CN112195163B - 一种不依赖锰离子的锰过氧化物酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不依赖锰离子的锰过氧化物酶突变体及其应用。本发明在Il‑MnP1氨基酸序列的基础上，对第70位氨基酸残基Arg和166位氨基酸残基Glu进行定点突变，经构建表达菌株、诱导表达、变性复性和纯化，获得了突变体MnP(R70V/E166A)。本发明的突变体在不依赖Mn2+、pH偏中性环境中能有效地对蒽醌染料进行脱色，且对H2O2浓度的耐受性提高，这对由蒽醌染料引起的水体污染的治理具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种不依赖锰离子(Mn2+)的锰过氧化物酶突变体及其对蒽醌染料的脱色应用。
背景技术
锰过氧化物酶(Manganese peroxidase，MnP，EC1.11.1.13)是一种含有血红素的过氧化物酶，主要由木生白腐真菌经胞外分泌产生。由于MnP能够降解难降解的芳香族化合物，包括合成染料。因此，该类酶在环境污染物治理中具有巨大的应用前景。
蒽醌染料是一种被广泛使用的颜色鲜艳的合成染料，其结构特点是在稠环共轭体系中，含有两个或两个以上的羰基。由于其是酮式结构，不易被氧化，不易发生光氧化反应，具有很高的耐光牢度，从而它的可生化性极差，不易被降解，导致含有这类染料的废水水体非常难脱色，进而造成水体的色度很高，严重影响了水体环境和水生动植物的正常生命活动。
大多数的MnP对蒽醌染料的降解需要Mn2+，且必须在pH偏酸性(pH 3.5-4.0)条件下发生反应，这会进一步向水体中引入金属离子，造成新的环境污染。但是还有一些MnP，能够不依赖于Mn2+直接氧化一些小分子底物和染料，可是其催化氧化能力较差，且对H2O2的耐受性偏弱，因此，锰离子依赖性、偏酸性的pH条件、较低的催化氧化能力和较差的H2O2的耐受性限制了MnP的实际应用。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种不依赖锰离子的锰过氧化物酶突变体及其应用。该突变体是对重组Il-MnP1第70位氨基酸残基Arg和166位氨基酸残基Glu进行定点突变而获得，它能够在没有Mn2+、pH偏中性环境条件下有效地对蒽醌染料脱色，且对H2O2浓度的耐受性提高。
来源于真菌Irpex lacteus F17(CCTCC AF 2014020)的重组锰过氧化物酶Il-MnP1的氨基酸序列(AGO86670.2)如SEQ ID NO.1所示。
本发明不依赖锰离子的锰过氧化物酶突变体MnP(R70V/E166A)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明锰过氧化物酶突变体MnP(R70V/E166A)的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：采用PCR的方法扩增获得突变体的线性质粒；
步骤2：将突变体的线性质粒磷酸化并连接，得到重组载体；
步骤3：将重组载体转化到表达菌株；
步骤4：培养表达菌株，诱导突变酶过量表达；
步骤5：变性、复性、回收并纯化表达的突变酶(R70V/E166A)。
本发明的锰过氧化物酶突变体MnP(R70V/E166A)在没有Mn2+、pH 5.5且H2O2浓度为0.4mmol/L的条件下对蒽醌染料Reactive blue 4的脱色率为59.4％，对Reactive blue 5的脱色率为80.8％，对Reactive blue 19的脱色率为90.56％，有望于对含有蒽醌染料的废水水体进行脱色治理，具有重要的应用价值。
附图说明
图1本发明突变酶的SDS-PAGE电泳图。
图2突变酶在不依赖Mn2+条件下催化Reactive blue 19的最适pH，以未突变酶为对照。
图3突变酶在不依赖Mn2+条件下催化Reactive blue 19的最适温度，以未突变酶为对照。
图4突变酶在不依赖Mn2+条件下催化Reactive blue 19的最适H2O2浓度，以未突变酶为对照。
图5突变酶在最适条件下对Reactive blue 4、Reactive blue 5和Reactive blue19的脱色，以未突变酶为对照。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方法和具体的操作过程。
实施例1：突变体MnP(R70V/E166A)的制备
1、以重组Il-MnP1的质粒(pET28a-mnp1)作为模板，采用一步PCR的方法进行定点突变，分别将第70位的氨基酸R(精氨酸CGT)变为V(缬氨酸GTC)，将第166位的氨基酸E(谷氨酸GAG)变为A(丙氨酸GCA)。表1所示为设计的引物序列(划横线的为突变位点)。
表1定点突变的引物序列
PCR反应体系及条件：50μL体系中包括上下游引物各1μL，DNA模板1μL，2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，ddH2O补至50μL。98℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火5s；72℃延伸7min；28个循环后72℃最后延伸10min，降至4℃保存。
以Il-MnP1的质粒(pET28a-mnp1)作为模板，R70V-F和R70V-R作为引物，扩增含有R70V突变位点的质粒，经DNA凝胶电泳检测正确后，采用胶回收试剂盒对目的基因进行回收和纯化。
采用Blunting Kination Ligation(BKL)Kit对回收产物进行磷酸化和连接。表2所示为磷酸化体系。
表2磷酸化体系
1)37℃反应10min。
2)70℃反应10min。
3)取5μL上述反应液于新的微量离心管中，加入5μLLigation Solution I，均匀混合，16℃反应1h。
将3)中反应液转化至50μLEscherichia coliRosetta(DE3)感受态细胞。
挑取单克隆并测序，对测序正确的阳性单克隆菌株进行质粒抽提，再按照上述定点突变的方法，以突变体R70V的质粒为模板，E166A-F和E166A-R为引物进行突变。最终获得含有两个突变位点的突变菌株R70V/E166A。
2、突变菌株的诱导表达
1)取50μL突变菌株接至5mL含有硫酸卡那霉素和氯霉素的LB培养基中活化：220rpm，37℃过夜培养(硫酸卡那霉素终浓度为50μg/mL，氯霉素终浓度为34μg/mL)；再转接于400mL含有硫酸卡那霉素和氯霉素的LB培养基，扩大培养2-3h至OD600＝0.4～0.6；加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，终浓度为0.5mM)诱导，于37℃培养3-4h；4℃，8000rpm离心10min，弃上清；包涵体沉淀用50mL的Tris-HCl(50mM，pH8.5)、0.1mL DTT(1M)、0.4mL EDTA(500mM)、10μL PMSF(100mM)重悬溶解，超声破碎至液体略透光；4℃，12000rpm离心30min弃上清。
2)沉淀重悬于5mL urea(8M)、200μL EDTA(500mM)、10μL DTT(1M)，4℃密闭静置2h40min。
3)将上述包涵体变性重悬液加入到复性液中，复性液(53.366mL)为：42.074mL的Tris-HCl(50mM，pH8.5)、10％甘油、3.2mLCaCl2(2.5M)、1.326mL氯化血红素(1mM)、1.06mLKCl(1M)、380μL GSSG(0.07M)、26μL MnSO4(0.1M)；4℃密闭且避光孵育36h。
4)用1L乙酸钠(10mmol/L，pH 6.0)透析，在4℃下磁力搅拌24h；透析结束后，4℃，12000rpm离心30min，将上清液抽滤(过0.22μm的水系滤膜)，所得即为酶液(待进一步纯化)。
5)将上述酶液上样至Ni-NTA亲和层析重力柱，用不同浓度的咪唑(30mM、100mM、200mM，pH均为7.4)进行洗脱，收集200mM咪唑洗脱液，对洗脱溶液进行浓缩、置换缓冲液(为上述乙酸钠)后即为纯突变酶。
6)用改良型Brandford法蛋白质浓度测定试剂盒测定上述酶的浓度，并用乙酸钠(10mmol/L，pH 6.0)稀释至100μg/mL。每1mL的稀释酶液(100μg/mL)需加入25μL CaCl2(2.5M)，4℃静置6天。
纯化结果如图1的SDS-PAGE电泳结果所示，蛋白大小约为43KDa。
实施例2：突变酶R70V/E166A的酶学性质测定
1、突变酶R70V/E166A在不依赖Mn2+条件下催化氧化Reactive blue 19的最适pH
以Reactive blue 19为模式染料，未突变酶作为对照，测定突变酶R70V/E166A在不依赖Mn2+条件下催化氧化Reactive blue 19的最适pH：不同pH(pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.53、8.0)的乳酸钠缓冲液(0.11mol/L)作为测定酶活的缓冲液。1mL反应体系为：0.11mol/L不同pH的乳酸钠缓冲液，100μg/mL MnP(蛋白浓度相同，终浓度为10μg/mL)，2mmol/LReactive blue 19(终浓度为0.1mmol/L)，加入4mmol/L的H2O2(终浓度为0.2mmol/L)混匀启动反应，实验的对照组不加酶，30℃水浴反应30min后在595nm波长下测定吸光值，再计算脱色率。
脱色率计算公式：
式中：A0是对照组在595nm下的吸光值，At是实验组反应t(min)后在595nm下的吸光值。
突变酶R70V/E166A对蒽醌染料Reactive blue 4(598nm)和Reactive blue 5(600nm)的脱色率计算如同上面等式。
结果如图2所示。由图2可知，未突变酶的最适pH为3.5，而突变酶R70V/E166A的最适pH为5.5。在不依赖Mn2+时，突变酶R70V/E166A对Reactive blue 19的脱色率要显著高于未突变酶，其在最适pH时的脱色率(91.94％)是未突变酶在最适pH时脱色率(17.94％)的5.12倍，且当pH为6.5时突变酶R70V/E166A对Reactive blue 19仍具有84％的脱色率。突变酶R70V/E166A的最适pH不仅得到提高，而且酶在偏中性环境中的催化氧化能力也得到增强。
2、突变酶R70V/E166A在不依赖Mn2+条件下催化氧化Reactive blue 19的最适温度
以Reactive blue 19为模式染料，未突变酶作为对照，测定突变酶R70V/E166A在不依赖Mn2+条件下催化Reactive blue 19的最适温度，温度范围为10、15、20、25、30、35、40℃。使用pH 4.0的0.11mol/L乳酸钠缓冲液，其他同(1)。
结果如图3所示。由图3可知，在不依赖Mn2+时，未突变酶和突变酶R70V/E166A的最适温度分别为30℃和25℃。未突变酶和突变酶R70V/E166A的最适温度相差5℃，然而，更重要的是突变酶R70V/E166A对Reactive blue 19的脱色率是未突变酶的4-6倍，酶的催化氧化能力获得了较大的提高。
3、突变酶R70V/E166A在不依赖Mn2+条件下催化氧化Reactive blue 19的最适H2O2浓度
以Reactive blue 19为模式染料，未突变酶作对照，测定突变酶R70V/E166A在不依赖Mn2+条件下催化氧化Reactive blue 19的最适H2O2浓度，H2O2浓度范围为0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2mmol/L。使用pH 4.0的0.11mol/L乳酸钠缓冲液，其他同(1)。
结果如图4所示。由图4可知，未突变酶和突变酶R70V/E166A的最H2O2浓度分别0.02mmol/L和0.4mmol/L，突变酶R70V/E166A的最适H2O2浓度有了很大的提高，酶对H2O2的耐受性增强。在不依赖Mn2+且H2O2浓度大于0.05mmol/L时，突变酶R70V/E166A对Reactiveblue 19的脱色率均要高于未突变酶，当H2O2浓度为0.4mmol/L时达到最大脱色率，为84.02％。
4、突变酶R70V/E166A在不依赖Mn2+且最适条件下对Reactive blue 4、Reactiveblue 5和Reactive blue 19的脱色
突变酶R70V/E166A以pH 5.5的乳酸钠(0.11mol/L)为缓冲液，分别以2mmol/LReactive blue 4(终浓度为0.2mmol/L)、2mmol/L Reactive blue 5(终浓度为0.1mmol/L)和2mmol/LReactive blue 19(终浓度为0.1mmol/L)作为底物，加入终浓度为0.4mmol/L的H2O2混匀启动反应，25℃水浴反应30min。未突变酶则以pH 3.5的乳酸钠(0.11mol/L)为缓冲液，同样分别以上述染料为底物，加入终浓度为0.02mmol/L的H2O2混匀启动反应，30℃水浴反应30min。测定和计算方法同(1)。
结果如图5所示。由图5可知，在不依赖Mn2+时，突变酶R70V/E166A对这3种蒽醌染料的脱色率大于未突变酶。具体表现为，突变酶R70V/E166A对Reactive blue 4、Reactiveblue 5和Reactive blue 19的脱色率分别达到59.4％、80.8％和90.56％，是未突变酶脱色率的3.47倍、5.91倍和6.62倍。突变酶R70V/E166A对蒽醌染料的催化氧化能力明显增强。
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Claims (4)
1.一种不依赖锰离子的锰过氧化物酶突变体，其特征在于：
所述锰过氧化物酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述锰过氧化物酶突变体是对重组锰过氧化物酶Il-MnP1第70位氨基酸残基Arg和166位氨基酸残基Glu进行定点突变而获得；
所述重组锰过氧化物酶Il-MnP 1来源于真菌Irpex lacteus F17，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述的锰过氧化物酶突变体的应用，其特征在于：
所述锰过氧化物酶突变体用于对含有蒽醌染料的废水进行脱色治理。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述锰过氧化物酶突变体在不含有Mn2+、pH偏中性环境条件下能够有效地对蒽醌染料脱色，且对H2O2浓度的耐受性提高。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述锰过氧化物酶突变体在不含有Mn2+、pH 5.5且H2O2浓度为0.4 mmol/L的条件下对蒽醌染料Reactive blue 4的脱色率为59.4%，对Reactive blue 5的脱色率为80.8%，对Reactive blue 19的脱色率为90.56%。
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