CN112255409A - 一种检测人脂蛋白磷脂酶a2底物及其试剂盒 - Google Patents
一种检测人脂蛋白磷脂酶a2底物及其试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112255409A CN112255409A CN201910606661.1A CN201910606661A CN112255409A CN 112255409 A CN112255409 A CN 112255409A CN 201910606661 A CN201910606661 A CN 201910606661A CN 112255409 A CN112255409 A CN 112255409A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- human lipoprotein
- substrate
- associated phospholipase
- reaction substrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/32—Cardiovascular disorders
- G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明目的在于提供一种人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物。本发明另一个目的提供一种检测人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的生化试剂盒。为了实现上述目的本发明提供了一种用于人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物，本发明制备了一种底物，将合成的底物1‑十二酰基‑2（4‑硝基苯戊二酰基）磷脂酰胆碱，溶解于TE缓冲液，并加入含硅油的甘油作为稳定剂。为了进一步提高底物稳定性，本发明经过测试采用三氟丙基甲基硅油。经过测试，本配方底物经过55℃加速破坏稳定性7天，后测试4‑硝基苯酚浓度无上升。而加入人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白后测试4‑硝基苯酚浓度反应曲线效能无下降，实现了人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物稳定性提升。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人脂蛋白磷脂酶A2底物及其试剂盒。
背景技术
脂蛋白相关磷脂酶A2 （lipoprorein-assoeiated phosPhohPaseA2，Lp-PLA2）又称血小板活化因子乙酞水解酶（PAF-AH），是一种炎性细胞分泌的能促使氧化磷脂水解的磷脂酶，是磷脂酶A2（PLA2）超家族中的一员，相对分子质量为45.4kD（441个氨基酸）。Lp-PLA2的基本功能是催化多种氧化磷脂Sn-2位上酰键水解，产生游离脂肪酸和溶血磷脂。此外，Lp-PLA2还能水解血小板活化因子等致炎因子。Lp-PLA2是磷脂酶超家族中的亚型之一，也被称为是血小板活化因子乙酰水解酶，由血管内膜中的巨噬细胞、T细胞和肥大细胞分泌。动脉粥样硬化斑块中Lp-PLA2表达上调，并且在易损斑块纤维帽的巨噬细胞中强表达。Lp-PLA2可水解氧化低密度脂蛋白ox-LDL中的氧化磷脂，生成脂类促炎物质，如溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸，进而产生多种致动脉粥样硬化作用，包括内皮细胞死亡和内皮功能异常，刺激粘附因子和细胞因子的产生。这些物质可通过趋化炎症细胞进一步产生自我强化的循环，生成更多促炎物质。Lp-PLA2的检测有活性法和浓度法两种。活性法主要采用高效液相色谱法、放射活度测定法和酶水解底物法等。高效液相色谱法灵敏度低，易受到血液中各种成分的干扰。放射活度测定法存在试剂的放射性污染、准确度低、重复性差等问题；酶水解底物法常用的底物以1-癸酞基-2-(4-硝基苯戊二酰基)磷脂酰胆碱、1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱、1-癸酰基-2-(4-硝基苯戊二酰基)磷脂酰胆碱，主要反应都是被脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白水解Sn-2 位产生4-硝基苯戊二酞，4-对硝基苯酚丁二酸酐，由于水解产物不稳定进一步分解，产生4-硝基苯酚或对硝基苯酚,导至溶液中4-硝基苯酚或对硝基苯酚对应波长吸光度发生变化，目前上述三种底物都存稳定性较差的问题，自然分解较快，底物必须独立的缓冲液体***保存到用前进行现稀释现用，否则底物由于自然氧化分解导至本底较高，从而降低检测效率。
发明内容
本发明目的在于提供一种人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物。
本发明另一个目的提供一种检测人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的生化试剂盒。
为了实现上述目的本发明提供了一种用于人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物，本发明制备了一种底物，将合成的底物1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）磷脂酰胆碱，溶解于TE缓冲液，并加入含硅油的甘油作为稳定剂。为了进一步提高底物稳定性，本发明经过测试采用三氟丙基甲基硅油。经过测试，本配方底物经过55℃加速破坏稳定性7天，后测试4-硝基苯酚浓度无上升。而加入人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白后测试4-硝基苯酚浓度反应曲线效能无下降，实现了人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物稳定性提升。
本发明为了更好实施上述方法，公开了一种检测人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的生化试剂盒，该试剂盒包括：稀释缓冲液R1和为人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物R2。使用前述发明中底物作为底物，稀释缓冲液采用pH7.4 磷酸盐缓冲液并加入0.05%吐温-20。对于前述试剂盒进一步优化增加校准品与质控品，校准品与质控品的主要成份为人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白溶液或含人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的血清。
附图说明
附图1.合成产物测定。
附图2.不同浓度样本OD405变化曲线图 。
附图3.40次空白试剂检测浓度。
具体实施方式
下列实施例是为了更详细的解释本发明，但不应理解释为本发明局限于此。
实施例1：合成1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
原料为月桂酰胺、甘油磷脂酰胆碱、3-(4-硝基苯基)戊二酸，方法如下：
1.将月桂酰胺加入到甘油磷脂酰胆碱中sn-3位；
2.三氯甲烷萃取产物1-十二酰基-2氢-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱；
3.将3-(4-硝基苯基)戊二酸加入到前述中产物1-十二酰基-2氢-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱中sn-2；
4.三氯甲烷萃取产物，硅胶柱纯化。
结果分析，使用浓度为3mmol/L人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白血清样本，加入前述合成产物1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱反应使用分光光度计测定产物OD405变化，经过测试，加入1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱后OD405连续变化结果见附图1.合成产物测定，结果证明底物能很好的被人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白识别并催化水解。将3mmol/L血清样本使用pH7.0~pH8.0磷酸盐缓冲液进行稀释后到2mmol/L、1mmol/L、0.5mmol/L、0mmol/L，使用分光光度计测定其OD变化速率，结果见附图2.不同浓度样本OD405变化曲线图，反应速率同样本浓度正相关性，证明该底物反应速率能反映样本中酶的活性与数量，可作为底物用于测量样本中人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白浓度。
实施例2：人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物缓冲液配制。
原料：1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱、pH7.5~8.5 TE（Tris-EDTA）缓冲液,甘油、三氟丙基甲基聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、二甲基亚砜。
配制方法：
将1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱溶于pH7.5~8.5 TE缓冲液中获得组分1；
将甘油按体积5%比例溶于二甲基亚砜获得混合溶剂1；
将甘油按体积10%比例溶于二甲基亚砜获得混合溶剂2；
取三氟丙基甲基聚硅氧烷按质量比1%溶于前述混合溶剂1中，使用超声波乳化分散，获得组分2；
取聚二甲基硅氧烷按质量比1%溶于前述混合溶剂1中，使用超声波乳化分散，获得组分3；
取三氟丙基甲基聚硅氧烷按质量比5%溶于前述混合溶剂2中，使用超声波乳化分散，获得组分4；
取聚二甲基硅氧烷按质量比5%溶于前述混合溶剂2中，使用超声波乳化分散，获得组分5；
分别取组分1与组分2，按体积比1:1混合获得反应底物1；
分别取组分1与组分3，按体积比99:1混合获得反应底物2；
分别取组分1与组分4，按体积比1:1混合获得反应底物3；
分别取组分1与组分5，按体积比99:1混合获得反应底物4；
测试：分别取前述反应底物1~4，分别分装两份，取一份放入55℃高温加速破坏性，另一份置于2~8℃冰箱中存放，一周后取出，使用分光光度计测试两种保存条件下的底物OD405，结果见表1.反应底物测定，加速破坏性实验对比，即前述配方能稳定保存1年以上分解率不超过2%，使用浓度为3mmol/L人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白血清样本，加入前述反应底物1~4，反应后使用分光光度计测定产物OD405变化，经过测试，加入OD405连续变化结果见表1.反应底物测定。结果显示，经过4种反应底物都具有良好的反应性，经过加速破坏性实验依然能保证98%以上效价。
表1.反应底物测定。
实施例3：人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白检测试剂盒
试剂盒含有组分R1、R2。R1为样本稀释液，常用的缓冲液均可达到稀释目的，为了更好的实施本实验发明，本发明具体的使用pH6.0~pH8.0的磷酸盐缓冲液，加入0.01%~0.1%吐温20。R2为反应底物，使用R1、R2在生化仪或是其它具有405nm波长的检测的能力的仪器，例如：分光光度计、含405波长特定蛋白分析仪、含405波长的酶标仪，均可完成以对反应底物OD405吸光度的测定来获得底物分解速率，从而获得样本中人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的活性与浓度。为了更好的实施发明，试剂盒中可选配质控品与校准品，为机器提供校准与质控。使用BECKMANCOULTER AU5400机型测试，使用本发明试剂采用OD405吸光度变化速率法进行检测，结果显示本试剂盒，在机30天试剂空白变化< 2%,检测线性范围5~3000IU/L，检出限，0.5IU/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明。
本说明书中所用的术语“样本稀释液”指在包括是本领域技术人员公知的，并且被包括在现有技术中。
Claims (10)
1.一种人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物，含底物、缓冲液、保护剂、稳定剂，其特征在于：所述底物为1-十二酰基-2（4-硝基苯戊二酰基）-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱。
2.根据权利要求1所述的人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物：其特征在于：
1）所述缓冲液为pH 7.5~8.5 TE缓种液保存；
2）所述保护剂为硅油；
3）所述的稳定剂为甘油二甲基亚砜溶液。
3.根据权利要求1或2所述的人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物，其特征在于所述的保护剂硅油为三氟丙基甲基聚硅氧烷。
4.根据权利要求3所述的人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物，其特征在于：所述的保护剂浓度为0.01%~0.05%。
5.根据权利要求3所述的人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物，其特征在于所述的稳定剂为5%~10的甘油二甲基亚砜溶液。
6.根据权利要求5所述的人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物，其特征在于所述的稳定剂在反应底物中体积占比为1%~50%。
7.根据权利要求3所述的人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物，其特征在于所述的保护剂经过乳化于甘油中二甲基亚砜溶液后加入到缓冲液中。
8.一种检测人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的生化试剂盒 ，含有组份R1、R2，其特征在于：其中R1为样本稀释缓冲液，R2为人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的反应底物。
9.根据权利要求8所述的检测人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的生化试剂盒，其特征在于：所述样本稀释缓冲液由pH6.0~pH8.0的磷酸盐缓冲液，加入0.01%~0.1%吐温20。
10.根据权利要求8所述的检测人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的生化试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中还有校准品和质控品，校准品与质控品为一定浓度的人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白溶液或含人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的血清。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910606661.1A CN112255409A (zh) | 2019-07-06 | 2019-07-06 | 一种检测人脂蛋白磷脂酶a2底物及其试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910606661.1A CN112255409A (zh) | 2019-07-06 | 2019-07-06 | 一种检测人脂蛋白磷脂酶a2底物及其试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112255409A true CN112255409A (zh) | 2021-01-22 |
Family
ID=74224716
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910606661.1A Pending CN112255409A (zh) | 2019-07-06 | 2019-07-06 | 一种检测人脂蛋白磷脂酶a2底物及其试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112255409A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114047150A (zh) * | 2021-11-11 | 2022-02-15 | 浙江伊利康生物技术有限公司 | 一种脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂、制备方法及其应用 |
-
2019
- 2019-07-06 CN CN201910606661.1A patent/CN112255409A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114047150A (zh) * | 2021-11-11 | 2022-02-15 | 浙江伊利康生物技术有限公司 | 一种脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂、制备方法及其应用 |
| CN114047150B (zh) * | 2021-11-11 | 2022-07-26 | 浙江伊利康生物技术有限公司 | 一种脂蛋白相关磷脂酶a2的检测试剂、制备方法及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Werner et al. | Ultramicro determination of serum triglycerides by bioluminescent assay. | |
| Pohanka | Biosensors and bioassays based on lipases, principles and applications, a review | |
| Ashour et al. | Use of a 96-well microplate reader for measuring routine enzyme activities | |
| Tougou et al. | Paraoxonase has a major role in the hydrolysis of prulifloxacin (NM441), a prodrug of a new antibacterial agent | |
| US20070166777A1 (en) | Methods for detecting lp-pla2 activity and inhibition of lp-pla2 activity | |
| CN102399851A (zh) | 酶法唾液酸检测试剂盒 | |
| de los Angeles Camacho-Ruiz et al. | A broad pH range indicator-based spectrophotometric assay for true lipases using tributyrin and tricaprylin | |
| Beisson et al. | Use of naturally fluorescent triacylglycerols from Parinari glaberrimum to detect low lipase activities from Arabidopsis thaliana seedlings1 | |
| CN1731146A (zh) | 一种检测α－L－岩藻糖苷酶活力的方法及试剂 | |
| CN104498586B (zh) | 一种稳定性强的单试剂血清甘油三酯检测试剂 | |
| Shoemaker et al. | Crystallization of β-galactosidase does not reduce the range of activity of individual molecules | |
| Christ et al. | Polyphosphate chain length determination in the range of two to several hundred P-subunits with a new enzyme assay and 31P NMR | |
| CN112255409A (zh) | 一种检测人脂蛋白磷脂酶a2底物及其试剂盒 | |
| Vinet | An enzymic assay for the specific determination of methanol in serum. | |
| US5512429A (en) | Assay for enzyme activity | |
| Masson et al. | Aryl acylamidase activity of human serum albumin with o-nitrotrifluoroacetanilide as the substrate | |
| Stafforini et al. | Determination of phospholipase activity of PAF acetylhydrolase | |
| CN107109462A (zh) | 涉及测试溶酶体贮积紊乱的方法 | |
| Henkel et al. | A newly drafted colour test for the determination of triglycerides convenient for manual and mechanized analysis (glycerolphosphate-oxidase—PAP method) | |
| Reiner et al. | Activity of Cholinesterases in Human Whole Blood Measured with Acetylthiocholine as Substrate and Ethopropazine as Selective Inhibitor of Plasma Butytylcholinesterase | |
| JP4542541B2 (ja) | 安定化コリンエステラーゼ基質溶液 | |
| JP5448317B2 (ja) | アジ化物によるカタラーゼの阻害に起因する測定誤差の低減方法 | |
| CN110160974A (zh) | 一种检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒 | |
| Chagas et al. | Mechanism of imidazole inhibition of a GH1 β‐glucosidase | |
| Rudakova et al. | A new selective inhibitor of mouse blood plasma carboxylesterase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |