚氧化酵素***。
为达到上述发明目的，所述抗病能力是指对抗病原体的能力；其中该病原体包含病毒或细菌。
为达到上述发明目的，所述病毒为白点症病毒。
为达到上述发明目的，所述细菌为副溶血弧菌。
为达到上述发明目的，所述甲壳类包含虾、蟹、蟳、鲎、虾姑或龙虾。
为达到上述发明目的，所述藻红蛋白的有效剂量为0.45μg～2.4μg。
为达到上述发明目的，所述组合物的施加方式包含口服、浸泡、喷洒或注射。
本发明另外提供一种藻红蛋白用于作为免疫刺激物的用途，其是包含对甲壳类施加一藻红蛋白；所述藻红蛋白可提高甲壳类的免疫能力或抗病能力。
本发明还提供一种饲料组合物，其是包含一藻红蛋白，所述的藻红蛋白可提高甲壳类的免疫能力或抗病能力。
本发明为所属领域长期存在的疾病问题提供了一个解决方法。本发明所提供的包含藻红蛋白的组合物可增加甲壳类的免疫能力，更具体地说，可加强甲壳类的吞噬作用及原酚氧化酵素***等非特异性免疫作用能力。对甲壳类施加本发明所提供的包含藻红蛋白的组合物，可提高甲壳类受病原体侵袭后的抗病能力。且本发明所提供的组合物是以藻红蛋白作为有效成分，其具有天然、不会产生食品安全问题及对环境伤害威胁较低的优势。
附图说明
图1是藻红蛋白对抗病原体能力的影响测试流程图；
图2是吞噬作用试验结果示意图；
图3是原酚氧化酵素***试验结果示意图。
具体实施方式
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，都为该所属专业人士领域可共同了解的意义，其中单数用语“一”、“一个”、“该”、“所述”，除非另有说明，皆可指代多于一个对象，此外，用语“包含”、“包括”都为开放式连接词。
本说明书用语“有效剂量(effective amount)”，是指涉有效活性物质的一足够量，可始授予者预防或减轻至少一项疾病症状或生理状况的剂量；其结果为降低和/或缓和征象(sign)、症状(symptom)、或病因，或为其他生理***的有意图的改变。
本说明书用语“甲壳类”是指隶属甲壳亚门(Crustacea)的节肢动物，其是包含但不限于虾、蟹、蟳、鲎、虾姑或龙虾。
本说明书用语“病原体”是指可引起甲壳类疾病的致病物质，其是包含但不限于细菌、真菌、病毒或寄生虫。
本发明所使用的组合物，其剂型包含但不限于溶液(Solution)、乳剂(Emulsion)、悬浮液(Suspension)、粉末(Powder)、锭剂(Tablet)、丸剂(Pill)、片剂(Troche)或胶囊(Capsule)以及其他类似或适用本发明的剂型。
本发明所述的组合物，可进一步添加一水产养殖添加物，其是包含但不限于疫苗、佐剂、免疫刺激物(immunostimulant)；其中该免疫刺激物是包含但不限于化学合成物、醣类或醣类衍生物。
本发明所述组合物适合的施加途径是包含但不限于浸泡、喷洒、药浴、口服或注射。
本发明实施例所使用的藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)可从市面上购得，本发明所属领域中具有常识者也可以从藻类包含红藻中萃取获得本发明所指的藻红蛋白。另外，除非另有说明，本发明所用的材料皆市售易于取得。
本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
实施例一、藻红蛋白对免疫能力的影响测试(一)
甲壳类的免疫机制以非特异性(nonspecific)免疫作用为主，其可分为体液性免疫作用与细胞性免疫作用，而细胞性免疫作用又包含吞噬作用(phagocytosis)等反应。本发明利用体外试验测试藻红蛋白对吞噬作用的影响，以作为评估藻红蛋白是否能提升甲壳类免疫能力的依据。
吞噬作用试验：使用吞噬作用试剂套组(#P35361，Life Technologies)进行吞噬作用试验，其为依照Neaga A.(2011)所提出的方法进行改良的检测。取100μL定量好的虾血球悬浮液(1×106cell/mL)或Shrimp salt solution buffer(SSS buffer)(取代血球悬浮液作为阴性控制组)，加至黑底96孔盘后，以800xg、4℃离心20分钟并去除上清液，接着用SSS buffer润洗一次，再以同样条件离心一次，然后分别加入100μL不同浓度的藻红蛋白(0.013、0.026、0.052及0.116mg/mL)，对照组则添加SSS buffer，在室温下共培养60分钟后，以800xg、4℃离心20分钟并去除上清液，接着加入100μL的K-12 BioParticle(Escherichia coli，荧光物质)，于室温培养20分钟后，以荧光酵素免疫分析测读仪(ELISAReader)侦测480nm(激发光):520nm(散射光)的荧光值，再代入下列公式计算。
吞噬作用活性(％)＝(实验组/对照组)×100％
吞噬作用试验结果如图2所示，有处理藻红蛋白的实验组，其吞噬作用效果较未处理的对照组效果好，且处理的藻红蛋白浓度越高，吞噬作用效果越好。此结果显示，藻红蛋白具有提升吞噬作用能力的功效。
实施例二、藻红蛋白对免疫能力的影响测试(二)
原酚氧化酵素***(prophenoloxidase system，proPO system)为甲壳类中类似补体***的一种酵素免疫***，其也为评估甲壳类免疫能力的重要指标因子。本发明进一步利用体外试验测试藻红蛋白对原酚氧化酵素***的影响，以作为评估藻红蛋白是否能提升甲壳类免疫能力的另一依据。
原酚氧化酵素***试验：依照Hernández-López(1996)法进行改良后检测，将虾血球悬浮于虾血球培养基(modified complete Hank’s balance salt solution，MCHBSS)，取500μL定量好的虾血球悬浮液(1×106cell/mL)，加入500μL不同浓度的藻红蛋白(0.013、0.026、0.052及0.116mg/mL)，在室温下共培养30分钟后，以800xg、4℃离心10分钟，接着去除虾血球培养基及藻红蛋白，再加入1mL的二甲基胂酸盐缓冲液(cacodylate buffer，CAbuffer)，使虾血球悬浮，然后以超音波震碎5秒，共4次，再以800xg、4℃离心10分钟，取50μL上清液至96孔盘，实验组加入50μL的0.1％胰蛋白酶(trypsin)进行刺激，对照组则加入50μL的二甲基胂酸盐缓冲液作为对照，反应10分钟后，每孔(well)加入50μL L-多巴(L-Dopa)作为受质，反应15分钟后，以酵素免疫分析测读仪(ELISA Reader)侦测492nm的吸光值，并以下列公式计算活性。
原酚氧化酵素活性＝(实验组吸光值)-(对照组吸光值)
原酚氧化酵素***试验结果如图3所示，有处理藻红蛋白的实验组，原酚氧化酵素***功能较未处理的对照组好，且处理的藻红蛋白浓度越高，原酚氧化酵素***功能越好。此结果显示，藻红蛋白具有提升原酚氧化酵素***功能的功效。
实施例三、藻红蛋白对抗病能力的影响测试(一)
将藻红蛋白经由添加至饲料口服或注射后打入虾体内，再经由细菌攻毒试验评估藻红蛋白对甲壳类抗病原体能力的影响。具体实施方式为依照Sirirustananun,N.(2011)所提出的方法，改良后进行。试验使用副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)作为攻毒用细菌，如图1所示，实验组在攻毒前一日分别注射20μL不同浓度的藻红蛋白(0.026、0.052及0.116mg/mL)，隔日再分别注射20μL的副溶血弧菌，每只虾注射量为5×106 CFU；对照组为未经藻红蛋白处理，直接进行副溶血弧菌注射的虾；另外以仅注射20μL SSS缓冲液的虾作为未攻毒对照组；总共为五个组别，每个组别11只虾。于攻毒后12、24、36、48、60和72小时观察虾存活率。
结果如表2所示，未经藻红蛋白处理的虾在进行副溶血弧菌攻毒1天后存活率仅剩27.27％，而经藻红蛋白处理，则可将虾的存活率提升于50％以上，且藻红蛋白浓度越高，虾的存活率会越高。结果证实藻红蛋白可有效提高虾对抗细菌的能力。
表2、藻红蛋白对虾抗细菌能力的影响
实施例四、藻红蛋白对抗病能力的影响测试(二)
将藻红蛋白经由添加至饲料口服或注射后打入虾体内，再经由病毒攻毒试验评估藻红蛋白对甲壳类抗病原体能力的影响。具体实施方式为依照Sirirustananun,N.(2011)所提出的方法，改良后进行。试验使用白点症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)作为攻毒用病毒，如图1所示，实验组在攻毒前一日分别注射20μL不同浓度的藻红蛋白(0.026、0.052及0.116mg/mL)，隔日再分别注射20μL的白点症病毒，每只虾注射量为9.19×104copies number；对照组为未接受藻红蛋白处理，直接进行白点症病毒注射的虾；另外以仅接受20μL SSS buffer的虾作为未攻毒对照组；总共为五个组别，每个组别为11只虾。于攻毒后12、24、36、48、60、72、84和96小时观察虾存活率。
结果如表3所示，未经藻红蛋白处理的虾在进行白点症病毒(White SpotSyndrome Virus，WSSV)攻毒后3天全数死亡，而经藻红蛋白处理的虾，其存活率及存活时间皆有所提升。结果证实藻红蛋白可有效提高虾对抗病毒的能力。
表3、藻红蛋白对虾抗病毒能力的影响
依实施例三及实施例四的结果可推算出，藻红蛋白可有效提升甲壳类抗病原体能力的有效剂量范围为0.45μg～2.4μg；其中，较佳的有效剂量范围为0.52μg～2.32μg；其中，更佳的有效剂量范围为1.04μg～2.32μg；其中，最佳的有效剂量为2.32μg。
综上所述，本发明提供了一个使用藻红蛋白作为免疫刺激物，用以提高甲壳类免疫能力及抗病能力的方法。由本发明的实施例可看出，使用藻红蛋白作为免疫刺激物，仅需1.5日即可明显提升甲壳类的抗病能力，且处理藻红蛋白的实验组存活率(63.64％)比对照组(27.27％)高出许多。使用藻红蛋白作为免疫刺激物与传统的免疫刺激物(表1)相比，其具有可快速提升甲壳类抗病能力的优势，且也不会产生食品安全问题及对环境产生伤害。
于本说明书较佳实施例揭示的内容，本发明所属领域具有常识者可明显得知前述实施例仅为例示；具本发明所属技术领域通常知识者可借由诸多变换、替换而实施，而不与本发明的技术特征有所差异。依据说明书实施例，本发明可有多种变换仍可以实施。本说明书提供的请求项界定本发明的范围，该范围涵盖前述方法与结构及与其相等的发明。
以上对本申请所提供的技术方案进行了详细介绍，本申请中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变的处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
Claims (10)
1.一种提高甲壳类免疫能力及抗病能力的方法，其特征在于，该方法包括：对甲壳类施加一组合物；其中该组合物包含一藻红蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫能力为吞噬作用或原酚氧化酵素***。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗病能力是指对抗病原体的能力；其中该病原体包含病毒或细菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述病毒为白点症病毒。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细菌为副溶血弧菌。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲壳类包含虾、蟹、蟳、鲎、虾姑或龙虾。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藻红蛋白的有效剂量为0.45μg～2.4μg。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中该组合物的施加方式包含口服、浸泡、喷洒或注射。
9.一种藻红蛋白用于作为免疫刺激物的用途，其特征在于，其是包含对甲壳类施加一藻红蛋白；所述的藻红蛋白可提高甲壳类的免疫能力或抗病能力。
10.一种饲料组合物，其特征在于，其是一藻红蛋白，所述的藻红蛋白可提高甲壳类的免疫能力或抗病能力。
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