CN112175977B - 一种米曲霉角蛋白酶基因及其表达载体与应用 - Google Patents

一种米曲霉角蛋白酶基因及其表达载体与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种米曲霉角蛋白酶基因及其表达载体与应用。具体技术方案为：一种角蛋白酶表达基因，其DNA序列如SEQ ID No：1所示。该基因表达了一种角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。本发明提供了一种新的可表达角蛋白酶的基因资源，并将该基因与质粒结合，转入菌株中生产角蛋白酶，丰富了角蛋白酶的来源。

Description

一种米曲霉角蛋白酶基因及其表达载体与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种米曲霉角蛋白酶基因及其表达载体与应用。
背景技术
我国的畜禽资源极为丰富，年产羽毛约为200万吨，其中大部分羽毛并未得到合理利用。如果直接将羽毛排放到环境中，不仅是巨大的浪费，还会造成污染。
将羽毛破碎形成的羽毛粉营养丰富，羽毛粉中粗蛋白质含量达80％以上。但与此同时，羽毛粉中富含角蛋白，难以被直接消化利用，从而降低了羽毛粉的饲用价值。角蛋白酶(Keratinase)是一种能够降解角蛋白的蛋白酶类，能够有效水解动物毛发、羽毛等富含角蛋白的原料，因而在饲料、皮革、医药业、食品等工业及环境治理方面具有广阔的应用前景。但目前已报道的角蛋白酶较少，且酶活较低，难以规模化应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种米曲霉角蛋白酶及其表达菌株和应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种角蛋白酶表达基因，其DNA序列如SEQ ID No：1所示。
相应的，所述角蛋白酶表达基因表达的角蛋白酶。
相应的，一种角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
相应的，所述角蛋白酶表达基因在表达角蛋白酶中的应用，将所述角蛋白酶表达基因与质粒连接后，转化到菌株中转录表达角蛋白酶。
优选的，启动基因发生转录表达的启动子为GAP启动子。
优选的，含所述GAP启动子的质粒为pGAPZ A、pGAPZ B、pGAPZ C和pGAPZα中的任意一种。
优选的，启动基因发生转录表达的启动子为甲醇启动子。
优选的，含所述甲醇启动子的质粒为pPIC9K。
相应的，所述基因表达的角蛋白酶在降解角蛋白中的应用。
本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种新的可表达角蛋白酶的基因资源，并将该基因与质粒结合，转入菌株中生产角蛋白酶，丰富了角蛋白酶的来源。
附图说明
图1为pGAPZA-AoKerase11酶连产物结构示意图；
图2为pPIC9K-AoKerase11酶连产物结构示意图；
图3为PCR验证两种重组的毕赤酵母表达菌株示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种新的基因资源：AoKerase11。其序列如SEQ ID No：1所示。该基因可表达角蛋白酶，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一：获得可表达角蛋白酶的菌株
选择米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株CGMCC 3.13905，购自于中国普通微生物菌种保存管理中心。在PDA培养基中28℃下培养3天，收集菌丝体并提取总mRNA。以mRNA为模板，反转录得到cDNA。再以cDNA为模板，通过PCR技术克隆获得AoKerase11基因的编码序列，具体如SEQ ID No：1所示。将编码序列DNA片段用限制性内切酶EcoR I与Not I进行双酶切，获得酶切后的编码序列DNA片段。用限制性内切酶EcoR I与Not I，同时对组成型表达质粒pGAPZA、甲醇诱导型质粒pPIC9K进行双酶切，获得两种质粒片段。其中，质粒pGAPZA和质粒pPIC9K购自赛默飞世尔科技有限公司(https://www.thermofisher.com)。
通过琼脂糖凝胶电泳对上述酶切后的编码序列DNA片段和质粒片段进行分离纯化，再用DNA连接酶分别将酶切后编码序列DNA与上述两种质粒片段分别进行酶连，获得两种酶连产物。酶连结果分别如图1(pGAPZA-AoKerase11)和图2(pPIC9K-AoKerase11)所示。将两种酶连产物分别转化进大肠杆菌DH5α菌株，挑取单克隆菌株，在LB培养基中37℃条件下培养3天后，提取重组质粒pGAPZA-AoKerase11和pPIC9K-AoKerase11。将这两种质粒分别用内切酶Sal I酶切线性化，再分别通过电转化方法转化进毕赤酵母。挑取转化子，PCR验证获得两种重组的毕赤酵母表达菌株，验证结果如图3所示。图3中，泳道M表示标准的不同分子量marker DNA，泳道1～3分别表示3个含有pGAPZA-AoKerase11质粒的重组毕赤酵母菌株PCR条带(3个重复)，泳道4～6分别表示3个含有pPIC9K-AoKerase11质粒的重组毕赤酵母菌株PCR条带(3个重复)。结果表明，利用两种不同质粒，均可成功将AoKerase11基因重组进毕赤酵母。
实施例二：角蛋白酶酶解性能展示
1、将实施例一中获得的携带有pGAPZA-AoKerase11的毕赤酵母表达菌株接种到BMMY培养基中，在30℃条件下培养1天，离心获得菌体。质粒pGAPZA的启动子为GAP启动子，甘油等碳源能够诱导其下游基因表达。因此将离心获得的菌体重新接种到新鲜的BMMY培养基中，培养基中加入1％的甘油(v/v)，培养5～7天，随后离心收集菌体。
超声波破碎菌体，离心除去沉淀物，取1.0mL的破碎液(pH＝6.5)，加入10mg羽毛粉做为底物，在30℃、150rpm的条件下，反应3分钟。结果显示：部分羽毛粉颗粒被水解后消失，利用分光光度计测定280nm处吸光值从水解前的0.02上升到0.87。对照组为不包含AoKerase11基因的酵母菌，其余条件相同，其破碎液于羽毛粉反应后，在280nm处的吸光值没有变化，水解前后吸光值均为0.02。从而确定破碎液中的角蛋白酶AoKerase11具有降解角蛋白的能力。
按上述步骤培养和制备含有AoKerase11的粗酶液。以羽毛粉为原料，在30℃条件下测定粗酶液中的角蛋白酶活力为56.7U/mL。一个酶活单位(U)指：在30℃时，每增加280nm处的吸光值0.01所需要的酶量。全文酶活单位均为此。
研究进一步通过镍离子亲和层析技术，获得纯化的AoKerase11。具体步骤如下：将培养好的发酵液离心，弃上清液，收集菌体。使用超声波破碎仪进行细胞破碎，然后离心除去沉淀物，获得含有AoKerase11的上清液。再将上清液加入镍离子亲和层析柱，保持30分钟后，使用含有300mM咪唑的磷酸缓冲液(50mM，pH＝7.0)进行洗脱，获得纯化的AoKerase11蛋白。测定纯化后的角蛋白酶AoKerase11酶活为130U/mg。
2、将实施例一中构建的含有pPIC9K-AoKerase11的毕赤酵母表达菌株接种到BMMY培养基中，在30℃条件下培养1天，离心获得菌体。由于质粒pPIC9K上携带有甲醇启动子，因此将离心获得的菌体接种到新鲜的BMMY培养基中时，需要在培养期间每天加入1％(v/v)甲醇，以诱导角蛋白酶进行表达。继续培养5～7天后，再次离心收集菌体。超声波破碎菌体，按实施例二、步骤1中所述实验方法，验证重组菌株能够产生角蛋白酶。制备重组角蛋白酶AoKerase11，获得含有AoKerase11的粗酶液。以羽毛粉为原料，在30℃条件下测定粗酶液中的角蛋白酶活力为22.6U/mL。
发明人发现：不同启动子对表达产生的角蛋白酶AoKerase11的酶活影响较大。其中，pGAPZA质粒效果最好，可能是由于其所含的GAP启动子能够更高效的促进角蛋白酶AoKerase11的转录，进而导致表达更多的AoKerase11蛋白。
与质粒pGAPZ A相比，质粒pGAPZ B和pGAPZ C仅在酶切位点上有所不同，质粒pGAPZα只是多了一个信号肽，不影响角蛋白酶的表达。试验证明，这些质粒均能够用于角蛋白酶AoKerase11的表达。按实施例一和实施例二步骤1的方法分别构建pGAPZB-AoKerase11、pGAPZC-AoKerase11和pGAPZα-AoKerase11，获得的未提纯角蛋白酶的酶活范围为56.7±0.5U/mL，提纯角蛋白酶的酶活范围为130±0.3U/mg。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种米曲霉角蛋白酶基因及其表达载体与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 978
<212> DNA
<213> 角蛋白酶(AoKerase11)
<400> 1
atggaggagt tattagcaaa acaccgcaag gaacaaaaag atctccaagc acgcatcact 60
cagaagaaga aatctgccac gaagaagacc cgccgaggaa ttaacgaaga atgcgagaga 120
cttcagaggg agctttccga acgacaccag gccgagattg cagagttgaa tggcgagcct 180
gccccgcccg ttgacgacct cgacgatctc agtttgaatg gaactgaaga agataaaaca 240
cagaaagacc atgccgatag ttcacaaaat cctccttcga tagataattc tccagataca 300
tcttcagcga cctcagagtc ctccgcttcc tcaccacgac ctaagaaacc aaatcgccaa 360
aaggctcgtc tggcacgtcg cgccgcggag caagcggcgc agtctgccat tgccgcggaa 420
gaagctgcaa aacaaacgga tcatcgtgga gatgaacaag aggtcatgga tggtgttttt 480
aaacggttgg ggttgaagca ggttgagata aagcccgatg ggcactgtct ctactccgct 540
attgcctacc agctggaaat gctgggtctg ggattgaaac ctgacccaaa aagaatcatc 600
cttgagaacc cgactcagtc ccgcattgat accgtagctt cccctcagca cgatggctat 660
agagcagtta gggctgttac ggccgatttc ataaacgagc accatgatga ttttgtgccc 720
ttcatggagg agcccgtgga actatacaca cgcaagatca agcttacagc agagtggggt 780
gggcaattgg agctattagc gattgctagg gcatatggcg tggaaatcaa cgtcatacaa 840
ggtgacggaa ggatcgaaaa gatcgaaggt gatactcaag agtatgatga cgaacagaag 900
agcaaacgcg ttatttggtt ggcctactat cggcatacgt acggtctcgg tgagcattat 960
aatgcgctta tgaaatga 978
<210> 2
<211> 325
<212> PRT
<213> 角蛋白酶(AoKerase11)
<400> 2
Met Glu Glu Leu Leu Ala Lys His Arg Lys Glu Gln Lys Asp Leu Gln
1 5 10 15
Ala Arg Ile Thr Gln Lys Lys Lys Ser Ala Thr Lys Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Gly Ile Asn Glu Glu Cys Glu Arg Leu Gln Arg Glu Leu Ser Glu Arg
35 40 45
His Gln Ala Glu Ile Ala Glu Leu Asn Gly Glu Pro Ala Pro Pro Val
50 55 60
Asp Asp Leu Asp Asp Leu Ser Leu Asn Gly Thr Glu Glu Asp Lys Thr
65 70 75 80
Gln Lys Asp His Ala Asp Ser Ser Gln Asn Pro Pro Ser Ile Asp Asn
85 90 95
Ser Pro Asp Thr Ser Ser Ala Thr Ser Glu Ser Ser Ala Ser Ser Pro
100 105 110
Arg Pro Lys Lys Pro Asn Arg Gln Lys Ala Arg Leu Ala Arg Arg Ala
115 120 125
Ala Glu Gln Ala Ala Gln Ser Ala Ile Ala Ala Glu Glu Ala Ala Lys
130 135 140
Gln Thr Asp His Arg Gly Asp Glu Gln Glu Val Met Asp Gly Val Phe
145 150 155 160
Lys Arg Leu Gly Leu Lys Gln Val Glu Ile Lys Pro Asp Gly His Cys
165 170 175
Leu Tyr Ser Ala Ile Ala Tyr Gln Leu Glu Met Leu Gly Leu Gly Leu
180 185 190
Lys Pro Asp Pro Lys Arg Ile Ile Leu Glu Asn Pro Thr Gln Ser Arg
195 200 205
Ile Asp Thr Val Ala Ser Pro Gln His Asp Gly Tyr Arg Ala Val Arg
210 215 220
Ala Val Thr Ala Asp Phe Ile Asn Glu His His Asp Asp Phe Val Pro
225 230 235 240
Phe Met Glu Glu Pro Val Glu Leu Tyr Thr Arg Lys Ile Lys Leu Thr
245 250 255
Ala Glu Trp Gly Gly Gln Leu Glu Leu Leu Ala Ile Ala Arg Ala Tyr
260 265 270
Gly Val Glu Ile Asn Val Ile Gln Gly Asp Gly Arg Ile Glu Lys Ile
275 280 285
Glu Gly Asp Thr Gln Glu Tyr Asp Asp Glu Gln Lys Ser Lys Arg Val
290 295 300
Ile Trp Leu Ala Tyr Tyr Arg His Thr Tyr Gly Leu Gly Glu His Tyr
305 310 315 320
Asn Ala Leu Met Lys
325

Claims (6)

1.一种角蛋白酶表达基因在表达角蛋白酶中的应用，其特征在于：将所述角蛋白酶表达基因与质粒连接后，转化到菌株中转录表达角蛋白酶；所述角蛋白酶表达基因的DNA序列如SEQ ID No：1所示。
2.根据权利要求1所述角蛋白酶表达基因在表达角蛋白酶中的应用，其特征在于：启动所述角蛋白酶表达基因发生转录表达的启动子为GAP启动子。
3. 根据权利要求2所述角蛋白酶表达基因在表达角蛋白酶中的应用，其特征在于：含所述GAP启动子的质粒为pGAPZ A、pGAPZ B、pGAPZ C和pGAPZα中的任意一种。
4.根据权利要求1所述角蛋白酶表达基因在表达角蛋白酶中的应用，其特征在于：启动所述角蛋白酶表达基因发生转录表达的启动子为甲醇启动子。
5.根据权利要求4所述角蛋白酶表达基因在表达角蛋白酶中的应用，其特征在于：含所述甲醇启动子的质粒为pPIC9K。
6. 一种角蛋白酶在降解角蛋白中的应用，其特征在于：所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
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