CN112189137A - 多重患者样品中的***的质谱法测定 - Google Patents

多重患者样品中的***的质谱法测定 Download PDF

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Abstract

本文提供了利用不同质量的至少两种不同的衍生化试剂高通量定量***的方法。在另一个方面，本文提供了用单一质谱测定法确定多个人类样品的每个中的***的量的方法，其通过使多个人类样品的每个经受不同的衍生化试剂以在多个样品的每个中生成不同衍生化的***；将多个样品组合以形成多重样品；并且通过质谱法定量每个样品中的***的量。

Description

多重患者样品中的***的质谱法测定
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2018年3月16日提交的美国临时申请号62/644,351的权益，其通过引用以其整体并入本文。
背景技术
***(4-雄烯-17β-醇-3-酮)是类固醇激素，并且是男性中的主要雄激素。男性***降低的主要原因包括低促性腺素性功能减退症、睾丸衰竭、高泌乳素血症、垂体机能减退、一些类型的肝肾疾病和严重疾病。
在女性中，正常水平的雄激素可以提供***产生的底物。女性的血清***水平升高可能表明***和肾上腺增生以及其他病况。女性***过多的临床表现包括***、多毛症、闭经和肥胖。
需要准确且有效地测量***。
发明内容
本文提供了利用至少两种不同质量的不同衍生化试剂对***进行高通量定量的方法。
在某些实施方式中，本文提供了在一次质谱测定法中检测多个患者样品的每个中的***的量的方法。该方法包括不同地处理每个患者样品以形成多个处理的样品，其中，由于处理，可通过质谱法将每个处理的样品中的***与其他处理的样品中的***区分开；将该处理的样品组合以形成多重样品；使该多重样品在适于生成通过质谱法可检测的一种或多种离子的条件下经受电离源，其中由来自每个处理的样品的***生成的一种或多种离子不同于来自其他处理的样品的***的一种或多种离子；通过质谱法检测来自每个处理的样品中的***的一种或多种离子的量；并且将来自每个处理的样品中的***的一种或多种离子的量与每个患者样品中***的量相关联。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括用单次质谱测定法确定多个人类样品的每个中***的量，该方法包括：i)使该多个人类样品中的每个经受不同衍生化试剂以在该多个样品的每个中生成不同衍生化的***；ii)将该多个样品组合以形成多重样品；并且iii)通过质谱法对每个样品中***的量进行定量。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括用单次质谱测定法确定两个人类样品中***的量，该方法包括：i)使两个人类样品的每个经受不同的衍生化试剂以在两个样品的每个中生成不同衍生化的***；ii)将该两个样品组合以形成多重样品；并且iii)通过质谱法对每个样品中***的量进行定量。
在某些实施方式中，本文提供的衍生化试剂包括羟胺或甲氧基胺。
在一些实施方式中，本文提供的方法是完全自动化的。
在一些实施方式中，本文提供的方法是无抗体的方法。
在一些实施方式中，本文提供的纯化包括使用固相提取(SPE)提取血清。在一些实施方式中，SPE是阴离子交换固相提取。在一些实施方式中，SPE是混合模式阴离子交换固相提取。在一些实施方式中，将所提取的样品浓缩。
在一些实施方式中，本文提供的纯化包括液相色谱法。在一些实施方式中，液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)。在一些实施方式中，液相色谱法包括高湍流液相色谱法(HTLC)。
在优选的实施方式中，电离包括加热电喷雾电离(HESI)。在优选的实施方式中，电离包括以正模式电离。在一些实施方式中，电离包括以负模式电离。
在一些实施方式中，电离包括大气压化学电离(APCI)。在一些实施方式中，电离包括以正模式电离。在一些实施方式中，电离包括以负模式电离。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括对于羟胺衍生化的***，测量质荷比为304.18±0.5的前体离子的量。在一些实施方式中，本文提供的方法包括对于甲氧基胺衍生化的***，测量质荷比为318.21±0.5的前体离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括对于羟胺衍生化的***，测量质荷比为112.05±0.5或124.05±0.5的碎片离子的量。在一些实施方式中，本文提供的方法包括对于甲氧基胺衍生化的***，测量质荷比为126.07±0.5、138.07±0.5或152.08±0.5的碎片离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法进一步包括添加内标。在一些实施方式中，该内标被同位素标记。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量质荷比为307.19±0.5(羟胺衍生化)或321.21±0.5(甲氧基胺衍生化)的内标前体离子和/或质荷比为127.06±0.5(羟胺衍生化)或129.07±0.5(甲氧基胺衍生化)的产物离子的量。
在某些实施方式中，本文提供的样品多重化比单一测定或色谱柱多重化快至少2倍。在某些实施方式中，本文提供的样品多重化比单一测定快至少3倍。在某些实施方式中，本文提供的样品多重化比单一测定快至少4倍。
在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于10ng/dL。在一些实施方式中，该方法的定量限小于或等于5ng/dL。在一些实施方式中，该方法的定量限小于或等于4ng/dL。在一些实施方式中，该方法的定量限小于或等于3ng/dL。在一些实施方式中，该方法的定量限小于或等于2ng/dL。在一些实施方式中，该方法的定量限小于或等于1ng/dL。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括在2.5ng/dL至2,000ng/dL范围内的定量线性。在一些实施方式中，本文提供的方法包括在1ng/dL至2,000ng/dL范围内的定量线性。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括在8至1,200ng/dL下1％至11％或1％至9％或2％或11％的测量不精确度(CV)。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括95％和105％之间或90％至110％之间的回收率。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括高达10,000ng/dL的临床可报告范围(CRR)。
在某些实施方式中，样品是体液。在一些实施方式中，样品是血浆或血清。在一些实施方式中，样品是全血。在一些实施方式中，样品是唾液或尿液。在一些实施方式中，样品是脑脊液(CSF)。
在一些实施方式中，方法可以包括将试剂以足使样品脱蛋白的量添加至该样品。
合适的测试样品包括可能含有目标分析物的任何测试样品。在一些优选的实施方式中，样品是生物样品；即，从任何生物来源，比如动物、细胞培养物、器官培养物等获得的样品。在某些优选的实施方式中，样品从哺乳动物比如狗、猫、马等获得。特别优选的哺乳动物是灵长类，最优选的是男性或女性人类。特别优选的样品包括血液、血浆、血清、毛发、肌肉、尿液、唾液、泪液、脑脊液或其他组织样品。这种样品，例如，可以从患者获得；即，活着的人，男性或女性，其为了疾病或病况的诊断、预后或治疗而将自身置于临床环境中。测试样品优选地从患者，例如，血清获得。
如本文所使用，除非另有说明，否则单数形式“一个(a、an)”和“所述(the)”包括复数引用。因而，例如，提及“一种蛋白”的包括多种蛋白分子。
如本文所使用，术语“纯化(purification)”或“纯化(purifying)”不是指从样品去除除了目标分析物(一种或多种)以外的所有材料。相反，纯化是指相对于样品中可能干扰目标分析物的检测的其他成分富集一种或多种目标分析物的量的步骤。本文通过各种方式纯化样品，以使得能够去除一种或多种干扰物质，例如，将会干扰通过质谱法检测所选的T母离子和子离子的一种或多种物质。
如本文所使用，术语“测试样品”是指可能含有T的任何样品。如本文所使用，术语“体液”是指可以与个体的身体分离的任何流体。例如，“体液”可以包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液等。
如本文所使用，术语“衍生化”是指使两种分子反应以形成新分子。衍生化试剂可以包括异硫氰酸酯基、二硝基-氟苯基、硝基苯氧基羰基和/或苯二醛基等。
如本文所使用，术语“色谱法”是指其中当由液体或气体携带的化学混合物在固定液相或固相周围流动或流过固定液相或固相时，由于化学实体的差异分布，导致该由液体或气体携带的化学混合物被分离成各种成分的过程。
如本文所使用，术语“液相色谱法”或“LC”是指当流体均匀地渗透通过细碎物质的柱或通过毛细管通道时选择性地阻滞流体溶液的一种或多种成分的过程。阻滞是由当该流体相对于固定相(一种或多种)移动时混合物的成分在一种或多种固定相和本体流体(即，流动相)之间的分配所导致。“液相色谱法”的实例包括反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)和高湍流液相色谱法(HTLC)。
如本文所使用，术语“高效液相色谱法”或“HPLC”是指其中通过迫使流动相在压力下通过固定相——通常为密集封装的柱来增大分离度的液相色谱法。
如本文所使用，术语“高湍流液相色谱法”或“HTLC”是指利用被测定的材料通过柱填料的湍流作为进行分离的基础的色谱形式。HTLC已应用于在通过质谱法进行分析之前制备含有两种未命名药物的样品。参见，例如，Zimmer等，J.Chromatogr.A 854:23-35(1999)；也参见，美国专利号5,968,367、5,919,368，5,795,469和5,772,874，其进一步解释了HTLC。本领域普通技术人员理解“湍流”。当流体缓慢且平稳地流动时，该流动被称为“层流”。例如，以较低的流动速率移动通过HPLC柱的流体是层状的。在层流中，流体颗粒的运动是有序的，其中颗粒通常沿直线移动。在更快的速度下，水的惯性克服了流体摩擦力，并产生湍流。与不规则边界不接触的流体“超出”了因摩擦而变慢或因不平坦表面而偏转的流体。当流体湍流地流动时，它以涡流和漩涡(或涡旋)的形式流动，具有比当流动是层状的时更大的“阻力”。许多参考文献可以用于帮助确定何时流体流动是层流或湍流(例如，Turbulent Flow Analysis:Measurement and Prediction，P.S.Bernard&J.M.Wallace，John Wiley&Sons，Inc.，(2000；An Introduction to Turbulent Flow，Jean Mathieu&Julian Scott，Cambridge University Press(2001))。
如本文所使用，术语“气相色谱法”或“GC”是指如此色谱法，其中样品混合物被汽化并注入到载气(如氮气或氦气)流中，移动通过含有由液体或颗粒状固体组成的固定相的柱，并且根据化合物对固定相的亲和力分离成其成分化合物。
如本文所使用，术语“大颗粒柱”或“提取柱”是指平均粒径大于大约35μm的色谱柱。如在这种情况下所使用，术语“大约”意思是±10％。在优选的实施方式中，柱含有直径为大约60μm的颗粒。
如本文所使用，术语“分析柱”是指如此色谱柱，其具有足够的色谱板以实现样品中物质的分离，这些物质从柱洗脱足以能够确定分析物的存在或量。这种柱通常与“提取柱”区分开，提取柱的一般目的是从非保留材料中分离或提取保留材料以便获得纯化的样品用于进一步分析。如在这种情况下所使用，术语“大约”意思是±10％。在优选的实施方式中，分析柱含有直径为大约4μm的颗粒。
如本文所使用，术语“在线(on-line)”或“线上(inline)”，例如以“在线自动方式”或“在线提取”使用的，是指无需操作者干预而进行的步骤。相反，如本文所使用的术语“离线”是指需要操作者的手动干预的步骤。因而，如果对样品进行沉淀，然后将上清液手动加载到自动进样器中，沉淀和加载步骤是与后续步骤离线的。在方法的各种实施方式中，可以以在线自动方式进行一个或多个步骤。
如本文所使用，术语“质谱法”或“MS”是指通过化合物的质量来鉴定化合物的分析技术。MS是指基于离子的质荷比或“m/z”过滤、检测和测量离子的方法。MS技术通常包括(1)电离化合物以形成带电荷化合物；和(2)检测带电荷化合物的分子量并且计算质荷比。化合物可以被电离并且通过任何合适的方式检测。“质谱仪”通常包括离子发生器和离子检测器。通常，一个或多个目标分子被电离，并且离子随后被引入到质谱仪，在那里，由于磁场和电场的组合，离子沿着空间中的路径，该路径取决于质量(“m”)和电荷(“z”)。参见，例如，美国专利号6,204,500，其名称为“Mass Spectrometry From Surfaces”；6,107,623，其名称为“Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry”；6,268,144，其名称为“DNADiagnostics Based On Mass Spectrometry”；6,124,137，其名称为“Surface-EnhancedPhotolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes”；Wright et al.,Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2:264-76(1999)；以及Merchant and Weinberger，Electrophoresis 21:1164-67(2000)。
如本文所使用，术语“以负离子模式运行”是指其中生成并检测负离子的那些质谱法。如本文所使用的术语“以正离子模式运行”，是指其中生成并检测正离子的那些质谱法。
如本文所使用，术语“电离”(“ionization”或“ionizing”)是指生成具有等于一个或多个电子单元的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单元的净负电荷的那些，而正离子是具有一个或多个电子单元的净正电荷的那些。
如本文所使用，术语“电子电离”或“EI”是指其中气相或蒸汽相中的目标分析物与电子流相互作用的方法。电子与分析物的碰撞产生了分析物离子，然后可以对其进行质谱技术。
如本文所使用，术语“化学电离”或“CI”是指其中使试剂气体(例如，氨气)进行电子碰撞，并且通过试剂气体离子与分析物分子的相互作用形成分析物离子的方法。
如本文所使用，术语“快原子轰击”或“FAB”是指其中高能原子束(通常为Xe或Ar)碰撞非挥发性样品，解吸并电离样品中含有的分子的方法。将测试样品溶解在粘性液体基质中，比如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯基辛基醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。为化合物或样品选择合适的基质是一个经验过程。
如本文所使用，术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”是指其中非挥发性样品暴露于激光照射的方法，其通过各种电离途径使样品的分析物解吸并电离，该电离途径包括光致电离、质子化、去质子化和簇衰变。对于MALDI，样品与能量吸收基质混合，所述能量吸收基质促进分析物分子的解吸。
如本文所使用，术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”是指其中非挥发性样品暴露于激光照射的另一种方法，其通过各种电离途径解吸并电离样品中的分析物，该电离途径包括光致电离、质子化、去质子化和簇衰变。对于SELDI，样品通常与优先保留一种或多种目标分析物的表面结合。如在MALDI中，该过程也可以采用能量吸收材料以促进电离。
如本文所使用，术语“电喷雾电离”或“ESI”是指其中使溶液沿着毛细管的较短长度通过的方法，在该毛细管的末端施加较高的正电势或负电势。到达管末端的溶液被汽化(雾化)成溶剂蒸气中非常小的溶液液滴的喷射或喷雾。该液滴的雾气流动通过蒸发室，该蒸发室被稍微加热以防止冷凝并蒸发溶剂。随着液滴变小，表面电荷密度增大，直到相同电荷之间的自然排斥导致离子以及中性分子被释放时为止。
如本文所使用，术语“大气压化学电离”或“APCI”是指类似于ESI的质谱法；然而，APCI通过在大气压下发生在等离子体内的离子-分子反应产生离子。通过喷雾毛细管和对电极之间的放电来维持等离子体。然后，通常通过使用一组差别泵送的撇取器站将离子提取到质量分析仪。干燥和预热N2气体的逆流可以用于改善溶剂的去除。对于分析较小极性的物质，APCI中的气相电离可能比ESI更有效。
如本文所使用的术语“大气压光致电离”或“APPI”是指如此形式的质谱法，其中分子M的光致电离的机制是光子吸收和电子喷射以形成分子离子M+。因为光子能量通常刚好在电离电势以上，所以分子离子较不易于离解。在许多情况下，可能的是，对样品进行分析而不需要色谱法，因而节省了显著的时间和费用。在水蒸气或质子溶剂的存在下，分子离子可以提取H以形成MH+。如果M具有较高的质子亲和力，则这倾向于发生。因为M+和MH+的和是恒定的，因此这不影响定量准确度。质子溶剂中的药物化合物通常观察为MH+，然而非极性化合物比如萘或***通常形成M+。Robb,D.B.,Covey,T.R.and Bruins,A.P.(2000)：参见，例如，Robb et al.,Atmospheric pressure photoionization:An ionization methodfor liquid chromatography-mass spectrometry.Anal.Chem.72(15):3653-3659。
如本文所使用，术语“电感耦合等离子体”或“ICP”是指其中在足够高的温度下使样品与部分电离的气体相互作用，使得大部分元素被原子化和电离的方法。
如本文所使用，术语“场解吸”是指其中将非挥发性测试样品放置在电离表面上，并且使用强电场生成分析物离子的方法。
如本文所使用，术语“解吸”是指从表面去除分析物和/或分析物进入气相。
如本文所使用，术语“量化限”、“定量限”或“LOQ”是指其中测量变得数量上有意义的点。在该LOQ处的分析物响应是可鉴定的、离散的和可再现的，其具有20％的精度和80％至120％的准确度。
如本文所使用，术语“检测限”或“LOD”是测量值大于与其相关联的不确定性的点。LOD被任意限定为与零浓度的2个标准偏差(SD)。
如本文所使用，体液样品中T的“量”通常是指反映体液体积中可检测的T的质量的绝对值。然而，量还考虑了与另一个T量相比的相对量。例如，体液中T的量可以是大于或小于正常存在的T的对照或正常水平的量。
如本文所使用的关于不包括离子质量的测量的定量测量的术语“大约”，是指指示值加上或减去10％。质谱仪在确定给定分析物的质量方面可能略有不同。在离子质量或离子的质/荷比的情况下，术语“大约”是指+/-0.5个原子质量单位。
上面描述的本发明的发明内容是非限制性的，并且根据下面的发明详述和权利要求，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
附图说明
图1显示了多重***LC-MS/MS测定的分析工作流程。内标——重同位素标记的T，用于校正处理期间的样品损失。在具有
Figure BDA0002774726350000081
Quantum Ultra(Thermo FisherScientific，Waltham，MA)MS检测器的Aria TX-4 LC(Thermo Scientific，Franklin，MA)上进行LC-MS/MS。
图2显示了1次注射中1个患者试样的实例色谱(A)；和1次注射中2个患者试样的实例色谱，多重样品方法(B)。
图3显示了典型的校准曲线，其显示了(A)羟胺-衍生化T和(B)甲氧基胺-衍生化***的2.5至2,000ng/dL的10个校准点。
图4显示了多重***LC-MS/MS测定的测定性能特征。CV，变异系数；HOA，羟胺；MOA，甲氧基胺；QC，质量控制；ND，未检测到。
图5显示了在稀释患者样品之后***的回收率。
图6显示了对于(A)1,830个患者样品和(B)具有T<100ng/dL的842个患者样品的样品多重法与运行单个样品之间的比较。
具体实施方式
液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)与先前使用的用于测量***(T)的技术相比，具有改进的准确度。高通量LC-MS/MS通过色谱柱多重化实现，其中多个样品平行运行。在此，我们的目标是通过每次LC-MS/MS运行组合至少2个患者样品以进一步增大通量。“样品多重化”的原理涉及使用至少2种不同质量的衍生化试剂。患者样品分别用1种或另一种衍生化试剂标记。每个患者的结果通过衍生化试剂的特征片段的质量来区分，从而在单次LC-MS/MS运行中给出2个单独的结果。
在某些实施方式中，本文提供了用于在一次质谱测定法中检测多个患者样品中的每个的***的量的方法。方法包括不同地处理每个患者样品以形成多个处理的样品，其中由于该处理，通过质谱法可将每个处理的样品中的***与其他处理的样品中的***区分开；组合处理的样品以形成多重样品；在适于生成质谱法可检测的一种或多种离子的条件下，使多重样品经受电离源，其中由来自每个处理的样品的***生成的一种或多种离子不同于来自其他处理的样品的***的一种或多种离子；通过质谱法检测来自每个处理的样品中的***的一种或多种离子的量；并且将来自每个处理的样品中的***的一种或多种离子的量与每个患者样品中***的量相关联。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括用单次质谱测定法确定多个人类样品中的每个的***的量，该方法包括：i)使多个人类样品中的每个经受不同的衍生化试剂以在多个样品的每个中生成不同衍生化的***；ii)组合该多个样品以形成多重样品；和iii)通过质谱法定量每个样品中***的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括用单次质谱测定法确定两个人类样品中的***的量，该方法包括：i)使两个人类样品的每个经受不同的衍生化试剂以在两个样品的每个中生成不同衍生化的***；ii)将该两个样品组合以形成多重样品；和iii)通过质谱法定量每个样品中***的量。
在某些实施方式中，本文提供的衍生化试剂包括羟胺或甲氧基胺。
在一些实施方式中，本文提供的方法是完全自动化的。
在一些实施方式中，本文提供的方法是无抗体的方法。
在一些实施方式中，本文提供的纯化包括使用固相提取(SPE)提取血清。在一些实施方式中，SPE是阴离子交换固相提取。在一些实施方式中，SPE是混合模式阴离子交换固相提取。在一些实施方式中，所提取的样品被浓缩。
在一些实施方式中，本文提供的纯化包括液相色谱法。在一些实施方式中，液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)。在一些实施方式中，液相色谱法包括高湍流液相色谱法(HTLC)。
在优选的实施方式中，电离包括加热电喷雾电离(HESI)。在优选的实施方式中，电离包括以正模式电离。在一些实施方式中，电离包括以负模式电离。
在一些实施方式中，电离包括大气压化学电离(APCI)。在一些实施方式中，电离包括以正模式电离。在一些实施方式中，电离包括以负模式电离。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括对于羟胺衍生化的***，测量质荷比为304.18±0.5的前体离子的量。在一些实施方式中，本文提供的方法包括对于甲氧基胺衍生化的***，测量质荷比为318.21±0.5的前体离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括对于羟胺衍生化的***，测量质荷比为112.05±0.5或124.05±0.5的碎片离子的量。在一些实施方式中，本文提供的方法包括对于甲氧基胺衍生化的***，测量质荷比为126.07±0.5、138.07±0.5或152.08±0.5的碎片离子的量。
在一些实施方式中，本文提供的方法进一步包括添加内标。在一些实施方式中，内标被同位素标记。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括测量质荷比为307.19±0.5(羟胺衍生化)或321.21±0.5(甲氧基胺衍生化)的内标前体离子和/或质荷比为127.06±0.5(羟胺衍生化)或129.07±0.5(甲氧基胺衍生化)的产物离子的量。
在某些实施方式中，本文提供的样品多重化比单一测定或色谱柱多重化至少快2倍。在某些实施方式中，本文提供的样品多重化比单一测定至少快3倍。在某些实施方式中，本文提供的样品多重化比单一测定至少快4倍。
在某些实施方式中，该方法的定量限小于或等于10ng/dL。在一些实施方式中，该方法的定量限小于或等于5ng/dL。在一些实施方式中，该方法的定量限小于或等于4ng/dL。在一些实施方式中，该方法的定量限小于或等于3ng/dL。在一些实施方式中，该方法的定量限小于或等于2ng/dL。在一些实施方式中，该方法的定量限小于或等于1ng/dL。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括在1ng/dL至2,000ng/dL范围内的定量线性。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括在8至1,200ng/dL下的1％至11％或1％至9％或2％至11％的测量不精确度(CV)。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括95％至105％或90％至110％之间的回收率。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括高达10,000ng/dL的临床可报告范围(CRR)。
在某些实施方式中，样品是体液。在一些实施方式中，样品是血浆或血清。在一些实施方式中，样品是全血。在一些实施方式中，样品是唾液或尿液。在一些实施方式中，样品是脑脊液(CSF)。
在一些实施方式中，方法可以包括以足以使样品脱蛋白的量添加试剂至样品。
合适的测试样品包括可能含有目标分析物的任何测试样品。在一些优选的实施方式中，样品是生物样品；即，从任何生物来源比如动物、细胞培养物、器官培养物等获得的样品。在某些优选的实施方式中，样品从哺乳动物，比如狗、猫、马等获得。特别优选的哺乳动物是灵长类，最优选的是男性或女性人类。特别优选的样品包括血液、血浆、血清、毛发、肌肉、尿液、唾液、泪液、脑脊液或其他组织样品。这种样品可以，例如，从患者获得；即，有生命的人，男性或女性，其为了诊断、预后或治疗疾病或病况而将自身置于临床环境中。测试样品优选地从患者，例如，血液血清获得。
用于质谱法的样品制备
可以用于相对于样品中的其他成分(例如，蛋白质)富集T的方法包括，例如，过滤、离心、薄层色谱法(TLC)、包括毛细管电泳的电泳、包括免疫亲和分离的亲和分离、包括乙酸乙酯提取和甲醇提取的提取法以及离液剂的使用或上述的任意组合等。
蛋白沉淀是制备测试样品的一个优选方法。这种蛋白纯化法在本领域是众所周知的，例如，Polson et al.,Journal of Chromatography B 785:263-275(2003)，描述了适用于该方法的蛋白沉淀技术。蛋白沉淀可用于从样品去除大部分蛋白质，使T保留在上清液中。可以将样品离心以将液体上清液与沉淀的蛋白质分离。然后可将所得的上清液应用于液相色谱法和随后的质谱分析。在某些实施方式中，使用蛋白沉淀，比如例如，乙腈蛋白沉淀，避免了在HPLC和质谱法之前对于高湍流液相色谱法(HTLC)或其他在线提取的需求。因此，在这种实施方式中，方法涉及(1)对目标样品进行蛋白沉淀；和(2)将上清液直接加载到HPLC-质谱仪上，而无需使用在线提取或高湍流液相色谱法(HTLC)。
在一些优选的实施方式中，HPLC单独或与一种或多种纯化法组合，可以用于在质谱法之前纯化T。在这种实施方式中，可以使用HPLC提取盒提取样品，其捕获分析物，然后洗脱和在第二HPLC柱上或在分析HPLC柱上进行色谱分离，之后进行电离。因为这些色谱法过程中涉及的步骤可以以自动方式链接，所以在分析物的纯化期间对操作者参与的需求可以最小化。这种特征可以节约时间和成本，并且消除了操作者出错的机会。
据信，比如由HTLC柱和方法所提供的湍流，可以提高传质速率，改善分离特性。HTLC柱借助高色谱流动速率通过穿过含有刚性颗粒的填充柱来分离成分。通过采用高流动速率(例如，3-5mL/min)，在柱中产生湍流，从而导致固定相和目标分析物(一种或多种)之间的几乎完全的相互作用。使用HTLC柱的优势是，避免了与生物流体基质相关联的大分子积累，因为在湍流条件下，不会保留高分子量种类。在一个步骤中组合多个分离的HTLC方法减少了对于冗长的样品制备的需求，并且以显著更大的速度运行。这种方法还实现了优于层流(HPLC)色谱法的分离性能。HTLC允许直接注射生物样品(血浆、尿液等)。在传统色谱形式中难以实现直接注射，因为变性的蛋白质和其他生物碎片会迅速阻塞分离柱。HTLC还允许小于1mL、优选地小于0.5mL、优选地小于0.2mL、优选地0.1mL的非常低的样品体积。
在其他地方已经描述了在通过质谱法分析之前应用于样品制备的HTLC的实例。参见，例如，Zimmer et al.，J.Chromatogr.A 854:23-35(1999)；还参见，美国专利号5,968,367；5,919,368；5,795,469和5,772,874。在该方法的某些实施方式中，在加载到HTLC柱上之前，使样品经受如上所述的蛋白沉淀；在可选的优选实施方式中，可以将样品直接加载到HTLC而无需进行蛋白沉淀。HTLC提取柱优选地是大颗粒柱。在各种实施方式中，可以以在线、自动方式进行该方法的一个或多个步骤。例如，在一个实施方式中，以在线、自动方式进行步骤(i)-(v)。在另一个实施方式中，在步骤(i)-(v)之后在线进行电离和检测步骤。
包括高效液相色谱法(HPLC)在内的液相色谱法(LC)依赖于相对缓慢的层流技术。传统的HPLC分析依赖于柱填料，其中通过柱的样品的层流是从样品分离目标分析物的基础。技术人员将理解，在这种柱中的分离是扩散过程。HPLC已成功地应用于分离生物样品中的化合物，但是在分离和随后使用质谱仪(MS)进行分析之前，需要显著量的样品制备，这使得该技术需要大量人力。此外，大多数HPLC***没有充分利用质谱仪的最大潜力，使得仅一个HPLC***被连接至单个MS仪器，导致进行大量测定的冗长时间需求。
已经描述了在质谱分析之前使用HPLC进行样品净化的各种方法。参见，例如，Taylor et al.,Therapeutic Drug Monitoring 22:608-12(2000)；和Salm et al.,Clin.Therapeutics 22Supl.B:B71-B85(2000)。
本领域技术人员可以选择适于与T一起使用的HPLC仪器和柱。色谱柱通常包括介质(即，填充材料)来促进化学部分的分离(即，分级分离)。介质可以包括微小颗粒。颗粒包括与各种化学部分相互作用以促进化学部分的分离的结合表面。一种合适的结合表面是疏水结合表面，比如烷基结合表面。烷基结合表面可以包括C-4、C-8、C-12或C-18结合的烷基，优选地C-18结合的基团。色谱柱包括用于接收样品的入口端口和用于排出包括分级分离的样品的流出物出口端口。在一个实施方式中，将样品(或预纯化样品)在入口端口处施加至柱，用溶剂或溶剂混合物洗脱，并且在出口端口处排出。可以选择不同的溶剂模式以便洗脱目标分析物(一种或多种)。例如，可以使用梯度模式、等度模式或多型(即，混合)模式进行液相色谱法。在色谱期间，材料的分离受变量的影响，比如洗脱液(也称为“流动相”)的选择、洗脱模式、梯度条件、温度等。
在某些实施方式中，可以在其中目标分析物被柱填充材料可逆地保留，而一种或多种其他材料不被保留的条件下通过施加样品至柱来纯化分析物。在这些实施方式中，可以采用其中目标分析物被柱保留的第一流动相条件，并且一旦未保留的材料被洗涤通过，可以随后采用第二流动相条件以从柱移出保留的材料。可选地，通过在其中与一种或多种材料相比，目标分析物以不同速率洗脱的流动相条件下将样品施加至柱来纯化分析物。这种步骤可以相对于样品的一种或多种其他成分来富集一种或多种目标分析物的量。
在一个优选的实施方式中，在HTLC之后，可以在疏水柱色谱***上进行HPLC。在某些优选的实施方式中，使用来自Cohesive Technologies的TurboFlow Cyclone
Figure BDA0002774726350000141
聚合物基柱(60μm粒径，50×1.0mm柱尺寸，
Figure BDA0002774726350000142
孔径)。在相关的优选实施方式中，使用来自Phenomenex Inc的具有亲水性封端的Synergi
Figure BDA0002774726350000143
醚联苯基分析柱(4μm粒径，150×2.0mm柱尺寸，
Figure BDA0002774726350000144
孔径)。在某些优选的实施方式中，使用HPLC级超纯水和100％甲醇作为流动相进行HTLC和HPLC。
通过仔细选择阀和连接器管道，可以根据需要连接两个或多个色谱柱使得材料从一个色谱柱穿过至另一个色谱柱而无需任何手动步骤。在优选的实施方式中，通过预编程以进行必要步骤的计算机控制阀和管道的选择。最优选地，色谱***也可以以这种在线方式连接至检测器***，例如，MS***。因而，操作者可以将样品托盘放置在自动进样器中，并且其余操作在计算机控制下进行，从而纯化并分析所有选定的样品。
在某些优选的实施方式中，样品中的T或其片段可以在电离之前被纯化。在特别优选的实施方式中，色谱法不是气相色谱法。
通过质谱的检测和定量
在各种实施方式中，可以通过技术人员已知的任何方法将T或其片段电离。使用质谱仪进行质谱法，该质谱仪包括用于将分级分离的样品电离并产生用于进一步分析的带电荷分子的离子源。例如，可以通过电子电离、化学电离、加热电喷雾电离(HESI)、电喷雾电离(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光致电离、大气压光致电离(APPI)、快原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子体喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离进行样品的电离。技术人员将理解，可以基于待测量的分析物、样品类型、检测器类型、正-负模式的选择等来确定电离方法的选择。
在优选的实施方式中，通过在正离子模式下的加热电喷雾电离(HESI)将T或其片段电离。
在样品已经被电离之后，可以分析由此产生的带正电荷或带负电荷的离子以确定质荷比。用于确定质荷比的合适的分析仪包括四极杆分析仪、离子阱分析仪和飞行时间分析仪。可以使用几种检测模式来检测离子。例如，即，可以使用选择性离子监测模式(SIM)来检测所选离子，或者可选地，可以使用扫描模式，例如，多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)来检测离子。优选地，使用四极杆分析仪确定质荷比。例如，在“四极杆”或“四极杆离子阱”仪器中，振荡射频场中的离子经受的力与电极之间施加的DC电势、RF信号的振幅和质/荷比成比例。可以选择电压和振幅使得仅具有特定质/荷比的离子行进通过四极杆的长度，而所有其他离子都发生偏转。因而，四极杆仪器可以用作“质量过滤器”，并且可以用作用于注射到仪器中的离子的“质量检测器”。
人们可以通过采用“串联质谱法”或“MS/MS”来提高MS技术的分辨率。在该技术中，由目标分子生成的前体离子(也称为母离子)可以在MS仪器中过滤，并且前体离子随后被碎片化以产生一种或多种碎片离子(也称为子离子或产物离子)，然后在第二MS步骤中对其进行分析。通过仔细选择前体离子，仅某些分析物产生的离子通过到达碎片化室，在其中与惰性气体原子的碰撞产生碎片离子。因为前体和碎片离子二者在给定的一组电离/碎片化条件下都以可再现的方式产生，因此MS/MS技术可以提供非常强大的分析工具。例如，过滤/碎片化的组合可以用于消除干扰物质，并且在复杂样品——比如生物样品中可能特别有用。
质谱仪通常为使用者提供离子扫描；即，在给定范围(例如，100至1000amu)内具有特定质/荷比的每种离子的相对丰度。通过本领域已知的许多方法，可以将分析物测定的结果——即质谱，与原始样品中分析物的量相关联。例如，假设采样和分析参数被仔细控制，则可以将给定离子的相对丰度与将该相对丰度转化为原始分子的绝对量的表格进行比较。可选地，分子标准品可以与样品一起运行，并且基于由那些标准品生成的离子构建标准曲线。使用这种标准曲线，可以将给定离子的相对丰度转化成原始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中，内标用于生成计算T的数量的标准曲线。生成和使用这种标准曲线的方法在本领域是众所周知的，并且普通技术人员能够选择合适的内标。例如，T的同位素可以用作内标。用于将离子的量与原始分子的量相关联的许多其他方法对于本领域普通技术人员将是众所周知的。
可以使用自动化机器进行该方法的一个或多个步骤。在某些实施方式中，一个或多个纯化步骤在线进行，并且更优选地，可以以在线方式进行所有纯化和质谱步骤。
在某些实施方式中，比如MS/MS，其中前体离子被分离用于进一步的碎片化，碰撞活化离解通常用于生成碎片离子以便进一步检测。在CAD中，前体离子通过与惰性气体碰撞获得能量，并且随后通过被称为“单分子分解”的过程破碎。必须在前体离子中沉积足够的能量，使得离子内的某些键会由于增加的振动能而断裂。
在特别优选的实施方式中，如下所述使用MS/MS检测和/或定量T。使样品经受液相色谱法——优选地HPLC，来自色谱柱的液体溶剂流进入MS/MS分析仪的加热雾化器接口，并且溶剂/分析物混合物在接口的加热管中被转化为蒸气。通过选定的离子发生器将分析物电离。离子，例如前体离子，穿过仪器的孔口并进入第一四极杆。四极杆1和3(Q1和Q3)是质量过滤器，使得能够基于离子的质荷比(m/z)选择离子(即，“前体”和“碎片”离子)。四极杆2(Q2)是碰撞室，在其中离子被碎片化。质谱仪的第一四极杆(Q1)选择具有T的质荷比的分子。具有T的正确的质/荷比的前体离子被允许穿入到碰撞室(Q2)，而具有任何其他质/荷比的不需要的离子与四极杆的侧面碰撞并被消除。进入Q2的前体离子与中性氩气分子碰撞并破碎。该过程被称为碰撞活化离解(CAD)。所生成的碎片离子穿入到到四极杆3(Q3)，其中选择T的碎片离子，而消除其他离子。
方法可以涉及以正离子或负离子模式进行的MS/MS。使用本领域公知的标准方法，普通技术人员能够鉴定可用于四极杆3(Q3)中选择的T的特定前体离子的一种或多种碎片离子。
当离子与检测器碰撞时，它们产生电子脉冲，该电子脉冲被转化为数字信号。所采集的数据被中继到计算机，该计算机绘制收集的离子数与时间的图。所得的质谱图类似于传统HPLC方法中生成的色谱图。测量对应于特定离子的峰下面积或这些峰的振幅，并将该面积或振幅与目标分析物的量相关联。在某些实施方式中，测量碎片离子(一种或多种)和/或前体离子的曲线下面积或峰的振幅，以确定T的量。如以上所述，可以使用基于分子内标的一种或多种离子的峰的校准标准曲线将给定离子的相对丰度转化成原始分析物的绝对量。
以下实施例用于说明本发明。这些实施例决不旨在限制方法的范围。
实施例
实施例1：通过质谱法进行的多重***定量
通过将***掺加到处理的血清中制备校准标准品和质量控制(QC)。QC水平为：QC1，8ng/dL；QC2，80ng/dL；QC3，250ng/dL；QC4，1,200ng/dL。根据图1中所显示的工作流程处理了患者血浆或血清试样，以及标准品和QC的等分试样(200μL)。所有移液步骤使用与Tecan IP8联结的Hamilton Star液体处理机器人自动进行。
将待分析的样品分成两组，鉴定为样品板A和样品板B。添加内标(IS)，然后使用板内直接蛋白沉淀和过滤从样品提取(T)。两个样品板均独立地进行衍生化。使用盐酸甲氧基胺对样品板A进行衍生化；使用盐酸羟胺对样品板B进行衍生化。在衍生化之后，使用StrataC18固相提取板，通过自动化在与Hamilton STAR联结的SPEware IP8***上进行自动固相提取。在该步骤将两种衍生物(样品板A&B)组合。在洗脱之后，将样品在氮气下干燥，并在注射前重新构建。
将四十微升的样品注射到高湍流液相色谱(HTLC)***上，并且将具有加热电喷雾电离(HESI)源的TSQ Quantum Ultra MS/MS(Thermo Fisher Scientific)用作检测器。以正离子模式获得质谱仪数据。每次注射的总运行时间为6.5分钟，其包括柱平衡。使用多个通道允许每1.5分钟分析两个样品，或者在6.5分钟内分析8个样品。定量基于独特的母体产物转变。使用了以下前体-片段对或‘质量转变’：
对于羟胺衍生物及其(IS)为304.18/112.05、124.05和307.19/127.06；并且对于甲氧基胺衍生物及其IS为318.21/126.07、138.07,152.08和321.21/129.07。
在平行测试中，将多重衍生化T测定的性能与现有T测定中累积的样品丢弃物的结果进行比较(Salameh，2010)。通过当前通过LCMS/MS检测T的方法测定了259个残留试样样品。
色谱柱多重化允许每6.5分钟分析4个样品。样品多重化将通量加倍为6.5分钟内8个样品。图2比较了单个样品与样品多重化的色谱图。
该方法至2,000ng/dL是线性的(图3)，并且校准曲线显示了再现性和线性的一致性。
分析灵敏度：定量限为1ng/dL。
在8至1,200ng/dL下的测量不精确度(CV)，对于甲氧基胺衍生物为2.6％至10.3％，并且对于羟胺衍生物为1.7％至8.7％(图4)。
掺加到患者样品的QC的2至4中T的回收率在95％和105％之间(图4)。
在1:4稀释的患者样品中T的回收率在95％至109％之间(图5)；因而将羟胺和甲氧基胺衍生物二者的临床可报告范围(CRR)扩大到10,000ng/dL。
对1,830个患者丢弃物的T结果的回归分析独立地和使用多重方法进行，得出浓度范围为3至4,862ng/dL的Deming拟合为4.79+1.03x(图6a)。
对于T<100ng/dL的842个患者样品，回归分析得出Deming拟合为-1.51+1.09x(图6b)。
结论：我们开发并验证了完全自动化的“样品多重化”方法以使LC-MS/MS通量加倍，而不会影响测定的准确度和特异性。
本文所提及或引用的文章、专利、专利申请和所有其他文件和电子可用信息通过引用以其全部并入本文，其程度就如同每个单独的出版物被明确地且单独地指示为通过引用并入一样。申请人保留将来自任何这种文章、专利、专利申请或其他物理和电子文件的任何和所有材料和信息以物理方式并入本申请的权利。
本文说明性描述的方法可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实践。因而，例如，术语“包括(comprising)”、“包含(including)”、“含有(containing)”等应当可扩展地理解，且不受限制。另外地，本文所采用的术语和表述被用作描述的术语而不是限制的，并且不旨在使用这种术语和表述来排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同形式。应当认识到，在所要求保护的发明的范围内进行各种更改是可能的。因而，应当理解，虽然已经通过优选实施方式和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所公开的其中体现的本发明进行更改和变型，并且这种更改和变型被认为在本发明的范围内。
已经在本文中广泛和概括地描述了本发明。落入一般公开内容的较窄的种类和亚类分组的每一个也形成方法的一部分。这包括对方法的一般性描述，其条件或否定限制是从属中删除任何主题，而不管本文中是否具体叙述了删除的材料。
其他实施方式在所附权利要求中。此外，在以马库什组来描述方法的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此还根据马库什组的单个成员或成员的子组来描述本发明。

Claims (17)

1.一种用单次质谱测定法确定多个人类样品的每个中的***的量的方法，所述方法包括：
i)使多个人类样品的每个经受不同的衍生化试剂以在所述多个样品的每个中生成不同衍生化的***；
ii)将所述多个样品组合以形成多重样品；和
iii)通过质谱法定量每个样品中所述***的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述衍生化试剂选自氯化羟胺和氯化甲氧基胺。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括液相色谱法。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述液相色谱法包括高湍流液相色谱法(HTLC)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述电离包括加热电喷雾电离(HESI)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述电离是正离子模式。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括测量质荷比选自304.18±0.5和318.21±0.5的一种或多种前体离子的量。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括测量质荷比选自112.05±0.5、124.05±0.5、126.07±0.5、138.07±0.5和152.08±0.5的一种或多种碎片离子的量。
10.根据权利要求1所述的方法，进一步包括添加内标。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述内标被同位素标记。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法包括测量质荷比选自307.19±0.5和321.21±0.5的一种或多种内标前体离子或质荷比选自127.06±0.5和129.07±0.5的一种或多种产物离子的量。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法的定量限小于或等于1ng/dL。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法的定量线性在1ng/dL至2,000ng/dL范围内。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是完全自动化的。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是无抗体的。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是血清。
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