CN112195244A - Gmfb作为肝细胞肝癌生物标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了GMFB作为肝细胞肝癌生物标志物的应用，属于癌症诊断和治疗技术领域。本发明以TCGA数据库中大量测序数据和临床数据为研究对象，统计分析GMFB在肝细胞肝癌患者群体中表达量，表明GMFB是肝细胞肝癌HCC显著差异表达基因，GMFB与HCC的发病相关，明确了GMFB与HCC的发病相关，且与HCC分级与分期有较强的相关性，与HCC患者，尤其是男性患者的预后也显著相关。检测GMFB的表达量的试剂在制备肝细胞肝癌早期诊断、肝细胞肝癌分级和/或分期或评估肝细胞肝癌预后的试剂盒中的应用。通过抑制GMFB表达实现抑制肝细胞肝癌细胞转移，因此GMFB在制备预防和/或治疗肝细胞肝癌或的药物中的应用。

Description

GMFB作为肝细胞肝癌生物标志物的应用
技术领域
本发明属于癌症的诊断和治疗技术领域，具体涉及GMFB作为肝细胞肝癌生物标志物的应用。
背景技术
原发性肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，有生长迅速和侵袭力强的特点。其中肝细胞肝癌(Liver hepatocellular carcinoma,HCC，LIHC)占原发性肝细胞肝癌的75％～90％。肝细胞肝癌常继发于慢性疾病，包括乙肝等慢性肝细胞病变，以及肥胖、代谢综合征等全身性疾病。肝细胞肝癌的高发病率和高死亡率，给我国带来了巨大的财政和社会负担。
由于缺乏灵敏的早期检测方法，肝细胞肝癌通常与预后不良，其5年生存率低于5％。目前依据早期诊断HCC的监测指南，临床上主要使用血清甲胎蛋白(AFP)进行早期HCC诊断。然而，AFP对HCC的特异性及敏感性均不够理想。约40％的HCC患者的AFP水平正常，尤其是对于早期HCC，AFP检测的敏感性不足。临床上也发现部分慢性肝炎和肝硬化患者中AFP水平也升高，可见AFP检测的特异性也不够理想。因此，迫切需要寻找一种或多种标记物辅助HCC的早期诊断。
GMFB(glia maturation factor beta,)是一种胶质细胞成熟因子，具有肌动蛋白解聚因子同源性(ADF-H)。在进化过程中，从酵母到哺乳动物该GMFB的基因都高度保守。同时该蛋白普遍表达，但主要在脑组织中富集，参与细胞的趋化性，内吞作用，细胞黏附等多种生物活动。目前尚未有GMFB与肝细胞肝癌相关的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种GMFB蛋白作为肝细胞肝癌生物标志物的新应用。
本发明提供了检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂在制备肝细胞肝癌早期诊断的试剂盒中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。
优选的，所述检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂包括检测GMFB的RNA表达水平的试剂和/或检测GMFB的蛋白表达水平的试剂；
当检测GMFB的RNA表达水平时，GMFB的TPM值(Transcripts Per Million，每千个碱基的转录每百万映射读取的转录产物)高于12.07时，表明患者有患肝细胞肝癌的风险。
本发明提供了检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂在制备肝细胞肝癌分级和/或分期的试剂盒中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。
优选的，所述检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂包括检测GMFB的RNA表达水平的试剂和/或检测GMFB的蛋白表达水平的试剂。
优选的，检测GMFB的RNA表达水平的试剂用于所述肝细胞肝癌分期时，第一阶段的样本中GMFB的TPM值的中位数为11.056；第二阶段的样本中GMFB的TPM值的中位数为11.233；第三阶段的样本中GMFB的TPM值的中位数为12.515。
优选的，检测GMFB的RNA表达水平的试剂用于所述肝细胞肝癌分级中，第一级的样本中GMFB的TPM值的中位数为10.824；第二级的样本中GMFB的TPM值的中位数为11.684；第三级的样本中GMFB的TPM值的中位数为13.588。
本发明提供了检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂在制备评估肝细胞肝癌预后的试剂盒中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。
优选的，所述肝细胞肝癌预后的评估对象包括男性患者；
所述检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂包括检测GMFB的RNA表达水平的试剂和/或检测GMFB的蛋白表达水平的试剂。
本发明提供了抑制肝细胞肝癌生物标志物表达的试剂在制备预防和/或治疗肝细胞肝癌的药物中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。
本发明提供了抑制肝细胞肝癌生物标志物表达的试剂在制备抑制肝细胞肝癌细胞的侵袭能力的药物中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。
本发明提供的检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂在制备肝细胞肝癌早期诊断的试剂盒中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。本发明以TCGA数据库中大量测序数据和临床数据为研究对象，统计GMFB在HCC患者群体中的表达量，结果表明，GMFB是肝细胞肝癌显著差异表达基因，GMFB与HCC的发病相关，可以用来辅助肝细胞肝癌的早期诊断。同时由于TCGA数据库包含三十多种肿瘤的信息以及上万个样本的详细数据，大量的样本增加分析结果的可靠性。
进一步的，本发明还具体限定了GMFB的RNA表达水平可以作为肝细胞肝癌诊断的标志分子。统计结果表明，一旦肝组织中GMFB的TPM高于12.07，就说明患者极有可能患有肝细胞肝癌，因此，可以结合其他诊断手段共同针对早期肝细胞肝癌的发病情况。
本发明提供的检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂在制备肝细胞肝癌分级和/或分期的试剂盒中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。本发明通过对TCGA数据库中HCC不同分级与分期中GMFB的表达量进行分析，明确了GMFB不仅与HCC的发病相关，还与HCC的分级与分期都有较强的相关性。同时由于TCGA数据库包含三十多种肿瘤的信息以及上万个样本的详细数据，大量的样本增加分析结果的可靠性。
进一步的，本发明具体限定了肝细胞肝癌分级分期的判断标准，GMFB与HCC的分级与分期都呈现出显著的正相关性，在临床上，可以依据中位数，对患者的分级分期进行判断：在对肝细胞肝癌分期分析的过程中，用50位正常人群的样本，168位stage 1的样本，84位stage 2的样本，82位stage3的样本和六位stage4的样本，他们GMFB TPM的中位数分别6.04、11.056、11.233、12.515和12.812。在对肝细胞肝癌分级分析的过程中，用50位正常人群的样本，54位grade 1的样本，173位grade 2的样本，118位grade 3的样本和12位grade 4的样本，他们GMFB TPM的中位数分别为6.04，10.824，11.684，13.588和9.358。其中stage 4和grade 4由于患者进入终末期，病例数较少，因此统计学差异不显著。
本发明提供了检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂在制备评估肝细胞肝癌预后的试剂盒中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。本发明对TCGA数据库中HCC患者GMFB不同表达水平的预后进行分析，结果表明GMFB的表达量与HCC患者的预后显著相关。同时由于TCGA数据库包含三十多种肿瘤的信息以及上万个样本的详细数据，大量的样本增加分析结果的可靠性。
进一步的，本发明具体限定了关于肝细胞肝癌预后评估对男性患者更加适用。数据中探针的表达范围是434-5082，分析中所用的CUTOFF值为1481。低表达患者的中位生存期为82.9个月，高表达患者的中位生存期为46.2个月，差异有统计学意义(P＝0.0042)。而对246位男性患者进行分析，结果表明，GMFB的表达量与男患者的预后具有更显著的相关性。数据中探针的表达范围是434-5082，分析中所用的CUTOFF值为1958。低表达患者的中位生存期位84.7个月，高表达患者的中位生存期为36.3个月，差异有统计学意义(P＝0.00014)。因此GMFB对肝细胞肝癌，尤其是在男性患者中有巨大的应用价值。
本发明提供了抑制肝细胞肝癌生物标志物表达的试剂在制备预防和/或治疗肝细胞肝癌或抑制肝细胞肝癌细胞的侵袭能力的药物中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB蛋白。Transwell实验结果证实，敲低GMFB可以显著降低肝细胞肝癌细胞的侵袭能力。因此，GMFB是潜在的治疗靶点，从而用于预防和/或治疗肝细胞肝癌中。
附图说明
图1为GMFB在包括肝细胞肝癌在内的多种癌症中高表达结果；
图2为GMFB高表达肝细胞肝癌患者的中位生存期与总体生存期均显著低于GMFB低表达的肝细胞肝癌患者，且有统计学意义(P＝0.00017)；
图3为GMFB与男性肝细胞肝癌患者的预后显著相关结果；在男性肝细胞肝癌患者中，GMFB低表达的中位生存月数为84.7，高表达组的中为生存月数为36.3；
图4为GMFB的表达量与肝细胞肝癌的分级显著相关结果；
图5为GMFB的表达量与肝细胞肝癌的临床分期显著相关结果；
图6为Transwell Invasion实验结果，其中图6A为在RNA水平上敲低了GMFB的结果，图6B为在蛋白水平上敲低GMFB的结果；图6C为结晶紫染色结果，图6D为对Si-scramble与Si-GMFB结果结晶紫染色结果的统计分析结果。
具体实施方式
本发明提供了检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂在制备肝细胞肝癌早期诊断的试剂盒中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。
在本发明中，所述检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂优选包括检测GMFB的RNA表达水平的试剂和/或检测GMFB的蛋白表达水平的试剂。当检测GMFB的RNA表达水平时，GMFB的TPM值高于12.07时，或表达量高于两倍正常患者值时，表明患者有患肝细胞肝癌的风险。肝细胞肝癌组织的RNA表达水平的手段优选包括RT-qPCR或RNA测序(如IlluminaHiSeq2000等商业化产品)。本发明对所述RT-qPCR的方法检测用试剂没有特殊限制，采用本领域所孰知的针对GMFB的cDNA为模板设计引物即可，例qhGMFB-Fw：CGCCGTGCCATTCTTAAAG(SEQ ID NO:3)，qhGMFB-Rv：CGAAACTTTCTCAGCTTTTCCAC(SEQ ID NO:4)。所述RNA测序优选采用Illumina HiSeq2000等商业化产品进行。
本发明提供了检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂在制备肝细胞肝癌分级和/或分期的试剂盒中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。
在本发明中，所述检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂优选包括检测GMFB的RNA表达水平的试剂和/或检测GMFB的蛋白表达水平的试剂。检测GMFB的RNA表达水平的试剂优选用于所述肝细胞肝癌分期时，第一阶段的样本中GMFB的TPM值的中位数为11.056；第二阶段的样本中GMFB的TPM值的中位数为11.233；第三阶段的样本中GMFB的TPM值的中位数为12.515；第四阶段的样本中GMFB的TPM值的中位数为12.812。检测GMFB的RNA表达水平的试剂优选用于所述肝细胞肝癌分级中时，第一级的样本中GMFB的TPM值的中位数为10.824；第二级的样本中GMFB的TPM值的中位数为11.684；第三级的样本中GMFB的TPM值的中位数为13.588；第四级的样本中GMFB的TPM值的中位数为9.358。其中stage 4和grade 4由于患者进入终末期，病例数较少，因此统计学差异不显著。
本发明提供了检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂在制备评估肝细胞肝癌预后的试剂盒中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。
在本发明中，所述肝细胞肝癌预后的评估对象优选包括男性患者。本发明通过对样本全部为男性患者的样本进行统计分析，结果表明，GMFB表达量越低，患者的中位生存期与终末生存期越长，差异十分显著。所述检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂包括检测GMFB的RNA表达水平的试剂和/或检测GMFB的蛋白表达水平的试剂。
本发明提供了抑制肝细胞肝癌生物标志物表达的试剂在制备预防和/或治疗肝细胞肝癌或抑制肝细胞肝癌细胞的侵袭能力的药物中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。本发明通过敲低GMFB后可使HEP3B细胞的侵袭能力显著降低，表明GMFB可以成为肝细胞肝癌的治疗靶点，抑制肝细胞肝癌细胞转移，从而达到治疗肝细胞肝癌的目的。所述抑制肝细胞肝癌生物标志物表达的试剂优选包括抑制GMFB的RNA表达水平的试剂和/或抑制GMFB的蛋白表达水平的试剂。所述抑制肝细胞肝癌生物标志物表达的手段包括RNA干扰法。所述抑制肝细胞肝癌生物标志物表达的试剂包括能够干扰GMFB的RNA转录或其蛋白翻译的试剂，例如干扰RNA或底物竞争性抑制剂等。
下面结合实施例对本发明提供的GMFB作为肝细胞肝癌生物标志物的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
使用UALCAN网站(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)，对TCGA数据库中50位正常人群和371名全部肝细胞肝癌患者肝细胞肝癌组织的RNA-seq数据进行GMFB TPM(Transcripts Per Million)分析[参见文献1,2,3]。
结果表明，GMFB在肝细胞肝癌组织中高表达。正常人群的GMFB TPM中位数为6.04，上四分位数为8.012，下四分位数为5.021。肝细胞肝癌患者GMFB TPM组的中位数为12.07上四分位数为17.524，下四分位数为8.123。经Student’s t检验显示差异有统计学意义(P＝1.62436730732907E-12)，因此GMFB的RNA表达水平可以作为肝细胞肝癌诊断的标志分子，一旦肝组织中GMFB的TPM高于12.07，就说明患者极有可能患有肝细胞肝癌。
图1表明GMFB在包括肝细胞肝癌在内的多种癌症中高表达，因此GMFB的RNA表达水平可以作为肝细胞肝癌诊断的标志分子。
实施例2
使用Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)对TCGA数据库中共364位肝细胞肝癌患者GMFB不同表达水平的预后进行分析[参见文献4]。
GMFB的表达量与HCC患者的预后显著相关。数据中探针的表达范围是434～5082，分析中所用的CUTOFF值为1481。低表达患者的中位生存期为82.9个月，高表达患者的中位生存期为46.2个月，差异有统计学意义(P＝0.0042)。然后，对246位男性患者进行分析。发现GMFB的表达量与男患者的预后具有更显著的相关性。数据中探针的表达范围是434～5082，分析中所用的CUTOFF值为1958。低表达患者的中位生存期位84.7个月，高表达患者的中位生存期为36.3个月，差异有统计学意义(P＝0.00014)。因此GMFB对肝细胞肝癌，尤其是在男性患者中有巨大的应用价值。
图2表明GMFB高表达肝细胞肝癌患者的中位生存期与总体生存期均显著低于GMFB低表达的肝细胞肝癌患者，且有统计学意义(P＝0.0042)，因此GMFB与肝细胞肝癌患者的预后显著相关，可以作为肝细胞肝癌预后的标志因子。
图3结果表明GMFB与男性肝细胞肝癌患者的预后显著相关，可以作为男性肝细胞肝癌预后的标志因子。在男性肝细胞肝癌患者中，GMFB低表达的中位生存月数为84.7，高表达组的中为生存月数为36.3。
实施例3
使用UALCAN网站(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)，对TCGA数据库中肝细胞肝癌不同分级与分期中GMFB的TPM进行分析。
在对肝细胞肝癌分期分析的过程中，随机选取50位正常人群的样本，168位stage1的样本，84位stage 2的样本，82位stage3的样本和六位stage4的样本，他们GMFB TPM的中位数分别依次为6.04、11.056、11.233、12.515和12.812。在对肝细胞肝癌分级分析的过程中，随机选择50位正常人群的样本，54位grade 1的样本，173位grade 2的样本，118位grade3的样本和12位grade 4的样本，GMFB TPM的中位数分别为6.04，10.824，11.684，13.588和9.358。其中stage 4和grade 4由于患者进入终末期，病例数较少，因此统计学差异不显著。
图4和图5表明GMFB的表达量与肝细胞肝癌的分级和临床分期显著相关，即GMFB可以作为肝细胞肝癌患者临床分级与分期的标志性分子。本发明明确了GMFB不仅与HCC的发病相关，同时与HCC的分级与分期都呈现出显著的正相关性，在临床上，可以依据中位数，对患者的分级分期进行判断。
实施例4
使用敲低GMFB表达的HEP3B细胞(购于ATCC，
Figure BDA0002721689800000081
HB-8064TM)用TRANSWELL实验，验证GMFB对于肝细胞肝癌细胞侵袭能力的影响。具体操作如下，在37℃、5％CO2和95％空气的培养环境中在含10％血清的高糖DMEM培养基上进行HEP3B细胞的培养。设计si-GMFB的引物:正向序列：GCCGAAGAUUUAGUGGAAAdTdT(SEQ ID NO:1)；反向序列：UUUCCACUAAAUCUUCGGCdTdT(SEQ ID NO:2)。使用LIPO2000常规转染，转染48小时后，分别使用RT-qPCR以及westernblot检测敲低效率[参见文献5,6]。在4℃冰箱中过夜溶Matrigel胶，用4℃冰箱保存的无血清高糖DMEM稀释。取100μl滴入到24-well transwell上室中，37℃孵育6h。使用200μl移液枪用无血清高糖培养基轻轻冲洗凝胶。将对照组(scramble转染24h)与实验组(Si-GMFB的HEP3B转染24h)的细胞弃培养基，PBS洗涤3遍，使用胰酶消化获取细胞悬液，离心后使用无血清高糖DMEM重悬。使用COUNTSTAR检测细胞数，按照5×105cells/ml在TRANSWELL上室加200μl细胞悬液。TRANWELL下室中加入1ml含10％血清的高糖DMEM。放回培养箱，继续培养24h。用棉签轻柔擦去上室上面残余的非侵袭细胞。取出transwells加入-20℃预冷的甲醇固定细胞10min，PBS洗三次，每孔加入1ml 0.1％结晶紫溶液，将小室置于其中，10min后取出，PBS漂洗三次。取上下左右4个视野拍照分析。
图6A证实在RNA水平上敲低了GMFB，图6B证实在蛋白水平上敲低GMFB。在HEP3B细胞中，敲低GMFB显著降低细胞的侵袭能力，证实GMFB是肝细胞肝癌治疗的潜在靶点。
由上述实施例可知，GMFB在肝细胞肝癌的患者中RNA水平与蛋白水平均高表达，其表达量与疾病的分级与分期呈正相关关系。此外GMFB低表达的肝细胞肝癌患者的预后显著优于GMFB高表达的患者，这种差异在男性患者中尤为显著。同时本发明还验证了通过降低肝细胞肝癌GMFB基因的表达量，可以显著抑制癌细胞的侵袭能力，因此GMFB可以作为潜在的治疗肝细胞肝癌的靶点。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 同济大学
<120> GMFB作为肝细胞肝癌生物标志物的应用
<150> 202010971718.0
<151> 2020-09-16
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccgaagauu uaguggaaat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uuuccacuaa aucuucggct t 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgccgtgcca ttcttaaag 19
<210> 4
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgaaactttc tcagcttttc cac 23

Claims (10)

1.检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂在制备肝细胞肝癌早期诊断的试剂盒中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂包括检测GMFB的RNA表达水平的试剂和/或检测GMFB的蛋白表达水平的试剂；
当检测GMFB的RNA表达水平时，GMFB的TPM值高于12.07时，表明患者有患肝细胞肝癌的风险。
3.检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂在制备肝细胞肝癌分级和/或分期的试剂盒中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂包括检测GMFB的RNA表达水平的试剂和/或检测GMFB的蛋白表达水平的试剂。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，检测GMFB的RNA表达水平的试剂用于所述肝细胞肝癌分期时，第一阶段的样本中GMFB的TPM值的中位数为11.056；第二阶段的样本中GMFB的TPM值的中位数为11.233；第三阶段的样本中GMFB的TPM值的中位数为12.515。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，检测GMFB的RNA表达水平的试剂用于所述肝细胞肝癌分级中，第一级的样本中GMFB的TPM值的中位数为10.824；第二级的样本中GMFB的TPM值的中位数为11.684；第三级的样本中GMFB的TPM值的中位数为13.588。
7.检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂在制备评估肝细胞肝癌预后的试剂盒中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述肝细胞肝癌预后的评估对象包括男性患者；
所述检测肝细胞肝癌生物标志物的表达量的试剂包括检测GMFB的RNA表达水平的试剂和/或检测GMFB的蛋白表达水平的试剂。
9.抑制肝细胞肝癌生物标志物表达的试剂在制备预防和/或治疗肝细胞肝癌的药物中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。
10.抑制肝细胞肝癌生物标志物表达的试剂在制备抑制肝细胞肝癌细胞的侵袭能力的药物中的应用，所述肝细胞肝癌生物标志物为GMFB。
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