CN112203681A - 疫苗组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于产生对PD1的体液应答的疫苗组合物，以及其用于治疗特征在于PD1参与的癌症中的用途，其中所述疫苗组合物包含有效量的免疫原，以诱导抗体应答，在所述抗体应答中抗体与PD1的B细胞表位结合。

Description

疫苗组合物及其用途

本公开基于澳大利亚临时专利申请号：2018900368、澳大利亚临时专利申请号：2018903518和澳大利亚临时专利申请号：2018903968，其每个的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及用于引起对程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的体液应答的疫苗组合物、制备这种组合物的方法、及其用于治疗特征在于PD1参与的疾病例如癌症中的用途。

背景技术

免疫检查点是指根植到(hardwire into)免疫***的过剩抑制通路，这些通路对于维持自我耐受以及调节周围组织中生理免疫应答的持续时间和幅度至关重要，以最大程度地减少附带的组织损伤。许多肿瘤指定某些免疫检查点通路作为免疫耐受性的机制，尤其是针对对肿瘤抗原特异性的T细胞的免疫耐受性。

T细胞受体共刺激通路在调节T细胞活化和耐受中具有重要作用。B7-CD28超家族包含共刺激和抑制受体，包括CD28和程序性细胞死亡蛋白1(PD1)。通常，T细胞上的PD1及其配体PD-L1(B7-H1)之间的相互作用控制正常免疫应答过程中周围T细胞耐受的诱导和维持。已经描述了PD1和PD-L1之间的相互作用负调节T细胞的增殖和细胞因子的产生。PD1通路的主要作用不是在初始的T细胞活化阶段，而是通过下调T细胞的活性来调节组织中的效应T细胞应答，以限制附带的组织损伤。然而，在几物种型的癌症中，例如在白血病和多发性骨髓瘤中，由于这些T细胞表面上PD1水平的升高，PD-L1在癌细胞上的表面表达抑制了细胞毒性淋巴细胞。在这方面，在侵袭性B细胞淋巴瘤亚组中，在恶性细胞和浸润的免疫细胞上均表达PD-L1。类似地，已经描述了骨髓瘤细胞上PD-L1表达的上调诱导T细胞凋亡和肿瘤特异性T细胞的无反应性，以及增强侵袭性骨髓瘤细胞的特性。

因为许多免疫检查点是由配体-受体相互作用引发的，所以它们很容易被抗体阻断或被重组形式的配体或受体调节。细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)抗体是获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准的此类免疫疗法药物中的首个(Nature ReviewsCancer，12，252-264，2012)。最近还开发和发布了靶向PD1及其天然配体PD-L1的治疗性抗体(例如

(Bristol MyersSquibb)和

(Merck))。

尽管潜在地具有高治疗功效，但是单克隆抗体的被动施用具有一些缺点，包括需要频繁施用、需要延长持续时间、成本密集性以及仅靶向单个表位。使用单克隆抗体治疗癌症也有其风险和局限性，其中重复施用抗体可能会在某些患者中产生不良影响，这样的示例包括输注反应、炎症、自身免疫和抗体耐受性。因此，迫切需要一种改进的治疗癌症的方法，所述癌症与检查点抗原PD1的参与相关，或者以其为特征。

发明内容

在本公开的一个方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述癌症的特征在于程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的参与，所述方法包括向受试者施用引起对PD1的体液应答的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含有效量的免疫原以诱导抗体应答，其中所述抗体与PD1的B细胞表位结合。

在一个实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用有效量的第二免疫原，以诱导针对癌症相关抗原的免疫应答。在又一个实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用与癌症相关抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

在本公开的另一方面，提供了疫苗组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症的特征在于PD1的参与，其中所述疫苗组合物包含有效量的免疫原，用于诱导抗体应答，其中，如本文所述，所述抗体与PD1的B细胞表位结合。在一个实施方案中，将药物配制成与第二免疫原一起施用，其中如本文所述，所述第二免疫原以有效量存在，以在受试者中诱导针对癌症相关抗原的免疫应答。

在本公开的另一方面，提供了用于治疗癌症的疫苗组合物，所述癌症的特征在于PD1的参与，其中所述疫苗组合物包含有效量的免疫原，用于诱导抗体应答，其中，如本文所述，所述抗体与PD1的B细胞表位结合。在一个实施方案中，所述组合物还包含有效量的第二免疫原，用于诱导针对癌症相关抗原的免疫应答，如本文所述。

在本公开的另一方面，提供了一种用于引起对PD1的体液应答的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含有效量的免疫原，用于诱导抗体应答，其中，如本文所述，所述抗体与PD1的B细胞表位结合。在一个实施方案中，所述组合物还包含有效量的第二免疫原，用于诱导针对癌症相关抗原的免疫应答，如本文所述。

在本公开的一个方面，提供了用于引起对PD1的体液应答的疫苗组合物，其中所述组合物包含免疫原，所述免疫原包含诱导抗体应答的肽序列，其中所述抗体与PD1的B细胞表位结合，其中所述肽序列包含选自以下的氨基酸序列中的至少8个连续的氨基酸残基：SEQ IDNOs：9、10、14、24、28、29、42、43、49、和与前述任一氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中免疫原的氨基酸序列与PD1的至少50个氨基酸残基的连续延伸序列(stretch)不同。

在本公开的另一方面，提供了一种治疗特征在于PD1参与的病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用本文所述的疫苗组合物。

在本公开的另一方面，提供了本文所述的疫苗组合物在制备用于治疗特征在于PD1参与的病症的药物中的用途。

在本公开的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的疫苗组合物和药学上可接受的赋形剂。

在本公开的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的疫苗组合物，用于治疗特征在于PD1参与的病症。

附图说明

图1是NuPage LDS-Page凝胶的示意图，其显示了纯化的PD1的GST-B细胞表位。使用简单的蓝色安全染色(Simply Blue Safe Stain，Thermo Scientific)对凝胶进行染色。

图2显示了已鉴定的小鼠PD1的B细胞表位(SEQ ID NO：119)抑制抗小鼠PD1单克隆抗体(mAb)与重组小鼠PD1结合的能力(ELISA OD值，450nm)。

图3显示了B细胞表位(SEQ ID NO：119)抑制抗小鼠PD-1mAb与表达小鼠PD-1的Jurkat T细胞结合的能力。

图4显示了用mPD1 B细胞表位(SEQ ID NO：119)-CRM缀合物免疫的小鼠血清中抗mPD1 IgG抗体的抗体滴度，如在第0天第一次免疫后，41天(BA1)、62天(BA2)、83天(BA3)和104天(BA4)的抗体滴度增加所说明的那样，结果显示明确的对mPD1 B细胞表位-CRM缀合物的抗体应答(图4)。

图5显示了在细胞测定法中JT-mPD1的抑制活性。在结合测定法中使用表达mPD1的Jurkat T细胞检查抗mPD1 mAb单独或与不同浓度的JT-mPD1预孵育后的结合。用星号表示显著差异。

图6显示了抗JT-mPD1-IgG与在Jurkat T细胞上表达的重组mPD1的结合。A)在结合测定法中使用表达重组mPD1的Jurkat T细胞，使用不同浓度的抗JT-mPD1 IgG或抗mPD1mAb。B)竞争性ELISA，其显示在与不同浓度的(i)从用JT-mPD1-KLH免疫的兔中分离的抗JT-mPD1 IgG、或(ii)从PBS对照兔中分离的总IgG(500μg/ml)进行预孵育之前或之后，抗mPD1mAb(0.2μg/ml)与包被在ELISA板上的mPD1的结合。C)竞争性ELISA，其显示在与不同浓度的抗JT-mPD1 IgG、或从PBS对照兔中分离的总IgG(500μg/ml)进行预孵育之前或之后，重组mPDL1-Fc与包被在ELISA板上的mPD1的结合。结果代表重复实验。用星号表示显著差异。

图7显示了在同基因小鼠肿瘤模型中抗JT-mPD1 IgG的抗肿瘤活性。BLAB/c小鼠移植了表达Her-2的乳腺癌D2F2/E2细胞。条表示在处死时的每组小鼠中外植肿瘤的平均重量。代表性外植肿瘤所对应的肉眼可见图像显示在每个条的下方。用星号表示显著差异。

图8显示多克隆抗PD1抗体(Sino Biological Inc.；目录号10377-RP03)与人PD1的每个12-mer线性肽片段的结合。片段的氨基酸序列(肽序列)沿x轴显示，并且(从x轴的左到右)代表表1的SEQ ID NO：2-54和62。数据显示了酶联免疫吸附测定法(ELISA)在450nm处的光密度(OD)读取(y轴)。

图9显示了亲和纯化的抗肽序列抗体(来自免疫的兔抗血清，以1：25,000稀释)与天然人PD1的结合。免疫兔的线性肽片段沿x轴显示。数据显示在450nm处的光密度(OD)读取(y轴)。

具体实施方式

详细说明

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。任何与本文所述相似或等同的材料和方法均可用于实施本发明。对于本领域的定义和术语以及本领域技术人员已知的其他方法，技术人员可以参考Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，ColdSpring Harbor Press，Plainsview，N.Y.，和Ausubel等人(1999)Current Protocols inMolecular Biology(Supplement 47)，John Wiley&Sons，New York，Murphy等人(1995)Virus Taxonomy Springer Verlag：79-87。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”或诸如“含有”或“包含”的变体将理解为暗示包括所述的要素或整数或要素或整数的组，但不排除任何其他要素或整数或要素或整数的组。

“由...组成”意指包括并且限于该短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由...组成”是指列出的要素是必需的或强制的，并且可不存在其他要素。“基本上由...组成”意指该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或不影响本公开所限定的所列要素的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由...组成”是指列出的要素是必需的或强制的，但其他要素是可选的，可以根据其是否影响所列出要素的活性或作用而存在或不存在。

如本文所使用的单数形式一(a)、一种(an)和该(the)包括复数方面，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“肽”，包括单个肽、以及两个或更多个肽；提及“表位”，包括一个表位，以及两个或更多个表位；等等。

核苷酸序列和氨基酸序列由序列标识符编号(SEQ ID NO：)表示，如下表1和2所示。SEQ ID NO：在数字上对应于序列标识符<400>1、<400>2，等等。本文提供了序列标识符的概述。

表1：

表2：

本公开至少部分地基于发明人的令人惊讶地发现，即用检查点抗原PD1的B细胞表位的肽序列进行免疫能够引起抗体应答，其中抗体与天然PD1蛋白结合。本发明人还惊奇地发现，用PD1来源的B细胞表位进行免疫，似乎没有引起任何不良副作用，例如体重减轻或炎性反应。

因此，在本公开的一个方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述癌症的特征在于程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的参与，所述方法包括向受试者施用引起对PD1的体液应答的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含有效量的免疫原以诱导抗体应答，其中所述抗体与PD1的B细胞表位结合。

本公开还至少部分地基于发明人的意想不到的发现，即当施用于受试者时，PD1的至少8个连续氨基酸残基的短肽序列可以诱导抗体应答，其中抗体与PD1的B细胞表位结合。

因此，还提供了用于引起对PD1的体液应答的疫苗组合物，其中所述组合物包含免疫原，所述免疫原包含诱导抗体应答的肽序列，其中所述抗体与PD1的B细胞表位结合，其中所述肽序列包含选自以下的氨基酸序列中的至少8个连续的氨基酸残基：SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43、49、和与前述任一氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中免疫原的氨基酸序列与PD1的至少50个氨基酸残基的连续延伸序列(stretch)不同。

免疫原

术语“免疫原”在本文中用于描述能够在体内引起免疫应答，包括体液(抗体)应答的肽。术语“肽”和“多肽”在本文中在其最广义上可互换使用，是指两个或更多个氨基酸残基的分子，或氨基酸类似物。氨基酸残基可通过肽键连接，或可替代地通过其他键连接，例如，酯、醚等，但在大多数情况下将通过肽键连接。本文使用的术语“氨基酸”或“氨基酸残基”包括天然和非天然或合成氨基酸，包括D-或L-形式，以及氨基酸类似物。“氨基酸类似物”应理解为非天然存在的氨基酸，其在一个或多个原子上不同于其相应的天然存在的氨基酸。例如，半胱氨酸的氨基酸类似物可以是高半胱氨酸。

“至少8个连续的氨基酸残基”是指选自以下的氨基酸序列的8、9、10、11或更多个连续的氨基酸残基：SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43、49和与前述任何氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，免疫原包含选自以下的氨基酸序列的至少9个，优选至少10个，更优选至少11个连续的氨基酸残基：SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43、49和与前述任何氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，肽序列包含选自SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43和49的氨基酸序列的至少8个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，肽序列包含选自SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43和49的氨基酸序列的至少9个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，肽序列包含选自SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43和49的氨基酸序列的至少10个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，肽序列包含选自SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43和49的氨基酸序列的至少11个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，肽序列选自SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43、49和58-63。在一个实施方案中，免疫原由以下氨基酸序列组成、或基本上由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自：SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43、49和58-63。

在一个实施方案中，肽序列在选自以下的氨基酸序列的N-末端和/或C-末端，进一步包含一个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等)其他氨基酸残基：SEQID NO：9、10、14、24、28、29、42、43、49和与任何前述氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸残基序列。在一个实施方案中，肽序列在选自以下的氨基酸序列的N-末端和/或C-末端，进一步包含一个或多个氨基酸残基：SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43和49。“一个或多个其他氨基酸残基”是指至少1个、优选至少2个、优选至少3个、优选至少4个、优选至少5个、优选至少6个、优选至少7个、优选至少8个、优选至少9个、优选至少10个、优选至少11个、优选至少12个、优选至少13个或优选至少14个其他氨基酸残基。在一个实施方案中，肽序列包含SEQ ID NO：1的至少13个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，肽序列包含SEQID NO：1的至少14个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，肽序列包含SEQ ID NO：1的至少15个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，肽序列包含SEQ ID NO：1的至少16个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，肽序列包含SEQ ID NO：1的至少17个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，肽序列包含SEQ ID NO：1的至少18个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，肽序列包含选自SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43和49的氨基酸序列，并且进一步包含从SEQ ID NO：1的肽序列的C-末端延伸的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，肽序列将包含选自SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43和49的氨基酸序列，并且进一步包含从SEQ ID NO：1的肽序列的N-末端延伸的一个或多个氨基酸残基。在又一个实施方案中，肽序列将包含选自SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43和49的氨基酸序列，并且进一步包含从SEQ ID NO：1的肽序列的C-末端延伸的一个或多个氨基酸残基和从SEQ IDNO：1的肽序列的N-末端延伸的一个或多个氨基酸残基。

在一个实施方案中，肽序列包含选自以下的氨基酸序列、由选自以下的氨基酸序列组成或基本上由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：58至63和与前述序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，肽序列包含选自SEQ ID NO：58至63的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在一个实施方案中，肽序列包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在一个实施方案中，肽序列包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在另一个实施方案中，肽序列包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在另一个实施方案中，肽序列包含SEQ IDNO：61的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在另一个实施方案中，肽序列包含SEQID NO：62的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在另一个实施方案中，肽序列包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

如本文其他地方所述，本发明人惊奇地发现，当在体内施用包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的至少8个连续氨基酸残基的肽序列的免疫原时，与本文公开的其他肽序列相比，其产生更高的抗PD1抗体滴度。因此，在一个实施方案中，肽序列包含SEQ ID NO：9、或与其具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的至少8个连续氨基酸残基。在另一个实施方案中，肽序列选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：43和与其具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，肽序列选自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：43。在一个实施方案中，免疫原由或基本上由选自SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：43的氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，免疫原包含至少两个本文公开的肽序列。在一个优选的实施方案中，至少两个肽序列中的每一个在体内诱导抗体应答，其中抗体与PD1的不同B细胞表位结合。

“至少两个肽序列”是指1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多个本文所述的肽序列。在一个实施方案中，免疫原包含至少2个、优选至少3个、优选至少4个、优选至少5个、优选至少6个、优选至少7个、优选至少8个、或更优选至少9个本文所述的肽序列。在一个实施方案中，免疫原包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：43。

当免疫原包含至少两个肽序列时，所述至少两个肽序列可以具有分支或线性构型。如本文所用，术语“融合蛋白”通常是指由彼此连接的两个或更多个肽序列组成的多肽。在一个实施方案中，融合蛋白包含两个或更多个彼此首尾连接的肽序列。在一个实施方案中，融合蛋白包含通过合适的连接部分(本文也称为接头)以线性构型彼此连接的两个或更多个肽序列。连接肽序列的合适方法是本领域技术人员熟悉的，其说明性示例包括肽(酰胺)键和接头。

如本文所用，术语“接头”是指***如本文所述的任何两个相邻肽序列之间的短多肽序列。在一个实施方案中，接头是1至10个氨基酸，优选1、2、3、4或5个天然或非天然存在的氨基酸的多肽接头。在一个实施方案中，接头是碳水化合物接头。合适的碳水化合物接头是本领域技术人员已知的。在本文公开的另一个实施方案中，融合蛋白包含一个或多个肽或多肽接头以及一个或多个其他非肽或非多肽接头。此外，在认为合适的情况下，可以将不同类型的接头(肽或非肽接头)掺入同一融合肽中。在使用肽或多肽接头连接两个分别的肽序列的情况下，有利地掺入接头，使得其N-末端通过肽键与一个肽序列的C-末端结合，并且其C-末端通过肽键与另一个肽序列的N-末端结合。融合蛋白内的各个肽序列还可以具有添加到任一末端或两个末端的一个或多个氨基酸，优选地添加到C-末端。因此，例如，可以将接头或间隔氨基酸添加到肽的N-末端或C-末端或两者，以连接肽，并允许方便地将肽彼此偶联和/或与递送***偶联，例如与用作锚的载体分子偶联。合适的肽接头的说明性示例是LP(亮氨酸-脯氨酸)。

免疫原可适当地包含融合蛋白，所述融合蛋白包含两个或更多个本文公开的肽序列的任何组合、由其组成或基本上由其组成。在一个实施方案中，融合蛋白包含至少三个本文公开的肽序列、由其组成或基本上由其组成。

融合蛋白可以任何顺序包含两个或更多个本文公开的肽序列，其说明性示例包括SEQ ID NO：9-10、SEQ ID NO：10-9、SEQ ID NO：9-14、SEQ ID NO：14-9、SEQ ID NO：10-14、SEQ ID NO：14-10、SEQ ID NO：9-28、SEQ ID NO：10-28、SEQ ID NO：14-28、SEQ ID NO：28-9、SEQ ID NO：28-10、SEQ ID NO：28-14、SEQ ID NO：9-29、SEQ ID NO：10-29、SEQ ID NO：14-29、SEQ ID NO：28-29、SEQ ID NO：29-9、SEQ ID NO：29-10、SEQ ID NO：29-14、SEQ IDNO：29-28、SEQ ID NO：9-10-14、SEQ ID NO：9-14-10、SEQ ID NO：14-9-10、SEQ ID NO：14-10-9、SEQ ID NO：10-14-9、SEQ ID NO：10-9-14、SEQ ID NO：9-10-28、SEQ ID NO：9-28-10、SEQ ID NO：28-9-10、SEQ ID NO：28-10-9、SEQ ID NO：10-28-9、SEQ ID NO：10-9-28等等。

在一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：43的肽序列、由其组成或基本上由其组成。在一个实施方案中，免疫原包含选自SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57的氨基酸序列。在一个实施方案中，免疫原由或基本上由选自SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57的氨基酸序列组成。

本文还考虑了包含至少两个本文公开的肽序列的融合蛋白，其串联重复两次或更多次。例如，本文考虑的融合蛋白可包含选自以下的氨基酸序列的至少8个连续氨基酸残基的肽序列的两个或更多个串联重复：SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43和49和与上述任何氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

不受理论或特定应用方式的束缚，应理解，如本文所述，相比于包含本文公开的单个肽序列的免疫原，将两个或更多个不同的肽序列掺入融合肽中，可引起更高的抗体滴度，从而产生更有益的免疫应答。

如本文所述，制备融合蛋白的合适方法是本领域技术人员所熟悉的。一个说明性的示例包括肽合成，所述肽合成包括顺序形成肽键，所述肽键连接如本文所述的每个肽序列与其各自相邻的肽序列，并回收所述融合肽。说明性的示例包括“氨基酸和肽合成(AminoAcid and Peptide Synthesis)”(牛津化学引物(Oxford Chemistry Primers)；JohnJones，牛津大学出版社)中描述的方法。合成肽也可以通过液相合成或固相肽合成(SPPS)在不同的固体支持物(例如聚苯乙烯、聚酰胺或PEG)上制备。SPPS可以结合使用F-moc(9H-芴-9-基甲氧基羰基)或t-Boc(叔丁氧基羰基)。也可以从许多商业制造商处获得定制肽。

或者，可以通过重组方法制备融合蛋白。例如，可以将包含编码融合蛋白的核酸序列的核酸分子转染到能够表达所述核酸序列的合适宿主细胞中，在适合于表达所述核酸序列的条件下孵育所述宿主细胞，并回收所述融合蛋白。用于制备编码融合蛋白的核酸分子的合适方法也是本领域技术人员已知的，基于遗传密码的知识，可能包括基于要用于表达和/或分泌重组融合蛋白的宿主细胞(例如微生物)的性质来优化密码子。合适的宿主细胞也是本领域技术人员已知的，其说明性示例包括原核细胞(例如大肠杆菌)和真核细胞(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))。参见“Short Protocols in Molecular Biology，第5版，第2卷：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology”(Frederick M.Ausubel(作者，编辑)，Roger Brent(编辑)，Robert E.Kingston(编辑)，David D.Moore(编辑)，J.G.Seidman(编辑)，John A.Smith(编辑)，Kevin Struhl(编辑)，JWiley&Sons，London)。

如本文所使用的，术语“编码”、“编码”等等是指核酸提供另一种核酸或多肽的能力。例如，如果核酸序列可以被转录和/或翻译(通常在宿主细胞中)以产生多肽、或者如果核酸序列可以被加工成可以被转录和/或翻译以产生多肽的形式，那么该核酸序列被称为“编码”多肽。这样的核酸序列可以包括编码序列或编码序列和非编码序列两者。因此，术语“编码”、“编码”等包括由DNA分子的转录产生的RNA产物，由RNA分子的翻译产生的蛋白质，由DNA分子转录形成RNA产物以及随后的RNA产物的翻译产生的蛋白质，或DNA分子转录以提供RNA产物、加工RNA产物以提供加工的RNA产物(例如mRNA)以及随后加工的RNA产物翻译产生的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化了编码本文所述的肽序列或本文所述的融合蛋白的核酸序列，以在合适的宿主细胞中表达。例如，在将融合蛋白用于在人受试者中诱导针对PD1的体液应答的情况下，核酸序列可以是人密码子优化的。用于密码子优化的合适方法是本领域技术人员已知的，例如使用位于约翰霍普金斯大学建立基因组网站上“软件工具”中的“基因设计”工具的“反向翻译”选项。

如本文其他地方所述，肽序列可以通过本领域技术人员已知的任何方法在融合肽内彼此连接。术语“连接”和“连接的”包括通过肽键将两个肽序列直接连接；即，一个肽序列的C-末端通过肽键与另一个肽序列的N-末端共价结合。术语“连接”和“连接的”在其含义内还包括两个肽序列通过***的接头元件的连接。本领域技术人员将理解，在通过接头将融合蛋白与载体蛋白偶联的情况下，优选从融合蛋白的C-末端进行这种接头介导的偶联，因为在某些情况下，从N-末端偶联的接头对期望引起的免疫应答产生负面影响。

在本文公开的一个实施方案中，融合蛋白中的至少两个肽序列通过非天然接头肽序列彼此连接。

当免疫原包含至少两个肽序列时，融合肽内的肽序列可以以下方式彼此连接，以确保融合蛋白包含与天然PD1的至少40个、优选至少50个氨基酸残基的连续延伸序列不同的氨基酸序列。

通过在单个融合蛋白中连接至少两个肽序列，其中至少两个肽序列中的每一个诱导抗体应答，其中抗体与天然检查点抗原的B细胞表位结合，可以得到均质的制剂，所述制剂中仅存在一种融合蛋白。融合蛋白的要素(即能够诱导抗体应答的肽序列，其中抗体与天然PD1的B细胞表位结合)在每种融合蛋白中都可以相同，并且可以进行选择(或选择和修饰)，使得将不想要的多肽内和多肽间的相互作用最小化。

疫苗组合物中存在的至少两个肽序列的比率最终可以由融合肽中的这些肽的比率决定。这意味着在融合蛋白的构建和设计水平上可以容易且可靠地固定用于引起对PD1的抗体应答的任何期望比率。

应当理解，融合肽可以包含任何合适长度的氨基酸序列，只要融合肽保留体内诱导抗体应答的能力或能力，其中抗体与天然PD1的B细胞表位结合。在一个实施方案中，融合肽的长度为至少16个(例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多个)氨基酸。在一个实施方案中，融合肽的长度为约16个氨基酸至约40个氨基酸。在一个实施方案中，融合肽的长度为约16个氨基酸至约36个氨基酸。在一个实施方案中，融合肽的长度为约16个氨基酸至约24个氨基酸。在一个实施方案中，融合肽的长度为约24个氨基酸。

如本文所用，术语“B细胞表位”是指被抗体识别的分子的一部分。因此，“B细胞表位”应理解为是能够被抗体识别(结合)的抗原的较小子序列。应当理解，抗原可以包含多个B细胞表位，因此可以被多种不同的抗体结合。单个表位也可以被具有不同抗原结合特异性和/或亲和力的多种抗体结合。不同亚类的多种抗体也可以结合相同的表位。

免疫原将包含至少一种肽序列，当施用于受试者时，所述肽序列将诱导抗体应答，使得抗体与PD1的B细胞表位结合，优选与天然PD1分子的B细胞表位结合；也就是说，与天然存在的PD1抗原结合。优选地，免疫原的至少一个肽序列将诱导抗体应答，使得抗体与天然PD1分子的细胞外结构域的B细胞表位结合。优选地，产生抗体的B细胞表位是位于天然抗原的细胞外结构域内的表位。在一个实施方案中，免疫原包含PD1的自体B细胞表位；即，PD1的B细胞表位具有源自与待治疗受试者相同物种的PD1分子的氨基酸序列。

如本文所用，术语“天然”和“天然的”是指正常情况下存在于自然界中的分子形式。在一个实施方案中，PD1的天然序列包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。相反，“非天然”序列，包括“非天然接头”，其是不属于PD1天然序列的任何氨基酸序列。

本公开还扩展到非人物种的PD1同种型，包括非人灵长类动物、犬、猫、马、牛、猪和鼠的PD1同种型。在本文公开的实施方案中，非人PD1同种型是小鼠PD1，其说明性示例包含Uniprot No.Q02242的氨基酸序列，其通过引用整体并入本文。

如本文所述，与SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43和49中的任一个具有至少70％的序列同一性的肽序列在本文中也称为“功能性变体”。应当理解，如本文所用，“功能性变体”是指与被比较的肽(即，比较物)具有不同氨基酸序列的肽序列，其可以包括天然的(即，天然)序列或其合成变体，但仍保留在体内诱导抗体应答的能力，其中抗体与PD1的B细胞表位结合。

确定功能性变体是否保留在体内诱导抗体应答的能力的合适方法是本领域技术人员熟悉的，其中抗体与天然PD1的B细胞表位结合，所述方法的说明性示例在本文其他地方描述。例如，可以使用相同的测定法，将包含非衍生的天然PD1的B细胞表位的融合蛋白引起的抗体应答与包含天然B细胞表位的变体的融合蛋白引起的抗体应答进行比较。如果包含变体的融合蛋白引起的免疫应答与包含非衍生的B细胞表位的融合蛋白引起的免疫应答一样强，那么该氨基酸取代可以被认为是功能上等同的。如果衍生的免疫应答优于非衍生的免疫应答，则可以认为氨基酸取代得到了改善。

功能性变体可包括与天然肽序列相差一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个)氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述差异不会、或不完全消除变体诱导抗体应答的能力，其中抗体与PD1的B细胞表位结合。在一些实施方案中，与天然肽序列相比，功能性变体可以包含氨基酸取代，所述氨基酸取代增强肽序列诱导抗体应答的能力，其中抗体与PD1的B细胞表位结合。在一个实施方案中，功能性变体与天然肽序列的区别在于一个或多个保守氨基酸取代。如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指在给定位置改变氨基酸同一性，用大小、电荷和/或极性近似相等的氨基酸替代它。氨基酸的天然保守取代的示例包括以下8组取代(由常规的单字母代码指定)：(1)M，I，L，V；(2)F，Y，W；3)K，R，(4)A，G；(5)S，T；(6)Q，N；(7)E，D；和(8)C，S。

提及“至少70％”，包括，例如，在最佳比对或最佳拟合分析之后，与SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43和49中的任何一个具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一个实施方案中，例如，在最佳比对或最佳拟合分析之后，功能性变体与SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43和49中的任何一个具有至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少86％、优选至少87％、优选至少88％、优选至少89％、优选至少90％、优选至少91％、优选至少92％、优选至少93％、优选至少94％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、优选至少99％或优选100％的序列同一性。

本文所用的术语“同一性”、“相似性”、“序列同一性”、“序列相似性”、“同源性”、“序列同源性”等是指在比对序列中的任何特定的氨基酸残基位置上，比对的序列之间的氨基酸残基是相同的。如本文所用，术语“相似性”或“序列相似性”表示在比对序列中的任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基类型相似。例如，亮氨酸可以取代异亮氨酸或缬氨酸残基。这可以称为保守取代。在一个实施方案中，可以通过氨基酸序列中包含的任何氨基酸残基的保守取代来修饰氨基酸序列，使得与未修饰的多肽相比较时，该修饰对经修饰多肽的结合特异性或功能活性没有影响。

在一些实施方案中，肽序列的序列同一性涉及在比对序列并引入缺口(如果需要)以达到最大同源性百分比后，候选序列中与相应的肽序列残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分。N-末端或C-末端的延伸或***均不应解释为降低序列同一性或同源性。用于进行两个或更多个氨基酸序列的比对并确定其序列同一性或同源性的方法和计算机程序是本领域技术人员众所熟知的。例如，可以使用算法，例如BLAST、FASTA或Smith-Waterman算法容易地计算两个氨基酸序列的同一性或相似性百分比。

用于确定氨基酸序列“相似性”的技术对于本领域技术人员而言是众所周知的。通常，“相似性”指的是两个或更多个肽序列或在适当位置上精确的氨基酸与氨基酸的比较，其中氨基酸相同或具有相似的化学和/或物理性质，例如电荷或疏水性。然后可以确定被比较的肽序列之间所谓的“相似性百分比”。通常，“同一性”指的是两个肽序列的精确的氨基酸与氨基酸的对应。

还可以通过确定它们的“同一性百分比”来比较两个或更多个肽序列。两个序列的同一性百分比可以描述为两个比对序列之间精确匹配的数目除以较短序列的长度再乘以100。Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法提供了核酸序列的近似比对。使用Dayhoff，Atlas of Protein Sequences andStructure，M.O.Dayhoff编辑，5suppl.3：353-358，National Biomedical ResearchFoundation，Washington，D.C.，USA开发的并由Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)标准化的评分矩阵,该算法可以扩展为与肽序列一起使用。用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的合适程序一般是本领域公知的。

可以通过计算机执行的算法(威斯康星遗传软件版本7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传计算机小组，美国威斯康星州575Science Drive Madison)、或者通过各种选定方法中的任何方法生成的检测和最佳比对，来进行用于比对窗口的最佳序列比对(即，在比较窗口中形成最高的同源性百分比)。还可以参考BLAST程序家族，例如由Altschul等人，1997，Nucl.Acids Res.25：3389所公开的。序列分析的详细讨论可以在Ausubel等人，"Current Protocols in Molecular Biology"，John Wiley&Sons Inc，1994-1998，第15章，第19.3单元找到。

在一个实施方案中，功能性变体包括氨基酸取代和/或其他修饰，以增加免疫原的稳定性和/或增加免疫原的溶解度，从而增强其在体内诱导抗体应答的能力。适当的修饰对于本领域技术人员是熟悉的，其说明性示例在本文的其他地方进行了描述。

本文公开的肽序列可以通过本领域众所周知的化学合成方法，作为分离的肽序列或作为另一肽或多肽的一部分合成产生。或者，可以在产生一种或多种(重组)肽序列的微生物中产生肽序列，然后可以将其分离，并且如果需要，可以进一步纯化。肽序列可以在微生物(例如细菌、酵母或真菌)、真核细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)或重组病毒载体(例如腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、Simliki森林病毒、杆状病毒、噬菌体、辛德毕斯病毒(sindbisvirus)或仙台病毒(sendai virus)中产生。用于产生肽序列的合适细菌是本领域技术人员熟悉的，其说明性示例包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或能够表达肽序列的任何其他细菌。用于表达肽序列的合适酵母类型的说明性示例包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、假丝酵母(Candida)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或任何其他能够表达肽的酵母。相应的方法是本领域众所周知的。分离和纯化重组产生的肽序列的方法也是本领域众所周知的，包括例如凝胶过滤、亲和色谱法和离子交换色谱法。

为了促进合成或重组肽序列的分离，可以制备融合多肽，其中至少一个肽序列与异源多肽翻译融合(共价连接)，使得能够通过亲和色谱法分离。典型的异源多肽是His-Tag(例如His₆.6个组氨酸残基)、GST-Tag(谷胱甘肽-S-转移酶)等。融合多肽不仅促进免疫原的纯化，还可以防止多肽在纯化过程中降解。如果需要在纯化后除去异源多肽，则融合多肽可在肽序列和异源多肽之间的连接处包含切割位点。切割位点由氨基酸序列组成，该氨基酸序列被对该位点处的氨基酸序列具有特异性的酶(例如蛋白酶)切割。

本文公开的肽序列可以在它们的N-末端和/或C-末端处或附近被适当地修饰，使得在所述位置上，半胱氨酸残基结合于其上。

为了制备肽序列，噬菌体文库和/或肽文库也适用，例如通过组合化学方法产生或通过针对大多数不同结构的高通量筛选技术获得(例如，参见Display：A LaboratoryManual by Carlos F.Barbas(编辑)等人；和Willats WG Phage display：practicalitiesand prospects.Plant Mol.Biol.2002December；50(6)：837-54)。

合适的功能性变体的说明性示例是SEQ ID NO：61的肽序列，应注意SEQ ID NO：61与相应的天然人PD1肽片段(SEQ ID NO：42)的不同之处在于在SEQ ID NO：42的位置3用丝氨酸残基取代半胱氨酸残基。因此，在一个实施方案中，功能性变体包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

通过将Th细胞表位掺入免疫原中可进一步增强对本文公开的肽序列的抗体应答，该Th细胞表位可促进有助于绕过MHC限制的细胞因子的释放(即混杂的Th细胞表位)。因此，在本文公开的实施方案中，免疫原还包含混杂的T辅助(Th)细胞表位。合适的混杂Th细胞表位是本领域技术人员已知的，其说明性示例包括麻疹病毒融合蛋白(MVF；KLLSLIKGVIVHRLEGVE；SEQ ID NO：110)；破伤风类毒素(TT；NSVDDALINSTIYSYFPSV；SEQ IDNO：111)；TT1(PGINGKAIHLVNNQSSE；SEQ ID NO：112)；TT肽P2(QYIKANSKFIGITEL；SEQ IDNO：113)；TT肽P30(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE；SEQ ID NO：114)；MVF'(LSEIKGVIVHRLEGV；SEQID NO：115)；乙型肝炎病毒(HBV；FFLLTRILTIPQSLN；SEQ ID NO：116)；环子孢子蛋白(CSP；TCGVGVRVRSRVNAANKKPEl；SEQ ID NO：117)，以及WO2000/046390中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，混杂的Th表位的长度是约8至约36个氨基酸、优选约8至约24个氨基酸、更优选约8至22个氨基酸、最优选约8至约22个氨基酸。在一个实施方案中，如本文所述，混杂Th细胞表位与肽序列或融合蛋白连接以形成嵌合肽。适当的接头对于本领域技术人员是熟悉的，其说明性示例在本文的其他地方进行了描述。

免疫原通常包含至少一个在体内诱导抗体应答的肽序列(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多个肽序列)，其中抗体与PD1的B细胞表位结合，优选与天然PD1分子的B细胞表位结合。所述至少一个肽序列可包含(i)PD1的B细胞表位或其功能性变体，(ii)PD1的B细胞表位的模拟表位或(iii)前述任一项的组合。在一个实施方案中，免疫原包含PD1的至少一个B细胞表位或其功能性变体。“至少一个”是指1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多个。在一个实施方案中，免疫原包含PD1的至少2个、优选至少3个、优选至少4个、优选至少5个、优选至少6个、优选至少7个、优选至少8个、优选至少9个、优选至少10个、优选至少11个或更优选至少12个非连续B细胞表位或其功能性变体。在一个实施方案中，免疫原包含PD1的一个B细胞表位或其功能性变体、由其组成或基本上由其组成。在另一个实施方案中，免疫原包含PD1的两个非连续的B细胞表位或其功能性变体、由其组成或基本上由其组成。在本文公开的另一个实施方案中，免疫原包含PD1的三个非连续的B细胞表位或其功能性变体、由其组成或基本上由其组成。

如本文所用，术语“B细胞表位”是指被抗体识别的分子的一部分。因此，“B细胞表位”应理解为是能够被抗体识别(结合)的抗原的较小子序列。应当理解，抗原可以包含多个B细胞表位，因此可以被多种不同的抗体结合。单个表位也可以被具有不同抗原结合特异性和/或亲和力的多种抗体结合。不同亚类的多种抗体也可以结合相同的表位。

免疫原将包含至少一种肽序列，当施用于受试者时，该肽序列将诱导抗体应答，使得该抗体与天然PD1分子的B细胞表位结合；也就是说，与天然存在的PD1抗原结合。优选地，免疫原的至少一个肽序列将诱导抗体应答，使得抗体与天然PD1分子的细胞外结构域的B细胞表位结合。优选地，产生抗体的B细胞表位是位于天然抗原的细胞外结构域内的表位。在一个实施方案中，免疫原包含PD1的自体B细胞表位；即，PD1的B细胞表位具有源自与待治疗受试者相同物种的PD1分子的氨基酸序列。

确定PD1的B细胞表位的方法是本领域技术人员熟悉的。在说明性示例中，可以通过使用建立的计算机程序将抗原的子序列高度准确地鉴定为B细胞表位或包含B细胞表位，所述计算机程序将所讨论的子序列与已知序列的数据库和/或已知被人或小鼠种系编码的抗体识别的部分序列进行比较。备选地，可以使用与抗原性相关的各种组合(例如表面可及性、链柔性、亲水性(hydropathy)/亲水性谱、预测的二级结构等)通过计算机辅助分析来鉴定B细胞表位。备选地，可以通过用所讨论的抗原免疫动物至少一次，以产生体液免疫应答，然后使用例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法、Western印迹分析或斑点印迹分析测试动物血清中与所施用抗原的至少一部分特异性结合的抗体，从而将抗原鉴定为包含B细胞表位。

在一个实施方案中，B细胞表位是人PD1的B细胞表位(SEQ ID NO：1)。上面的表1和2列出了人PD1的B细胞表位的说明性示例。

在一个实施方案中，PD1的B细胞表位选自SEQ ID NO：2-109。在另一个实施方案中，PD1的B细胞表位选自SEQ ID NO：9、43和57。在本文公开的另一个实施方案中，PD1的B细胞表位是PD1的B细胞表位的功能性变体，其说明性示例在本文表1和表2中提供(即，SEQ IDNO：2-109)。

本公开还扩展到非人物种的PD1同种型，包括非人灵长类动物、犬、猫、马、牛、猪和鼠的PD1同种型。在本文公开的实施方案中，非人PD1同种型是小鼠PD1，其说明性示例包含Uniprot No.Q02242的氨基酸序列，其通过引用整体并入本文。

如本文所用，术语“功能性变体”是指与相比较的肽(即，比较物)具有不同氨基酸序列的肽序列，其可以包括天然序列或其同种型，但当施用时，保留了诱导抗体应答的能力，其中抗体与PD1的B细胞表位结合。功能性变体包括PD1 B细胞表位的片段。应当理解，PD1 B细胞表位的功能片段可以是任何合适的长度，只要该片段保留了诱导抗体应答的能力，其中抗体与PD1的B细胞表位结合，优选在抗体应答中抗体与天然PD1的B细胞表位结合。

在一个实施方案中，功能性变体是SEQ ID NO：1的PD1蛋白的片段，其包含选自SEQID NO：2-109的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

在另一个实施方案中，功能性变体是SEQ ID NO：1的PD1蛋白的片段，其包含选自SEQ ID NO：9、43和57的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

本领域技术人员熟悉确定PD1的B细胞表位的变体是否保留诱导抗体应答(其中抗体与天然PD1的B细胞表位结合)的能力的合适方法，其说明性示例在本文其他地方描述。例如，可以使用相同的测定法，将包含非衍生的天然PD1的B细胞表位的融合蛋白引起的抗体应答与包含天然B细胞表位的变体的融合蛋白引起的抗体应答进行比较。如果包含变体的融合蛋白引起的免疫应答与包含非衍生的B细胞表位的融合蛋白引起的免疫应答一样强，那么该氨基酸取代可以被认为是功能上等同的。如果衍生的免疫应答优于非衍生的免疫应答，则可以认为氨基酸取代得到了改善。

术语“功能性变体”也包括与天然序列相差一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个)氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述差异不会、或不完全消除变体诱导抗体应答的能力，其中抗体与PD1的B细胞表位结合。在一些实施方案中，与B细胞表位的天然序列相比，该功能性变体可以包含增强免疫原诱导抗体应答的能力的氨基酸取代，在所述抗体应答中抗体与PD1的B细胞表位结合。在一个实施方案中，功能性变体与天然肽序列的区别在于一个或多个保守氨基酸取代。如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指在给定位置改变氨基酸同一性，用大小、电荷和/或极性近似相等的氨基酸替代它。氨基酸的天然保守取代的示例包括以下8组取代(由常规的单字母代码指定)：(1)M，I，L，V；(2)F，Y，W；(3)K，R，(4)A，G；(5)S，T；(6)Q，N；(7)E，D；和(8)C，S。

在一个实施方案中，功能性变体与天然PD1抗原的B细胞表位的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性。提及“至少85％”，包括，例如，在最佳比对或最佳拟合分析之后，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性或相似性。因此，在一个实施方案中，例如，在最佳比对或最佳拟合分析之后，序列与本文鉴定的序列具有至少85％、优选至少86％、优选至少87％、优选至少88％、优选至少89％、优选至少90％、优选至少91％、优选至少92％、优选至少93％、优选至少94％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、优选至少99％或优选100％的序列同一性或序列同源性。

在一个实施方案中，功能性变体包括氨基酸取代和/或其他修饰，以增加免疫原的稳定性和/或增加免疫原的溶解度，从而增强其在体内诱导抗体应答的能力。适当的修饰对于本领域技术人员是熟悉的，其说明性示例在本文的其他地方进行了描述。

应当理解，免疫原可以包含任何合适长度的肽序列，只要该肽在根据本文公开的方法施用于受试者时，保留诱导抗体应答的能力或能力即可，在所述抗体应答中抗体与天然PD1的B细胞表位结合。如本文其他地方所述，本领域技术人员熟悉确定肽序列在施用时是否保留诱导抗体应答的能力或能力的方法，在所述抗体应答中抗体与天然PD1的B细胞表位结合。在一个实施方案中，肽序列的长度为至少10个(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个)氨基酸。在一个实施方案中，肽序列的长度为约10个氨基酸至约40个氨基酸。在一个实施方案中，肽序列的长度为约10个氨基酸至约35个氨基酸。在一个实施方案中，肽序列的长度为约10个氨基酸至约30个氨基酸。在一个实施方案中，肽序列的长度为约10个氨基酸至约25个氨基酸。在一个实施方案中，肽序列的长度为约10个氨基酸至约20个氨基酸。在一个实施方案中，肽序列的长度为约10个氨基酸至约15个氨基酸。

如本文其他地方所述，免疫原将包含至少一个能够诱导抗体应答的肽序列，在所述抗体应答中，抗体与PD1的B细胞表位结合，优选地与天然PD1的B细胞表位结合。这可以通过使用包含PD1的B细胞表位的氨基酸序列(或其功能性变体)和/或PD1 B细胞表位的模拟表位的肽序列来实现。在本文公开的一个实施方案中，免疫原包含PD1的B细胞表位的至少一个模拟表位。

如本文所用，术语“模拟表位”通常是指具有构象的分子，该构象具有与其模拟的B细胞表位等同的拓扑结构，并且所述分子结合抗体的抗原结合区，该抗体的抗原结合区与免疫特异性结合所述B细胞表位的抗体的抗原结合区相同。模拟表位将在宿主中引发免疫应答，该宿主对该模拟表位模拟的抗原具有反应性。

PD1 B细胞表位的模拟表位优选是抗原性多肽，其氨基酸序列不同于天然PD1的B细胞表位的氨基酸序列。模拟表位不仅可以包含天然PD1分子的一个或多个天然存在的氨基酸残基的氨基酸取代，而且可以包含一个或多个非天然氨基酸(即，不是来自20个“经典”氨基酸)的氨基酸取代，或者其可以完全是这种非天然氨基酸组装的。合适的模拟表位可以从可商购的肽库中提供。优选地，这些模拟表位的长度为至少7个氨基酸(例如，长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多个氨基酸)。优选的长度可以是多达16个，优选地多达14或20个氨基酸(例如5至16个氨基酸残基)。也可以使用更长的模拟表位。在一个实施方案中，模拟表位可以是多肽的一部分，因此在其N-末端和/或C-末端包含至少一个其他氨基酸残基。

本文公开的肽序列可以通过本领域众所周知的化学合成方法，作为分离的肽序列或作为另一肽或多肽的一部分合成产生。或者，可以在产生一种或多种(重组)肽序列的微生物中产生肽序列，然后可以将其分离，并且如果需要，可以进一步纯化。肽序列可以在微生物(例如细菌、酵母或真菌)、真核细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)或重组病毒载体(例如腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、Simliki森林病毒、杆状病毒、噬菌体、辛德毕斯病毒(sindbisvirus)或仙台病毒(sendai virus)中产生。用于产生肽序列的合适细菌是本领域技术人员熟悉的，其说明性示例包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或能够表达肽序列的任何其他细菌。用于表达肽序列的合适酵母类型的说明性示例包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、假丝酵母(Candida)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或任何其他能够表达肽的酵母。相应的方法是本领域众所周知的。分离和纯化重组产生的肽序列的方法也是本领域众所周知的，包括例如凝胶过滤、亲和色谱法和离子交换色谱法。

为了促进合成或重组肽序列的分离，可以制备融合多肽，其中至少一个肽序列与异源多肽翻译融合(共价连接)，使得能够通过亲和色谱法分离。典型的异源多肽是His-Tag(例如His₆.6个组氨酸残基)、GST-Tag(谷胱甘肽-S-转移酶)等。融合多肽不仅促进模拟表位的纯化，还可以防止多肽在纯化过程中降解。如果需要在纯化后除去异源多肽，则融合多肽可在肽序列和异源多肽之间的连接处包含切割位点。切割位点由氨基酸序列组成，该氨基酸序列被对该位点处的氨基酸序列具有特异性的酶(例如蛋白酶)切割。

本文公开的肽序列可以在它们的N-末端和/或C-末端处或附近被适当地修饰，使得在所述位置上，半胱氨酸残基结合于其上。

为了制备肽序列，噬菌体文库和/或肽文库也适用，例如通过组合化学方法产生或通过针对大多数不同结构的高通量筛选技术获得(例如，参见Display：A LaboratoryManual by Carlos F.Barbas(编辑)等人；和Willats WG Phage display：practicalitiesand prospects.Plant Mol.Biol.2002December；50(6)：837-54)。

当免疫原包含两个或更多个肽序列时，该肽序列可以作为融合蛋白呈现。如本文所用，术语“融合蛋白”通常是指由彼此连接的两个或更多个肽序列组成的多肽。在一个实施方案中，融合蛋白包含/是彼此连接的两个或更多个肽序列的非天然多肽序列。连接肽序列的合适方法是本领域技术人员熟悉的，其说明性示例包括肽(酰胺)键和接头。

如本文所述，本文公开的免疫原可适当地包含融合蛋白，所述融合蛋白包含两个或更多个PD1 B细胞表位和/或其模拟表位的任何组合、由其组成或基本上由其组成。在一个实施方案中，如本文所述，融合蛋白包含PD1的至少两个B细胞表位或其功能性变体、由其组成或基本上由其组成。在另一个实施方案中，如本文所述，融合蛋白包含PD1的至少两个非连续B细胞表位或其功能性变体、由其组成或基本上由其组成。在本文公开的另一个实施方案中，如本文所述，融合蛋白包含PD1的至少三个非连续B细胞表位或其功能性变体、由其组成或基本上由其组成。

在另一个实施方案中，如本文所述，融合蛋白包含PD1的B细胞表位的至少两个模拟表位、由其组成或基本上由其组成。在另一个实施方案中，如本文所述，融合蛋白包含PD1的B细胞表位的至少三个模拟表位、由其组成或基本上由其组成。

本文还考虑了包含融合蛋白的免疫原，所述融合蛋白包含如本文所述的至少一个(例如1、2、3、4、5、6个或更多个)PD1 B细胞表位或其功能性变体，以及如本文所述的PD1 B细胞表位的至少一个模拟表位(例如1、2、3、4、5、6或更多个)、由其组成或基本上由其组成。在本文公开的实施方案中，融合蛋白包含如本文所述的一个PD1的B细胞表位或其功能性变体，以及如本文所述的一个PD1 B细胞表位的模拟表位。在另一个实施方案中，融合蛋白包含如本文所述的PD1的两个B细胞表位或其功能性变体，以及如本文所述的一个PD1 B细胞表位的模拟表位。在另一个实施方案中，融合蛋白包含如本文所述的一个PD1的B细胞表位或其功能性变体，以及如本文所述的PD1 B细胞表位的两个模拟表位。在本文公开的另一个实施方案中，融合蛋白包含如本文所述的PD1的两个B细胞表位或其功能性变体，以及如本文所述的PD1 B细胞表位的两个模拟表位。在另一个实施方案中，融合蛋白包含如本文所述的PD1的三个B细胞表位或其功能性变体，以及如本文所述的PD1 B细胞表位的两个模拟表位。在另一个实施方案中，融合蛋白包含如本文所述的PD1的三个B细胞表位或其功能性变体，以及如本文所述的PD1 B细胞表位的两个模拟表位。

本文还公开了包含融合蛋白的免疫原，所述融合蛋白包含一个或多个PD1 B细胞表位的至少两个模拟表位(例如，至少2个、优选至少3个、优选至少4个、优选至少5个、优选至少6个、优选至少7个、优选至少8个、优选至少9个、更优选至少10个模拟表位)、由其组成或基本上由其组成。

应当理解，在融合蛋白包含多于一个的模拟表位的情况下，模拟表位可引起抗体应答，其中抗体与相同的PD1 B细胞表位结合，或者抗体可以结合PD1不同的B细胞表位。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含能够在体内诱导抗体应答的至少两个模拟表位，在所述抗体应答中，抗体结合PD1至少两个B细胞表位(例如，至少2个、优选至少3个、优选至少4个、优选至少5个、优选至少6个、优选至少7个、优选至少8个、优选至少9个、优选至少10个或更多个PD1 B细胞表位)。

本文还考虑了包含至少两个本文公开的肽序列的融合蛋白，其串联重复两次或更多次。例如，本文考虑的融合蛋白可以包含表1和表2中列出的肽片段的两个或更多个串联重复(即，SEQ ID NO：2-109或其功能性变体)。

不受理论或特定应用方式的束缚，应理解，如本文所述，相比于包含PD1的单个B细胞表位或其模拟表位的免疫原，将两个或更多个不同的B细胞表位和/或模拟表位掺入融合肽中，可引起更高的抗体滴度，从而产生更有益的免疫应答。

当至少两个肽序列包含自然界中存在的氨基酸序列(例如，源自天然PD1的B细胞表位的序列)时，该肽序列可以在融合肽内彼此连接，以确保融合蛋白包含与天然PD1的至少40个氨基酸残基的连续延伸序列不同的氨基酸序列。例如，当至少两个肽序列是人PD1的B细胞表位(例如，SEQ ID NO：1)时，融合蛋白包含至少两个人PD1的非连续的B细胞表位。因此，在融合蛋白包含PD1的至少两个B细胞表位(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多个PD1的非连续B细胞表位)的情况下，所述融合蛋白可包含彼此连接的PD1的至少两个非连续B细胞表位，从而所述PD1的至少两个B细胞表位在其天然状态下(即，在天然PD1中)是非连续的。

载体

如本文所述，免疫原的肽序列可以适当地与载体缀合、偶联或以其他方式与载体连接。因此，在本文公开的另一个实施方案中，免疫原包含载体。

在一个实施方案中，载体是免疫原性的。如本文所用，术语“免疫原性”通常是指与不存在载体相比，载体能够促进或增强针对其所缀合、偶联或以其他方式连接的肽序列的体液免疫应答。

合适的载体是本领域技术人员已知的，其说明性示例包括钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、霍乱毒素的B亚基(CT，CTB)、大肠杆菌及其变体的热不稳定毒素(LT)、乳酸菌(LAB)/益生菌、细菌菌蜕(bacterial ghost)、寄生虫来源的抗原，例如来自刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)的抗原(参见，例如Wagner等人Sci Rep.(2017)；7(1)：15211和Wagner等人，PLoS One.(2016)；11(5)：e0155081，其内容全文以引用方式并入本文)、脂质体、病毒样颗粒、壳聚糖、病毒体、toll样受体激动剂、脂质A、细菌DNA(CpG)、ISCOM、细胞因子(GM-CSF)、聚合物、无机微粒子和纳米粒子以及白喉毒素变体CRM-197。在本文公开的一个实施方案中，载体选自钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、霍乱毒素的B亚基(CT，CTB)、大肠杆菌及其变体的热不稳定毒素(LT)、乳酸菌(LAB)/益生菌、细菌菌蜕、寄生虫来源的抗原、脂质体、壳聚糖、病毒体、病毒样颗粒和白喉毒素变体CRM-197。在一个实施方案中，载体不是病毒样颗粒。在一个实施方案中，疫苗组合物不包含病毒样颗粒。

在一个实施方案中，载体是白喉毒素变体CRM-197(SEQ ID NO：118)。CRM-197(GenBank登录号1007216A；SEQ ID NO：118)是白喉毒素的一种无酶促活性且无毒的形式，其在第52个氨基酸残基处包含单个氨基酸取代(Gly-Glu)。产生Glu52取代的单个GCA突变将CRM-197与野生型物种区分开来。CRM-197没有毒性似乎是因为其片段A的酶促活性丧失所致，该片段在野生型物种中催化感染细胞中延伸因子2(转位酶)的化学修饰，这对于蛋白质合成至关重要。这种无毒特性使CRM-197成为制备缀合疫苗的合适载体蛋白。

SEQ ID NO：118(CRM-197；GenBank登录号1007216A)

将本文所公开的肽序列或融合蛋白与载体(例如CRM-197)缀合、偶联或以其他方式连接的方法对于本领域技术人员而言是已知的。说明性示例包括由Chang等人(1998，FEBS Letters，427：362-366)和Berti等人(2004，Biophysical Journal，86：3–9)描述的那些。

如本文所公开的，通常通过使用合适的交联剂活化赖氨酰残基来实现如本文所述的肽序列与载体的缀合。例如，由于CRM-197包含40个赖氨酸残基，其中许多残基可用于交联，因此CRM-197缀合的终产物总是异质的。不受理论或特定作用方式的束缚，通常应理解，肽序列与载体的比例取决于肽序列的大小或分子量。例如，在肽序列相对较小(例如，长度为约75个氨基酸)的情况下，可能产生与20-39个肽序列缀合的载体。相反，对于较大的肽序列，载体可以与多达或少于20个肽序列缀合。在本文所述的实施方案中，免疫原包含2-39个肽序列，其与载体缀合、偶联或以其他方式连接。在另一个实施方案中，免疫原包含至少20个肽序列，其与载体缀合、偶联或以其他方式连接。在另一个实施方案中，免疫原包含6至12个肽序列，其与载体缀合、偶联或以其他方式连接。

免疫原的肽序列可以通过共价键与载体缀合、偶联或以其他方式连接。然而，在一些实施方案中，肽序列可以通过非共价结合与载体偶联。在免疫原与载体非共价结合的情况下，非共价结合通常涉及肽序列的一个或多个原子与载体的一个或多个原子之间的电磁相互作用。说明性示例包括离子键合(即，通过相反电荷在两个带相反电荷的离子之间形成的吸引力)、范德华力(即，融合蛋白与载体中存在的共价键的永久和/或诱导的偶极之间的力)和/或疏水相互作用(即，如本文所述的肽序列或融合蛋白中疏水/脂肪族部分与载体的疏水部分结合的趋势产生的力)。

在本文公开的实施方案中，肽表位与载体缀合。

本领域技术人员将理解，在通过接头将肽表位与载体蛋白偶联的情况下，优选从肽表位的C-末端进行这种接头介导的偶联，因为在某些情况下，从N-末端偶联的接头对期望引起的免疫应答产生负面影响。

在本文公开的一个实施方案中，载体是免疫原性的。

在本文公开的一个实施方案中，载体选自钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、霍乱毒素的B亚基(CT，CTB)、大肠杆菌及其变体的热不稳定毒素(LT)、乳酸菌(LAB)、细菌菌蜕、脂质体、壳聚糖、病毒体、病毒样颗粒、树突细胞和白喉毒素变体CRM-197。在一个实施方案中，载体不是病毒样颗粒。在一个实施方案中，疫苗组合物不包含病毒样颗粒。

在本文公开的实施方案中，载体是白喉毒素变体CRM-197(SEQ ID NO：58)。

CRM-197(GenBank登录号1007216A；SEQ ID NO：58)是白喉毒素的一种无酶促活性且无毒的形式，其在第52个氨基酸残基处包含单个氨基酸取代(Gly-Glu)。产生Glu52取代的单个GCA突变将CRM-197与野生型物种区分开来。CRM-197没有毒性似乎是因为其片段A的酶促活性丧失所致，该片段在野生型物种中催化感染细胞中延伸因子2(转位酶)的化学修饰，这对于蛋白质合成至关重要。这种无毒特性使CRM-197成为制备缀合疫苗的合适载体蛋白。

SEQ ID NO：58(CRM-197；GenBank登录号1007216A)

可以将肽表位与CRM-197缀合、偶联或以其他方式连接的方法是本领域技术人员已知的。说明性示例包括由Chang等人(1998，FEBS Letters，427：362-366)和Berti等人(2004，Biophysical Journal，86：3–9)描述的那些。

通常通过使用合适的交联剂活化赖氨酰残基来实现如本文所述的肽表位与CRM-197的缀合。由于CRM-197包含40个赖氨酸残基，其中许多残基可用于交联，因此CRM-197缀合的终产物总是异质的。不受理论或特定作用方式的束缚，通常应理解免疫原与载体蛋白的比例取决于免疫原的大小或分子量。例如，在免疫原相对较小(例如，长度为12-24个氨基酸)的情况下，可能产生与20-39个免疫原缀合的载体。相反，对于较大的免疫原，载体可以与多达或少于20个免疫原缀合。在本文所述的实施方案中，载体包含2至39个免疫原。在另一个实施方案中，载体包含至少20个免疫原。在另一个实施方案中，载体包含6至12个免疫原。

免疫原可以通过共价键与载体偶联。然而，在一些实施方案中，免疫原可以通过非共价结合与载体偶联。在肽序列与载体非共价结合的情况下，非共价结合通常涉及免疫原的一个或多个原子与载体的一个或多个原子之间的电磁相互作用。说明性示例包括离子键合(即，通过相反电荷在两个带相反电荷的离子之间形成的吸引力)、范德华力(即，肽表位与载体中存在的共价键的永久和/或诱导的偶极之间的力)和/或疏水相互作用(即，如本文所述的肽表位中的疏水/脂肪族部分与载体的疏水部分结合的趋势产生的力)。

佐剂

本文公开的疫苗组合物可以适当地与佐剂一起配制，以进一步增强针对PD1的抗体应答。因此，在一个实施方案中，本文公开的疫苗组合物包含佐剂。

如本文所用，术语“佐剂”通常是指可以增加由免疫原引起的免疫(抗体)应答的幅度的一类物质，所增加的幅度超过所预期的免疫原单独引起的幅度。

合适的佐剂是本领域技术人员已知的，其说明性示例包括铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾(也称为明矾))、脂质体、病毒体、油包水或水包油乳剂(例如，弗氏不完全佐剂、

和AS03)、3-O-去酰基-4'-单磷酰基脂质A(MPL)和含有MPL的佐剂(例如AS01、AS02和AS04)、toll样受体激动剂(例如，参见Kaczanowska等人，2013，J.Leukoc.Biol.93(6)：847-863，其全部内容通过引用并入本文)、角鲨烯和基于皂角苷的佐剂。基于皂角苷的佐剂包括皂角苷或皂角苷衍生物，例如，其来自皂树(Quillajasaponaria)、人参(Panax ginseng)、三七(Panax notoginseng)、西洋参(Panaxquinquefolium)、桔梗(Platycodon grandiflorum)、远志(Polygala senega)、远志(Polygala tenuifolia)、巴西苦菜(Quillaja brasiliensis)、黄芪(Astragalusmembranaceus)和牛膝(Achyranthes bidentata)。示例性的基于皂角苷的佐剂包括iscoms、iscom基质、ISCOMATRIX^TM佐剂、Matrix M^TM佐剂、Matrix C^TM佐剂、Matrix Q^TM佐剂、

-100佐剂、

-300佐剂、ISCOPREP^TM、ISCOPREP^TM衍生物、包含ISCOPREP^TM或ISCOPREP^TM衍生物的佐剂、QS-21、QS-21衍生物和包含QS-21或QS21衍生物的佐剂。

其他合适的佐剂包括细胞因子、趋化因子和生长因子，其说明性示例包括GM-CSF、白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-5、IL：-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(例如IFN-γ)、转化生长因子(例如TGF-β)、RANTES、MIP1-α、MCP-1、热休克蛋白(例如HSP70)、C型凝集素受体激动剂(例如Mincle、Dectin-1、Dectin-2和CLEC9A)和视黄酸诱导基因I(RIG-1)样受体配体(例如RIG-1和黑色素瘤分化相关基因5(MDA5))和Toll样受体配体或激动剂。合适的Toll样受体配体是本领域技术人员熟悉的，其说明性示例包括单磷酰基脂质A(3-O-去酰基-4'-单磷酰基脂质A；MPL)、细菌脂蛋白、Pam₃CSK₄、聚I：C、聚ICLC、吡喃葡萄糖基脂质A稳定的乳剂和CpG ODN。Toll样受体配体的其他示例在Steinhagen等人(2011，Vaccine，29(17)：3341-3355)中公开，其全部内容通过引用并入本文。

在本文公开的实施方案中，佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、氢氧化磷酸钙、皂角苷、TLR激动剂、CRM197、油包水乳剂、水包油乳剂、弗氏不完全佐剂、MF59、CpG寡核苷酸、iscoms、iscom基质、单磷酰基脂质A((3-O-去酰基-4'-单磷酰基脂质A；MPL)、AS01(基于脂质体的MPL和QS-21的制剂)、AS04(基于脂质体的MPL和氢氧化铝的制剂)、QS-21、QS-21衍生物、含有QS-21或QS21衍生物的佐剂以及上述任意的组合。

在本文公开的实施方案中，佐剂是TLR-4激动剂。在本文公开的一个实施方案中，TLR-4激动剂是单磷酰基脂质A。在本文公开的一个实施方案中，佐剂是Montanide。在本文公开的一个实施方案中，TLR-4激动剂是AS01(一种基于脂质体的MPL和QS-21的制剂)。在本文公开的一个实施方案中，佐剂是AS04(一种基于脂质体的MPL和氢氧化铝的制剂)。在本文公开的另一个实施方案中，佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾。

本文也考虑了在相同疫苗组合物中的两种或更多种佐剂的混合物。本公开还扩展到使用佐剂和/或载体的组合。

在本文公开的一个实施方案中，组合物进一步包含佐剂。

如本文所用，术语“佐剂”通常是指可以增加由免疫原引起的免疫应答的幅度的一类物质，所增加的幅度超过所预期的免疫原单独引起的幅度或不存在佐剂时如本文所述的免疫原-载体缀合物引起的幅度。

合适的佐剂是本领域技术人员已知的。合适的佐剂的非限制性示例包括铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾(也称为明矾))、脂质体、病毒体、油包水或水包油乳剂(例如，弗氏佐剂、

和AS03)、3-O-去酰基-4'-单磷酰基脂质A(MPL)和含有MPL的佐剂(例如AS01、AS02和AS04)和基于皂角苷的佐剂。基于皂角苷的佐剂包括皂角苷或皂角苷衍生物，例如，其来自皂树(Quillaja saponaria)、人参(Panax ginseng)、三七(Panax notoginseng)、西洋参(Panax quinquefolium)、桔梗(Platycodongrandiflorum)、远志(Polygala senega)、远志(Polygala tenuifolia)、巴西苦菜(Quillaja brasiliensis)、黄芪(Astragalus membranaceus)和牛膝(Achyranthesbidentata)。示例性的基于皂角苷的佐剂包括iscoms、iscom基质、ISCOMATRIX^TM佐剂、Matrix M^TM佐剂、Matrix C^TM佐剂、Matrix Q^TM佐剂、

-100佐剂、

-300佐剂、ISCOPREP^TM、ISCOPREP^TM衍生物、包含ISCOPREP^TM或ISCOPREP^TM衍生物的佐剂、QS-21、QS-21衍生物和包含QS-21或QS21衍生物的佐剂。本文所述的疫苗组合物还可与免疫调节剂联合，所述免疫调节剂包括例如细胞因子、趋化因子和生长因子。本文也考虑了在相同疫苗组合物中的两种或更多种佐剂的混合物。

在本文公开的一个实施方案中，佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、氢氧化磷酸钙、皂角苷、弗氏完全佐剂、TLR激动剂、CRM197、

弗氏不完全佐剂、MF59、CpG寡核苷酸、iscoms、iscom基质、ISCOMATRIX^TM佐剂、Matrix M^TM佐剂、Matrix C^TM佐剂、MatrixQ^TM佐剂、

-100佐剂、

-300佐剂、ISCOPREP^TM、ISCOPREP^TM衍生物、包含ISCOPREP^TM或ISCOPREP^TM衍生物的佐剂、单磷酰基脂质A((3-O-去酰基-4'-单磷酰基脂质A；MPL)、AS01(一种基于脂质体的MPL和QS-21的制剂)、AS04(一种基于脂质体的MPL和氢氧化铝的制剂)、QS-21、QS-21衍生物、含有QS-21或QS21衍生物的佐剂、以及上述任意的组合。

在本文公开的实施方案中，佐剂是TLR-4激动剂。在本文公开的一个实施方案中，TLR-4激动剂是单磷酰基脂质A。在本文公开的一个实施方案中，佐剂是Montanide。在本文公开的一个实施方案中，TLR-4激动剂是AS01(一种基于脂质体的MPL和QS-21的制剂)。在本文公开的一个实施方案中，佐剂是AS04(一种基于脂质体的MPL和氢氧化铝的制剂)。

本公开还扩展到佐剂和/或载体的组合的用途。

癌症治疗

如本文其他地方所述，本发明人的令人惊讶地发现，用检查点抗原PD1的B细胞表位的肽序列进行免疫能够引起抗体应答，其中抗体与天然PD1蛋白结合。还令人惊讶地发现，用PD1来源的B细胞表位进行免疫似乎没有引起不良副作用，该不良副作用有时在被动施用针对检查点抗原的抗体时是明显的。因此，本文公开了一种治疗癌症的方法，其特征在于程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的参与，所述方法包括向受试者施用引起对PD1的体液应答的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含有效量的免疫原以诱导抗体应答，其中所述抗体与PD1的B细胞表位结合。

术语“癌症”和“肿瘤”在本文中可互换使用，并且应理解为包括恶性细胞；也称为赘生性细胞、癌细胞或肿瘤细胞。“恶性细胞”是指通过不受控制的细胞增殖而生长的异常细胞，并且其通常在初始生长刺激停止后仍继续生长。

“特征在于PD1的参与的癌症”是指PD1参与在其中的癌症，所述PD1至少部分地参与负责下调针对该癌症的免疫应答的内源性抑制通路。

本领域技术人员将熟悉特征在于PD1参与的癌症类型。说明性示例包括恶性肿瘤，例如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、***癌和唾液腺癌。在一个实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，癌症是黑色素瘤。在另一个实施方案中，所述癌症是胃癌。如本文其他地方所述，本文所述的方法涉及用于治疗特征在于PD1参与的癌症的疫苗组合物。其他说明性示例包括白血病、***瘤、畸胎瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血液癌、皮肤癌、脑癌、***、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、***癌、食管癌、结肠直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、***癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌、肺癌、***癌、结肠癌、子***及其转移。

在一些实施方案中，癌症的特征在于恶性细胞的存在，其中恶性细胞或组织表达或异常表达(例如，过度表达)癌症相关抗原，如本文其他地方所述。优选地，癌症的特征在于癌症相关抗原的表面表达。“异常”或“异常的”表达是指与非恶性或正常细胞中或健康个体中(即，未患有异常或异常的抗原表达相关的疾病的个体中)的状态相比，癌症相关抗原表达被改变，优选增加。在一些实施方案中，癌症相关抗原表达增加是指增加至少10％、优选至少20％、优选至少50％、优选至少100％或更多。在一些实施方案中，癌症相关抗原的异常或异常的表达是指仅在癌细胞或组织上可检测到抗原，而在正常或健康组织中则不可检测到表达。

如本文所述，疫苗组合物被配制用于向有此需要的受试者施用，以提供“有效量”的免疫原；也就是说，有效地引起任何一种或多种具体是治疗效果的量。本领域技术人员通过常规实验，能够确定施用而用于期望结果的有效、无毒的量。通常，如本文公开的疫苗组合物可以以与施用途径和接受者的身体特征(包括健康状况)相兼容的方式施用，并且以这样的方式，其引起一种或多种期望的效果(即治疗效果)。例如，组合物的适当剂量可以取决于多种因素，包括但不限于受试者的身体特征(例如年龄、体重、性别)、该组合物是用作单一试剂还是用作辅助疗法的一部分(例如，如本文其他地方所述，与针对癌症相关抗原的第二免疫原一起)、任何潜在癌症的进展(即病理状态)、以及本领域技术人员可以识别的其他因素。Gennaro(2000，"Remington：The Science and Practice of Pharmacy"，20thedition，Lippincott，Williams，&Wilkins；和Gilman等人(编辑)，(1990)，"Goodman AndGilman's：The Pharmacological Bases of Therapeutics"，Pergamon Press)中讨论了在确定例如组合物的合适剂量时可以考虑的一般考虑因素的其他说明性示例。

考虑到上面概述的一些考虑因素，预期有效量将落入可以通过本领域技术人员已知的方法确定的相对较宽的范围内。

待施用的免疫原的有效量通常在每位受试者约5μg至约1.0mg免疫原的范围内、每位受试者约10μg至约500μg免疫原的范围内、或每位受试者约15μg至约60μg免疫原的范围内。例如，可以通过涉及测量抗原特异性抗体的滴度的标准方法来确定有效量。可以监测本文所述的组合物提供的免疫水平，以确定是否需要加强(如果有)。例如，在评估血清中抗原特异性抗体的滴度之后，通常在首次向受试者中施用组合物后数天或数周，可能需要和/或期望进行任选的加强免疫。

对于本领域技术人员而言显而易见的是，如果需要诱导期望的免疫应答，则可以例如通过施用的形式、途径和部位以及待治疗的具体受试者的性质来确定最佳量和各剂量的间隔，如本文其他地方所描述的。可以使用本领域技术人员已知的常规技术来确定最佳条件。在某些情况下，可能需要对疫苗和/或药物组合物进行几次或多次施用，如本文所述。例如，可将组合物施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。施用可以是约一天间隔至约十二周间隔，并且在某些实施方案中，可以是约一至约四周间隔。可能需要定期重新施用以获得期望的治疗效果，例如减少肿瘤大小和/或降低转移的发生。对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以使用常规的治疗过程或功效或免疫状态确定测试来确定最佳的施用过程。

将理解的是，如本文预期的，“诱导”免疫或抗原特异性抗体应答包括引起或刺激免疫应答和/或增强先前存在的免疫应答，以获得期望的治疗效果，例如减小肿瘤大小、减慢肿瘤生长和/或降低转移的发生。例如，就完全或部分防止转移的发生而言，该作用也可以是预防性的。

如本文所用，术语“施用”或“施用”通常是指将如本文所述的疫苗和/或药物组合物引入患者体内的步骤，以使患者的免疫***对融合蛋白中的肽序列产生应答。如本文所用，“有此需要的受试者”包括已经被诊断出患有癌症的个体。因此，从最广泛的意义上讲，术语“有此需要的患者”涵盖了已经存在需求的个体以及有发展成癌症的风险的个体。

术语“治疗”、“治疗”等在本文中也可互换使用，是指减轻、降低、缓解、改善或以其他方式抑制受试者的癌症发展，包括癌症的一种或多种症状。术语“治疗”、“治疗”等在本文中也可互换使用，是指在可能易患癌症或处于癌症风险中、但是尚未被诊断为患有癌症的受试者中，预防癌症的发生或延迟癌症的发作或随后的进展。在那种情况下，术语“治疗”、“治疗”等可以与术语例如“预防”、“预防的”和“预防性”互换使用。如本文所用，“治疗”癌症的药物理想地将通过消除其根本原因而完全消除疾病，从而在停止施用组合物时，疾病不会再发展，而是保持缓解。如本文所用，“改善”癌症的药物不能消除疾病的根本原因，但可以降低疾病的严重程度，如通过任何已建立的分级***所测量的和/或通过改善患者的健康来测量的，例如减轻疼痛和/或不适感。

本文还考虑了通过使用一种或多种其他治疗剂来治疗癌症的辅助疗法。不受理论或特定应用方式的束缚，通常将理解，如本文所述，第二免疫原的使用可提供增强的免疫应答，用于治疗受试者的癌症。在一个实施方案中，本文公开的方法进一步包括向受试者施用有效量的第二免疫原，以诱导针对除PD1以外的检查点抗原的免疫应答。在一个实施方案中，本文公开的方法进一步包括向受试者施用有效量的第二免疫原，以诱导针对癌症相关抗原的免疫应答。

由第二免疫原诱导的免疫应答可以适当地包括T细胞应答(例如，CTL)、B细胞应答或两者。例如，第二免疫原可以包含除PD1以外的检查点抗原和/或癌症相关抗原的至少一个B细胞表位(和/或其模拟表位)，使得当以有效量施用于受试者时，能够诱导针对检查点抗原和/或癌症相关抗原的抗体(B细胞)应答。在一个实施方案中，向受试者施用有效量的第二免疫原以诱导抗体(B细胞)应答。在一个实施方案中，向受试者施用有效量的第二免疫原，以诱导抗体应答，其中抗体与癌症相关抗原的B细胞表位结合。在另一个实施方案中，向受试者施用有效量的第二免疫原，以诱导抗体应答，其中抗体与PD1以外的检查点抗原的B细胞表位结合。在一个实施方案中，第二免疫原包含PD1以外的检查点抗原和/或癌症相关抗原的至少一个B细胞表位。在另一个实施方案中，第二免疫原包含能够诱导抗体应答的模拟表位，在所述抗体应答中抗体与除PD1以外的检查点抗原和/或癌症相关抗原的B细胞表位结合。

替代地或另外地，第二免疫原可以包含PD1以外的检查点抗原和/或癌症相关抗原的至少一个T细胞表位，使得当以有效量施用于受试者时，其能够诱导针对检查点抗原和/或癌症相关抗原的T细胞(例如CTL)应答。因此，在一个实施方案中，向受试者施用有效量的第二免疫原，以诱导针对PD1以外的检查点抗原的T细胞应答。另一个实施方案中，向受试者施用有效量的第二免疫原，以诱导针对癌症相关抗原的T细胞应答。在一个实施方案中，第二免疫原包含癌症相关抗原的至少一个T细胞表位。在另一个实施方案中，第二免疫原包含PD1以外的检查点抗原的至少一个T细胞表位。

在其他实施方案中，第二免疫原包含至少一个癌症相关抗原的B细胞表位或其模拟表位，和至少一个癌症相关抗原的T细胞表位，使得当以有效量施用于受试者时，其能够诱导针对癌症相关抗原的抗体应答和T细胞应答。所述至少一个T细胞表位和所述至少一个B细胞表位或其模拟表位可以合适地源自相同的癌症相关抗原，使得当以有效量向受试者施用第二免疫原时，其能够诱导针对相同的癌症相关抗原的抗体应答和T细胞应答。备选地或另外地，所述至少一个T细胞表位和所述至少一个B细胞表位或其模拟表位可以合适地源自不同的癌症相关抗原，使得当以有效量向受试者施用第二免疫原时，其能够诱导针对不同的癌症相关抗原的抗体应答和T细胞应答。

PD1以外的合适的检查点抗原是本领域技术人员熟悉的，其说明性示例由Pardoll(2012,Nature Reviews Cancer 12：252-64)讨论了。合适的检查点抗原的其他说明性示例包括CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原-4)及其配体CD80和CD86；PD-L1(程序性细胞死亡配体1)、PD-L2(程序性细胞死亡配体2)、LAG-3(淋巴细胞激活基因-3)及其配体MHC I类或II类、TIM-3(T细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3)及其配体GAL-9、B和T淋巴细胞减毒株(BTLA)及其配体疱疹病毒进入介体(HVEM)以及其他，例如Nirschl&Drake(2013Clin Cancer Res 19：4917-24)所讨论的。在本文公开的实施方案中，PD1以外的检查点抗原选自PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、OX40、OX40L、TIM-3和GAL-9。

术语“检查点抗原”应理解为是指参与免疫***功能的内源性抑制通路的抗原，例如那些维持自我耐受并调节对抗原刺激的免疫应答的持续时间和程度的抗原。

术语“癌症相关抗原”、“与癌症相关的抗原”、“肿瘤相关抗原”、“肿瘤抗原”、“癌症抗原”等在本文中可互换使用，是指在癌细胞或组织中异常表达的抗原。在一些实施方案中，抗原可以在有限数量的组织和/或器官中或在特定的发育阶段中在正常条件下表达。例如，抗原可以在正常条件下在胃组织中特异性表达，并且在一种或多种癌细胞中表达或异常表达(例如，过度表达)。不论癌症的起源如何，抗原的表达都可以在癌细胞或组织中重新激活。在一些实施方案中，癌症相关抗原包括分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗原(即，在正常条件下在某些细胞类型中在某些分化阶段特异性表达的蛋白质)、癌/睾丸抗原(即，在正常情况下在睾丸中有时在胎盘中特异性表达的蛋白质)和种系特异性抗原。

在一个实施方案中，与癌症有关的抗原在癌细胞的细胞表面上表达，并且优选在正常细胞和组织上不表达或仅很少表达。优选地，抗原或抗原的异常表达鉴定癌细胞，优选肿瘤细胞。在一些实施方案中，在受试者(例如，患有癌症的患者)中的癌细胞表达的抗原是自身蛋白。但是，应当理解，通常在正常条件下在携带抗原的受试者(通常是没有癌症的健康患者)中没有见到可检测水平的针对抗原的自身抗体，或者仅存在低于阈值浓度的量的自身抗体，该阈值浓度是损伤携带抗原的组织或细胞所必需的。合适的癌症相关抗原是本领域技术人员已知的，其说明性示例包括EGFR(例如，Her2/neu，Her-1)、BAGE(B黑色素瘤抗原)、CEA(癌胚抗原)、Cpg(胞嘧啶-磷酸二酯鸟嘌呤)、Gp100(糖蛋白100)、h-TERT(端粒酶转录酶)、MAGE(黑色素瘤抗原编码基因)、Melan-A(T细胞识别的黑色素瘤抗原)和MUC-1(粘蛋白-1)。因此，在一个实施方案中，癌症相关抗原选自EGFR(例如，Her2/neu，Her-1)、BAGE(B黑色素瘤抗原)、CEA(癌胚抗原)、CpG(胞嘧啶磷酸二酯鸟嘌呤)、Gp100(糖蛋白100)、h-TERT(端粒酶转录酶)、MAGE(黑色素瘤抗原编码基因)、Melan-A(T细胞识别的黑色素瘤抗原)和MUC-1(粘蛋白-1)。还应理解，通过本文公开的方法产生的疫苗组合物的靶抗原的选择通常取决于疫苗组合物的预期用途。例如，如果疫苗组合物旨在治疗患有乳腺癌的受试者，那么抗原通常是与乳腺癌相关的抗原(例如，由乳腺癌过度表达的抗原)。与乳腺癌症相关的抗原的合适示例是本领域技术人员熟悉的，其说明性示例包括表皮生长因子受体Her2/neu和Her1。

在一些实施方案中，PD1以外的检查点抗原和/或癌症相关抗原的氨基酸序列在正常组织中表达的抗原与在癌细胞或组织中表达的抗原之间是相同的。在其他实施方案中，与将在正常组织或细胞中表达的天然抗原的氨基酸序列相比，PD1以外的检查点抗原和/或癌症相关抗原的氨基酸序列在其氨基酸序列中包含突变。

还应理解，如本文所述，第二免疫原通过引起对PD1以外的检查点抗原和/或癌症相关抗原的免疫应答来改善疫苗组合物功效的能力不需要第二免疫原与PD1靶向的免疫原一起存在于疫苗组合物中，或者不需要第二免疫原与PD1靶向的免疫原同时施用给有此需要的受试者。因此，可以在施用PD1靶向的免疫原之前或之后施用本文所述的第二免疫原，其中可以优化施用PD1靶向的免疫原与施用第二免疫原之间的时间期间，以提供期望的协同或累加效果。

术语“正常组织”或“正常条件”通常指健康组织或健康受试者的条件；即非病理性条件，其中“健康”优选地是指非致瘤的或非癌的。

术语“特异性表达”通常是指抗原仅或主要在特定组织或器官中表达。例如，在乳腺组织中特异性表达的抗原是指该抗原主要在乳腺组织中表达，而在其他组织中不表达，或者在其他组织或器官中不以显著的程度表达。因此，专门在乳腺组织的细胞中表达、而在其他任何组织(例如胃粘膜)中的表达显著较少的抗原，是在乳腺组织的细胞中特异性表达。在一些实施方案中，抗原还可以在正常条件下在多于一种的组织类型或器官(例如，2、3、4、5、6或更多种)组织类型或器官中特异性表达。例如，如果癌症相关抗原在正常条件下在乳腺和胃组织中以大致相等的程度表达，则认为该抗原在乳腺和胃组织中特异性表达。

如本文所用，术语“自体蛋白”是指由受试者的基因组编码的蛋白，其在正常条件下(即，非病理条件下)任选地在某些正常组织类型或某些发育阶段表达。

本文还考虑了治疗特征在于PD1参与的癌症的方法，其中将本文公开的疫苗组合物与一种或多种特异性靶向癌症的其他治疗剂一起(同时或相继)施用。因此，在另一个实施方案中，该方法还包括向受试者施用一种或多种特异性靶向恶性细胞的其他治疗剂。

在另一个实施方案中，本文所述的疫苗组合物还包含一种或多种特异性靶向恶性细胞的其他治疗剂或化合物。合适的其他治疗剂是本领域技术人员已知的，其说明性示例包括与检查点抗原和/或癌症相关抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段。因此，在一个实施方案中，本文公开的方法进一步包括向受试者施用如本文其他地方所述的与癌症相关抗原特异性结合的抗体，或其抗原结合片段。在又一个实施方案中，本文公开的方法进一步包括向受试者施用如本文其他地方所述的与检查点抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段与PD1以外的检查点抗原特异性结合。备选地或另外地，抗体或抗原结合片段与PD1特异性结合。

在本公开的另一方面，提供了疫苗组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症的特征在于PD1的参与，其中所述疫苗组合物包含有效量的免疫原，用于诱导抗体应答，其中，如本文所述，所述抗体与PD1的B细胞表位结合。

在本公开的另一方面，提供了用于治疗癌症的疫苗组合物，所述癌症的特征在于PD1的参与，其中所述疫苗组合物包含有效量的免疫原，用于诱导抗体应答，其中，如本文所述，所述抗体与PD1的B细胞表位结合。

在本公开的另一方面，提供了一种用于引起对PD1的体液应答的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含有效量的免疫原，用于诱导抗体应答，其中，如本文所述，所述抗体与PD1的B细胞表位结合。

在一个实施方案中，本文所述的疫苗药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。合适的药学上可接受的赋形剂(例如载体、稀释剂等)是本领域技术人员知道的。例如，可以使用多种水性(药学上可接受的)赋形剂，例如缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行无菌过滤。可以将所得的水性溶液原样包装或冻干包装，备用，在施用前将冻干制剂与无菌溶液组合。所述组合物还可包含为接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、蔗糖或其他碳水化合物等。制备肠胃外施用的化合物的合适方法对于本领域技术人员而言是已知的或显而易见的，并且在例如A.Gennaro(2000)"Remington：The Science and Practice of Pharmacy"，第20版，Lippincott，Williams，&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人，eds 7.sup.th ed.，Lippincott，Williams，&Wilkins；以及Handbook ofPharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人编辑3.sup.rded.Amer.Pharmaceutical Assoc.中详细描述了。

疫苗组合物可以制备成适于肠胃外施用的形式(例如，皮下、肌内或静脉内注射)或适于通过吸入施用(例如鼻内吸入或口内吸入)的气雾形式。

本文所述的疫苗组合物也可以在试剂盒中提供。试剂盒可包含有助于实施本文所述方法的其他组分，例如一种或多种施用装置、一种或多种赋形剂、一种或多种载体和/或一种或多种稀释剂。试剂盒可包含用于容纳各种组分的容器以及在此类方法中使用试剂盒组分的说明书。

在本文公开的实施方案中，疫苗组合物还包含有效量的第二免疫原，用于诱导针对PD1以外的检查点抗原和/或癌症相关抗原的免疫应答，如本文其他地方所述。

在另一个实施方案中，疫苗组合物还包含与检查点抗原和/或癌症相关抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，如本文其他地方所述。

在另一个实施方案中，疫苗组合物还包含一种或多种特异性靶向恶性细胞的其他治疗剂，如本文其他地方所述。

癌症相关抗原

为了改善本文公开的肽表位在治疗特征在于PD1参与的病症(其中该病症是癌症)中的功效，疫苗组合物可以进一步包含至少一种癌症相关抗原的B细胞表位和/或模拟表位。

在本文公开的实施方案中，疫苗组合物还包含至少一种癌症相关抗原的B细胞表位和/或模拟表位，使得肽表位和至少一种癌症相关抗原的B细胞表位和/或模拟表位存在于相同的组合物中。然而，应理解的是，至少一种癌症相关抗原的B细胞表位和/或模拟表位通过引起针对癌症相关抗原的抗体应答来改善本文公开的肽表位的功效的能力，并不需要使至少一种癌症相关抗原的B细胞表位和/或模拟表位存在于具有肽表位的疫苗组合物中，或者不需要同时施用于有此需要的受试者。因此，在一些实施方案中，如本文其他地方所述，可以在施用肽表位之前或之后施用至少一种癌症相关抗原的B细胞表位和/或模拟表位，其中可优化施用疫苗组合物和施用至少一种癌症相关抗原的B细胞表位和/或模拟表位之间的时间期间，以提供期望的协同或累加作用。

如本文其他地方指出的，术语“癌症相关抗原”、“与癌症相关的抗原”、“肿瘤相关抗原”、“肿瘤抗原”、“癌症抗原”等在本文中可互换使用，是指在癌细胞或组织中异常表达的抗原。在一些实施方案中，抗原可以在有限数量的组织和/或器官中或在特定的发育阶段中在正常条件下表达。例如，抗原可以在正常条件下在胃组织中特异性表达，并且在一种或多种癌细胞中表达或异常表达(例如，过度表达)。不论癌症的起源如何，抗原的表达都可以在癌细胞或组织中重新激活。在一些实施方案中，癌症相关抗原包括分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗原(即，在正常条件下在某些细胞类型中在某些分化阶段特异性表达的蛋白质)、癌/睾丸抗原(即，在正常情况下在睾丸中有时在胎盘中特异性表达的蛋白质)和种系特异性抗原。在一个实施方案中，与癌症有关的抗原在癌细胞的细胞表面上表达，并且优选在正常细胞和组织上不表达或仅很少表达。优选地，抗原或抗原的异常表达鉴定癌细胞，优选肿瘤细胞。在一些实施方案中，在受试者(例如，患有癌症的患者)中的癌细胞表达的抗原是自身蛋白。但是，应当理解，通常在正常条件下在携带抗原的受试者(通常是没有癌症的健康患者)中没有可检测水平的针对抗原的自身抗体，或者仅存在低于阈值浓度的量的自身抗体，该阈值浓度是损伤携带抗原的组织或细胞所必需的。

在一些实施方案中，癌症相关抗原的氨基酸序列在正常组织中表达的抗原与在癌细胞或组织中表达的抗原之间是相同的。在其他实施方案中，与将在正常组织或细胞中表达的癌症相关抗原的氨基酸序列相比，癌症相关抗原在其氨基酸序列中包含突变。

应当理解，本文描述的方法适用于生产用于治疗任何癌症的疫苗组合物，只要认为该癌症可通过由PD1肽表位诱导的靶向抗体应答单独治疗、或者可通过由PD1肽表位诱导的靶向抗体应答与至少一种癌症相关抗原的B细胞表位和/或模拟表位诱导的靶向抗体应答组合治疗，如本文所述。合适的癌症的说明性示例包括白血病、***瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血液癌、皮肤癌、脑癌、***、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、***癌、食管癌、结肠直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、***癌、子宫癌、卵巢癌、肺癌、肺癌、***癌、结肠癌、肾细胞癌、子***及其转移。

如本文所用，术语“模拟表位”通常是指具有构象的分子，该构象具有与其模拟的B细胞表位等同的拓扑结构，并且所述分子结合抗体的抗原结合区，该抗体的抗原结合区与免疫特异性结合所述B细胞表位的抗体的抗原结合区相同。模拟表位将在宿主中引发免疫应答，该宿主对该模拟表位模拟的抗原具有反应性。

癌症相关抗原的模拟表位优选是抗原多肽，其氨基酸序列不同于天然癌症相关抗原的氨基酸序列。模拟表位不仅可以包含天然癌症相关抗原的一个或多个天然存在的氨基酸残基的氨基酸取代，而且可以包含一个或多个非天然氨基酸(即，不是来自20个“经典”氨基酸)的氨基酸取代，或者其可以完全是这种非天然氨基酸组装的。合适的模拟表位可以从可商购的肽库中提供。优选地，这些模拟表位的长度为至少7个氨基酸(例如，长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多个氨基酸)。优选的长度可以是多达16个，优选地多达14或20个氨基酸(例如5至16个氨基酸残基)。也可以使用更长的模拟表位。在一个实施方案中，模拟表位可以是多肽的一部分，因此在其N-末端和/或C-末端包含至少一个其他氨基酸残基。

药物组合物

在本公开的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的疫苗组合物和药学上可接受的赋形剂。

合适的药学上可接受的赋形剂(例如载体、稀释剂等)是本领域技术人员知道的。例如，可以使用多种水性(药学上可接受的)赋形剂，例如缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行无菌过滤。可以将所得的水性溶液原样包装或冻干包装，备用，在施用前将冻干制剂与无菌溶液组合。所述组合物还可包含为接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、蔗糖或其他碳水化合物等。制备肠胃外施用的化合物的合适方法对于本领域技术人员而言是已知的或显而易见的，并且在例如A.Gennaro(2000)"Remington：The Science and Practice of Pharmacy"，第20版，Lippincott，Williams，&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人，eds 7.sup.th ed.，Lippincott，Williams，&Wilkins；以及Handbook ofPharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人编辑3.sup.rded.Amer.Pharmaceutical Assoc.中详细描述了。

药物组合物可以是适于肠胃外施用的形式(例如，皮下、肌内或静脉内注射)或适于通过吸入施用(例如鼻内吸入或口内吸入)的气雾形式。

本文所述的药物组合物也可以在试剂盒中提供。试剂盒可包含有助于实施本文所述方法的其他组分，例如一种或多种施用装置、一种或多种赋形剂、一种或多种载体和/或一种或多种稀释剂。试剂盒可包含用于容纳各种组分的容器以及在此类方法中使用试剂盒组分的说明书。

在本文公开的实施方案中，所述药物组合物还包含如本文所述的检查点抗原或检查点抑制剂。

用途和治疗方法

在本公开的另一方面，提供了一种治疗特征在于PD1参与的病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用本文所述的疫苗组合物或本文所述的药物组合物。

本发明还扩展到如本文所述的疫苗组合物在制备用于治疗有此需要的受试者中特征在于PD1参与的病症的药物中的用途。

本公开还扩展到如本文所述的疫苗组合物或如本文所述的药物组合物，用于治疗有此需要的受试者中特征在于PD1参与的病症。

本领域技术人员熟悉特征在于PD1参与的病症的类型，其说明性示例包括自身免疫、癌症、慢性病毒感染和移植排斥。在一个实施方案中，特征在于PD1参与的病症是癌症。说明性示例包括恶性肿瘤，例如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、***癌和唾液腺癌。在一个实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，癌症是黑色素瘤。在另一个实施方案中，癌症是胃癌。

如本文所述，疫苗或药物组合物通常以“有效量”施用；也就是说，有效地引起任何一种或多种特别是治疗效果的量。本领域技术人员通过常规实验，能够确定用于期望的结果的待施用的有效、无毒的量。通常，如本文公开的疫苗和/或药物组合物可以以与施用途径和接受者的身体特征(包括健康状况)相兼容的方式施用，并且以这样的方式，其引起一种或多种期望的效果(即治疗效果)。例如，组合物的适当剂量可以取决于多种因素，包括但不限于受试者的身体特征(例如年龄、体重、性别)、该组合物是用作单一试剂还是用作辅助疗法的一部分(例如，与检查点抗原或检查点抑制剂一起)、任何潜在癌症的进展(即病理状态)、以及本领域技术人员可以识别的其他因素。Gennaro(2000，"Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy"，第20版，Lippincott，Williams，&Wilkins；和Gilman等人(编辑)(1990)，"Goodman And Gilman's：The Pharmacological Bases of Therapeutics"，Pergamon Press)中讨论了在确定例如组合物的合适剂量时可以考虑的一般考虑因素的其他说明性示例。

考虑到上面概述的一些考虑因素，预期有效量将落入可以通过本领域技术人员已知的方法确定的相对较宽的范围内。

待施用的肽表位的有效量通常在每位受试者约5μg至约5.0mg肽序列的范围内、优选每位受试者约500μg至约5.0mg肽表位的范围内、优选每位受试者约10μg至约500μg肽表位的范围内、或者每位受试者约15μg至约60μg肽表位的范围内。例如，可以通过涉及测量抗原特异性抗体的滴度的标准方法来确定有效量。可以监测本文所述的组合物提供的免疫水平，以确定是否需要加强(如果有)。例如，在评估血清中抗原特异性抗体的滴度之后，通常在首次向受试者中施用组合物后数天或数周，可能需要和/或期望进行任选的加强免疫。如本文其他地方所述，使用混杂的Th细胞表位可以增强由本文所述的免疫原引起的抗体应答，因此，可能需要较低剂量的免疫原。当免疫原包含混杂的Th细胞表位时，可以将免疫原以每位受试者约5μg至约5.0mg免疫原的范围施用给受试者，优选每位受试者约500μg至约5.0mg免疫原的范围，或者优选每位受试者约1mg至约5mg免疫原的范围。

如本文所述的疫苗和/或药物组合物可以分离地或与其他治疗剂组合施用给有此需要的受试者；也就是说，作为辅助疗法的一部分。在辅助治疗的情况下，施用可以是同时或相继施用；即，首先施用疫苗和/或药物组合物，然后施用其他治疗剂和/或预防剂，或者在施用其他治疗剂后施用疫苗和/或药物组合物。因此，在将两种或更多种实体“联合”施用给受试者的情况下，它们可以同时以单一组合物施用、或以分开的组合物同时施用、或以分开的组合物在分开的时间施用。

另外的治疗剂可以包含检查点抑制剂。如本文其他地方所指出的，术语“检查点抗原”通常是指参与免疫***功能的内源性抑制通路的抗原，例如那些维持自我耐受性并调节对抗原刺激的免疫应答的持续时间和程度的抗原。然而，研究表明，检查点抗原会降低宿主对癌症的免疫应答的效率，从而导致肿瘤生长(参见，Nirschl&Drake，2013，Clin CancerRes 19：4917-24)。合适的检查点抗原是本领域技术人员熟悉的，其说明性示例由Pardoll(2012，Nature Reviews Cancer 12：252-64)讨论。合适的检查点抗原的其他说明性示例包括CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原-4)及其配体CD80和CD86；PD-L1(程序性细胞死亡配体1)、PD-L2(程序性细胞死亡配体2)、LAG-3(淋巴细胞激活基因-3)及其配体MHC I类或II类、TIM-3(T细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3)及其配体GAL-9、B和T淋巴细胞减毒株(BTLA)及其配体疱疹病毒进入介体(HVEM)以及其他，例如Nirschl&Drake(2013 Clin Cancer Res 19：4917-24)所讨论的。

疫苗组合物可以靶向多种抗原；也就是说，可以靶向除PD1以外的多种抗原。例如，肽表位可以进一步包含一种或多种癌症相关抗原的一个或多个B细胞表位和/或模拟表位，使得肽表位在施用时将诱导对PD1和一种或多种癌症相关抗原(例如2、3、4、5、6、7或更多种癌症相关抗原)的抗体应答。在又一个实施方案中，肽表位包含一种或多种其他检查点抗原(PD1除外)的一个或多个B细胞表位和/或模拟表位，使得所述肽表位在施用时将诱导针对一种或多种其他检查点抗原(例如，PD1以外的1、2、3、4、5、6、7或更多种其他检查点抗原)的抗体应答。

因此，在一个实施方案中，本文公开的方法进一步包括向受试者施用与癌症相关抗原特异性结合的抗体，或其抗原结合片段。在一个实施方案中，癌症相关抗原选自Her2/neu、Her-1、B黑色素瘤抗原(BAGE)、癌胚抗原(CEA)、胞嘧啶磷酸二酯鸟嘌呤(CpG)、糖蛋白100(Gp100)、端粒酶转录酶(h-TERT)、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、T细胞识别的黑色素瘤抗原(Melan-A)和粘蛋白-1(MUC-1)。

在一个实施方案中，在施用疫苗组合物之后将抗体或其抗原结合片段施用给受试者。

对于本领域技术人员而言显而易见的是，如果需要诱导期望的免疫应答，则可以例如通过施用的形式、途径和部位以及待治疗的具体受试者的性质来确定最佳量和各剂量的间隔，如本文其他地方所描述的。可以使用本领域技术人员已知的常规技术来确定最佳条件。

在某些情况下，可能需要对疫苗和/或药物组合物进行几次或多次施用，如本文所述。例如，可将组合物施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。施用可以是约一天间隔至约十二周间隔，并且在某些实施方案中，可以是约一至约四周间隔。可能需要定期重新施用以获得期望的治疗效果，例如减少肿瘤大小和/或降低转移的发生。对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以使用常规的治疗过程或功效或免疫状态确定测试来确定最佳的施用过程。

将理解的是，如本文预期的，“诱导”免疫或抗原特异性抗体应答包括引起或刺激免疫应答和/或增强先前存在的免疫应答，以获得期望的治疗效果，例如减小肿瘤大小、减慢肿瘤生长和/或降低转移的发生。例如，就完全或部分防止转移的发生而言，该作用也可以是预防性的。

如本文所用，术语“施用”或“施用”通常是指将如本文所述的疫苗和/或药物组合物引入患者体内的步骤，以使患者的免疫***对肽表位中的肽序列产生应答。如本文所用，“有此需要的受试者”包括已经被诊断出患有癌症的个体。因此，从最广泛的意义上讲，术语“有此需要的患者”涵盖了已经存在需求的个体以及有发展成癌症的风险的个体。

如本文所用，“治疗”癌症的药物理想地将通过消除其根本原因而完全消除疾病，从而在停止施用组合物时，疾病不会再发展，而是保持缓解。如本文所用，“改善”癌症的药物不能消除疾病的根本原因，但可以降低疾病的严重程度，如通过任何已建立的分级***所测量的和/或通过改善患者的健康来测量的，例如减轻疼痛和/或不适感。

本文提及的所有专利、专利申请和出版物均通过引用全文并入本文。

本领域技术人员将理解，本文描述的发明除了具体描述的那些之外还可以进行变化和修改。应当理解，本发明包括落入本发明的精神和范围内的所有这样的变化和修改。本发明还包括单独地或共同地在本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或更多个的任何和所有组合。

现在将参考以下实施例描述本发明的某些实施方案，这些实施例仅出于说明的目的，并不意图限制上述一般性的范围。

如本文其他地方所述，本文所述的疫苗组合物可以分离地或与一种或多种其他治疗剂组合地施用于有此需要的受试者；也就是说，作为辅助疗法的一部分。在辅助治疗的情况下，施用可以是同时或相继施用；即，首先施用疫苗组合物，然后施用一种或多种其他治疗剂，或者在施用其他治疗剂后施用疫苗组合物。因此，在将两种或更多种实体“联合”施用给受试者的情况下，它们可以同时以单一组合物施用、或以分开的组合物同时施用、或以分开的组合物在分开的时间施用。

本文提及的所有专利、专利申请和出版物均通过引用全文并入本文。

本领域技术人员将理解，本文描述的发明除了具体描述的那些之外还可以进行变化和修改。应当理解，本发明包括落入本发明的精神和范围内的所有这样的变化和修改。本发明还包括单独地或共同地在本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或更多个的任何和所有组合。

现在将参考以下实施例描述本发明的某些实施方案，这些实施例仅出于说明的目的，并不意图限制上述一般性的范围。

实施例

实施例1–小鼠PD1(mPD1)B细胞表位的鉴定和体外表征

A.重叠肽的产生和表达

为了测试针对PD1的免疫在体内对肿瘤生长的功效，进行了实验以鉴定作为人PD1表位替代物或其模拟表位的小鼠PD1表位，这将允许随后在同基因小鼠肿瘤模型中进行测试，如下文实施例3中概述。

将对应于小鼠PD-1的胞外结构域的蛋白质序列(Q02242；Uniprot)电反翻译为DNA序列(ATG：Biosynthetics GmbH；Merzhausen，Germany)。将编码蛋白质的DNA序列分成作为重叠肽的均匀大小的肽-CDS，长度15个氨基酸(aa)，3个aa偏移(offset)，并将所得的DNA序列***表达载体pEPX-1(ATG：Biosynthetics GmbH；Merzhausen，Germany)。将DNA序列***到谷胱甘肽S-转移酶(GST)编码基因的下游，在诱导后产生包含融合到单个重叠肽的N-末端的GST(26kDa)的蛋白质。表达载体用于转化大肠杆菌BL21菌株。从补充有卡那霉素的平板中挑选出带有表达载体的大肠杆菌菌落(克隆)，并通过菌落印迹测定法进行筛选。还挑选了带有表达载体的菌落，在表达载体中没有***物(即对照)。

B.菌落印迹测定法用于检测表达特异性重叠肽的克隆

将感兴趣克隆复制到硝酸纤维素膜上，并用裂解液(Tris-HCl pH 8.0 50mM，溶菌酶200μg/ml)裂解，然后在-80℃冷冻并在37℃解冻三个循环。解冻的最后一步后，将膜与含有PBS-5％脱脂乳的封闭溶液一起孵育。丢弃封闭溶液，将膜与大鼠抗小鼠PD1单克隆抗体(mAb)(Biolegend，克隆29F.1A12)在室温孵育2小时。然后将膜用0.0.5％的PBS-Tween洗涤3次，并在室温下与缀合有碱性磷酸酶的二抗山羊抗大鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology)一起孵育2h。经过如上所述的额外洗涤后，使用底物溶液“1-Step NBT/BCIP”(ThermoScientific)显影信号。下列PD1 B细胞表位被鉴定为对大鼠抗小鼠PD1单克隆抗体具有反应性：

ISLHPKAKIEESPGA(小鼠PD1(mPD1)的氨基酸残基126-140；Uniprot编号：Q02242；SEQ ID NO：119)。

C.斑点印迹测定法用于检测细菌裂解物中的B细胞表位

表达B细胞表位候选物的克隆的细菌培养物用于制备细菌裂解物的细胞质级分和总级分。将细菌培养物的两等份离心，并如上所述裂解细菌沉淀。将裂解的细菌进一步离心，然后将上清液用作细胞质级分，或者将裂解的细菌直接用作总级分。

将检查的裂解物点到硝酸纤维素膜上，用于斑点印迹测定法。用PBS-2％脱脂乳封闭膜后，使膜与单克隆抗体(mAb)反应，该单克隆抗体已在菌落印迹测定法中用于检测阳性克隆，其余的检测步骤也与菌落印迹测定法相似。

D.纯化GST融合的B细胞表位以进行下游表征

使用新鲜制备的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，含10mM还原型谷胱甘肽)、使用5ml谷胱甘肽琼脂糖4B(GSTrap；GE Healthcare)，将含有GST融合的感兴趣B细胞表位的0.22μm过滤的细胞质级分用于纯化。通过如上所述的斑点印迹分析检查洗脱的材料，并通过SDS-PAGE分析显示材料的纯度。

E.SDS-Page分析

将一部分纯化的GST-B细胞表位与NuPage LDS样品缓冲液和NuPAGE还原剂(Thermo Scientific)组合，在200电压下于NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶中电泳35分钟。然后使用Simply Blue Safe Stain(Thermo Scientific)对凝胶染色。结果如图8所示。

F.竞争性ELISA

竞争性ELISA用于检查已鉴定的B细胞表位抑制抗小鼠PD1 mAb与用作包被抗原的重组小鼠PD1结合的能力，向其上施加含有不同浓度的模拟表位和mAb的预孵育的混合物。使用二抗小鼠抗大鼠IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch Laboratories；缀合HRP)，并使用TMB染色进行检测(ELISA OD值，450nm)，检测了与包被的重组mPD1结合的抗小鼠PD-1mAb。结果如图9所示。

G.表达PD1的T细胞系

为了产生表达小鼠PD-1的T细胞，如先前所述培养Jurkat E6.1NF-κB：：eGFP报告T细胞系和K562刺激物细胞系(Battin等人，PLoS One，2017,12(5)：e0178220；PMID：28542462)。先前已经描述了表达小鼠PD-1的JE6.1 NF-kB：：eGFP报告细胞(Jutz等人，Oncotarget，2017，8(39)：64892-64906；PMID：29029399)。通过逆转录病毒转导CD5L-OKT3scFv-CD14构建体(其编码与人CD14融合的抗人CD3单链片段)，产生基于K562细胞系(K562S)的T细胞刺激细胞(Leitner等人，J.Immunol.Methods，2010，362(1-2)：131-141；PMID：20858499)。K562S通过连接它们的TCR-CD3复合物来刺激人T细胞和T细胞系。为了从报告细胞中分离刺激细胞，对K562S进行了工程化，使其组成型表达红色荧光蛋白(RFP)。建立单细胞克隆以确保各个分子的均匀和可比较的表达。为了确认各个分子的细胞表面表达，使用了来自Biolegend(San Diego，CA)的PE缀合的抗mPD-1抗体(29F.1A12)。用PE缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)检测K562S细胞上的膜结合抗CD3片段。使用FACS Calibur和CellQuest软件(均为BD Biosciences，SanJose，CA)进行流式细胞术数据的获取。使用FlowJo软件(版本10.0.8，Tree Star，Ashland，OR)和Graphpad Prism(版本5，GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA)分析数据。

H.建立肿瘤移植Balb/C小鼠

没有转染的小鼠乳腺癌细胞(D2F2)或转染Her-2并稳定表达的小鼠乳腺癌细胞(D2F2/E2)用于建立涉及小鼠在2-3周内发展出肿瘤的体内环境，并评估小鼠PD1 B细胞表位在肿瘤进展中的作用。将雌性Balb/C小鼠(Charles River，Sulzfeld，德国；送到时6-8周龄)移植有不同数量的细胞：

A组：0.5xE6/D2F2细胞/小鼠s.c.(n＝4)

B组：1xE6/D2F2细胞/小鼠s.c.(n＝4)

C组：2xE6/D2F2细胞/小鼠s.c.(n＝4)

D组：0.5xE6/D2F2/E2细胞/小鼠s.c.(n＝4)

E组：1xE6/D2F2/E2细胞/小鼠s.c.(n＝4)

F组：2xE6/D2F2/E2细胞/小鼠s.c.(n＝4)

在实验期间和处死小鼠后测量肿瘤的大小，结果显示在研究期间肿瘤大小显著增加。

实施例2-在小鼠PD1 B细胞表位JT-mPD1(SEQ ID NO：119)的存在下，抗mPD1单克隆抗体与mPD1的结合被抑制。

使用mPD1阳性的Jurkat T细胞，在基于细胞的测定法中检查了JT-mPD1抑制抗小鼠PD1 mAb结合的能力(参见实施例1G)。对抗小鼠PD1 mAb单独、以及与不同浓度的JT-mPD1预孵育后进行了测试。在不存在JT-mPD1的情况下，抗mPD1 mAb的最大结合是明显的。在JT-mPD1的存在下，这种结合活性被剂量依赖性地抑制(参见图3和图5)。

实施例3–Balb/C小鼠的免疫和对mPD1的体液和细胞应答的表征

Balb/C雌性小鼠(Charles River，Sulzfeld，德国；送到时为6-8周龄)用于实验环境中，包括腹膜内施用CRM缀合的B细胞表位(Provepharm)与作为佐剂的明矾(Alum)。用NaCl溶液稀释缀合的PD1 B细胞表位，并在注射前与明矾混合。以3周间隔进行六次免疫，并在每次免疫前和最后一次免疫后三周(当处死小鼠时)采集血样。免疫实验包括初始

小鼠(n＝4)、用50μg CRM(n＝6)、10μg mPD1 B细胞表位-CRM缀合物(n＝6)或50μg mPD1-B细胞表位-CRM缀合物(n＝6)免疫的小鼠的组。简而言之，小鼠在第1天接受腹膜内第一剂量的单独的CRM或mPD1 B细胞表位-CRM缀合物(10μg或50μg)。单独的CRM或mPD1 B细胞表位-CRM缀合物的后续剂量在第21天(第2剂量)、第42天(第3剂量)、第63天(第4剂量)和第84天(第5剂量)施用。从小鼠采集血样在第0天(预采血-BA0)、第41天(BA1)、第62天(BA2)、第83天(BA3)和第104天(BA4)进行。在第105天处死动物。

用mPD1 B细胞表位-CRM缀合物免疫的小鼠对mPD1-CRM缀合物显示出明确的抗体应答，如抗mPD1 IgG抗体在第0天的首次免疫后的41天(BA1)、62天(BA2)、83天(BA3)和104天(BA4)的滴度增加所说明的(图4)。单独的CRM或mPD1 B细胞表位-CRM缀合物免疫的小鼠未显示不良副作用、体重变化或任何炎症体征。

实施例4-针对JT-mPD1产生的特异性IgG抗体在体外阻断mPD1/mPDL1的相互作用

研究了mPD1 B细胞表位(SEQ ID NO：119；JT-mPD1)，以检查针对该肽产生的抗体是否可以结合天然mPD1并抑制其与小鼠PDL1的相互作用。

简而言之，通过皮下施用200μg缀合至钥孔戚血蓝蛋白(KLH)的mPD1 B细胞表位(JT-mPD1)，然后以三周间隔进行三个额外的给药，对兔(Charles River(法国))进行免疫。在第四次也是最后一次给药后两周处死兔子。从免疫的兔血清(Squarix(德国))中分离总的和JT-PD1特异性IgG。

使用表达重组mPD1的人Jurkat T细胞在细胞测定法中检查分离的抗JT-mPD1 IgG与表达mPD1的T细胞结合的能力。将细胞与单独的抗小鼠PD1 mAb一起孵育，或者在与递增浓度的JT-mPD1肽预孵育后与抗小鼠PD1 mAb一起孵育。如图5所示，在没有JT-mPD1 IgG的情况下，抗小鼠PD1 mAb与重组mPD1阳性(mPD1+)Jurkat T细胞的最大结合是明显的，而与JT-mPD1的预孵育，则剂量依赖性地抑制了抗小鼠PD1 mAb与mPD1+Jurkat T细胞的结合(图5)。

进一步研究了mPD1 B细胞表位(JT-mPD1；SEQ ID NO：119)，以确定针对该肽产生的抗体是否可以与mPD1结合并抑制mPD1与其配体(小鼠PDL1)的相互作用。如图6A所示，抗JT-mPD1 IgG不与对照(mPD1阴性)Jurkat细胞结合，而抗JT-mPD1 IgG剂量依赖性地与mPD1+Jurkat细胞结合。这些数据证实了针对JT-mPD1产生的抗体的特异性及其与T细胞上的天然mPD1结合的能力。当将抗JTmPD1 IgG的结合与抗mPD1 mAb的结合进行比较时，注意到明显地与抗mPD1 mAb的结合更强(图6A)。

还使用竞争性ELISA检查了抗JT-mPD1 IgG抑制抗mPD1 mAb与mPD1结合的能力。如图6B所示，虽然单独的抗mPD1 mAb与重组mPD1结合，但与抗JT-mPD1 IgG的预孵育剂量依赖性地抑制了抗mPD1 mAb与重组mPD1的结合。相比之下，在此测定法中，与从非免疫兔(PBS对照)分离的兔IgG的预孵育对抗PD1 mAb与重组mPD1的结合没有抑制活性。这些结果表明，抗JT-mPD1 IgG和抗mPD1 mAb与mPD1上的相同表位结合。

为了检查抗JT-mPD1 IgG是否可以抑制mPD1和mPDL1之间的相互作用，进行了进一步的竞争性ELISA。如图6C所示，虽然浓度为500μg/ml的从非免疫的(PBS对照)兔中分离的兔IgG对小鼠PDL1与mPD1的结合影响最小，但抗JT-mPD1 IgG表现出显著地和剂量依赖性地抑制小鼠PDL1与mPD1的结合。

实施例5-针对JT-mPD1的IgG抗体在体内抑制肿瘤生长

这项研究试图检查抗JT-mPD1 IgG是否能抑制mPD1/mPDL1的相互作用并降低体内肿瘤的生长。

简而言之，如上文实施例3中所述，将乳腺癌细胞系D2F2/E2移植给BALB/c小鼠。然后，动物接受PBS(PBS对照)、从非免疫兔中分离的总兔IgG(IgG对照)或抗JT-mPD1 IgG。如图7所示，虽然在PBS或兔IgG处理的小鼠中观察到相似的肿瘤重量，但在用抗JT-mPD1或抗mPD1 mAb治疗的小鼠中却观察到肿瘤重量的显著减少。这些结果表明，PD1 B细胞表位可用于疫苗组合物中，以在体内引起抗PD1的抗体应答，其中抗PD1抗体抑制已建立的肿瘤的生长。

实施例6：通过ELISA筛选肽序列文库的PD1的B细胞表位

生成表1中所列的生物素化肽片段的文库(SEQ ID NO：2-54和62)，然后使用多克隆抗PD1抗体在链霉亲和素包被的板上通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行筛选，以鉴定抗PD1抗体结合的肽片段。

生物素化的肽片段以干燥粉末的形式提供，并在200μL的纯溶剂(例如二甲基亚砜或二甲基甲酰胺)或溶剂/水混合物中重构。在使用前，将每个生物素化的肽片段在含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至工作浓度1：1000。

为了使链霉亲和素包被的、BSA封闭的板与生物素化的肽片段反应，将100μL每种稀释的生物素化的肽片段溶液转移到板的相应孔位置，并在振荡器上于20℃孵育约1小时的期间。

然后将板用含有0.1％v/v Tween 20的PBS(在0.15M氯化钠溶液中含有0.01M磷酸钠，pH7.2)洗涤四次。洗涤步骤后，从孔中除去过量的洗涤缓冲液。然后将板在37℃下干燥。

抗PD1多克隆抗体(Sino Biological Inc.；目录号10377-RP03；针对重组人PD1/CD279产生的兔多克隆抗体)在含有0.1％叠氮化钠的2％BSA/PBS中稀释。将约100μL稀释的抗体放入含有捕获的生物素化肽片段的板的每个孔中，在振荡器上于20℃孵育约1小时(或在4℃过夜)。然后将板用PBS/0.1％v/v Tween 20洗涤四次，并从每个孔中除去过量的洗涤缓冲液。

然后将大约100μL辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体添加到每个孔中，并在20℃下孵育约1小时。然后将板用PBS/0.1％v/v Tween 20洗涤四次，并从每个孔中除去过量的洗涤缓冲液。然后将板仅用PBS洗涤两次，以除去洗涤缓冲液中残留的痕量Tween。

为了检测辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体的存在，将100μL的1-Step^TMABTS(Pierce目录号：37615)添加到每个孔中，并在20℃下孵育45分钟。使用微量滴定仪Titertek Multiskan MC读板器在相对于参考波长492nm的405nm的双波长模式下读取每个孔中任何颜色变化的吸光度，并与适当的阴性对照进行比较，例如在没有添加生物素化的肽片段的孔中、在没有添加抗PD1多克隆抗体的孔中、和/或在没有添加辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体的孔中观察到的颜色变化。

颜色变化的检测(与适当的对照相比)表明存在与生物素化的肽片段结合的抗PD1多克隆抗体。ELISA数据如图8所示。随后选择了十三种肽序列进行免疫研究-SEQ ID NO：9、10、13、14、28、29、36、42、43、49和58-61。

实施例7–用于筛选能够产生针对PD1的抗体应答的肽片段文库的免疫方案

A.兔的免疫

随后，将从上述实施例6的筛选测定法中鉴定并选择的十三种肽序列缀合至载体蛋白，钥孔戚血蓝蛋白(KLH)。参见表3：

表3：

肽序列	载体蛋白	SEQ ID NO：
			H-GWFLDSPDRPWNC-NH<sub>2</sub>	KLH	9
H-LDSPDRPWNPPTC-NH<sub>2</sub>	KLH	10
			H-PPTFSPALLVVTC-NH<sub>2</sub>	KLH	13
H-FSPALLVVTEGDC-NH<sub>2</sub>	KLH	14
			H-LAAFPEDRSQPGC-NH<sub>2</sub>	KLH	28
H-FPEDRSQPGQDC-NH<sub>2</sub>	KLH	29
			H-GRDFHMSVVRARC-NH<sub>2</sub>	KLH	36
H-LRVTERRAEVPTC-NH<sub>2</sub>	KLH	49
			H-FVLNWYRMSPSNC-NH<sub>2</sub>	KLH	58
H-NWYRMSPSNQTDC-NH<sub>2</sub>	KLH	59
			H-RMSPSNQTDKLAC-NH<sub>2</sub>	KLH	60
H-YLSGAISLAPKAC-NH<sub>2</sub>	KLH	61
			H-GAISLAPKAQIKC-NH<sub>2</sub>	KLH	43

用盐水稀释大约250-500μg每个KLH缀合的肽片段，然后在完全或不完全的弗氏佐剂中以1：1的质量比乳化。根据以下免疫方案，将乳化液通过肩膀周围的皮下注射和腿内的肌肉内注射施用于兔：

i.第00天-收集2ml血清(用于0.5-1.0ml免疫前血清；

ii.第1天-第一次免疫，完全弗氏佐剂，500μg肽片段；

iii.第15天-第2次免疫，完全弗氏佐剂，500μg肽片段；

iv.第29天-第3次免疫，不完全弗氏佐剂，250μg肽片段；

v.第35天-收集血清，2-3ml用于通过ELISA评估抗PD1抗体的滴度；

vi.第36天-第4次免疫，不完全弗氏佐剂，250μg肽片段(任选地)；

vii.第43天-第5次免疫，不完全弗氏佐剂。250μg肽片段(任选地)；

viii.第50天-第6次免疫，不完全弗氏佐剂250μg肽片段(任选地)；

ix.第57天-第7次免疫，不完全弗氏佐剂250μg肽片段(任选地)；

x.第63天-从免疫的兔收集血液样品。

B.通过ELISA评估免疫的兔中抗PD1抗体的滴度

酶联免疫吸附测定法(ELISA)用于测量从免疫的兔收集的血液样本中的抗PD1抗体滴度。简而言之，用与His标签缀合的PD1(SEQ ID NO：1)包被微量滴定板。用BSA封闭微量滴定板的孔，以最大程度地减少非特异性结合后，将稀释的免疫兔的血清加入板中，并在振荡器上于20℃孵育约1小时(或在4℃过夜)。然后将板用PBS/0.1％v/v Tween 20洗涤四次，并从每个孔中除去过量的洗涤缓冲液。

然后将大约100μL辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体添加到每个孔中，并在20℃下孵育约1小时。然后将板用PBS/0.1％v/v Tween 20洗涤四次，并从每个孔中除去过量的洗涤缓冲液。然后将板仅用PBS洗涤两次，以除去洗涤缓冲液中残留的痕量Tween。

为了检测辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体的存在，将100μL的1-Step^TMABTS(Pierce目录号：37615)添加到每个孔中，并在20℃下孵育45分钟。使用微量滴定仪Titertek Multiskan MC读板器在相对于参考波长492nm的405nm的双波长模式下读取每个孔中任何颜色变化的吸光度，并与适当的阴性对照进行比较，例如在没有添加PD1的孔中、在没有添加免疫的兔血清的孔中、和/或在没有添加辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体的孔中观察到的颜色变化。

颜色变化的检测(与适当的对照相比)表明在免疫的兔中产生了针对肽片段的免疫应答。下表4显示了被鉴定为在免疫的兔中产生抗PD1抗体应答的肽序列。所述肽序列被鉴定为SEQ ID NO：9(血清编号2809001)、SEQ ID NO：10(血清编号2809003)、SEQ ID NO：14(血清编号2809007)、SEQ ID NO：28(血清编号2809009)、SEQ ID NO：29(血清编号2809011)、SEQ ID NO：49(血清编号2809015)、SEQ ID NO：59(血清编号2809019)、SEQ IDNO：61(血清编号2809023)和SEQ ID NO：43(血清编号2809025)：

表4：

蛋白质ID	序列	血清
			PD1	GWFLDSPDRPWNC	2809001
PD1	LDSPDRPWNPPTC	2809003
PD1	FSPALLVVTEGDC	2809007
			PD1	LAAFPEDRSQPGC	2809009
PD1	FPEDRSQPGQDC	2809011
PD1	LRVTERRAEVPTC	2809015
PD1	NWYRMSPSNQTDC	2809019
PD1	YLSGAISLAPKAC	2809023
			PD1	GAISLAPKAQIKC	2809025

来自ELISA测定法的吸光度(OD)读取显示在下表5和6中，这些读取来自两个独立的ELISA测定法：

表5：ELISA测定法No.1

表6：ELISA测定法No.2

实施例8–使用SEQ ID NO：9和43的融合肽的免疫方案

将肽序列SEQ ID No：9和43组合形成2种不同的融合肽-SEQ ID NO：56和SEQ IDNO：57-然后将其与KLH缀合。参见表7(SEQ ID NO：9以下划线表示)：

表7：

肽序列	载体蛋白
		H-<u>GWFLDSPDRPWN</u>GAISLAPKAQIKC-NH<sub>2</sub>	KLH
H-GAISLAPKAQIK<u>GWFLDSPDRPWN</u>-NH<sub>2</sub>	KLH

用盐水稀释大约250-500μg每个KLH缀合的融合肽，然后在完全或不完全的弗氏佐剂中以1：1的质量比乳化。根据上述实施例2的免疫方案，将乳化液通过肩膀周围的皮下注射和腿内的肌肉内注射施用于兔。

根据以上实施例2中列出的方法，使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量从免疫的兔收集的血液样品中的抗PD1抗体滴度。来自ELISA测定法的吸光度读取显示在下表8中(SEQ ID NO：9以下划线表示)：

表8：

PD1融合蛋白	<u>GWFLDSPDRPWN</u>GAISLAPKAQIKC	2916501
			PD1融合蛋白	GAISLAPKAQIK<u>GWFLDSPDRPWN</u>C	2916503

实施例9–源自免疫兔的抗PD1抗体与其他物种的PD1的交叉反应

为了评估在免疫兔中产生的抗人PD1抗体是否将与其他物种的PD1交叉反应，在ELISA测定法中筛选了来自以上实施例7和8的抗PD1抗血清与小鼠、恒河猴、犬和大鼠PD1蛋白的结合。ELISA测定法的OD读取显示在下表9中：

表9：

筛选了产生的针对SEQ ID NO：9(血清编号2809001)、SEQ ID NO：10(血清编号2809003)、SEQ ID NO：14(血清编号2809007)、SEQ ID NO：28(血清编号2809009)、SEQ IDNO：29(血清编号2809011)、SEQ ID NO：49(血清编号2809015)、SEQ ID NO：59(血清编号2809019)、SEQ ID NO：61(血清编号2809023)和SEQ ID NO：43(血清编号2809025)肽的亲和纯化的抗PD1抗体与不同物种的PD1蛋白的结合。将所有抗体1/100稀释。

表9-续

筛选出针对SEQ ID NO：56(血清编号2916501)和SEQ ID NO：57(血清编号2916503)融合肽产生的亲和纯化的抗PD1抗体与不同物种的PD1蛋白的结合。将所有抗体1/100稀释。

对于每个物种，His标记的PD1以2.5μg/ml结合到镍包被的板上

实施例10–源自免疫兔的抗PD1抗体与其他物种PD1的交叉反应的比较

进一步进行了ELISA测定法，以直接比较免疫兔(兔1和2)中产生的抗人PD1抗体与不同物种的PD1蛋白的交叉反应。OD读取显示在下表10中：

表10：

筛选了产生的针对SEQ ID NO：9(血清编号2809001)、SEQ ID NO：43(血清编号2809025)和SEQ ID NO：57(血清编号2916503)的肽和融合肽的亲和纯化的抗PD1抗体与不同物种的PD1蛋白的结合(所有抗体均1/100稀释)。

总结

使用抗PD1多克隆抗体，本发明人筛选了54个人PD1的线性肽片段(12-mer，3个氨基酸偏移)的文库，并鉴定了与抗PD1多克隆抗体结合的总共13个肽序列。将13个肽序列各自缀合至载体蛋白(KLH)，随后将缀合KLH的肽注射入兔。收集来自免疫兔的抗血清，从抗血清中亲和纯化抗PD1抗体，并筛选与天然人PD1的结合。发明人意外地发现，用于免疫兔的13种肽缀合物中，只有9种缀合物产生了足够的抗PD1抗体滴度–SEQ ID NO：9、10、14、28、29、49、59、61和43。在免疫兔中产生明显的抗PD1抗体滴度的9个肽序列中，SEQ ID NO：9产生最高的抗PD1抗体滴度。在用包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：43的融合肽(SEQ ID NO：56和SEQID NO：57)免疫的动物中也产生了抗PD1抗体。

来自用肽序列SEQ ID NO：9、10、14、28、29、49、59、61、43、56和57免疫的动物的亲和纯化的抗PD1抗体显示出与来自其他物种(小鼠、大鼠、恒河猴、食蟹猴和犬)的PD1蛋白的至少一些交叉反应，与来自恒河猴和食蟹猴的PD1蛋白的交叉反应最大。

这些数据表明，PD1的小线性肽可用于疫苗组合物中，以在体内产生抗体应答，其中抗体与该受试者中的天然PD1结合，因此可用于治疗特征在于PD1参与的疾病，例如癌症。

Claims (83)

1.一种治疗癌症的方法，其特征在于程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的参与，所述方法包括向受试者施用疫苗组合物，所述疫苗组合物包含有效量的免疫原以诱导抗体应答，其中抗体与PD1的B细胞表位结合。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原包含PD1的B细胞表位。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述B细胞表位选自SEQ ID NO：2-109。

4.权利要求3所述的方法，其中所述B细胞表位选自SEQ ID NO：9、43和57。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其进一步包括向受试者施用有效量的第二免疫原，以诱导针对癌症相关抗原的免疫应答。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述免疫应答是抗体应答，其中抗体与所述癌症相关抗原的B细胞表位结合。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其进一步包括向受试者施用与癌症相关抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述癌症相关抗原选自Her2/neu、Her-1、B黑色素瘤抗原(BAGE)、癌胚抗原(CEA)、胞嘧啶磷酸二酯鸟嘌呤(CpG)、糖蛋白100(Gp100)、端粒酶转录酶(h-TERT)、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、T细胞识别的黑色素瘤抗原(Melan-A)和粘蛋白-1(MUC-1)。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述免疫原包含载体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述载体选自钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、霍乱毒素的B亚基(CT，CTB)、大肠杆菌及其变体的热不稳定毒素(LT)、乳酸菌(LAB)、细菌菌蜕、脂质体、壳聚糖、病毒体和白喉毒素变体CRM-197。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述载体是白喉毒素变体CRM-197(SEQ ID NO：118)。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述疫苗组合物包含佐剂。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、氢氧化磷酸钙、皂角苷、TLR激动剂、CRM197、油包水乳剂、水包油乳剂、弗氏不完全佐剂、MF59、CpG寡核苷酸、iscoms、iscom基质、单磷酰基脂质A(3-O-去酰基-4'-单磷酰基脂质A；MPL)、AS01(基于脂质体的MPL和QS-21的制剂)、AS04(基于脂质体的MPL和氢氧化铝的制剂)、QS-21、QS-21衍生物、含有QS-21或QS21衍生物的佐剂、细胞因子、趋化因子、角鲨烯以及上述任意的组合。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述佐剂是TLR-4激动剂。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述TLR-4激动剂是单磷酰基脂质A。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述佐剂是Montanide。

17.疫苗组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症的特征在于PD1的参与，其中所述疫苗组合物包含有效量的免疫原，用于诱导抗体应答，其中抗体与PD1的B细胞表位结合。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述药物被配制与第二免疫原一起施用，其中所述第二免疫原以有效量存在，以在受试者中诱导针对癌症相关抗原的免疫应答。

19.一种用于治疗癌症的疫苗组合物，所述癌症的特征在于PD1的参与，其中所述疫苗组合物包含有效量的免疫原，用于诱导抗体应答，其中抗体与PD1的B细胞表位结合。

20.根据权利要求19所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述免疫原包含PD1的B细胞表位。

21.根据权利要求20所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述B细胞表位选自SEQID NO：2-109。

22.根据权利要求21所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述B细胞表位选自SEQID NO：9、43和57。

23.根据权利要求19至22中任一项所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述组合物还包含有效量的第二免疫原，用于诱导针对癌症相关抗原的免疫应答。

24.根据权利要求23所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述免疫应答是抗体应答，其中抗体与所述癌症相关抗原的B细胞表位结合。

25.根据权利要求23或权利要求24所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述癌症相关抗原选自Her2/neu、Her-1、B黑色素瘤抗原(BAGE)、癌胚抗原(CEA)、胞嘧啶磷酸二酯鸟嘌呤(CpG)、糖蛋白100(Gp100)、端粒酶转录酶(h-TERT)、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、T细胞识别的黑色素瘤抗原(Melan-A)和粘蛋白-1(MUC-1)。

26.根据权利要求19至25中任一项所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述免疫原包含载体。

27.根据权利要求26所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述载体选自钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、霍乱毒素的B亚基(CT，CTB)、大肠杆菌及其变体的热不稳定毒素(LT)、乳酸菌(LAB)、益生菌、细菌菌蜕、脂质体、壳聚糖、病毒体、寄生虫来源的抗原和白喉毒素变体CRM-197。

28.根据权利要求27所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述载体是白喉毒素变体CRM-197(SEQ ID NO：118)。

29.根据权利要求19至28中任一项所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含佐剂。

30.根据权利要求29所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、氢氧化磷酸钙、皂角苷、弗氏完全佐剂、TLR激动剂、CRM197、油包水乳剂、水包油乳剂、弗氏不完全佐剂、MF59、CpG寡核苷酸、iscoms、iscom基质、单磷酰基脂质A((3-O-去酰基-4'-单磷酰基脂质A；MPL)、AS01(基于脂质体的MPL和QS-21的制剂)、AS04(基于脂质体的MPL和氢氧化铝的制剂)、QS-21、QS-21衍生物、含有QS-21或QS21衍生物的佐剂以及上述任意的组合。

31.根据权利要求30所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述佐剂是TLR-4激动剂。

32.根据权利要求31所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述TLR-4激动剂是单磷酰基脂质A。

33.根据权利要求32所述的用于治疗癌症的疫苗组合物，其中所述佐剂是Montanide。

34.一种用于引起对PD1的体液应答的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含有效量的免疫原，用于诱导抗体应答，其中抗体与PD1的B细胞表位结合。

35.根据权利要求34所述的疫苗组合物，其中所述免疫原包含PD1的B细胞表位。

36.根据权利要求35所述的疫苗组合物，其中所述B细胞表位选自SEQ ID NO：2-109。

37.根据权利要求36所述的疫苗组合物，其中所述B细胞表位选自SEQ ID NO：9、43和57。

38.根据权利要求34至37中任一项所述的疫苗组合物，其中所述组合物还包含有效量的第二免疫原，用于诱导针对癌症相关抗原的免疫应答。

39.根据权利要求38所述的疫苗组合物，其中所述免疫应答是抗体应答，其中抗体与所述癌症相关抗原的B细胞表位结合。

40.根据权利要求38或权利要求39所述的疫苗组合物，其中所述癌症相关抗原选自Her2/neu、Her-1、B黑色素瘤抗原(BAGE)、癌胚抗原(CEA)、胞嘧啶磷酸二酯鸟嘌呤(CpG)、糖蛋白100(Gp100)、端粒酶转录酶(h-TERT)、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、T细胞识别的黑色素瘤抗原(Melan-A)和粘蛋白-1(MUC-1)。

41.根据权利要求38至40中任一项所述的疫苗组合物，其中所述免疫原包含载体。

42.根据权利要求41所述的疫苗组合物，其中所述载体选自钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、霍乱毒素的B亚基(CT，CTB)、大肠杆菌及其变体的热不稳定毒素(LT)、乳酸菌(LAB)、益生菌、细菌菌蜕、脂质体、壳聚糖、病毒体、寄生虫来源的抗原和白喉毒素变体CRM-197。

43.根据权利要求42所述的疫苗组合物，其中所述载体是白喉毒素变体CRM-197(SEQID NO：118)。

44.根据权利要求38至43中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含佐剂。

45.根据权利要求44所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、氢氧化磷酸钙、皂角苷、弗氏完全佐剂、TLR激动剂、CRM197、油包水乳剂、水包油乳剂、弗氏不完全佐剂、MF59、CpG寡核苷酸、iscoms、iscom基质、单磷酰基脂质A((3-O-去酰基-4'-单磷酰基脂质A；MPL)、AS01(基于脂质体的MPL和QS-21的制剂)、AS04(基于脂质体的MPL和氢氧化铝的制剂)、QS-21、QS-21衍生物、含有QS-21或QS21衍生物的佐剂以及上述任意的组合。

46.根据权利要求45所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是TLR-4激动剂。

47.根据权利要求46所述的疫苗组合物，其中所述TLR-4激动剂是单磷酰基脂质A。

48.根据权利要求47所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是Montanide。

49.用于引起对PD1的体液应答的疫苗组合物，其中所述组合物包含免疫原，所述免疫原包含诱导抗体应答的肽序列，其中抗体与PD1的B细胞表位结合，其中所述肽序列包含选自以下的氨基酸序列中的至少8个连续的氨基酸残基：SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43、49、和与前述任意氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述免疫原的氨基酸序列与PD1的至少50个氨基酸残基的连续延伸序列不同。

50.根据权利要求49所述的疫苗组合物，其中所述肽序列包含选自SEQ ID NOs：9、10、14、24、28、29、42、43和49的氨基酸序列的至少8个连续的氨基酸残基。

51.根据权利要求50所述的疫苗组合物，其中所述肽序列选自SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43、49和58-63。

52.根据权利要求49或权利要求50所述的疫苗组合物,其中所述肽序列选自SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：43和与其具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

53.根据权利要求52所述的疫苗组合物,其中所述肽序列选自SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：43。

54.根据权利要求48至53中任一项所述的疫苗组合物，其中所述免疫原还包含混杂的T辅助细胞表位。

55.根据权利要求48至54中任一项所述的疫苗组合物，其中所述免疫原包含至少两个肽序列。

56.根据权利要求55所述的疫苗组合物，其中所述免疫原包含SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：43。

57.根据权利要求56所述的疫苗组合物，其中所述免疫原包含选自SEQ ID NO：56和SEQID NO：57的氨基酸序列。

58.根据权利要求48所述的疫苗组合物，其中所述免疫原由以下氨基酸序列组成、或基本上由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自：SEQ ID NO：9、10、14、24、28、29、42、43、49和58-63。

59.根据权利要求58所述的疫苗组合物，其中所述免疫原由或基本上由选自SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：43的氨基酸序列组成。

60.根据权利要求48所述的疫苗组合物，其中所述免疫原由或基本上由选自SEQ IDNO：56和SEQ ID NO：57的氨基酸序列组成。

61.根据权利要求48至60中任一项所述的疫苗组合物，其中所述免疫原与载体缀合。

62.根据权利要求61所述的疫苗组合物，其中所述载体是免疫原性的。

63.根据权利要求61或权利要求62所述的疫苗组合物，其中所述载体选自钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、霍乱毒素的B亚基(CT，CTB)、大肠杆菌及其变体的热不稳定毒素(LT)、乳酸菌(LAB)、细菌菌蜕、脂质体、壳聚糖、病毒体、树突细胞和白喉毒素变体CRM-197。

64.根据权利要求63所述的疫苗组合物，其中所述载体是白喉毒素变体CRM-197(SEQID NO：118)。

65.根据权利要求48至64中任一项所述的疫苗组合物，其中所述组合物包含佐剂。

66.根据权利要求65所述的疫苗组合物，其中所述佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、氢氧化磷酸钙、皂角苷、弗氏完全佐剂、TLR激动剂、CRM197、

弗氏不完全佐剂、MF59、CpG寡核苷酸、iscoms、iscom基质、ISCOMATRIX^TM佐剂、Matrix M^TM佐剂、Matrix C^TM佐剂、Matrix Q^TM佐剂、

-100佐剂、

-300佐剂、ISCOPREP^TM、ISCOPREP^TM衍生物、包含ISCOPREP^TM或ISCOPREP^TM衍生物的佐剂、单磷酰基脂质A((3-O-去酰基-4'-单磷酰基脂质A；MPL)、AS01(一种基于脂质体的MPL和QS-21的制剂)、AS04(一种基于脂质体的MPL和氢氧化铝的制剂)、QS-21、QS-21衍生物、含有QS-21或QS21衍生物的佐剂、以及上述任意的组合。

67.根据权利要求66所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是TLR-4激动剂。

68.根据权利要求67所述的疫苗组合物，其中所述TLR-4激动剂是单磷酰基脂质A。

69.根据权利要求68所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是Montanide。

70.根据权利要求48至69中任一项所述的疫苗组合物，其进一步包含至少一种癌症相关抗原的B细胞表位和/或模拟表位。

71.根据权利要求70所述的疫苗组合物，其中所述癌症相关抗原选自Her2/neu、Her-1、B黑色素瘤抗原(BAGE)、癌胚抗原(CEA)、胞嘧啶磷酸二酯鸟嘌呤(CpG)、糖蛋白100(Gp100)、端粒酶转录酶(h-TERT)、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、T细胞识别的黑色素瘤抗原(Melan-A)和粘蛋白-1(MUC-1)。

72.一种治疗特征在于PD1参与的病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用权利要求48至71中任一项所述的疫苗组合物。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述病症是癌症。

74.根据权利要求73所述的方法，其进一步包括向受试者施用与癌症相关抗原特异性结合的抗体，或其抗原结合片段。

75.根据权利要求74所述的方法，其中所述癌症相关抗原选自Her2/neu、Her-1、B黑色素瘤抗原(BAGE)、癌胚抗原(CEA)、胞嘧啶磷酸二酯鸟嘌呤(CpG)、糖蛋白100(Gp100)、端粒酶转录酶(h-TERT)、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、T细胞识别的黑色素瘤抗原(Melan-A)和粘蛋白-1(MUC-1)。

76.根据权利要求74或权利要求75所述的方法，其中在施用疫苗组合物之后将抗体或其抗原结合片段施用给受试者。

77.权利要求48至77中任一项所述疫苗组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗特征在于PD1参与的病症。

78.根据权利要求77所述的用途，其中所述病症是癌症。

79.根据权利要求78所述的用途，其中所述药物被配制用于在施用特异性结合癌症相关抗原的抗体或其抗原结合片段之前施用。

80.根据权利要求79所述的用途，其中所述癌症相关抗原选自Her2/neu、Her-1、B黑色素瘤抗原(BAGE)、癌胚抗原(CEA)、胞嘧啶磷酸二酯鸟嘌呤(CpG)、糖蛋白100(Gp100)、端粒酶转录酶(h-TERT)、黑色素瘤抗原编码基因(MAGE)、T细胞识别的黑色素瘤抗原(Melan-A)和粘蛋白-1(MUC-1)。

81.一种药物组合物，其包含权利要求48至71中任一项所述的疫苗组合物和药学上可接受的赋形剂。

82.根据权利要求9所述的方法，其中所述载体不是病毒样颗粒。

83.根据权利要求26、41和61中任一项所述的组合物，其中所述载体不是病毒样颗粒。

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