CN112266930B - 超声穿孔转染细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种超声穿孔转染细胞的方法，包括以下步骤：1)培养靶细胞；2)将靶细胞、目的对象和超声造影剂混合于容器中；3)使用超声波作用于所述容器；4)将所述容器在恒温条件下再培养，以使目的对象充分进入靶细胞；其中，目的对象为目的基因或目的蛋白，且当目的对象为目的基因时，所述步骤3)中采用的超声波的频率为800‑900kHz；当目的对象为目的蛋白时，所述步骤3)中采用的超声波的频率为800‑1200kHz。本发明的超声穿孔转染细胞的方法，操作简单，转染效率高，成本低，且本发明可以对DNA、RNA、蛋白、病毒、糖、药物、纳米颗粒了等不限定范围的分子进行转化或转染。

Description

超声穿孔转染细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞转染技术领域，特别涉及一种超声穿孔转染细胞的方法。
背景技术
细胞工程、遗传工程、基因工程等学科或行业中均涉及对真核细胞(如细菌)和原核细胞(如真菌、鼠、羊、人体细胞)等进行分子如质粒或双链DNA、小RNA、病毒、蛋白、药物、纳米材料等从胞外向胞内的输运。在生命科学的研究领域，该过程是使细胞获得新遗传性状或蛋白表达的必经流程；在新药研发中，该过程应用于小批量蛋白/抗体制备、抗体药物筛选、阳性克隆筛选；在细胞免疫治疗中，也是瞬转制备CAR-T、CAR-NK等细胞的关键技术环节。因此分子向细胞内的输运涉及生命科学研究和工业生产的全行业。当受体细胞为细菌等原核细胞时，该过程称为“转化”，当受体细胞为动物细胞等真核细胞时，该过程称为“转染”。
现有的转染方法分为病毒载体转染体系和非病毒转染体系。病毒载体转染体系转化效率高，但病毒载体的产生需要设计和合成特定的病毒包装***并且要针对性的进行优化，因此对研究和操作人员提出了较高的要求。而且病毒对细胞或者在体的风险性也限制了其大规模使用。再非病毒转染体系中，电穿孔转染是采用最为广泛的方法，但电穿孔过程中的高电压以及阴极效应产生的大量氢氧根离子，对细胞造成极大损害，导致电转后细胞较高的死亡率。同时现在的电穿孔传染设备针对的少量细胞的转染(微升到几十毫升)，对于医药企业需要扩大规模到几百毫升体系的转染则无能为力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种超声穿孔转染细胞的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种超声穿孔转染细胞的方法，包括以下步骤：
1)培养靶细胞；
2)将靶细胞、目的对象和超声造影剂混合于容器中；
3)使用超声波作用于所述容器；
4)将所述容器在恒温条件下再培养，以使目的对象充分进入靶细胞；
其中，目的对象为目的基因或目的蛋白，且当目的对象为目的基因时，所述步骤3)中采用的超声波的频率为800-900kHz；当目的对象为目的蛋白时，所述步骤3)中采用的超声波的频率为800-1200kHz。
优选的是，包括以下步骤：
1)培养靶细胞；
2)将超声造影剂配置在缓冲液中，再加入靶细胞、目的基因，将得到的混合体系转移至玻璃管；
3)将用于发出超声波的换能器置于玻璃管底部，且换能器与玻璃管底部之间的距离保持在10-30mm，调整超声波的频率为800-900kHz，使换能器发出的超声波作用于玻璃管30-120s；
4)将玻璃管置于恒温培养箱中12min，以使目的基因充分进入靶细胞；将玻璃管从恒温培养箱中取出，将玻璃管中的细胞悬浮液接种于预热的含2.5％牛血清的RPMI培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中培养4h，换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞；培养24h后，完成转染，在荧光显微镜下观察转染效率。
优选的是，其中，目的基因为带有绿色荧光的pEGFP-C1质粒。
优选的是，所述步骤2)具体为：将超声造影剂配置在5ml PBS缓冲液中，再加入靶细胞、目的基因，其中，目的基因的最终浓度为20ug/ml，超声造影剂的最终浓度为1*106/ml-1*107/ml；然后将得到的混合体系转移至玻璃管中。
优选的是，包括以下步骤：
1)培养靶细胞；
2)将目的蛋白重悬于超声造影剂中，然后再与靶细胞混合于玻璃管中；
3)将用于发出超声波的换能器置于玻璃管底部，且换能器与玻璃管底部之间的距离保持在10-30mm，调整超声波的频率为800-1200kHz,使换能器发出的超声波作用于玻璃管30-120s；
4)将玻璃管置于恒温培养箱中3h，以使目的蛋白充分进入靶细胞，完成转染；将玻璃管从恒温培养箱中取出，用PBS缓冲溶液洗涤后在荧光显微镜下观察转染效率。
优选的是，其中，目的蛋白为带荧光标记的牛血清蛋白。
优选的是，所述步骤2)具体为：将1ug带荧光标记的牛血清蛋白重悬于10ul超声造影剂中，得到混合液，然后取2.5ul该混合液与200ul靶细胞混合于玻璃管中。
优选的是，所述步骤1)具体为：在6孔板中培养Hela细胞，于37℃下、5％二氧化碳气氛中培养3天，培养基为含2.5％牛血清的RPMI培养基；使用PBS洗涤细胞2次后，加入胰酶-EDTA消化细胞2min，再加入含2.5％牛血清的RPMI培养基；轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min。
本发明的有益效果是：
本发明的超声穿孔转染细胞的方法，操作简单，转染效率高，成本低；与感受态细胞转化技术、融合转化技术或病毒载体的转染相比，本发明的适用对象更为广泛，而且由于不须做病毒封装或购买感受态细胞，因此成本降低；且本发明可以对DNA、RNA、蛋白、病毒、糖、药物、纳米颗粒了等不限定范围的分子进行转化或转染。
由于超声发生器件可以进行不同规模的定制，而且反应容器可以根据需要进行调整，本发明可以覆盖微升到几百升的反应体系，完全满足实验室的原理性研究到工业级小试水平的目的；
与电转化相比，由于超声波能量通过声场传播，因此实现非接触的能量传输，因此反应的体系(细胞和分子)不会像电转过程受电极重复使用带来的污染而困扰；且本发明不需要复杂的细胞清洗和降低离子浓度步骤，不须施加上千伏的电压，对技术人员的专业技能要求和时间投入要求降低，所以本发明的方法操作更为简单，成本更低。
附图说明
图1为实施例1中的超声转染后细胞的荧光显微成像照片；
图2为对比例1中的电转后细胞的荧光显微照片；
图3为实施例2中实现蛋白转染的Hela细胞照片；
图4为实施例2中的超声发生器的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1超声介导的基因转染
一种超声穿孔转染细胞的方法，包括以下步骤：
1)培养Hela细胞(靶细胞)：
在6孔板中培养Hela细胞，于37℃下、5％二氧化碳气氛中培养3天，培养基为含2.5％牛血清(sigma公司)的RPMI培养基(Gibco公司)；使用PBS洗涤细胞2次后，加入胰酶-EDTA消化细胞2min，再加入含2.5％牛血清的RPMI培养基；轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min。
2)将超声造影剂(SonoVue,Bracco公司)配置在5ml PBS缓冲液中，再加入靶细胞、带有绿色荧光的pEGFP-C1质粒(目的基因)，其中，目的基因的最终浓度为20ug/ml，超声造影剂的最终浓度为1*106/ml-1*107/ml；将得到的混合体系转移至玻璃管；
3)将用于发出超声波的换能器置于玻璃管底部，且换能器与玻璃管底部之间的距离保持在10-30mm，调整超声波的频率为800-900kHz，使换能器发出的超声波作用于玻璃管30-120s；本实施例中采用超声发生器产生超声波，超声发生器包括波形发生器、放大器和换能器，换能器上固定了支架，玻璃管放入支架上，使玻璃管底部距离换能器10-30mm；
4)将玻璃管置于恒温培养箱中12min，以使目的基因充分进入靶细胞；将玻璃管从恒温培养箱中取出，将玻璃管中的细胞悬浮液接种于预热的含2.5％牛血清(sigma公司)的RPMI培养基(Gibco公司)中，上下吹打均匀后，置于培养箱中培养4h，换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞；培养24h后，完成转染，在荧光显微镜下观察转染效率。
实施例2超声介导的蛋白转染
一种超声穿孔转染细胞的方法，包括以下步骤：
1)培养Hela细胞(靶细胞)，与实施例1的方法相同；
2)将1ug的目的蛋白：带荧光标记的牛血清蛋白(FITC-BSA，采购于Sigma公司)重悬于10ul超声造影剂中得到混合液，然后取2.5ul该混合液与200ul靶细胞混合于玻璃管中然后再与靶细胞混合于玻璃管中；
3)将用于发出超声波的换能器置于玻璃管底部，且换能器与玻璃管底部之间的距离保持在10-30mm，调整超声波的频率为800-1200kHz,使换能器发出的超声波作用于玻璃管30-120s；参照图4，本实施例中采用超声发生器产生超声波，超声发生器包括波形发生器、放大器和换能器，换能器上固定了支架，玻璃管(参照图4，本实施例中玻璃管直径为35mm)放入支架上，使玻璃管底部距离换能器10-30mm；
4)将玻璃管置于恒温培养箱中3h，以使目的蛋白充分进入靶细胞，完成转染；将玻璃管从恒温培养箱中取出，用PBS缓冲溶液洗涤3次后在荧光显微镜下观察转染效率。
对比例1电穿孔介导的基因转染
本实施例中提供传统的电穿孔介导的基因转染方法与实施例1进行对比，以体现实施例1的方法的优势。
本实施例中，电穿孔介导的基因转染的方法包括以下步骤：
1)培养Hela细胞(靶细胞)：在6孔板中培养Hela细胞，于37℃下培养3天；使用PBS洗涤细胞2次后，加入胰酶消化细胞2min，再加入含2.5％牛血清(sigma公司)的RPMI培养基(Gibco公司)；轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min；
2)加入0.5ml电转缓冲液(Bio-rad电转缓冲液)重悬细胞，并上下吹打均匀；加入带有绿色荧光的pEGFP-C1质粒(目的基因)，使pEGFP-C1质粒最终浓度为20ug/ml，上下吹打均匀；
3)将步骤2)得到的细胞悬液转移入Bio-rad电转杯，放入Gene Pulser Xcell电穿孔***中，参数设置为250V，10ms；电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中12min，以使核酸充分进入细胞；将电击杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的含2.5％牛血清(sigma公司)的RPMI培养基(Gibco公司)中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养；正常培养4h，换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞；培养24h后，在荧光显微镜下观察转染效率。
对实施例1和对比例1进行荧光成像与转化效率计算具体方法为：将细胞涂片在载玻片后，放置于荧光显微镜(BX53，奥林巴斯)下，用50x油镜观察；激发波长为476nm，发射波长为510nm；同时拍摄荧光成像照片和白光成像照片；白光成像下的细胞数为n1，荧光成像下有绿色荧光的细胞数为n2；则转染效率为n2/n1*100％。
经过三次重复，计算得到的转染效率如表1所示
表1
电转染效率(％) 超声转染效率(％)
1 11.3 38.9
2 14.6 46.7
3 9.8 45.4
平均 11.9 43.7
图1为实施例1中的超声转染后细胞的荧光显微成像照片，图2为对比例1中的电转后细胞的荧光显微照片，图3为实施例2中实现蛋白转染的Hela细胞照片。从表1和图1、图2的结果可以看出，相比于传统的电穿孔介导的基因转染方法，本发明的方法转染效率得到了显著提高。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (5)

1.一种超声穿孔转染细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)培养靶细胞；2)将靶细胞、目的对象和超声造影剂混合于容器中；
3)使用超声波作用于所述容器；
4)将所述容器在恒温条件下再培养，以使目的对象充分进入靶细胞；
所述步骤1)具体为：在6孔板中培养Hela细胞，于37℃下、5％二氧化碳气氛中培养3天，培养基为含2.5％牛血清的RPMI培养基；使用PBS洗涤细胞2次后，加入胰酶-EDTA消化细胞2min，再加入含2.5％牛血清的RPMI培养基；轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min；
其中，目的对象为目的基因或目的蛋白，且当目的对象为目的基因时，所述步骤3)具体为：将用于发出超声波的换能器置于玻璃管底部，且换能器与玻璃管底部之间的距离保持在10-30mm，调整超声波的频率为800-900kHz，使换能器发出的超声波作用于玻璃管30-120s；
所述步骤4具体为：将玻璃管置于恒温培养箱中12min，以使目的基因充分进入靶细胞；将玻璃管从恒温培养箱中取出，将玻璃管中的细胞悬浮液接种于预热的含2.5％牛血清的RPMI培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中培养4h，换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞；培养24h后，完成转染，在荧光显微镜下观察转染效率；
其中，当目的对象为目的蛋白时，所述步骤3)具体为：将用于发出超声波的换能器置于玻璃管底部，且换能器与玻璃管底部之间的距离保持在10-30mm，调整超声波的频率为800-1200kHz,使换能器发出的超声波作用于玻璃管30-120s；
所述步骤4具体为：将玻璃管置于恒温培养箱中3h，以使目的蛋白充分进入靶细胞，完成转染；将玻璃管从恒温培养箱中取出，用PBS缓冲溶液洗涤后在荧光显微镜下观察转染效率。
2.根据权利要求1所述的超声穿孔转染细胞的方法，其特征在于，其中，目的基因为带有绿色荧光的pEGFP-C1质粒。
3.根据权利要求2所述的超声穿孔转染细胞的方法，其特征在于，所述步骤2)具体为：将超声造影剂配置在5ml PBS缓冲液中，再加入靶细胞、目的基因，其中，目的基因的最终浓度为20ug/ml，超声造影剂的最终浓度为1×106/ml-1×107/ml；然后将得到的混合体系转移至玻璃管中。
4.根据权利要求3所述的超声穿孔转染细胞的方法，其特征在于，其中，目的蛋白为带荧光标记的牛血清蛋白。
5.根据权利要求4所述的超声穿孔转染细胞的方法，其特征在于，所述步骤2)具体为：将1ug带荧光标记的牛血清蛋白重悬于10ul超声造影剂中，得到混合液，然后取2.5ul该混合液与200ul靶细胞混合于玻璃管中。
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