CN112233040B - 一种自动离焦校正的傅里叶叠层显微成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种自动离焦校正的傅里叶叠层显微成像方法，通过提出的一种新的聚焦评价函数——图像偏移量，采用倾斜照明下离焦图像信息的偏移量进行离焦量评估。本发明是一种适合于傅里叶叠层显微成像模式的重聚焦方式，根据图像离焦偏移量进行判断更符合该***的成像机制，重聚焦准确快速；在样品未处于焦平面上时，也可以利用拍摄到的图像在傅里叶叠层显微成像前进行自动的离焦校正。本发明不需任何机械扫描装置，结构简单，造价便宜，可实现快速的大视场超分辨。
Description
技术领域
本发明属于计算光学显微成像技术，具体为一种自动离焦校正的傅里叶叠层显微成像方法。
背景技术
在医学上，对于身体组织的病变问题，医生们需要取一定大小的病变组织制成病理切片，在显微镜下进行诊断，并做出具体的病情分析。通常采用数字病理切片又称虚拟病理切片，这是一种现代数字***与传统光学放大装置有机结合的技术。它将传统的玻璃病理切片通过全自动显微镜或光学放大***扫描采集得到高分辨数字图像，再应用计算机对得到的图像自动进行高精度多视野无缝隙拼接和处理，获得优质的可视化数据以应用于病理学的各个领域。
这种高精度、高速度的机械扫描方式，使得目前市场上的数字病理***体积庞大，价格昂贵，这大大加重了患者在医疗费用上的支出。究其原因是，传统显微镜无法兼顾成像的高分辨率与大视场两方面。随着计算显微成像技术的快速发展，于2013年Zheng等人提出傅里叶叠层成像技术可实现使用一个低数值孔径，低放大倍率的物镜，获得大视场和高分辨率的成像结果（Zheng G, Horstmeyer R, Yang C. Wide-field, high-resolutionFourier ptychographic microscopy. Nature photonics. 2013;7:739-45.）。该技术通过一块可编程LED，每个LED单独发出不同角度的照明光对样品进行拍摄，将拍摄到的一系列低分辨率的样品振幅信息在频率域进行合成。其中，每个LED拍摄到的低分辨率图在频率域中对应于不同频率孔径的信息，通过这些信息对计算的样品信息进行强度约束，并运用迭代方法进行计算得到一个最终收敛的结果。这些低分辨率图像所对应的孔径位置由LED的照明角度相对应，最终可达到的分辨率为照明数值孔径与物镜数字空间共同确定，若采用远大于物镜数值孔径的照明数值孔径就可以大大提高成像分辨率。
但是在对样品进行实际拍摄时，如果样品未能准确处于焦平面处，则用拍摄的离焦图像进行迭代重构就无法保证结果的准确性。因此需要先采用***重聚焦（Groen FCA.A comparison of different focus functions for use in autofocus algorithms.Cytometry. 1987;6.）进行离焦校正，才能达到准确的成像结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自动离焦校正的傅里叶叠层显微成像方法，在样品未处于焦平面上时，也可以利用拍摄到的图像在傅里叶叠层显微成像前进行自动的离焦校正，以达到准确的成像结果。
本发明的技术方案如下：一种自动离焦校正的傅里叶叠层显微成像方法，其特征在于，步骤为：
步骤1，使用中心照明的明场图像初始化样品高分辨率频谱；
步骤2，在离焦距离遍历范围内，依次取特定的传播距离，计算聚焦像质评价函数—图像偏移量；
步骤3，通过像质评价函数判断该传播距离是否为准确的离焦距离；
步骤4，重复步骤2~3，直到确定准确的离焦距离为止；
步骤5，将各个LED照明下拍摄到的图像利用角谱传播理论传播相应离焦距离进行重聚焦；
步骤6，重复步骤5，直到所有LED照明下对应的子孔径都校正完毕；
步骤7，用离焦校正后的图像进行傅里叶叠层显微成像。
优选的，步骤2中，使用LED面阵中心3×3区域照明下的低分辨率图像进行分析计算，对于特定的传播距离z，聚焦像质评价函数的具体计算步骤如下：
步骤2.1，使用中心照明图像初始化样品高分辨率频谱，将高分辨率频谱中与中心相邻的子孔径乘上角谱传播因子进行传播：
其中A 0 是子孔径对应的的角谱，A是传播距离z后的角谱，k是平面波波矢，表征光波传播方向，cosα是光波传播方向和x轴夹角余弦，cosβ是光波传播方向和y轴夹角余弦，角谱A 0 的截取方式为：
其中U h (ξ,η)是高分辨率频谱，H(ξ,η)是传递函数，ξ 0 =(cosα)/λ，η 0 =(cosβ)/λ；
与子孔径相对应的LED倾斜照明下采集到的低分辨率图像为I lm (x,y)，对应的复振幅为ψ lm (x,y)，选取传播后的子孔径角谱A进行逆傅里叶变换并用采集的低分辨率图像I lm (x,y)，进行振幅约束，得到生成的低分辨率图像I ln (x,y)，对应的复振幅为ψ ln (x,y) ，振幅约束的实现方式为：
；
步骤2.2，计算图像I ln (x,y)相对于图像I lm (x,y)的标准差S num ，并记录，标准差的计算方式为：
其中n为图像像素点个数；
步骤2.3，重复步骤2.1、步骤2.2，直到LED面阵中心周围的灯都完成相应的操作并求和：
S sum (z)即为***的聚焦评价函数。
优选的，步骤3中，确定准确离焦距离的方法为：在一定范围内遍历传播距离z，计算该距离下的聚焦像质评价函数，当取某一传播距离z使计算的聚焦评价函数达到最优时，则将该传播距离z确定为准确的离焦距离，传播距离z的遍历范围取[-30,30]μm。
优选的，步骤5的具体步骤如下：
步骤5.1，对于每一幅LED照明拍摄到的图像，包括明场与暗场图像，取其角谱乘上对应的角谱传播因子进行传播校正：
其中A 0 是LED照明下对应子孔径的角谱，A是传播距离z后完成离焦校正的角谱，k是平面波波矢，表征光波传播方向，cosα是光波传播方向和x轴夹角余弦，cosβ是光波传播方向和y轴夹角余弦；
步骤5.2，对传播后的角谱A做逆傅里叶变换，得到校正后的明场、暗场图像：
其中U h (ξ,η)是高分辨率频谱，H(ξ,η)是传递函数，ξ 0 =(cosα)/λ，η 0 =(cosβ)/λ，直到每个LED照明下拍摄的图像都校正完毕，为接下来的傅里叶叠层显微成像做准备。
本发明的有益效果是：（1）在样品未处于焦平面上时，也可以利用拍摄到的图像在傅里叶叠层显微成像前进行自动的离焦校正；（2）这是一种适合于傅里叶叠层显微成像模式的重聚焦方式，根据图像离焦偏移量进行判断更符合该***的成像机制，重聚焦准确快速；（3）本发明不需任何机械扫描装置，结构简单，造价便宜，可实现快速的大视场超分辨。
附图说明
图1为本发明实施例的数字病理***示意图。
图2为本发明实施例采用的环形LED面阵示意图。
图3为本发明实施例中环形LED面阵的模型图。
图4为本发明实施例的流程示意图。
图5为归一化聚焦评价函数示意曲线。
环形LED面阵1、样品2、显微物镜3、筒镜4、相机5。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本实施例的数字病理***如图1~3所示，包括环形LED面阵1、显微物镜3、筒镜4和相机5。环形LED面阵1、样品2、显微物镜3、筒镜4和相机5位于同一轴线上，环形LED面阵1位于样品2前方45cm左右，样品2位于显微物镜的前焦面上，显微物镜3和筒镜4距离为二者机械焦距的和，相机5位于筒镜4的后焦面上。环形LED面阵1的具体分布情况如图2所示，是一个82 mm×82 mm的LED面阵，采用的是5050贴片LED，环上12颗灯，内部9颗灯，内部9颗灯上方盖有一片毛玻璃片。在正式计算之前，需要针对物镜进行不同波长照射下的焦平面位置矫正。
如图4所示，一种自动离焦校正的傅里叶叠层显微成像方法，具体步骤如下。
步骤1，使用中心照明的明场图像初始化样品高分辨率频谱。
初始化一个高分辨率的样品复振幅分布I h 1/2 e iφh ，可以令初始化的相位分布φ h = 0，以及非零的振幅分布。选取中心照明下拍摄到的明场图像作为初始化振幅分布。并求这个高分辨率复振幅对应频率域的高分辨率频谱复振幅分布U h (ξ,η)。其中h表示高分辨率。如式(1)、(2)：
(1)
(2)
其中ψ h (x,y)表示初始化的高分辨率样品复振幅分布，U h (ξ,η)表示初始化的高分辨率样品频谱分布，I center 表示中心的LED灯照射下的样品强度分布，upsample表示上采样。 upsample后的矩阵大小应当适当恰好可以容纳超分辨后的结果，又不能过大造成不必要的计算负担。
步骤2，在离焦距离遍历范围内，依次取某一特定的传播距离，计算聚焦像质评价函数——图像偏移量。选取图像信息偏移量作为聚焦像质评价函数的优势为：这是一种适合于傅里叶叠层显微成像模式的重聚焦方式，根据平面波角谱传播特点，当倾斜光照明时，离焦图像的信息会发生偏移，而空间域的信息位移在频率域内通过相位移动进行表征，此时可用相位差别进行离焦量评估。相比于其他几类判据，该方法根据图像离焦偏移量进行判断更符合该***的成像机制，具有惟一极值，且在极值两侧有更明显的上升和下降梯度，重聚焦准确快速。
步骤2.1，使用中心照明图像初始化样品高分辨率频谱，将高分辨率频谱中与中心相邻的子孔径乘上角谱传播因子进行传播。如式(3)：
(3)
其中，A 0 是该子孔径对应的角谱，A是传播距离z后的角谱，k是平面波波矢，表征光波传播方向，cosα是光波传播方向和轴夹角余弦，cosβ是光波传播方向和轴夹角余弦。
其中，角谱的截取方式如式(4)：
(4)
其中H(ξ,η)是***传递函数，频率平移量(ξ 0 ,η 0 )与照射角度(cosα, cosβ)的关系为ξ 0 =(cosα)/λ，η 0 =(cosβ)/λ。
与该子孔径相对应的LED倾斜照明下采集到的低分辨率图像为I lm (x,y)（对应的复振幅为ψ lm (x,y)）。选取传播后的子孔径角谱进行逆傅里叶变换并用采集的低分辨率图像I lm (x,y)进行振幅约束，得到生成的低分辨率图像I ln (x,y)（对应复振幅为ψ ln (x,y)）。
其中，振幅约束的实现方式如式(5)：
(5)
步骤2.2，计算图像I ln (x,y)相对于图像I lm (x,y)的标准差S num ，并记录。
标准差的计算方式如式(6)：
(6)
其中，n为图像像素点个数。
步骤2.3，重复前两个步骤，直到中心周围的八颗灯都完成相应的操作并求和得到S sum (z)：
(7)
S sum (z)即为***的聚焦评价函数。
步骤3：通过像质评价函数判断该传播距离是否为准确的离焦距离。
在一定范围内遍历传播距离z，计算该距离下的聚焦像质评价函数，当取某一传播距离使计算的聚焦评价函数达到最优时，则可将该传播距离确定为准确的离焦距离。根据经验，z的遍历范围可取[-30,30]μm。
步骤4：重复步骤2~3，直到确定准确的离焦距离为止；
步骤5：将各个LED照明下拍摄到的图像利用角谱传播理论传播相应离焦距离进行重聚焦。
步骤5.1，对于每一幅LED照明拍摄到的图像（包括明场与暗场图像），取其角谱（频谱）乘上对应的角谱传播因子进行传播校正，与前式(3)相同：
(3)
其中A 0 是该LED照明下对应子孔径的角谱，A是传播距离z后完成离焦校正的角谱，k是平面波波矢，表征光波传播方向，cosα是光波传播方向和x轴夹角余弦，cosβ是光波传播方向和y轴夹角余弦。
步骤5.2，对传播后的角谱做逆傅里叶变换，得到校正后的明场、暗场图像，如式(8)：
(8)
直到每个LED照明下拍摄的图像都校正完毕，为接下来的傅里叶叠层显微成像做准备。
步骤6：重复步骤5，直到所有LED照明下对应的子孔径都校正完毕。
步骤7：用离焦校正后的图像进行傅里叶叠层显微成像。
步骤7.1，选取高分辨率样品复振幅频谱的一个子区域，每个子区域对于一个照明角度，将这个子区域的频谱信息取出，做逆傅里叶变换生成一个对应照明角度的低分辨率样品的复振幅分布I l 1/2 e iφl 。其中l表示低分辨率，
(9)
(10)
其中ψ l (x,y)表示生成低分辨率图像的复振幅分布，子孔径区域中心频率(ξ 0 ,η 0 )与照明角度(cosα, cosβ)的对应关系为ξ0=(cosα)/λ，η0=(cosβ)/λ。
步骤7.2，将生成的低分辨复振幅I l 1/2 e iφl 中的振幅I l 1/2 替换为对应照明角度拍摄的振幅图像I lm 1/2 ，其中m表示为拍摄到的图像，替换后得到I lm 1/2 e iφl 并将其对应的频谱信息填回原来的高分辨率频谱，
(11)
(12)
即对应图4中的第三步，如式(12) 。
步骤7.3，接着下一个对应不同照明角度的子孔径区域，并重复步骤7.1和步骤7.2。
步骤7.4，最后再重复上述步骤7.1到步骤7.4，逐渐得到一个收敛稳定的高分辨率样品复振幅分布I h 1/2 e iφh ，
(13)
以上是自动离焦校正的傅里叶叠层显微成像方法，其中包含了***重聚焦算法和傅里叶叠层显微算法。
本实施例采用了倾斜照明下离焦图像信息的偏移量进行离焦量评估；用角谱传播理论进行重聚焦；用采集到的明场图像进行图像信息频谱的初始化；用拍摄到的明场图像进行约束，恢复图像的明场频谱信息；用拍摄到的暗场图像进行约束，恢复图像的暗场频谱信息；重复约束过程直到图像收敛。
本实施例提出的一种契合傅里叶叠层成像算法特点的重聚焦判据，可以更快更准确的给出重构过程中需要进行角谱传播的量，使成像快速结果清晰。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (3)
1.一种自动离焦校正的傅里叶叠层显微成像方法，其特征在于，步骤为：
步骤1，使用中心照明的明场图像初始化样品高分辨率频谱；
步骤2，在离焦距离遍历范围内，依次取预定的传播距离，计算聚焦像质评价函数—图像偏移量；
步骤2中，使用LED面阵中心3×3区域照明下的低分辨率图像进行分析计算，对于预定的传播距离z，聚焦像质评价函数的具体计算步骤如下：
步骤2.1，使用中心照明图像初始化样品高分辨率频谱，将高分辨率频谱中与中心相邻的子孔径乘上角谱传播因子进行传播：
其中A 0是子孔径对应的的角谱，A是传播距离z后的角谱，k是平面波波矢，表征光波传播方向，cosα是光波传播方向和x轴夹角余弦，cosβ是光波传播方向和y轴夹角余弦，角谱A 0的截取方式为：
其中U h (ξ,η)是高分辨率频谱，H(ξ,η)是传递函数，ξ 0 =(cosα)/λ，η 0 =(cosβ)/λ；
与子孔径相对应的LED倾斜照明下采集到的低分辨率图像为I lm (x,y)，对应的复振幅为ψ lm (x,y)，选取传播后的子孔径角谱A进行逆傅里叶变换并用采集的低分辨率图像I lm (x, y)，进行振幅约束，得到生成的低分辨率图像I ln (x,y)，对应的复振幅为ψ ln (x,y)，振幅约束的实现方式为：
步骤2.2，计算图像I ln (x,y)相对于图像I lm (x,y)的标准差S num，并记录，标准差的计算方式为：
其中n为图像像素点个数；
步骤2.3，重复步骤2.1、步骤2.2，直到LED面阵中心周围的灯都完成相应的操作并求和：
S sum (z)即为***的聚焦评价函数；
步骤3，通过像质评价函数判断该传播距离是否为准确的离焦距离；
步骤4，重复步骤2~3，直到确定准确的离焦距离为止；
步骤5，将各个LED照明下拍摄到的图像利用角谱传播理论传播相应离焦距离进行重聚焦；
步骤6，重复步骤5，直到所有LED照明下对应的子孔径都校正完毕；
步骤7，用离焦校正后的图像进行傅里叶叠层显微成像。
2.根据权利要求1所述的自动离焦校正的傅里叶叠层显微成像方法，其特征在于，步骤3中，确定准确离焦距离的方法为：在一定范围内遍历传播距离z，计算该距离下的聚焦像质评价函数，当取某一传播距离z使计算的聚焦评价函数达到最优时，则将该传播距离z确定为准确的离焦距离，传播距离z的遍历范围取[-30,30]μm。
3.根据权利要求1所述的自动离焦校正的傅里叶叠层显微成像方法，其特征在于，步骤5的具体步骤如下：
步骤5.1，对于每一幅LED照明拍摄到的图像，包括明场与暗场图像，取其角谱乘上对应的角谱传播因子进行传播校正：
其中A 0是LED照明下对应子孔径的角谱，A是传播距离z后完成离焦校正的角谱，k是平面波波矢，表征光波传播方向，cosα是光波传播方向和x轴夹角余弦，cosβ是光波传播方向和y轴夹角余弦；
步骤5.2，对传播后的角谱A做逆傅里叶变换，得到校正后的明场、暗场图像：
其中U h (ξ,η)是高分辨率频谱，H(ξ,η)是传递函数，ξ 0 =(cosα)/λ，η 0 =(cosβ)/λ，直到每个LED照明下拍摄的图像都校正完毕，为接下来的傅里叶叠层显微成像做准备。
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