CN112213459B - 基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测设备及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测设备及方法。检测设备包括多通道微流控芯片，多孔光纤探头，荧光检测仪及光源；多通道微流控芯片包括进样通道、与进样通道连通的储存通道及与储存通道通过连接通道连通的检测通道，储存通道内储存有细菌微胶囊；多孔光纤探头一端***检测通道，另一端与荧光检测仪连接；光源位于多通道微流控芯片上方。本发明多通道微流控芯片的通道中储有细菌微胶囊，该设备可将样品直接注入多通道微流控芯片通道中直接进行检测，实现生化需氧量的快速，灵敏，精确，可靠检测；克服传统传感器中微生物膜寿命短、应用条件苛刻、重复性差等问题；具有简单便携，检测过程稳定，适用范围广的优点。
Description
技术领域
本发明涉及环境水样检测技术领域，特别是涉及一种基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测设备及方法。
背景技术
生物化学需氧量(biochemical oxygen demand)，是表示水中有机物等需氧污染物质含量的一个综合指标，它说明水中有机物由于微生物的生化作用进行氧化分解，使之无机化或气体化时所消耗水中溶解氧的总数量。污水中各种有机物得到完全氧化分解的时间，总共约需20天，为了缩短检测时间，一般生化需氧量以被检验的水样在20℃下5天内的耗氧量为代表，称其为5日生化需氧量，简称BOD5。BOD5数值越高，代表水体污染越严重。
BOD5的经典测试方法是稀释接种法，应用较广，适用于地表水生活污水和工业废水的测定，但存在测量的精度不高、操作复杂、测量周期长的缺点，不能及时反映水质情况，不利于对污染状况及时做出科学判断。在稀释接种法上进行改进的增温法、测压法、检压式库仑计法等方法，一样也存在相似的局限性。BOD5另一种常见的测定方法是微生物传感器测定法。微生物传感器解决了经典测定方法测量周期长的问题，且操作相对简单，这在应用中有着较大优势，但在实际使用过程中存在一些问题，如稳定性不高、微生物膜寿命短、应用条件苛刻、重复性差等；另外，浓度过高的无机盐，重金属离子会对微生物膜有抑制和毒害作用；而且，当水样中含有较多对BOD值有贡献的悬浮物时，测定结果偏差会较大，这都局限了微生物传感器的使用范围与实用性。如何能够能实现精确，简便的生化需氧量测定，是环境监测中亟待解决的问题。
微流控芯片又被称为微全分析***或芯片实验室，它能够在一块小尺寸的芯片上集成分析所需要的多种步骤，如样品预处理，试剂输送，混合，分离与检测。目前已经被广泛地应用于实验室分析，环境监测，食物检测和生物防护等领域。由于微流控芯片具有透光，传热，易修饰等性质，可以负载光学，电化学等检测元件。此外，微流控芯片具有盖度可设计性，可满足不同的检测需求。因此，微流控芯片的发展为许多分析难题提供了新的思路和方法。近年来，人们对环境水样监测的需求越来越迫切，便携式的，精确可靠的BOD5检测设备将为环境保护和可持续发展提供有力的支持。目前市场上的BOD5微生物传感器设备在实际使用中仍有不足，也很难克服传感器中菌膜的不稳定性等问题。
基于上述问题，申请人经过不断研究发现直接将细菌微球植入到微流控芯片中培养将是一种革新式的技术，能为BOD5检测带来重大的影响，因此，构建包埋细菌微球的微流控芯片检测技术至关重要。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测设备，该检测设备将细菌微胶囊包埋在多通道微流控芯片中，能将水样直接注入多通道微流控芯片中直接进行检测，实现了生化需氧量的快速，灵敏，精确，可靠检测；克服了传统传感器中微生物膜寿命短、应用条件苛刻、重复性差等问题。
本发明的另一目的在于提供一种基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
根据本发明的一个方面，本发明提供的一种基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测设备，包括：多通道微流控芯片，多孔光纤探头，荧光检测仪，以及光源，其中，所述多通道微流控芯片包括：进样通道、与所述进样通道连通的储存通道、以及与所述储存通道通过多个连接通道连通的检测通道，所述储存通道内储存有细菌微胶囊，所述连接通道的尺寸小于所述细菌微胶囊的尺寸；所述多孔光纤探头的一端***到所述检测通道中，另一端与所述荧光检测仪连接；所述光源位于所述多通道微流控芯片的上方。
优选地，所述储存通道为直通道。其中，所述储存通道可以为一个或多个。进一步地，当为多个时，优选并排间隔设置，且检测通道设置在相邻两储存通道之间。例如，所述储存通道可以为两个，所述检测通道为一个，且两个储存通道分别位于检测通道的两侧。所述检测通道也可以为直通道。
优选地，所述连接通道为多个，间隔布置在所述储存通道与检测通道之间。更优选地，所述连接通道分别垂直于所述储存通道和检测通道。
优选地，所述细菌微胶囊中的细菌品类可以为皮状丝胞杆菌，假单胞菌，梭状芽孢杆菌等。优选地，所述细菌微胶囊的直径为30～200μm。优选地，所述细菌微胶囊是通过微流控芯片的流动聚焦方法制备得到。更优选地，所述细菌微胶囊中的细菌品类可以为枯草芽孢杆菌微胶囊。所述枯草芽孢杆菌微胶囊的制备，包括以下步骤：制备枯草芽孢杆菌悬液；将悬液与海藻酸钠、聚乙烯醇溶液混合，再加入Ca-EDTA，作为分散相；采用氟化油混合表面活性剂和乙酸作为连续相；将所述分散相和连续相以各自的预设流速在多通道微流控芯片中进行流动聚焦，得到枯草芽孢杆菌微胶囊。进一步地，所述分散相预设流速为10～200μL/min，例如可以为50μL/min；所述连续相预设流速为300～800μL/min，例如可以为400μL/min。
优选地，所述储存通道、检测通道均为长方体结构。
优选地，所述储存通道的宽度为2～200mm，例如可以为25mm；长度为2～200mm，例如可以为50mm；高度为1～1500微米，例如可以为800微米。
优选地，所述检测通道的宽度为2～200mm，例如可以为50mm；长度为2～200mm，例如可以为50mm，高度为1～1500微米，例如可以为800微米。
优选地，所述连接通道为长方体结构或管状结构。所述连接通道的尺寸小于所述细菌微胶囊的尺寸，以避免细菌微胶囊扩散至检测通道中。此处尺寸并非所有尺寸，例如可以以连接通道的高度来限定，使其高度低于所述储存通道和检测通道的高度，同时也需小于细菌微胶囊的尺寸即可。具体地例如，所述连接通道的高度可以为1～100微米，例如可以为20微米，其小于本申请细菌微胶囊直径。
优选地，***到所述检测通道中的所述多孔光纤探头上修饰有氧气敏感荧光指示剂，为[Ru(dpp)3]Cl2。所述荧光检测仪可以为手持式。所述光源可以为LED光源。
根据本发明的还一个方面，本发明提供的一种基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
安装上述的基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控设备；
将待测样品从多通道微流控芯片的进样通道注入到储存通道中，待测样品经过储存通道后进入到检测通道并与所述检测通道中的多孔光纤探头接触；然后通过所述荧光检测仪直接输出检测结果。优选地，采用注射器吸取待测样品并将其注入储存通道中。检测原理：打开各电源后，多孔光纤探头将检测到的荧光信号传送给荧光检测仪，荧光检测仪将其转化为电信号输出检测结果。
优选地，所述环境水样品的体积可以为50～500微升，例如100微升。
进一步地，所述检测方法中，安装基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测设备的步骤中，包括：制备多通道微流控芯片；制备细菌微胶囊；将所述细菌微胶囊注入到所述多通道微流控芯片的储存通道中，并将所述多通道微流控芯片进行低温保存，低温一般可以为1～10℃，例如可以为4℃；低温保存时间一般可以为6个月；制备多孔光纤探头；取出所述多通道微流控芯片并活化8～24h，将所述多孔光纤探头一端***到所述多通道微流控芯片的检测通道中，另一端与荧光检测仪连接；在所述多通道微流控芯片的上方布置光源，安装完成。优选地，所述细菌微胶囊通过微流控芯片的流动聚焦方法制备得到。
更进一步地，所述制备多孔光纤探头的步骤中，包括：将1～10mg[Ru(dpp)3]Cl2中加入10～100mL的混合溶液中，制备得到溶胶，其中，所述混合溶液包括：20～40％正硅酸乙酯，具体可为20％，20～40％Octyl-triEOS(正辛基三乙氧基硅烷)，30～50％乙醇，以及1～10％HCl；多孔光纤首先采用NaOH浸泡1～4h，清洗后在负压条件下抽取入所述溶胶，室温下静置2～8h，得到修饰后的所述多孔光纤探头。
与现有技术相比，本发明通过将细菌微胶囊储存在多通道微流控芯片的通道中形成了所述设备，将其应用于生化需氧量检测中，实现了水样生化需氧量(BOD5)的快速，灵敏，准确，可靠性检测。具体地：
(1)本发明采取的细菌微胶囊可以固定大量的细菌，例如固定大量的枯草芽孢杆菌，性能非常稳定；同时微胶囊结构可以避免细菌与水样中的污染物直接接触，克服了传统传感器中微生物膜寿命短、应用条件苛刻、重复性差等问题。
(2)本发明的取样和检测过程简便快捷，例如可使用注射器迅速完成水样取样和芯片检测进样，过程中最大程度地维持了水样中溶解氧的稳定。
(3)本发明的检测设备还具有简单便携，可实时检测，能够在多种复杂环境中使用，具有适用范围广的优点。
附图说明
图1是本发明基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测设备的结构示意图。图1中，1储存通道，2检测通道，3连接通道，4多孔光纤探头，5进样通道，6光源，7荧光检测仪，8注射器，9细菌微胶囊。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
图1示意性地示出了本发明基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测设备的一种结构。如图1所示，本发明提供的一种本发明基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测设备，包括：多通道微流控芯片，多孔光纤探头4，荧光检测仪7，以及光源6。其中，所述多通道微流控芯片包括：进样通道5、与所述进样通道5连通的储存通道1、以及与所述储存通道1通过多个连接通道3连通的检测通道2，所述储存通道1内包埋有细菌微胶囊9。所述多孔光纤探头4的一端***到所述检测通道2中，另一端与所述荧光检测仪7连接。所述光源6位于所述多通道微流控芯片的上方。其中，所述荧光检测仪8可以为市售的手持式荧光检测仪7。所述光源6可以为LED光源。
本申请中，所述储存通道1为直通道。所述储存通道1可以设置为一个或多个。当为多个时，并排间隔设置，相邻两个储存通道1之间设置检测通道2，储存通道1与检测通道2之间通过多个低高度的连接通道3连通。如图1所示，所述储存通道1可以设置两个，分别位于检测通道2的两侧，每侧的储存通道1通过连接通道3与检测通道2连通。所述连接通道3为多个，间隔布置在所述储存通道1与检测通道2之间，且多个连接通道3间隔距离相同，更优选地，连接通道3分别垂直于所述储存通道1和检测通道2布置，可以减小截面积，以使连接通道3和储存通道1接口处形成的张力阀的控制效果更好。所述连接通道3的尺寸小于所述细菌微胶囊9的尺寸；需要说明的是，此处“尺寸”并非连接通道3/细菌微胶囊9的所有尺寸，只要某一个尺寸小于细菌微胶囊9使细菌微胶囊9无法通过即可。例如以对连接通道3的高度进行限定，连接通道3的高度低于储存通道1和检测通道2，且小于细菌微胶囊9的尺寸，这样才能够有效防止细菌微胶囊9从储存通道1扩散至检测通道2中。所述储存通道1可以为长方体结构(但不限于此)，宽度可以为2～200mm，长度可以为2～200mm，高度可以为1～1500微米。所述检测通道2可以为长方体结构(但不限于此)，宽度可以为2～200mm，长度可以为2～200mm，高度可以为1～1500微米。所述连接通道3可以为长方体结构或管状结构，当为长方体结构时，高度可以为1～100微米，远小于本申请细菌微胶囊9的直径，当然所述连接通道3的宽度也可以限定为1～100微米，长度不做具体限定。当为管状结构时，其内径小于细菌微胶囊9的直径即可。所述进样通道5可以设置多个支路，以便与多个储存通道1连接，例如可以设置为U形、Y形等结构。
本发明提供的一种基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测方法，即上述基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测设备在环境水样生化需氧量检测中的应用，包括：安装所述的基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控设备；采用注射器吸取待测样品，并将所述待测样品从多通道微流控芯片的进样通道注入到储存通道中，待测样品经过储存通道后进入到检测通道，并与所述检测通道中的多孔光纤探头接触；打开电源，多孔光纤探头将检测到的荧光信号传送给荧光检测仪，所述荧光检测仪将其转化为电信号输出检测结果。
本发明中，所述细菌微胶囊中的细菌品类可以为皮状丝胞杆菌，假单胞菌，梭状芽孢杆菌等。更优选地，所述细菌微胶囊中的细菌品类为枯草芽孢杆菌微胶囊。下面以枯草芽孢杆菌微胶囊为例(其他菌种的制备方法和检测方法均与其基本相同，培养基组分和培养条件，活化时间等根据菌种不同稍作调整即可)，对本发明基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测方法的具体过程进行详细描述，包括：细菌微胶囊的制备、多通道微流控芯片的设计、多孔光纤探头4的设计、检测设备的安装、以及环境水样的检测。
实施例1枯草芽孢杆菌微胶囊的制备
所述枯草芽孢杆菌微胶囊以微流控芯片的流动聚焦方法制备。具体包括：先将枯燥芽孢杆菌在30℃，170r/min培养24h后于4℃、3000r/min离心15分钟收集菌体，用磷酸缓冲液洗涤2次，制成20mg/mL细菌悬液。然后将海藻酸钠(浓度可以为4～8％，具体为4％)，聚乙烯醇(浓度可以为8～15％，具体为10％)溶液以9∶1比例混合，得到的混合液与等体积的细菌悬液混合，再次得到的含细菌混合液，将该含细菌混合液再与100mM Ca-EDTA等体积混合作为分散相，其中，采用海藻酸钠和聚乙烯醇作为壁材，机械强度更高，更有利于细菌微球的稳定。接着采用氟化油FC-40混合PFPE-PEG表面活性剂(质量浓度0.5％)和乙酸作为连续相。最后将两种溶液中以流速分别为分散相50μL/min，连续相400μL/min，在微流控芯片中进行流动聚焦，得到枯草芽孢杆菌微凝胶胶囊油相悬液；收集胶囊油相悬液后静置，收集枯草芽孢杆菌水凝胶胶囊沉淀，使用磷酸盐缓冲液清洗两次并重悬于磷酸盐缓冲液中，得到枯草芽孢杆菌微凝胶胶囊磷酸盐悬液。其中，上述步骤得到的枯草芽孢杆菌微胶囊的直径为150～200μm。
实施例2枯草芽孢杆菌微胶囊的多通道微流控芯片的设计
首先，设计多通道微流控芯片的具体结构；其中，芯片底板采用玻璃材质制作，各通道采用聚二甲氧基硅氧烷、聚丙烯酸等制作。具体结构设计：将所述多通道微流控芯片设置为三个主要通道，包括：左侧的储存通道1、中间的检测通道2、以及右侧的储存通道1，其中，两个储存通道1长40mm，宽25mm；检测通道3长40mm，宽为50mm，检测通道2和储存通道1的具体尺寸保证能够容纳足够的液体和光导纤维探头即可；储存通道1和检测通道2的高度为800μm。储存通道1与检测通道2之间通过细的连接通道3连通，连接通道3的高度低于储存通道1和检测通道2，高度可以为50μm可有效防止细菌微胶囊9(直径为150～200μm)从左右两侧的储存通道1扩散至中间的检测通道2中。另外，该多通道微流控芯片还包括进样通道5，环境水样从进样通道5经储存通道1进入检测通道2进行检测。
然后，将实施例1制备得到的枯草芽孢杆菌微凝胶胶囊磷酸盐悬液注入到储存通道1中，4℃低温保存，得到含有枯草芽孢杆菌胶囊的多通道微流控芯片。
实施例3多孔光纤探头6的设计及检测设备的安装
首先，将市售多孔光纤使用0.1Mol NaOH清洗浸泡2小时后，在0.08MPa条件下吸入修饰溶胶，即室温静置2小时后，修饰完成，清水清洗后烘干备用。其中，修饰溶胶的制备方法为：将1mg[Ru(dpp)3]Cl2加入到7.5mL混合溶液(22.7％正硅酸乙酯，22.7％Octyl-triEOS，50％乙醇，8％HCl)中。
然后，取出所述多通道微流控芯片并活化16h，将修饰完成的多孔光纤探头4的一端***检测通道2中，未修饰的一端与荧光检测仪7连接，以读取储存数值。其中，所述检测通道的末端即多孔光纤探头***端，在***前是薄膜封闭状态。本发明中所述多孔光导纤维探头4可重复***上述枯草芽孢杆菌微胶囊芯片的中间检测通道2中进行检测。
最后，将检测所需的LED光源6垂直地布置在多通道微流控芯片的上方。
实施例4环境水样的检测
首先，使用注射器8吸取环境水样品100μL，注满储存通道1和检测通道2中。然后，打开LED光源6和荧光检测仪7开始记录数值。具体原理：水中溶解氧通过枯草芽孢杆菌微胶囊与多孔光纤探头4上的[Ru(dpp)3]Cl2反应，荧光淬灭，溶液中溶解氧信号通过多孔光纤探头4的涂层转化为荧光信号，再由多空光纤传入荧光检测仪7；随着溶解氧逐渐被微胶囊中的枯草芽孢杆菌消耗，荧光逐渐恢复，荧光强度提高，荧光数据通过多孔光纤探头4传递给荧光检测仪7，荧光检测仪7信号输出，记录溶解氧浓度变化，即可完成检测。
本发明上述实施例可以快速完成环境水样中生化需氧量的检测，取样快捷，在7分钟内可以得到结果，而现有传感器检测周期大多在15～30min。本发明检测结果稳定可靠，操作过程简便快捷，避免了过多人工操作的误差。且该检测设备简单便携可实施检测，能够广泛应用在多种复杂环境中。
本发明的描述是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显然的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。
Claims (9)
1.一种基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测设备，其特征在于，包括：多通道微流控芯片，多孔光纤探头，荧光检测仪，以及光源，其中，
所述多通道微流控芯片包括：进样通道、至少两个储存通道、以及一个检测通道；其中，所述进样通道设置有多个支路，一个支路与一个储存通道连通；所述检测通道与每个储存通道之间均通过多个连接通道连通；所述储存通道和所述检测通道的高度均高于连接通道以形成液体张力阀，所述储存通道内储存有细菌微胶囊；所述连接通道的尺寸小于所述细菌微胶囊的尺寸；所述细菌微胶囊是通过微流控芯片的流动聚焦方法制备得到；
所述多孔光纤探头的一端***到所述检测通道中，另一端与所述荧光检测仪连接；其中，***到检测通道中的所述多孔光纤探头上修饰有氧气敏感荧光指示剂[Ru(dpp)3]Cl2；
所述光源位于所述多通道微流控芯片的上方。
2.根据权利要求1所述的生化需氧量微流控检测设备，其特征在于，所述储存通道和所述检测通道均为直通道；所述储存通道并排间隔设置。
3.根据权利要求2所述的生化需氧量微流控检测设备，其特征在于，所述储存通道为两个，所述检测通道为一个，且两个储存通道分别位于检测通道的两侧；所述连接通道分别垂直于所述储存通道和检测通道。
4.根据权利要求1-3任一项所述的生化需氧量微流控检测设备，其特征在于，所述储存通道的宽度为2～200mm，长度为2～200mm，高度为1～1500μm；所述检测通道的宽度为2～200mm，长度为2～200mm，高度为1～1500μm；所述连接通道的高度为1～100μm。
5.根据权利要求1所述的生化需氧量微流控检测设备，其特征在于，所述细菌微胶囊中的细菌品类为皮状丝胞杆菌、假单胞菌和梭状芽孢杆菌中的一种。
6.根据权利要求1所述的生化需氧量微流控检测设备，其特征在于，所述细菌微胶囊的直径为30～200μm。
7.一种基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测方法，其特征在于，包括：
安装如权利要求1-6任一项所述的生化需氧量微流控设备；
将待测样品从多通道微流控芯片的进样通道注入，待测样品经储存通道进入检测通道并与所述检测通道中的多孔光纤探头接触，通过所述荧光检测仪输出检测结果。
8.根据权利要求7所述的生化需氧量微流控检测方法，其特征在于，安装所述的生化需氧量微流控设备的步骤，包括：
制备多通道微流控芯片；
制备细菌微胶囊；
将所述细菌微胶囊注入到所述多通道微流控芯片的储存通道中，并将所述多通道微流控芯片进行低温保存，低温为1～10℃；
制备多孔光纤探头；
取出所述多通道微流控芯片并活化8～24h，将所述多孔光纤探头一端***到所述多通道微流控芯片的检测通道中，另一端与荧光检测仪连接；
在所述多通道微流控芯片的上方布置光源。
9.根据权利要求8所述的一种基于细菌微胶囊的生化需氧量微流控检测方法，其特征在于，采用微流控芯片的流动聚焦方法制备得到细菌微胶囊。
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