CN112213402A - (3r,4r)-1-苄基-n,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐及其异构体的检测方法 - Google Patents

(3r,4r)-1-苄基-n,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐及其异构体的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种(3R,4R)‑1‑苄基‑N,4‑二甲基哌啶‑3‑胺二盐酸盐及其对映异构体的检测方法，使用手性衍生化试剂异硫氰酸酯或异氰酸酯对1‑苄基‑N,4‑二甲基哌啶‑3‑胺二盐酸盐进行柱前衍生化，采用高效液相色谱法进行检测。本发明实现了(3R,4R)‑1‑苄基‑N,4‑二甲基哌啶‑3‑胺二盐酸盐和(3S,4S)‑1‑苄基‑N,4‑二甲基哌啶‑3‑胺二盐酸盐的分离，检测成本低且具有良好的灵敏度、专属性和准确度，是枸橼酸托法替布起始原料质量控制的行之有效的检测方法，从而进一步地最终保证枸橼酸托法替布产品质量和患者用药安全。

Description

(3R,4R)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐及其异构体 的检测方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种枸橼酸托法替布起始原料(3R,4R)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐(命名为SM-B)及其对映异构体的检测方法。
背景技术
枸橼酸托法替布由美国辉瑞公司研发，用于治疗成人活动期及对甲氨蝶呤(MTX)反应不佳的中至重度类风湿关节炎(RA)患者。
枸橼酸托法替布的中文化学名为(3R,4R)-4-甲基-3-(甲基-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-氨基)-β-氧-1-哌啶丙腈，2-羟基-1,2,3-丙烷三羧酸(1:1)，分子式为C16H20N6O·C6H8O7，结构式为：
Figure BDA0002125679940000011
枸橼酸托法替布分子中有两个手性中心，有RR、RS、SR、SS四种光学异构体，其中RR构型是有效的JAK-1和-3络氨酸激酶抑制剂，而其他构型并无生物等效性，因此，在药物合成过程中需要对光学异构体进行严格的质量控制。
1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐(又名N,4-二甲基-1-(苯基甲基)-3-哌啶胺盐酸盐)具有两个手性中心，有RR、RS、SR、SS四种光学异构体，其中只有(3R,4R)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐(又名(3R,4R)-N,4-二甲基-1-(苯基甲基)-3-哌啶胺盐酸盐，CAS号1062580-52-2)才是有效合成RR构型枸橼酸托法替布合成的起始原料。由于现有技术下，商业购买的(3R,4R)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐(SM-B)中通常含有RS、SR、SS等一种或多种光学异构体杂质，按照源头控制的原则，需要对SM-B的光学异构体进行严格的质量控制，以保证枸橼酸托法替布的质量。现有技术下，在常规的反相色谱条件下可以实现1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐RS及SR两种非对映异构体与RR构型的分离，但是SS构型和RR构型为一对对映异构体，它们具有相同的物理性质、热力学性质和化学性质，只有在手性环境中才显示出差异，常规的反相色谱条件下难以实现SS构型和RR构型的1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐的分离。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用高效液相色谱分离测定枸橼酸托法替布起始原料(3R,4R)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐(SM-B)及其对映异构体的方法，从起始原料控制枸橼酸托法替布中手性异构体含量从而保证药物安全性和质量可靠性。
本发明所述(3R,4R)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐(SM-B)及其对映异构体结构式如下：
Figure BDA0002125679940000021
本发明具体技术方案如下：
(3R,4R)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐(SM-B)及其对映异构体的检测方法，使用手性衍生化试剂异硫氰酸酯或异氰酸酯对1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐(所述1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐为可能含有SS构型光学异构体的SM-B，或者含有RR构型光学异构体的(3S,4S)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐)进行柱前衍生化，采用高效液相色谱法进行检测，使(3R,4R)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐和(3S,4S)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐获得分离。
优选的，所述手性衍生化试剂选自2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯或(S)-(-)-1-苯乙基异氰酸酯。
所用的柱前衍生化方法为按待测物与衍生化试剂摩尔量为1:3进行反应，以三乙胺为缚酸剂，室温反应30min。
优选的，采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱进行分离分析。
本发明所述的检测方法，高效液相色谱法可采用等度或者梯度洗脱，流动相A为缓冲盐溶液，溶液pH 2～4，优选溶液pH 2.3～3.5；流动相B为有机溶剂，选自甲醇或甲醇和乙腈的混合溶液中的一种或几种。优选的，所述缓冲盐溶液选自乙酸铵缓冲液或磷酸盐缓冲液。
优选的，所述高效液相色谱法采用等度洗脱，流动相A与流动相B的体积为7:3～2:8，即有机相占整个流动相的比例为30％～80％。
本发明所述的检测方法，高效液相色谱法流动相的流速为0.8～1.2ml/min，色谱柱柱温是20～40℃，检测器为紫外检测器，检测波长为200～400nm。
本发明使用柱前衍生化-高效液相色谱法对枸橼酸托法替布起始原料SM-B分析检测，实现了(3R,4R)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐和(3S,4S)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐的分离，检测成本低且具有良好的灵敏度、专属性和准确度，是枸橼酸托法替布起始原料SM-B对映异构体质量控制的行之有效的检测方法，从而进一步地最终保证枸橼酸托法替布产品质量和患者用药安全。
附图说明
图1常规高效液相色谱手性柱对SM-B及其对映异构体的分离(以正己烷-异丙醇-三乙胺(95:5:0.1)为流动相)。
图2常规高效液相色谱手性柱对SM-B及其对映异构体的分离(以磷酸二氢钾溶液-乙腈(80:20)为流动相)。
图3以(S)-(+)-α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯乙酰氯作为衍生化试剂的HPLC图谱。图4以(S)-(-)-1-苯乙基异氰酸酯作为衍生化试剂的HPLC图谱。
图5以GITC作为衍生化试剂的HPLC图谱。
图6不同pH条件下流动相A对***适用性溶液的HPLC图谱。
图7以乙腈为流动相B对***适用性溶液及SM-B对映异构体溶液的HPLC图谱。
图8以甲醇为流动相B对***适用性溶液及SM-B对映异构体溶液的HPLC图谱。
图9本发明实施例4对***适用性溶液的HPLC图谱。
图10本发明实施例5中各溶液HPLC对比图谱。
具体实施方式
下面将结合具体实施例、对比例和试验例对本发明进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
实施例1常规高效液相色谱手性柱对SM-B及其对映异构体的分离
试验例1
实验仪器：Aglent 1260高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为CHIRALPAK AD-H(4.6*250mm，5μm)；柱温为35℃；采用紫外检测器，检测波长为257nm；流动相流速为0.8ml/min；以正己烷-异丙醇-三乙胺(95:5:0.1)为流动相。
实验步骤：
溶剂：正己烷-异丙醇(50:50)
SB-B对映异构体储备液：取2.5mg，用溶剂稀释至50ml。
***适用性溶液：取SM-B10mg，置10ml量瓶中，加异构体储备液200μl，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
取***适用性溶液及SM-B对映异构体储备液各10μl并注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。结果如图1所示，结果显示在此色谱条件下，SM-B在5.2min出峰，SM-B对映异构体在5.1min出峰，两者无法有效分离，且此色谱条件下，基线波动大，峰响应较弱，检测灵敏度低。
试验例2：
实验仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为CHIRALPAK AD-RH(4.6*250mm，5μm)；柱温为30℃；采用紫外检测器，检测波长为210nm；流动相流速为1.0ml/min；以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(pH8.0)-乙腈(80:20)为流动相，等度采集30min。
实验步骤：
SB-B对映异构体储备液：取2.5mg，用流动相稀释至50ml。
***适用性溶液：取SM-B10mg，置10ml量瓶中，加异构体储备液200μl，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
取***适用性溶液及SM-B对映异构体储备液各10μl并注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。结果如图2所示，结果显示，在此色谱条件下，SM-B及其对映异构体均拖尾严重，拖尾因子7.4，无法有效分离。
实施例2不同手性衍生化试剂的考察
试验例1：以(S)-(+)-α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯乙酰氯作为衍生化试剂
实验仪器：Aglent 1260高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为Welch Ultimate XB-C18(4.6*250mm，5μm)；柱温为40℃；采用紫外检测器，检测波长为210nm；流动相流速为1.0ml/min；以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH3.0)-甲醇(50:50)为流动相，等度采集60min。
实验步骤：
0.1％三乙胺溶液：取三乙胺100μl，用乙腈稀释至100ml，摇匀即得。
衍生化试剂稀释液：取(S)-(+)-α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯乙酰氯10mg，用乙腈稀释至10ml，摇匀即得。
SM-B对映异构体储备液：取2.5mg，用0.1％三乙胺溶液稀释至25ml。
***适用性溶液：取SM-B2.5mg，置5ml量瓶中，加异构体储备液250μl，加0.1％三乙胺溶液2ml，加衍生化试剂稀释液1ml，混匀，室温放置30min，加水稀释至刻度，摇匀即得。
取***适用性溶液10μl并注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。图3为以(S)-(+)-α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯乙酰氯作为衍生化试剂对***适用性溶液检测得到的HPLC图谱。结果显示，在改的色谱条件下，SM-B在10.2min出峰，SM-B对映异构体在11min出峰，两者未完全分离，同时有其他杂峰干扰对映异构体的检测。
试验例2：以(S)-(-)-1-苯乙基异氰酸酯作为衍生化试剂
实验仪器：Aglent 1260高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为Welch Ultimate XB-C18(4.6*250mm，5μm)；柱温为40℃；采用紫外检测器，检测波长为210nm；流动相流速为1.0ml/min；以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH2.3)-甲醇(50:50)为流动相，等度采集60min。
实验步骤：
0.1％三乙胺溶液：取三乙胺100μl，用乙腈稀释至100ml，摇匀即得。
衍生化试剂稀释液：取(S)-(-)-1-苯乙基异氰酸酯50μl，用乙腈稀释至10ml，摇匀即得。
SB-B对映异构体储备液：取2.5mg，用0.1％三乙胺溶液稀释至25ml。
***适用性溶液：取SM-B2.5mg，置5ml量瓶中，加异构体储备液250μl，加0.1％三乙胺溶液2ml，加衍生化试剂稀释液1ml，混匀，室温放置30min，加水稀释至刻度，摇匀即得。
取***适用性溶液10μl并注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。图4为以(S)-(-)-1-苯乙基异氰酸酯作为衍生化试剂的对***适用性溶液检测得到的HPLC图谱。结果显示，在本发明的色谱条件下SM-B在19min出峰，SM-B对映异构体在22min出峰，两者能有效分离，同时其余杂峰不干扰对映异构体的检测。
试验例3以2,3,4,6-四乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基异硫氰酸酯(GITC)作为衍生化试剂
实验仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为YMC-Triart C18(4.6*250mm，5μm)；柱温为30℃；采用紫外检测器，检测波长为250nm；流动相流速为1.0ml/min；以0.02mol/L乙酸铵缓冲液(pH3.5)-甲醇(50:50)为流动相，等度采集30min。
实验步骤：
0.1％三乙胺溶液：取三乙胺100μl，用50％乙腈溶液稀释至100ml，摇匀即得。
2,3,4,6-四乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基异硫氰酸酯(GITC)溶液：取GITC50mg，用50％乙腈溶液溶解并稀释至5ml，摇匀即得。
SB-B对映异构体储备液：取2.5mg，用50％乙腈溶液稀释至25ml。
***适用性溶液：取SM-B2.5mg，置5ml量瓶中，加异构体储备液250μl，加0.1％三乙胺溶液0.5ml，加GITC溶液1ml，混匀，室温放置30min，加50％乙腈溶液稀释至刻度，摇匀即得。
取***适用性溶液10μl并注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。图5为以GITC作为衍生化试剂对***适用性溶液检测得到的HPLC图谱。结果显示，在改色谱条件下，SM-B在17min出峰，SM-B对映异构体在15.2min出峰，两者能有效分离，同时其余杂峰不干扰对映异构体的检测。
实施例3本发明所述检测方法流动相的筛选
试验例1：流动相A pH值的筛选
实验目的：选用0.01mol/L磷酸二氢钾水溶液为水相，调节不同的pH值，考察流动相pH值对SM-B对映异构体检测的影响，选取合适的条件用于SM-B对映异构体检测。
实验仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为Welch Ultimate XB-C18(4.6*250mm，5μm)；柱温为40℃；采用紫外检测器，检测波长为210nm；流动相流速为1.0ml/min；以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，调节三种不同的pH值(分别为pH2.3、pH3.0、pH6.0)，流动相A-甲醇(50:50)等度采集60min。
实验步骤：
0.1％三乙胺溶液：取三乙胺100μl，用乙腈稀释至100ml，摇匀即得。
衍生化试剂稀释液：取(S)-(-)-1-苯乙基异氰酸酯50μl，用乙腈稀释至10ml，摇匀即得。
SM-B对映异构体储备液：取2.5mg，用0.1％三乙胺溶液稀释至25ml。
***适用性溶液：取SM-B2.5mg，置5ml量瓶中，加异构体储备液250μl，加0.1％三乙胺溶液2ml，加衍生化试剂稀释液1ml，混匀，室温放置30min，加水稀释至刻度，摇匀即得。
取***适用性溶液10μl并注入液相色谱仪，分别在不同的流动相条件下检测，记录色谱图。图6为采用不同pH值的流动相A对***适用性溶液检测得到的HPLC对比图谱。结果显示，当流动相A的pH值为6.0时，未观察到SM-B及其对映异构体峰，应为在采集时间内未洗脱出；当流动相A的pH值为2.3时，SM-B在19min出峰，SM-B对映异构体在22min出峰，两者能有效分离，当流动相A的pH值为3.0时，SM-B在19.5min出峰，SM-B对映异构体在23min出峰，两者能有效分离，同时其余杂峰不干扰对映异构体的检测。
试验例2：流动相B的筛选
实验目的：考察甲醇和乙腈两种有机溶剂对SM-B对映异构体检测的影响，选取合适的条件用于SM-B对映异构体检测。
实验仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为Welch Ultimate XB-C18(4.6*250mm，5μm)；柱温为40℃；采用紫外检测器，检测波长为210nm；流动相流速为1.0ml/min；以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH2.3)为流动相A，以甲醇或乙腈为流动相B，流动相A-B(50:50)等度采集60min。
实验步骤：
0.1％三乙胺溶液：取三乙胺100μl，用乙腈稀释至100ml，摇匀即得。
衍生化试剂稀释液：取(S)-(-)-1-苯乙基异氰酸酯50μl，用乙腈稀释至10ml，摇匀即得。
SM-B对映异构体储备液：取2.5mg，用0.1％三乙胺溶液稀释至25ml。
***适用性溶液：取SM-B2.5mg，置5ml量瓶中，加异构体储备液250μl，加0.1％三乙胺溶液2ml，加衍生化试剂稀释液1ml，混匀，室温放置30min，加水稀释至刻度，摇匀即得。
SM-B对映异构体溶液：取SM-B对映异构体储备液2ml，加衍生化试剂稀释液1ml，混匀，室温放置30min，加水稀释至刻度，摇匀即得。
取***适用性溶液及SM-B对映异构体溶液各10μl并注入液相色谱仪，分别在不同的流动相条件下检测，记录色谱图。图7为采用乙腈为流动相B对***适用性溶液及SM-B对映异构体溶液检测得到的HPLC图谱；图8为采用甲醇为流动相B对***适用性溶液及SM-B对映异构体溶液检测得到的HPLC图谱。结果显示，当使用乙腈为流动相B时，SM-B及其对映异构体出峰时间约为6min，两者未达到基线分离，且出峰前后有较多杂峰，干扰异构体检测；如图3所示，当使用甲醇为流动相B时，SM-B在19min出峰，SM-B对映异构体在22min出峰，两者能有效分离，同时其余杂峰不干扰对映异构体的检测。
实施例4本发明所述检测方法对SM-B及其对映异构体的分离
实验仪器：Aglent 1260高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为Welch Ultimate XB-C18(4.6*250mm，5μm)；柱温为40℃；采用紫外检测器，检测波长为210nm；流动相流速为1.0ml/min；以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH3.0)-甲醇(50:50)为流动相，等度采集60min。
实验步骤：
0.1％三乙胺溶液：取三乙胺100μl，用乙腈稀释至100ml，摇匀即得。
衍生化试剂稀释液：取(S)-(-)-1-苯乙基异氰酸酯50μl，用乙腈稀释至10ml，摇匀即得。
SB-B对映异构体储备液：取2.5mg，用0.1％三乙胺溶液稀释至25ml。
***适用性溶液：取SM-B2.5mg，置5ml量瓶中，加异构体储备液250μl，加0.1％三乙胺溶液2ml，加衍生化试剂稀释液1ml，混匀，室温放置30min，加水稀释至刻度，摇匀即得。
取***适用性溶液10μl并注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。图9为采用本发明的检测方法对***适用性溶液检测得到的HPLC图谱。结果显示，在本发明的色谱条件下，SM-B在19.5min出峰，SM-B对映异构体在23min出峰，两者能有效分离，同时其余杂峰不干扰对映异构体的检测。
实施例5本发明所述检测方法对SM-B及其对映异构体的分离
实验仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪。
色谱条件：色谱柱为Welch Ultimate XB-C18(4.6*250mm，5μm)；柱温为40℃；采用紫外检测器，检测波长为210nm；流动相流速为1.0ml/min；以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH2.3)-甲醇(50:50)为流动相，等度采集60min。
实验步骤：
0.1％三乙胺溶液：取三乙胺100μl，用乙腈稀释至100ml，摇匀即得。
衍生化试剂稀释液：取(S)-(-)-1-苯乙基异氰酸酯50μl，用乙腈稀释至10ml，摇匀即得。
SM-B对映异构体储备液：取2.5mg，用0.1％三乙胺溶液稀释至25ml。
SM-B对映异构体对照品溶液：取SM-B对映异构体储备液250μl，置5ml量瓶中，加0.1％三乙胺溶液2ml，加衍生化试剂稀释液1ml，混匀，室温放置30min，加水稀释至刻度，摇匀即得。
SM-B供试品溶液：取SM-B2.5mg，置5ml量瓶中，加0.1％三乙胺溶液2ml，加衍生化试剂稀释液1ml，混匀，室温放置30min，加水稀释至刻度，摇匀即得。
回收率溶液：取SM-B2.5mg，置5ml量瓶中，平行称取3份，分别加异构体储备液250μl、500μl、1000μl，加0.1％三乙胺溶液2ml，加衍生化试剂稀释液1ml，混匀，室温放置30min，加水稀释至刻度，摇匀即得。
空白溶液：取0.1％三乙胺溶液2ml，置5ml量瓶中，加衍生化试剂稀释液1ml，混匀，室温放置30min，加水稀释至刻度，摇匀即得。
取空白溶液、SM-B对映异构体对照品溶液、SM-B供试品溶液、回收率溶液各10μl并注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。图10为本发明的检测方法检测得到上述溶液的HPLC对比图谱。结果显示，在本发明的色谱条件下，空白溶液不干扰SM-B及其对映异构体的检测，SM-B及其对映异构体能有效分离，SM-B对映异构体回收率良好，3份回收率溶液的回收率分别为96.8％、93.7％、99.4％，检测灵敏度高，限度浓度(1％)的SM-B对映异构体的信噪比高达100，远高于定量限。

Claims (7)

1.(3R,4R)-1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐及其对映异构体的检测方法，其特征在于使用手性衍生化试剂异硫氰酸酯或异氰酸酯对1-苄基-N,4-二甲基哌啶-3-胺二盐酸盐进行柱前衍生化，采用高效液相色谱法进行检测。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述手性衍生化试剂选自2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯或(S)-(-)-1-苯乙基异氰酸酯。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述高效液相色谱法采用等度或梯度洗脱，流动相A为缓冲盐溶液，溶液pH 2~4；流动相B为有机溶剂，选自甲醇或甲醇和乙腈的混合溶液。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述缓冲盐溶液选自乙酸铵缓冲液或磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述高效液相色谱法采用等度洗脱，流动相A与流动相B的体积为7:3～2:8。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于流动相的流速为0.8~1.2ml/min，色谱柱柱温是20~40℃，检测器为紫外检测器，检测波长为200~400nm。
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