CN112166196A

CN112166196A - 大核酸的靶向细胞内递送

Info

Publication number: CN112166196A
Application number: CN201980032988.0A
Authority: CN
Inventors: U·布林克曼; T·基利安
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2021-01-01
Also published as: KR20200143731A; CA3097512A1; JP2021523727A; AU2019269066B2; MX2020012378A; JP7206297B2; KR102470059B1; US20210061867A1; AU2019269066A1; EP3794132A1; WO2019219721A1

Abstract

本文报告了一种用于将大核酸靶向递送至真核细胞的细胞核的组合物，所述组合物包含呈经组装的核小体形式的组蛋白、大核酸、半抗原和双特异性结合剂的非共价复合物，所述双特异性结合剂对所述半抗原具有第一结合特异性并且对所述真核细胞上呈递的细胞表面靶标具有第二结合特异性，其中所述组蛋白和/或所述核酸共价结合/缀合至所述半抗原，所述组蛋白和所述大核酸彼此(非共价)缔合/形成非共价复合物，并且所述半抗原和所述双特异性结合剂通过所述双特异性结合剂的所述第一结合特异性彼此缔合/彼此结合。

Description

大核酸的靶向细胞内递送

技术领域

本发明属于核酸递送领域。本文报告了一种用于将大核酸靶向递送至真核细胞的细胞核的组合物，包含组蛋白、大核酸、半抗原和双特异性结合剂的非共价复合物，该双特异性结合剂对于该半抗原具有第一结合特异性并且对于呈递在该真核细胞上的细胞表面靶标具有第二结合特异性。

背景技术

遗传物质在细胞核中是有活性的。转运可在细胞***期间当核被膜在有丝***过程中短暂瓦解时碰巧地发生，或者不得不主动进行。因此，对于遗传物质转移至所有那些在该遗传物质的期望表达之前的时间内不***的细胞中来说，主动转运至活细胞的细胞核内是必需的。核酸的核转运***非常重要，因为它可以有效地将DNA转移至那些很少分离或根本不***的细胞内。大多数原代细胞属于这一种。出于两个原因，科学界对于原代细胞的关注最高。首先，这些从有机体新鲜分离的细胞比从它们衍生的细胞系更好地反映该细胞类型的功能状态。其次，它们是基因疗法的靶标细胞。此外，通过令那些在开始转移和分析之前的时间内尚未***的细胞能够表达所转移的遗传物质，细胞核转运***增加了DNA转移至所建立的细胞系中的效率。

包被细胞核的双层膜包括孔。小分子可通过扩散穿过这些孔。为了能够进入细胞核，大于约50kDa的蛋白质需要必须被转运机构识别的核定位信号(NLS)。NLS是一种信号肽，其介导被转运物(可为另一种肽)从细胞的细胞质至细胞核的转移。通常，功能信号由四个至八个氨基酸组成，富含正氨基酸精氨酸和赖氨酸并且含有脯氨酸。它在进化过程中非常保守，使得哺乳动物NLS在酵母中也发挥作用。一种经典的NLS为，例如，SV40大T抗原核心序列PKKKRKV。异源NLS也可用作将靶标分子转运至细胞核内的工具。对于这一目的，可将NLS并入细胞质蛋白序列中的相对随机位置或可将NLS肽与蛋白质或甚至金颗粒化学偶联(在Gorlich,D.,EMBO J.17(1998)2721-2727中综述)。关于NLS的概述由Boulikas给出(Boulikas,T.,Crit.Rev.Eukaryot.Gene Expr.3(1993)193-227)。

靶向基因递送是一种通过提供基因产物或通过改变患者的基因设定来解决获得性或遗传性疾病的治疗方法。迄今为止，用于基因疗法的大多数核酸递送方法是基于病毒载体或阳离子脂质和具有转染样特性的聚合物。抗体或抗体衍生物(诸如scFv)或其它细胞或组织结合实体可连接至此类脂质体性或病毒递送实体，目的为改善核酸递送的靶向特异性和效力(参见，例如，Kim,K.S.等人，Cancer Gene.Ther.15(2008)331-340；Zhang,Y.&Pardridge,W.M.,Pharm.Res.26(2009)1059-1063；Xu,L.,Pirollo,K.F.&Chang,E.H.,J.Contr.Rel.74(2001)115-128)。

经由衍生自病毒的实体的基因递送牵涉复杂过程以生成递送***。它牵涉可被人类免疫***识别的病毒成分。免疫原性呈递为潜在的安全性和PK问题并且可干扰靶向基因递送的效力(Nayak,S.&Herzog,R.W.,Gene Ther.17(2010)295-304；Mingozzi,F.&High,K.A.,Blood 122(2012)23-36)。

合成的递送复合物诸如与脂质或聚合物组合的DNA的复杂度较低并且不携带病毒成分。但是，它们的有效性往往低于经由衍生自病毒的实体进行的基因递送。纳米颗粒和/或具有转染样功能性的实体所固有的非特异性膜相互作用特性也产生潜在的安全/PK问题(Bartneck,M.,Warzecha,K.T.&Tacke,F.,Hepatobiliary Surg.Nutr.3(2014)364-376)。

本领域当前状态下的衍生自病毒以及脂质/聚合物的递送媒介物固有地与生物膜相互作用。对于令核酸能够细胞内吸收和/或胞内体逃逸，这是必需的。膜相互作用特性可支持蓄积在或递送至富含膜的器官诸如肝或肺内。另一方面，它确实为递送至其它靶标器官、组织或细胞提供了障碍。

组蛋白在DNA转染中的效力已经有所描述(Balicki and Beutler,Mol.Med.3(1997)782-787；Budker等人，BioTechniques 23(1997)139-147；Chen等人，Hum.GeneTher.5(1994)429-435；Fritz等人，Hum.Gene Ther.7(1996)1395-1404；Hagstrom等人，Biochim.Biophys.Acta 1284(1996)47-55)。到目前为止，在全部组蛋白亚类中，组蛋白H2A在介导DNA转染中最为有效(Balicki and Beutler,supra,1991)。

Nagasaki等人(Bioconjug.Chem.14(2003)282-286)证明，不能通过将DNA与经典阳离子NLS的缀合物注射入细胞的细胞质中来实现质粒DNA的核定位。另一方面，已经描述了几种人工***，它们被认为可借助含有核定位信号的肽或蛋白质来增加转染效率。

Subramanian等人(Nat.Biotechnol.17(1999)873-877)公开了非经典NLS与从SV40 T抗原共有NLS的错义序列衍生的阳离子肽支架的缀合物，以便改善借由不***细胞的脂质转染进行的细胞核导入的最后步骤。

US 5,670,347公开了由DNA结合碱性区、柔性铰链区和NLS组成的肽。在这种情况下，由于DNA结合也是通过氨基酸的正电荷实现的，该试剂与DNA形成复合物，这意味着同时用于跨细胞膜转运。NLS序列为何不应参与DNA的结合尚不清楚，因此只要该肽与之链接，则核转运蛋白的实际信号就有可能被DNA掩蔽。此外，所生成的复合物可变得非常大，这将会损害通过核孔的转运。

WO 2000/40742公开了一种细胞核转运剂，其包含特异性地结合至DNA的DNA结合部分以及具有基本上中性静电荷的扩展核定位信号。

WO 2001/38547公开了一种用于将分子转移至真核细胞内的多肽，其包含至少两个肽单体，每个肽单体包括核定位信号或蛋白质转导结构域。所使用的核定位信号是天然地出现在蛋白质中的经典NLS。

WO 2001/81370公开了一种基因递送***，其中通常衍生自组蛋白H2A的基因递送促进肽与核酸复合，以有效且稳定地将核酸递送至细胞内，并最终递送至细胞核。此类肽介导的基因递送基于以下原理：组蛋白上的非中性化的正电荷通过DNA的带负电磷酸主链静电结合，并且组蛋白中的细胞核靶向信号改善DNA至细胞核的运输以进行转录。还公开了分离的基因递送促进肽，该肽包含至少7个氨基酸，优选17个氨基酸，衍生自组蛋白H2A的N-末端区域，其中该肽表现出转染活性和核定位活性。也公开了一种复合物，其包含与核酸复合的此类肽。还公开了包含该复合物和转染增强培养基的溶液。

WO 2001/81370中公开，所测试的阳离子聚合物全部结合至DNA，如琼脂糖凝胶电泳所证明，但只有DNA结合对于转染是不足够的，并且组蛋白H2A中的氨基酸序列存在特殊之处，而这是其有效介导基因递送的卓越能力的原因。WO 2001/81370中还公开，H2A的促进转染和核定位的活性部位横跨残基1-36并且具备核定位信号(NLS)和DNA裁剪特性两者。

WO 2002/055721公开了包含蛋白质的模块化转染***，若将其加载至待转染的核酸上，则该蛋白质能够形成核蛋白丝(NPF)。该NPF形成蛋白质可使用核定位信号修饰，以便改善核酸到真核细胞的细胞核内的转运。

WO 2008/031598公开了一种用于将核酸转运至真核细胞内的转运剂和一种用于生产该剂的方法。该转运剂包含能够与至少一种核酸分子形成复合物并缩合该核酸分子的复合物形成部分，以及至少一个包含至少一个核定位信号并且具有大约中性的静电荷的核定位部分。WO 2008/031598中公开，将结合并缩合核酸分子的部分与包含NLS但具有基本上中性静电荷的部分组合，获得有效的转运剂，该转运剂允许将分子高效转移至真核细胞内。

但是，经典核定位信号的一个缺点是，它们倾向于经由它们的正电荷结合核酸，使得这些电荷被掩蔽并且它们作为细胞核转运机构的信号的功能显著受损。

Cristiano,R.J.等人公开了表皮生长因子介导的经由表皮生长因子受体将DNA递送至肺癌细胞内(Cancer Gene Ther.3(1996)4-10)。在Cristiano等人的方法中，使用病毒进行到细胞质或细胞核内的细胞内递送。使用经由聚赖氨酸进行的非特异性的、电荷介导的相互作用将修饰附接至DNA(EGF或病毒)。

Schneider,B.等人公开了通过双特异性洋地黄毒苷结合抗体介导的靶向siRNA递送和mRNA敲除(Mol.Ther.Nucleic Acids 1(2012)e46)。在Schneider等人的方法中，使用脂质、化学生成的纳米颗粒或具有细胞穿透肽的复合物进行小siRNA分子到细胞质或细胞核内的细胞内递送。

EP 0 779 365 A2公开了将核酸引入细胞内用于治疗性或诊断性用途的方法。这些方法基于经化学修饰的DNA与抗体形成的复合物。在EP 0 779 365 A2的方法中，使用病毒或细菌来源的结构域进行到细胞质或细胞核内的细胞内递送。

发明内容

本文报告了一种用于将大核酸引入真核细胞内的组合物。该方法不适用于小核酸诸如siRNA或LNA。所引入的大核酸可助长由包含在该大核酸上的结构性基因编码的多肽的瞬时或稳定表达。

本发明至少部分地基于以下发现：只有正确组装的和功能性的染色质才能成功地将大分子靶向细胞内。还已经发现，无论是不正确组装的染色质，还是非特异性的组蛋白聚集体，都不能在大核酸的靶向递送中起作用。

与组蛋白或细胞穿透肽等的非特异性组装的复合物相比，根据本发明的用于靶向递送大核酸的实体在大核酸的细胞内递送中更有效。

根据本发明的实体和方法不含病毒、细菌或化学合成来源的化合物或实体。

因此，已经发现，对于大核酸的有效细胞内递送，组蛋白首先不得不组装至正确折叠的和功能性的染色质中，并且其次不得不与靶向结构域/实体组合。

将组蛋白确定组装至功能性染色质内导致与待递送的大核酸的确定相互作用，并且对于大核酸的细胞内递送是必要的。

该领域已知的是，在例如转染增强培养基或缓冲液中“转染”肽或多肽。如本文所报告的组合物适用于在常规培养基中的靶向吸收。不需要设计特定培养基来使得如本文所报告的组合物的使用变得容易。

该领域已知的是，“转染”不具靶向性并因此不具特异性，即，呈递在溶液中的所有细胞无论其表型如何都被转染。因此，使用该领域已知的方法不可能选择细胞群体的特定亚群体进行转染。使用如本文所报告的组合物，这不是问题。借由该靶向性，可在细胞的大群体中选择性地鉴定对于一种或多种特异性细胞表面标记物即细胞表面靶标呈阳性的细胞亚群体。因此，当在体内应用时，可避免不希望的“副作用”。已经指出，如本文所报告的组合物在不存在呈递各自细胞表面靶标的细胞的情况下是无活性的，即，不转染。这在体内使用期间提供了额外的安全性。

本发明至少部分地基于以下发现：使用如本文所报告的组合物可实现靶标特异性的大核酸递送。

该领域已知的是，包含组蛋白和DNA的非确定复合物。如本文所报告的组合物是(化学计量学)确定的组合物。如本文所报告的组合物基于正确且确定地组装的核小体。这导致改善的转染效率。

本发明至少部分地基于以下发现：使用如本文所报告的组合物，不需要添加(即，可省略)转染增强剂。因此，例如，对细胞在转染之后的存活率的影响(如果有)得以减小或甚至可忽略不计。

本发明至少部分地基于以下发现：在相当的条件下，与已知方法相比，使用如本文所报告的组合物改善了转染效率。

本发明包含用于包括表达质粒在内的大核酸的靶向细胞内递送和细胞内功能性的实体。这些实体包含

(i)待递送的核酸诸如例如质粒，

(ii)功能化地与该核酸组装以形成一个或多个核小体的一个或多个组蛋白，

和

(iii)缀合至质粒-核小体组装体的细胞表面靶向实体(这一细胞表面靶向实体令特异性递送至确定的细胞群体和确定的细胞群体内成为可能)。

可使用不同途径实现细胞表面靶向实体与核酸-核小体复合物的缀合。一种可能性是通过将半抗原附接至组蛋白(例如，经由化学或基因缀合)或质粒DNA(例如，经由DNA结合肽)，之后与半抗原结合双特异性抗体(bsAbs)进行复合作用。另一种可能性是通过细胞表面靶向实体与组蛋白的直接重组融合或化学缀合。

根据本发明的新递送实体不含病毒成分。此外，这些实体带有低免疫原性风险，因为它们的蛋白质成分是从人类序列(人组蛋白和人源化抗体衍生物)生成的。此外，这些递送实体显示没有或仅有非常低的非特异性膜相互作用特性。该细胞表面靶向实体无法识别的细胞对其吸收的缺失已经证实了这一点。将基因递送至表达该细胞表面靶向实体所识别的表面抗原的细胞内的效力达到与病毒递送相当的水平，并且比转染样纳米颗粒/聚合物方法更有效。

如本文所报告的一个方面是，用于将大核酸靶向递送至真核细胞的细胞核的组合物，其包含：

-组蛋白(一种或多种组蛋白多肽)，

-大核酸，

-半抗原，和

-双特异性结合剂，其具有对于该半抗原的第一结合特异性(第一结合位点特异性地结合至该半抗原)和对于该真核细胞上抗原(呈递在该真核细胞上的细胞表面靶标)的第二结合特异性(第二结合位点)，

其中

-该组蛋白和/或该核酸共价地结合/缀合至该半抗原，

-该组蛋白和该大核酸彼此(非共价地)缔合/形成非共价复合物/形成功能性染色质复合物/形成(一个或多个)核小体，并且

-该半抗原和该双特异性结合剂彼此缔合/通过该双特异性结合剂的第一结合特异性彼此结合。

在一个实施例中，组蛋白和大核酸形成(功能性)染色质。

在一个实施例中，该组合物不含细菌蛋白质。

在一个实施例中，该组合物不含病毒组分，但大核酸除外。

在一个实施例中，该组合物的组分形成(化学计量学地)确定的和/或稳定的和/或可分离的复合物。

在一个实施例中，该组合物的效率是包含非确定/非特异性的组蛋白-核酸复合物即非功能性染色质的组合物的效率的至少2倍。

在一个实施例中，该组合物还包含足够数目组蛋白多肽，以便将大核酸组装至一个或多个核小体中。在一个实施例中，该组合物包含至多/大约/约1个核小体每150bp大核酸。

在一个实施例中，该组合物还包含约8个组蛋白多肽每至多150bp大核酸。

在一个实施例中，该组合物还包含约一个核小体每至多150bp大核酸。

在一个实施例中，该组合物中的组蛋白是两种或更多种不同组蛋白的混合物。在一个实施例中，该混合物是组蛋白H2A、H2B、H3和H4的混合物。

在一个实施例中，该组合物中的一种组蛋白/多种组蛋白是小牛胸腺组蛋白、鸡红细胞组蛋白、重组人组蛋白或它们的混合物。

在一个实施例中，该组合物中的一种组蛋白/多种组蛋白是组蛋白H2A多肽和组蛋白H3多肽的混合物。

在一个实施例中，该组合物中的组蛋白是重组人组蛋白H3。

在一个实施例中，该组合物中的组蛋白是重组人组蛋白H3.1或H3.3。

在上述实施例中鉴定的不同组蛋白具有以下氨基酸序列：

在一个实施例中，该大核酸是恰好一个大核酸分子。

在一个实施例中，该大核酸选自包含至少一个表达盒的表达质粒和分离的表达盒。

在一个实施例中，该大核酸包含介于1,000个和100,000个之间的核苷酸或碱基对。在另一个实施例中，该大核酸包含介于1,250个和20,000个之间的核苷酸或碱基对。在又一个实施例中，该大核酸包含介于1,500个和10,000个之间的核苷酸或碱基对。

在一个实施例中，该组蛋白是人组蛋白H3.1或H3.3或者小牛胸腺组蛋白。在一个实施例中，该人组蛋白未经化学衍生化。在一个实施例中，该人组蛋白未缀合至半抗原。

在一个实施例中，该组蛋白是小牛胸腺组蛋白，并且使用了约2μg组蛋白每μg大核酸。

在一个实施例中，该组蛋白是重组人组蛋白，并且使用了约0.8-1μg组蛋白每μg大核酸。

在一个实施例中，该组蛋白是鸡红细胞组蛋白，并且使用了约1μg组蛋白每μg大核酸。

在一个实施例中，该组合物还包含至少一个半抗原分子。在一个实施例中，该组合物包含两个或更多个半抗原分子，并且两个或更多个半抗原分子是相同的半抗原分子或不同的半抗原分子。在一个实施例中，半抗原/半抗原分子选自生物素、洋地黄毒苷、茶碱、溴脱氧尿苷、荧光素、DOTAM和螺旋体基序多肽。

在该组合物的一个实施例中，该半抗原还化学地缀合至该组蛋白或大核酸。

在该组合物的一个实施例中，该半抗原还缀合至DNA结合肽，该DNA结合肽附接至该大核酸。

在该组合物的一个实施例中，该/每个组蛋白多肽还缀合至单个半抗原分子，和/或该大核酸分子还缀合至至少一个半抗原分子。

在该组合物的一个实施例中，该双特异性结合剂选自双特异性抗体、双特异性支架、双特异性肽、双特异性适配体、双特异性低分子量结构。在一个实施例中，该双特异性抗体选自双特异性全长度抗体、双特异性CrossMab、双特异性T细胞双特异性、DAF和DutaMab。在一个实施例中，该双特异性抗体是双特异性抗体片段。在一个实施例中，该双特异性抗体片段选自DutaFab、F(ab')2、串联scFv、双抗体、tandAb、scFv2-CH1/CL和VHH2-CH1/CL。

在该组合物的一个实施例中，该细胞表面靶标是内化细胞表面受体。在一个实施例中，该细胞表面靶标是内化细胞表面受体，其选自由以下组成的组：细胞类型特异性碳水化合物；受体酪氨酸激酶诸如HER1、HER2、HER3；IGF1R；细胞类型特异性抗原诸如Mesothelin、PSMA、CD19、CD20、CD44、TfR、LRP、IL-受体。

在一个实施例中，该组合物还包含恰好一个双特异性结合剂或该双特异性结合剂的两个或更多个拷贝。

在该组合物的一个实施例中，该半抗原是生物素，该双特异性结合剂是双特异性抗体，并且该第一结合特异性是包含下列的一对抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域：(a)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HVR-H2、(c)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-H3、(d)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-L1、(e)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-L3。

在该组合物的一个实施例中，该半抗原是洋地黄毒苷，该双特异性结合剂是双特异性抗体，并且该第一结合特异性是包含下列的一对抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域：(a)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-H2、(c)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-H3、(d)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-L1、(e)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-L3。

在该组合物的一个实施例中，该半抗原是茶碱，该双特异性结合剂是双特异性抗体，并且该第一结合特异性是包含下列的一对抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域：(a)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H2、(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3、(d)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-L1、(e)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L3。

在该组合物的一个实施例中，该半抗原是荧光素，该双特异性结合剂是双特异性抗体，并且该第一结合特异性是包含下列的一对抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域：(a)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HVR-H2、(c)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HVR-H3、(d)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-L1、(e)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-L3。

在该组合物的一个实施例中，该半抗原是溴脱氧尿苷，该双特异性结合剂是双特异性抗体，并且该第一结合特异性是包含下列的一对抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域：(a)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HVR-H2、(c)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HVR-H3、(d)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HVR-L1、(e)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HVR-L3。

在该组合物的一个实施例中，该半抗原是SEQ ID NO:57的螺旋体基序多肽，该双特异性结合剂是双特异性抗体，并且该第一结合特异性是包含下列的一对抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域：SEQ ID NO:55的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，以及SEQ ID NO:56的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。

在该组合物的一个实施例中，每个半抗原还通过一个/单个双特异性结合剂特异性地结合。

在该组合物的一个实施例中，该大核酸编码CRISPR/Cas9。

在该组合物的一个实施例中，该大核酸还包含：

-CRISPR/Cas***核酸，和/或

-哺乳动物细胞内源多肽的表达盒，和/或

-编码具有治疗功能的酶或其他蛋白质/肽的多肽的表达盒，和/或

-用于具有治疗功能的非编码RNA的转录***，该具有治疗功能的非编码RNA如微RNA、短干扰RNA、长非编码RNA、RNA诱饵、RNA适体和核酶。

在一个实施例中，该组蛋白是具有野生型氨基酸序列的天然出现的组蛋白。

在一个实施例中，该组合物不含病毒或细菌来源的化合物，但待递送的大核酸序列除外。

如本文所报告的一个方面是，包含如本文所报告的组合物和药学上可接受的载体的药物制剂。

在一个实施例中，该药物制剂还用作药品。

在一个实施例中，该药物制剂还用于基因疗法中。

如本文所报告的一个方面是，如本文所报告的组合物在制造药品中的用途。

如本文所报告的一个方面是，治疗患有遗传性疾病的个体的方法，其包括向该个体施用有效量的如本文所报告的组合物，其中该大核酸包含(在表达盒内)编码治疗该疾病所需的多肽的结构性基因。

如本文所报告的一个方面是，改变个体的细胞中的基因表达的方法，其包括向该个体施用有效量的如本文所报告的组合物，其中该大核酸或包含(在表达盒内)编码改变基因表达所需的多肽的结构性基因或包含治疗性核酸。

如本文所报告的一个方面是，制备如本文所报告的组合物的方法，其包括以下步骤：

a)孵育该大核酸和组蛋白以形成大核酸-组蛋白复合物，其中该大核酸或该组蛋白或两者与至少一个半抗原分子缀合，

b)使用双特异性结合剂孵育在a)中形成的复合物以生成双特异性结合剂-大核酸-组蛋白复合物，

c)分离和/或纯化在步骤b)中形成的复合物，从而产生如本文所报告的组合物。

如本文所报告的一个方面是，一种用于将大核酸引入真核细胞中的方法，其包括以下步骤：

a)在适用于将该双特异性结合剂结合至细胞表面靶标的条件下，使用如本文所报告的组合物孵育真核细胞，

b)分离包含该大核酸或其功能片段的细胞，从而将大核酸引入真核细胞中。

如本文所报告的一个方面是，转染真核细胞的方法，其包括以下步骤：

b)分离包含该大核酸或其功能片段的细胞，从而转染真核细胞。

如本文所报告的一个方面是，将核酸转运至真核细胞内的方法，其包括以下步骤：

b)分离包含该大核酸或其功能片段的细胞，从而将大核酸转运至真核细胞内。

如本文所报告的一个方面是，将核酸转运至真核细胞的细胞核内的方法，其包括以下步骤：

b)分离包含该大核酸或其功能片段的细胞，从而将大核酸转运至真核细胞的细胞核内。

如本文所报告的一个方面是，如本文所报告的组合物用于将大核酸靶向递送至真核细胞内的用途。

如本文所报告的一个方面是，如本文所报告的组合物用于将大核酸或其功能片段引入真核细胞的细胞核内的用途。

在一个实施例中，该组合物还用于将大核酸或其功能片段引入真核细胞内。

在一个实施例中，该组合物还用于以大核酸或其功能片段转染真核细胞。

如本文所报告的一个方面是，以使用如本文所报告的组合物的方法获得的细胞及其子代。

如本文所报告的一个方面是，一种用于转染真核细胞群体的确定亚群体的方法，其包括以下步骤：

-使用如本文所报告的组合物孵育真核细胞群体，该真核细胞群体包括至少两个在至少一个细胞表面抗原中有所区别的亚群体，其中该双特异性结合剂的第二结合特异性特异性地结合至对于该真核细胞群体的一个(单个)亚群体为特异性的细胞表面抗原，从而转染真核细胞群体的确定亚群体。

除了使用上文概述的半抗原之外，还使用其它手段将靶向实体链接至该大核酸。这些包括而不限于，

-缀合或融合至组蛋白，

-将半抗原或结合实体缀合或融合至DNA结合实体/肽，

-结合组蛋白的双或多特异性实体(例如，抗组蛋白bsAb)，

-结合DNA的双或多特异性实体(例如，抗DNA bsAb)，

-结合修饰核苷酸的双或多特异性实体(例如，抗BrdU bsAb)。

根据本发明的组合物的优点是对接纳者细胞或有机体的毒性最小，具有质粒的细胞接入、细胞内运输和细胞核保留。

根据本发明的组合物可用来促进治疗性肽/核酸的核定位，同时具备以下优点：保留质粒、对质粒的内体截留缺失、以及保护质粒不被核酸酶和类似的细胞内过程影响。

根据本发明的组合物/转运剂的供给也是向用于基因疗法的全人工基因转移***迈出的重要一步。此类基因转移***必须具备三个功能性成分：一个成分用于DNA穿过细胞膜的通路，第二个成分用于将该DNA转移至(一般不***的)靶标细胞的细胞核内，并且第三成分介导该DNA至基因组内的整合。基因疗法中可采用的全人工基因转移组合物极有可能比目前应用的病毒***更易生产、更便宜且更易处理，而且它不经历这些***的内在风险。

根据本发明的组合物也增加了被培养细胞中的转染效率。

在本发明的一个优选实施例中，上述方法使用真核细胞和/或至少一个DNA分子作为核酸来实施，该真核细胞是休眠的、缓慢分离的或不***的细胞，优选为原代细胞。

具体实施方式

本发明至少部分地基于以下发现：使用如本文所报告的组合物，可在常规培养基中实现以编码肽或多肽的大核酸转染真核细胞。

本发明至少部分地基于以下发现：使用如本文所报告的组合物，可依据其表型实现对真核细胞群体的亚群体的靶向转染。借由该靶向性，可在细胞的大群体中选择性地鉴定对于一种或多种特异性细胞表面标记物即细胞表面靶标呈阳性的细胞亚群体。因此，当在体内应用时，可避免不希望的“副作用”。这在体内使用期间提供了额外的安全性。

定义

杵臼结构二聚模块及其在抗体工程化中的用途在Carter P.、Ridgway J.B.B.、Presta L.G.:Immunotechnology，1996年2月第2卷第1期，第73-73(1)页中有所描述。

抗体重链中的CH3结构域可通过“杵臼结构(knob-into-holes)”技术改变，这一技术在例如WO 96/027011、Ridgway,J.B.等人，Protein Eng.9(1996)617-621和Merchant,A.M.等人，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中以若干实例详细描述。在这一方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加这两个CH3结构域的异二聚化，从而增加包含它们的多肽的异二聚化。(两个重链的)两个CH3结构域中的一个可为“杵(knob)”而另一个为“臼(hole)”。二硫桥的引入进一步稳定化异二聚体(Merchant,A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产率。但这在本发明的分子中不存在。

(抗体重链的)CH3结构域中的突变T366W表示为“杵突变”或“突变杵”，而(抗体重链的)CH3结构域中的突变T366S、L368A、Y407V表示为“臼突变”或“突变臼”(根据Kabat EU索引编号)。通过将S354C突变引入具有“杵突变”(表示为“杵-cys-突变”或“突变杵-cys”)的重链的CH3结构域中或通过将Y349C突变引入具有“臼突变”(表示为“臼-cys-突变”或“突变臼-cys”)的重链的CH3结构域(根据Kabat EU索引编号)中，也可使用位于CH3结构域之间的额外的链间二硫桥(Merchant,A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681)。但这在本发明的分子中不存在。

关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中。

如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置是根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号***编号的，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”。具体地，将Kabat编号***(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat的EU索引编号***(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3，这在本文中通过在此情况下称为“根据Kabat的EU索引编号”而进一步分类)。

可用于实施本发明的方法和技术在例如1997年出版的Ausubel,F.M.编著的《分子生物学现行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)第I至III卷；Glover,N.D.和牛津大学出版社在1985年出版的Hames,B.D.编著的《DNA克隆：实践方法》(DNA Cloning:A Practical Approach)第I卷和第II卷；IRL出版公司在1986年出版的Freshney,R.I.编著的《动物细胞培养：实践方法》(Animal Cell Culture–a practical approach)；CHSL出版社在1992年出版的Watson,J.D.等人所撰《重组DNA(第二版)》(Recombinant DNA,SecondEdition)；N.Y.,VCH出版社在1987年出版的Winnacker,E.L.编著《从基因到克隆》(FromGenes to Clones)；美国学术出版社在1998年出版的Celis,J.编著的《细胞生物学(第二版)》(CellBiology,Second Edition)；Alan R.Liss,Inc.,N.Y.在1987年出版的Freshney,R.I.编著《动物细胞培养：基础技术手册(第二版)》(Culture of Animal Cells:A Manualof Basic Technique,Second Edition)中所述。

使用重组DNA技术能够生成核酸衍生物。此类衍生物可例如在一个或几个核苷酸位置处通过置换、改变、交换、删除或***来修饰。例如，可通过定点突变手段进行修饰或衍生。此类修饰可由该领域技术人员容易地进行(参见，例如，Sambrook,J.等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring HarborLaboratory Press,New York,USA)；Hames,B.D.和Higgins,S.G.，《核酸杂交：实践方法》(Nucleic acid hybridization–a practical approach(1985)IRL Press,Oxford,England))。

必须注意的是，如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，“一个细胞”所指的包括多个此类细胞和该领域技术人员已知的其等效物，如此等等。同样，术语“一个/一种”、“一个/一种或多个/多种”和“至少一个/一种”在本文中可互换使用。也应注意的是，术语“包含”、“包括”和“具有”可互换使用。

术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-20％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-10％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-5％范围。

“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、scFv、Fab、scFab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见例如Plueckthun,A.在The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore(eds.),Springer-Verlag,New York(1994),pp.269-315中所述；还可参见WO 93/16185；US5,571,894和US 5,587,458。

双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等人；Nat.Med.9(2003)129-134；以及Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(20039 129-134)中还描述了三体抗体和四体抗体。

单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见US 6,248,516)。

抗体片段可通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。

术语“抗体片段”也包括“双重作用Fab”或“DAF”，其包含结合两个不同抗原的抗原结合位点(参见，例如，US 2008/0069820)。

术语“结合(至抗原)”表示抗体在体外检测中的结合。在一个实施例中，在结合检测中测定结合，其中抗体结合至表面，并且通过表面等离子体共振(SPR)测量抗原至抗体的结合。结合意味着结合亲和性(KD)为10^-8M或更低，在一些实施例中为10^-13至10^-8M，在一些实施例中为10^-13至10^-9M。术语“结合”也包括术语“特异性地结合”。

例如，在

检测的可能实施例中，抗原结合至表面，并且通过表面等离子体共振(SPR)测量抗体结合位点的结合。结合的亲和性由术语ka(缔合常数：缔合以形成复合物的速率常数)、kd(解离常数：复合物解离的速率常数)和KD(kd/ka)定义。另选地，关于共振信号高度和解离行为，SPR传感图的结合信号可直接与参考物质的响应信号比较。

如本文所用，术语“结合位点”表示可特异性地结合至第二多肽的一个多肽或一对多肽。在一个实施例中，结合位点选自由以下组成的多肽的组：抗体重链可变结构域、抗体轻链可变结构域、一对抗体重链和抗体轻链的可变结构域、受体或其功能片段、配体或其功能片段、酶或其底物。术语“包含”也包括术语“由...组成”。

药剂(例如药物制剂)的“有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。

术语“全长抗体”表示具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。全长抗体包含两条全长抗体轻链和两条全长抗体重链结，每条全长抗体轻链包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，每条全长抗体重链包含重链可变结构域、第一恒定结构域、铰链区、第二恒定结构域和第三恒定结构域。全长抗体可包含其它结构域诸如，例如，缀合至全长抗体的一条或多条链的额外scFv或scFab。这些缀合物也为术语全长抗体所涵盖。

术语“真核细胞”、“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和衍生自该原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的抗体。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有中的至少一个可变结构域，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指以下项中的每一种：包含氨基酸残基延伸体的抗体可变结构域的在序列中高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中的(L1、L2、L3)。

HVR包括

(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia,C和Lesk，A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；

(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)；

(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及

(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。

除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施例中，该个体或受试者为人。

“经分离的”组合物为已自其自然环境的组分中分离的组合物。在一些实施例中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，体积排阻色谱或离子交换或反相HPLC)测定，将组合物纯化至大于95％或99％的纯度。关于用于评估例如抗体纯度的方法的综述，参见Flatman,S.等人，J.Chrom.B 848(2007)79-87。

“经分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有该核酸分子的细胞中，但该核酸分子呈递在染色体外或与其天然染色***置不同的染色***置处。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式呈递)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。

“单特异性抗体”表示具有关于一种抗原的单个结合特异性的抗体。单特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2)或它们的组合(例如，全长抗体加上额外的scFv或Fab片段)。

“多特异性抗体”表示具有关于同一抗原上至少两个不同表位或两个不同抗原的结合特异性。多特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2双特异性抗体)或它们的组合(例如，全长抗体加上额外的scFv或Fab片段)。具有两个、三个或更多个(例如，四个)功能性抗原结合位点的工程化抗体也已有报告(参见，例如，US 2002/0004587A1)。一种多特异性抗体是双特异性抗体。多特异性抗体也可通过用于制备抗体Fc-异二聚分子的工程化静电转向效应来制备(WO 2009/089004)。

“裸多特异性抗体”是指不缀合至部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的多特异性抗体。裸多特异性抗体可呈递在药物制剂中。

“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，借此，铰链区定位在第一恒定结构域与第二恒定结构域之间。类似地，自N-末端至C-末端，各轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，继之以恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可配属为两种类型中的一种，该两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。

术语“核小体”表示包含DNA和组蛋白的颗粒。染色质是一种大分子状态，在该状态下，核DNA封装在细胞内。核小体是染色质的结构单元。每个核小体由约150bp双链DNA和组蛋白八聚体构成，该组蛋白八聚体含有每个核心组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)的两个拷贝。组蛋白H1是一种链接组蛋白，它牵涉入核小体之间的结合中以进一步压缩染色质(Luger,K.等人，Nature 389(1997)251-260；Chakravarthy,S.等人，FEBS Lett.579(2005)895-898)。因此，在真核生物中，核小体是DNA封装的基本单元。核小体核心颗粒包含大约150个碱基对(bp)的DNA，该DNA包裹在环绕组蛋白八聚体的左手超螺旋圈中。例如，组蛋白八聚体可由组蛋白H2A、H2B、H3和H4中每一个的2个拷贝组成。核心颗粒通常由被称为“链接DNA”的延伸体连接。这一链接DNA可包含至多约80bp。本文中，术语“核小体”表示核心颗粒任选地加上链接DNA中的一个。功能性染色质需要以或多个核小体的存在。

术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。

术语“互补位”是指给定抗体分子的一部分，该部分为靶标与结合位点之间的特异性结合所需。互补位可以是连续的，即，由呈递在结合位点中的相邻胺基酸残基形成；或不连续的，即，由位于氨基酸残基的一级序列中(诸如在氨基酸残基的CDR的氨基酸序列中)不同位置处但在结合位点所采取的三维结构中距离较近的氨基酸残基形成。

术语“肽链接体”表示天然和/或合成来源的链接体。肽链接体由氨基酸的线性链组成，其中20种天然出现的氨基酸是通过肽键连接的单体性构建块。该链具有1至50个氨基酸残基，优选1至28个之间的氨基酸残基，尤其优选3至25个之间的氨基酸残基的长度。肽链接体可含有重复的氨基酸序列或天然出现多肽的序列。肽链接体具有功能以确保环状融合多肽的结构域可通过允许该结构域正确折叠并且被适宜地呈递而执行它们的生物学活性。优选地，肽链接体是“合成的肽链接体”，其被设计为富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基。这些残基排列为例如至多五个氨基酸的重复性单元，诸如GGGS(SEQ ID NO:58)、GGGGS(SEQ ID NO:59)、QQQG(SEQ ID NO:60)、QQQQG(SEQ ID NO:61),SSSG(SEQ ID NO:62)或SSSSG(SEQ ID NO:63)。这一小重复单元可重复二至五次以形成多体性单元，例如(GGGS)2(SEQ ID NO:64)、(GGGS)3(SEQ ID NO:65)、(GGGS)4(SEQ ID NO:66)、(GGGS)5(SEQ ID NO:67)、(GGGGS)2(SEQ ID NO:68)、(GGGGS)3(SEQ ID NO:69)、(GGGGS)4(SEQ ID NO:70)、(GGGGS)4GG(SEQ ID NO:73)、GG(GGGGS)3(SEQ ID NO:72)和(GGGGS)6(SEQ ID NO:74)。在至多六个额外任意度的多体单元的氨基末端和/或羧基末端，可加入天然出现的氨基酸。其它合成的肽链接体由单个氨基酸构成，其重复10至20次并且可在链接体的氨基末端和/或羧基末端包含至多六个额外任意度，天然出现的氨基酸例如丝氨酸GSSSSSSSSSSSSSSSG(SEQ ID NO:71)。所有肽链接体均可由核酸分子编码并因此可被重组表达。由于链接体本身就是肽，经由形成在两个氨基酸之间的肽键将抗融合肽与链接体连接。

术语“药物制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。

“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。

如本文所用，术语“重组抗体”表示所有通过重组手段制备、表达、创造或分离的抗体(嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体)。这包括从宿主细胞诸如NS0、HEK、BHK或CHO细胞或从人类免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，小鼠)分离的抗体，或使用转染至宿主细胞内的重组表达质粒表达的抗体。此类重组抗体具有重排形式的可变区和恒定区。如本文所报告的重组抗体可能遭遇体内体细胞超突变。因此，重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是下述序列，尽管衍生自人类种系VH序列和VL序列并与之相关，但在天然条件下可以不存在于体内人类抗体种系品目中。

如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变待治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。

如在本申请中所用的术语“价”表示(抗体)分子中存在指定数目的结合位点。因此，术语“二价”“四价”和“六价”分别表示(抗体)分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。如本文所报告的双特异性抗体是“二价”的一个优选实施例。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)(单键，例如，Kindt,T.J.等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007)，第91页)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合具体抗原的抗体可使用VH或VL结构域从结合该抗原的抗体中分离，以分别筛选互补性VL或VH结构域的库(参见，例如，S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人，Nature 352(1991)624-628)。

如本文所用，术语“载体”是指能够载运与其相链接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作链接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

如本文所用，术语“结构域交叉”表示，在一对抗体重链VH-CH1片段与其相应缀合抗体轻链中，即，在抗体结合臂中(即，在Fab片段中)，结构域序列与天然序列的不同之处在于，至少一个重链结构域被其相应的轻链结构域置换，反之亦然。结构域交叉有三种通常类型，(i)CH1结构域与CL结构域的交叉，其导致具有VL-CH1结构域序列的结构域交叉轻链和具有VH-CL结构域序列的结构域交叉重链片段(或具有VH-CL-铰链-CH2-CH3结构域序列的全长抗体重链)，(ii)VH结构域与VL结构域的结构域交叉，其导致具有VH-CL结构域序列的结构域交叉轻链和具有VL-CH1结构域片段的结构域交叉重链片段，和(iii)完整轻链(VL-CL)与完整VH-CH1重链片段的结构域交叉(“Fab交叉”)，其导致具有VH-CH1结构域的结构域交叉轻链和具有VL-CL结构域序列的结构域交叉重链片段(所有前述结构域序列均以N-末端至C-末端方向指示)。

如本文所用，关于相应重链结构域和轻链结构域的术语“彼此替代”是指前述结构域交叉。因此，当CH1结构域和CL结构域“彼此替代”时，是指项目(i)下提及的结构域交叉以及所得重链和轻链结构域序列。据此，当VH和VL“彼此替代”时，是指项目(ii)下提及的结构域交叉；而当CH1结构域和CL结构域“彼此替代”并且VH1结构域和VL结构域“彼此替代”时，是指项目(iii)下提及的结构域交叉。例如，在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254和Schaefer,W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 108(2011)11187-11192中报告了包括结构域交叉的双特异性抗体。

使用如本文所报告的方法生产的多特异性抗体也可包含Fab片段，该片段包括如上述项目(i)下提及的CH1结构域和CL结构域的结构域交叉，或上述项目(ii)下提及的VH结构域和VL结构域的结构域交叉。特异性地结合至同一抗原的Fab片段被构造成具有同一结构域序列。因此，在多特异性抗体中含有超过一个具有结构域交叉的Fab片段的情况下，该Fab片段特异性地结合至同一抗原。

如本文所用，术语“结合位点”表示一种多肽，其可特异性地结合至第二多肽或可借由第二多肽被特异性地结合。在一个实施例中，结合位点选自由以下组成的多肽的组：抗体重链可变结构域、抗体轻链可变结构域、一对抗体重链和抗体轻链的可变结构域、受体或其功能片段、配体或其功能片段、酶或其底物。

基因转移

受体介导的内吞作用过程导致受体从浆膜移动至细胞内部。当细胞表面受体在配体诱导的活化之后被单泛素化时，该过程开始。接着，受体被带到内吞泡中，它们要么从那里被靶向至溶酶体或液泡进行降解，要么被再循环回浆膜。

如本发明所属的非病毒性基因转移提供了一种可供选择的有效基因递送方法，其旨在导致低水平的毒性。非病毒性基因疗法的目标是模拟成功的病毒性机制来克服阻断靶标基因有效表达的细胞屏障，同时最小化与基因递送相关的毒性。合成的非病毒性载体的能力将会包括特异性结合至细胞表面、进入、内体逃逸、转运至细胞核、以及稳定整合到靶标细胞基因组中。

非病毒性基因递送技术的速率限制步骤是将包封的质粒从内体转移至细胞核(Felgner,Sci.Am.276(1997)102-106)。在这一设定中，质粒被细胞内吞到内体隔室中。预期这一隔室的酸性连同其核酸酶活性一起将会快速降解质粒(Felgner,Sci.Am.276(1997)102-106)。已知氯喹提高内体的酸性pH，并且用于某些基因治疗方案中以提升内体释放(Fritz等人，Hum.Gene Ther.7(1996)1395-1404)。

本发明提供非病毒性基因转移，其克服与化学和物理方法(包括DEAE葡聚糖、聚凝胺和矿物磷酸钙、微注射和电穿孔)相关的固有缺点。本发明还比脂质体基因转移更有用。尽管脂质体基因转移具有多种优点，包括缺乏免疫原性、易于制备和封装大DNA分子的能力，但必须谨慎地控制脂质体/DNA的比率以避免毒性聚集体的出现。此外，脂质体的递送和基因表达效率有限，并且它们具有与带负电大分子的潜在负面相互作用。

与蛋白质和肽基因转移中的DNA形成复合物，即形成多聚复合物(polyplex)(Feigner等人，Hum.Gene Ther.8(1997)511-512)，是通过带正电的赖氨酸和精氨酸残基与DNA主链中带负电的磷酸根之间的静电相互作用介导的(Sternberg等人，FEBS Lett.356(1994)361-366)。肽基因转移的实例利用了受体介导的内吞作用的生理学细胞过程进行内化。

受体介导的基因递送构造体含有受体结合配体和DNA结合部分(一般为聚-L-赖氨酸)。已经使用大量的不同配体靶向细胞，该配体包括转铁蛋白、去唾液酸糖蛋白、免疫球蛋白、胰岛素、EGF受体和整合素结合肽。DNA结合元件包括鱼精蛋白；组蛋白Hl、H2A、H3和H4；聚-L-赖氨酸；以及具有重复序列的阳离子两亲α-螺旋寡肽(Niidome等人，J.Biol.Chem.272(1997)15307-15312)。

本发明的蛋白质/肽基因转移的潜在优点包括易于使用、生产和突变发生；纯度；同质性；将核酸靶向特定细胞类型的能力；成本效益高的大规模制造；靶向配体的模块化附接；以及对可递送的核酸的大小或类型的限制少。

有效基因递送的关键步骤是多聚复合物的形成；正在分析蛋白质/肽与质粒之间相互作用，包括颗粒大小、蛋白质/肽/DNA电荷比、缓冲介质等，以优化多聚复合物形成的条件(Adami等人，J.Pharm.Sci.87(1998)678-683；Duguid等人，Biophys.J.74(1998)2802-2814；Murphy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)1517-1522；Wadhwa等人，Bioconjug.Chem.8(1997)81-88)。与目前可用的基因递送方法(包括磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、脂质***)相比，蛋白质/肽基因转移牵涉创造一种其特性可预设和控制的递送媒介物，这将会用来增强外源性核酸的进入和持续表达所需的活性。此外，不同于很多阳离子脂质体，经由蛋白质/肽介导的DNA缩合在配制期间稳定化多聚复合物并且在血清中保持其结构(Adami等人，J.Pharm.Sci.87(1998)678-683；Wilke等人，Gene Ther.3(1996)1133-1142)。一旦鉴定活性肽基序，即可将它们组合以获得其功能类似于病毒衣壳功能多功能性复合物。

尺寸大于寡核苷酸的DNA不容易被内吞，因此必须将其封装在能够有效进入细胞内的媒介物中(Bongartz等人，Nucleic Acids Res.22(1994)4681-4688；Felgner,Sci.Am.276(1997)102-106)。细胞DNA吸收的主要障碍是电荷(Felgner,Sci.Am.276(1997)102-106)。在水溶液中，DNA具有净负电荷。DNA倾向于被细胞膜排斥，因为它们也是带负电的。在少数例外情况下，细胞似乎能够同化裸DNA；这包括在直接肌肉注射小鼠后成功的靶标蛋白表达(Blau和Springer,N.Engl.J.Med.333(1995)1554-1556；Cohen,Science,259(1993)1691-1692；Felgner,Sci.Am.276(1997)102-106；Wolff等人，Science 247(1990)1465-1468)。除非使用载体，否则大多数细胞对转染极具抵抗性。

组合物和方法

本文报告了一种用于将基因高效且特异性靶向递送至细胞内的新颖***。通过盐梯度渗析，质粒DNA和组蛋白已经组装成染色质。为了使此类“质粒-染色质”的抗体介导靶向成为可能，例如，经由核酸结合肽桥连接双特异性抗体衍生物和染色质。使用该组合物/复合物，染色质组装的质粒DNA可高效靶向细胞。

已经发现，在正常培养条件下，将nM浓度的抗体靶向质粒-染色质施加到细胞，能够在>90％的细胞内实现细胞内递送和核(表达)功能性。观察到靶向和转基因功能性，其对于不同细胞系和不同抗体靶标具有绝对特异性而没有可检测的毒性。用于靶向转基因递送和细胞内功能性的实例包括受体构造体以及编码CRISPR/Cas9基因编辑的转基因，证明了这一靶向基因递送方法的广泛应用性。

用于靶向递送大核酸的采用半抗原结合bsAb的媒介物的生成和组成

所采用的实体和过程步骤以及用于生成根据本发明的递送实体的不同观点的示例性非限制性概述提供在图1中，根据本发明的实体能实现大核酸诸如质粒的特异性靶向和有效的细胞内递送。

由于如本文所报告的靶向递送实体和方法尤其适用于递送大核酸，例如，表达质粒，使用表达质粒完成下述示例性说明。这不应视为限制本发明的范畴。它仅仅用来例示本发明。本发明的真实范畴在所附权利要求书中阐述。

将编码所希望序列、基因或表达盒的质粒DNA与组蛋白组装以形成导致“质粒-染色质”的核小体。

之后，通过活化半抗原试剂(诸如NHS-半抗原或马来酰亚胺-半抗原或其它半抗原衍生物)的化学缀合作用将半抗原附接至核小体，如图1中的左图“A”所示。另一种将半抗原附接至核小体-质粒复合物的方法显示在图1的右图“B”中。这里，将具有DNA结合功能性的半抗原化的人类肽加入核小体组装的质粒中，以形成半抗原化的质粒-核小体-肽复合物。

最后，将识别所使用的半抗原以及细胞表面抗原的双特异性抗体加入半抗原化的质粒-染色质(通过图1的A或B半抗原化)中。这些双特异性抗体变成通过它们的半抗原结合部分缀合至半抗原化的质粒核小体。所得的双特异性抗体-质粒-染色质复合物包含bsAb的第二特异性的自由结合实体，该实体对于靶标细胞表面上的靶标具有结合特异性。

通过将DNA双链包裹在组蛋白八聚体周围，组蛋白能够高度压缩DNA。组蛋白也可含有促进细胞吸收的序列/结构域(Wagstaff,K.M.等人，Mol.Ther.15(2007)721-731；Rosenbluh,J.等人，J.Mol.Biol.345(2005)387-400；Rosenbluh,J.等人，Biochim.Biophys.Acta 1664(2004)230-240；Wagstaff,K.M.等人，Faseb J.22(2008)2232-2242)。与带负电的核酸相比，组蛋白-DNA复合物，即核小体或染色质，也具备大大减少的整体电荷。因此，将质粒DNA“封装”在核小体/质粒-染色质内以评估大小压缩和负电荷减少是否能促进细胞内质粒递送，优先与细胞或组织特异性递送联合。

组蛋白在DNA上的组装可通过体外盐梯度渗析以各种规模有效地实现。

组蛋白八聚体以确定的模式组装在DNA上(约147个碱基对被包裹在一个八聚体周围)。核小体/质粒染色质的成功形成导致染色质的整体电荷比单独的组蛋白(正电荷)或质粒DNA(负电荷)减少。因为核小体结合的DNA也受到保护而不受核酸酶影响，因此，质粒DNA的核酸酶抗性用作借以评估质粒染色质成功形成的另一参数。

已经发现，核心组蛋白可通过盐梯度渗析有效地组装在DNA上。这一方法也可用于超螺旋质粒DNA来生产质粒染色质。已经使用这一方法由eGFP表达质粒生成质粒染色质。由于组蛋白八聚体以高度确定的模式组装在DNA上(一个八聚体周围精确地包裹有147个碱基对)，可通过核酸酶消化和后续的琼脂糖凝胶电泳分析染色质的质量。高效组装染色质的核酸酶消化在短消化时间内生成了多个具有147个碱基对的DNA片段，指示一个质粒上在近距离内组装了超过一个组蛋白。此外，短于147bp的DNA片段仅以极小的比例出现，在较晚时间点最大程度地轻微可见。

对所组装质粒染色质的电荷抗性和核酸酶抗性的实验评估显示在图2B(EMSA)和图2A(核酸酶抗性检测)中。

这些分析的结果表明了质粒染色质的成功生成：EMSA检测(图2B)表明了轻微保留，即，所组装染色质的电荷比单独的质粒DNA减少。核酸酶敏感性检测(图2A)也证明，质粒DNA变成耐核酸酶，如通过多个具有147个碱基对的DNA片段所指示。这指示一个质粒上在近距离内组装了超过一个组蛋白。此外，短于147bp的DNA片段仅以极小的比例出现(在所有时间点轻微可见)。

对于缀合至半抗原，不同的方法可能同样有效：

(A)通过赖氨酸侧链缀合将染色质半抗原化

(B)通过质粒DNA的半抗原化作用在核小体组装之前将染色质半抗原化

(C)通过采用半抗原化的组蛋白进行染色质组装将染色质半抗原化。

对于以生物素作为示例性半抗原，使用这些不同方法各自获得的结果显示在图3中。图3A示出，在化学缀合反应之后，质粒-染色质结合至链霉亲和素。这证实了生物素已经化学附接至质粒-染色质。图3B示出，生物素化学缀合至质粒-DNA也导致生物素化的质粒-染色质，通过其结合链霉亲和素的能力表示。图3C示出使用生物素化的组蛋白在染色质组装反应中成功形成复合物，生成了生物素化的质粒-染色质。

Haas等人的先前工作(参见，例如，WO 2011/157715)鉴定了衍生自人类分泌蛋白的结合核酸的带正电人类肽(即，在人体内具有低免疫原性)(Haas,A.K.等人，Biochem.J.442(2012)583-593)。那些带正电的两亲性肽中的一些表现出横跨生物膜的能力，即，可被视为人类细胞穿透肽(huCPP)。其它包含相同量正电荷的结合DNA的肽仍没有CPP功能性。

为了鉴定适用于将半抗原附接至质粒DNA的肽，已经分析了Haas等人描述的肽子集以及其一些突变衍生物的质粒结合特征。这些包括半抗原化(洋地黄毒苷化)NRTN、ASM3B和CPXM2(有效的CPP功能性)、WNT(无/低CPP功能性)、FALL(低/无CPP功能性)，以及作为参考物质的TAT肽(CPP)、衍生自p53的DNA结合肽和含有组氨酸而非赖氨酸或精氨酸的突变FALL肽。也包括由与His-Fall组合的NRTN构成的融合肽。

通过EMSA位移检测和/或通过微型热泳分析(MST)来分析肽与质粒DNA的相互作用。两种技术都将结合DNA的肽与不结合DNA的肽区分开来。这些实验的结果(图4A(EMSA)、图4B(MST)、下表)指示，几种人类肽结合质粒DNA并因此可用来将半抗原附接至质粒DNA。这些包括衍生自人类P53、NRTN、FALL、CPXM2、WNT、ASM3B及其衍生物的肽。

肽名称	DNA结合	已知CPP功能性
			P53	+++	？
WNT	+	-
			NRTN	+	+++
FALL	+++	++
			CPXM2	+++	++
HisFALL	-	？
			TAT	+	+
ASM3B	+	++
			HisFALL-NRTN	+	？

也可将半抗原化的DNA结合肽附接至质粒-染色质。这造成肽结合的半抗原被并入质粒-核小体中。

已经用来显示这一方法的一种示例性肽是人类细胞穿透肽CPXM2。这种肽经由与带负电的DNA主链的电荷相互作用来捕捉质粒-染色质。上文证明了半抗原(在这种情况下是生物素)被成功并入质粒-染色质中。图5示出，在生物层干涉量度分析法中(Octet)分析了生物素化的肽结合至质粒-染色质，使其能结合至链霉亲和素。图5证明了通过bio-CPXM2肽的附接进行的质粒-染色质的生物素化。

Haas等人鉴定的衍生自人类蛋白质并且结合核酸的肽CPXM2可作为示例性分子，用于经由与带负电的DNA主链的电荷相互作用来捕捉质粒DNA或染色质(Haas,A.K.等人，Biochem.J.442(2012)583-593)。使用半抗原化的(例如，生物素化的)CPXM2肽变体以及半抗原(即，在这个实例中是生物素)结合双特异性抗体，使得CPXM2肽能结合至抗体。通过微型热泳(MST)测量抗体-肽构造体与染色质的亲和性。使用这一方法，在溶液中生成了亲和性数据而无需捕捉抗体或肽，因为这将会由于活动性效应而影响这一***的亲和性。为了鉴定最合适的抗体格式，将一价生物素结合triFab的亲和性以及由于分子交联造成的潜在聚集与二价生物素结合双特异性抗体进行比较(Mayer,K.,等人，Int.J.Mol.Sci.16(2015)27497-27507；Schneider,B.等人，Mol.Ther.Nucleic Acids 1(2012)e46)。一价抗生物素triFab～生物素CPXM2构造体与染色质的亲和性在3位数纳摩尔范围(300nM)内。二价抗生物素双特异性抗体～生物素CPXM2构造体证明了进一步的稳定化(达到2位数nM亲和性)而不受这一理论的束缚，极有可能是由于因为两个CPXM2肽可能被一个抗体结合的活动性效应。使用两种抗体-肽构造体均未观察到聚集，指示使用两种抗体格式均未发生交联。通过相对应的无肽对照组证实了特异性。MST数据集汇总在下表中。

构造体	K<sub>D</sub>[nM]	SEM[nM]
			染色质+bio-CPXM2～一价抗生物bsAb	300	36
染色质+bio-CPXM2～二价抗生物bsAb	73.1	3.4
			染色质+仅一价抗生物bsAb	无相互作用	N.A.
染色质+仅二价抗生物bsAb	无相互作用	N.A.

通过Octet***验证了染色质、肽和抗体之间的相互作用。由于在将肽偶联至二价双特异性抗体格式时观察到最强的相互作用，这一***已经用于进一步的研究。由于抗体肽构造体与带负电的DNA主链相互作用，已经检查了这一相互作用是否改变质粒染色质在抗体-肽组装之后的核酸酶抗性。在使用抗体和肽孵育染色质并接着进行核酸酶消化之后，在270秒之后，消化的DNA谱类似于单独核酸酶处理染色质20秒后的谱。这一数据清楚地证明，在形成靶向染色质复合物的情况下，质粒DNA得到进一步保护而不受核酸酶影响。

先前已经描述了结合细胞表面抗原以及半抗原的BsAb来捕捉半抗原化的载荷体并形成抗体-载荷体复合物(参见，例如，WO 2011/003780；Schneider,B.等人，Mol.Ther.Nucleic Acids 1(2012)e46；Dengl,S.等人，Immunol.Rev.270(2016)165-177)。

使用上述样品和稳健的电荷反应将生物素化的质粒-染色质偶联至bsAb，该baAb结合生物素以及呈递在癌细胞表面上的抗原诸如LeY或CD33。这牵涉在25℃将生物素化的质粒-染色质和bsAb以4比25的比率孵育30分钟。除了呈递在癌细胞上的抗原之外，也可使用任何对于细胞的某些亚群体为特异性的其它抗原。尤其优选的是内化细胞表面受体。

通过SPR分析(ForteBio Octet)监控bsAb与半抗原化的质粒-染色质的组装反应，如图6中所示。因此，抗Ley/生物素双特异性抗体(bio-bsAbs(LeY-Bio))被捕捉在蛋白A浸渍液上，接着，评估所加入的生物素化的质粒-染色质与生物素结合bsAb的结合。

图6A示出形成bsAb与质粒-染色质的结合的复合物形成，该质粒-染色质通过化学缀合染色质的赖氨酸侧链而生物素化。

图6B示出形成bsAb与质粒-染色质的结合的复合物形成，该质粒-染色质在染色质组装之前通过质粒DNA的化学缀合而生物素化。

图6C示出形成与生物素化的质粒-染色质的结合的复合物形成，其通过将生物素化的DNA结合肽加入质粒-染色质中而获得。

图6D示出形成与洋地黄毒苷化的质粒-染色质的结合的复合物形成，其通过将洋地黄毒苷化的DNA结合肽加入质粒-染色质中而获得。在这一实例中，抗-Dig-bsAbs(LeY-Dig)被捕捉在蛋白A浸渍液上。

在携带被相对应的bsAb识别的靶标抗原的细胞上，证明了bsAb-DNA复合物和bsAb-染色质复合物的抗体介导靶向。因此，同时结合LeY抗原和洋地黄毒苷或者结合LeY抗原和生物素的bsAb与表达LeY的MCF7乳腺癌细胞联合使用。

因此，除了测定抗体-染色质复合物的特异性形成和延长的核酸酶抗性之外，还测定经由相关抗体将DNA递送至细胞表面。为了测定递送效力和特异性，将除了具有抗生物素特异性之外还具有抗Lewis Y或CD33特异性的抗体在MCF7细胞(LeY+++/CD33-)上比较。此外，使用以Cy5荧光团标记的质粒DNA使得能够通过流式细胞术在细胞处理之后一小时将细胞上的质粒DNA定量。为了阐明染色质组装对递送特异性和效力的影响，在染色质组装之前和组装之后采用质粒DNA递送***。图14示出，使用在染色质组装之前与抗LeY抗体(红色虚线，右图)和抗CD33抗体(蓝色虚线，左图)复合的质粒DNA处理之后，MCF7细胞的Cy5信号。在使用抗LeY-DNA-Cy5复合物处理之后检测到清晰的荧光信号，证明DNA递送的高效率。相比之下，抗CD33-DNA-Cy5复合物并未导致Cy5阳性细胞，证实DNA递送是特异性的并且是唯一性地靶向抗体介导的。在染色质组装之后，质粒DNA递送效力和特异性未受影响，因为在使用抗LeY-chromatin-Cy5复合物处理之后观察到同样清晰的荧光信号(图15，红色实线，右峰)，而使用抗CD33-chromatin-Cy5复合物处理之后没有检测到Cy5信号(图15，蓝色实线，右峰)。为了确认抗体在我们的递送***中的存在，我们将以Cy3荧光团标记的抗CD33和抗LeY抗体与Cy5标记的染色质一起使用。如图16中所示，使用抗CD33-Cy3-chromatin-Cy5复合物处理的MCF7细胞不显示增强的Cy5和Cy3信号(蓝色等值线，左下象限)，证明细胞表面既不呈递抗体也不呈递染色质。相比之下，抗LeY-Cy3-染色质-Cy5处理导致了清晰的Cy3和Cy5荧光信号(图16，红色等值线，跨右下象限和右上象限)，证实位于细胞表面的抗体并且确认了染色质的成功递送。最后，检查了抗生物素靶向抗体的第二特异性。因此，将包含生物素化-CPXM2肽的靶向染色质递送***与其中生物素化肽更换为具有错误半抗原(洋地黄毒苷)的肽的靶向***比较。图16强调，在MCF7细胞上，两种复合物(左下象限中具有生物素-CPXM2的蓝色等值线和右下象限中具有洋地黄毒苷-CPXM2的绿色等值线)都生成了清晰的Cy3荧光信号，而仅在使用包含生物素-CPXM2的复合物处理之后观察到Cy5信号。这清楚地证明，尽管具有细胞表面特异性，但抗半抗原的第二特异性对于染色质也是必需的，并且因此对于质粒DNA递送也是必需的。注意到抗体与肽/染色质之间的非特异性相互作用的缺失。

为了分析质粒的靶向递送(不具有核小体/染色质组装)，将以Cy5标记的GFP编码质粒在PBS中使用洋地黄毒苷标记的肽(CPXM2)孵育1小时，之后使用双特异性抗LeY/洋地黄毒苷抗体孵育30分钟。将样品加入接种在8孔室载玻片中的MCF7细胞中，最终浓度为4μg/mL质粒DNA、250nM肽和125nM抗体。此后，用共焦显微镜在1小时、4小时、24小时和48小时对细胞成像。

这些分析的结果在图7中示出。可看出，质粒DNA有效地递送至MCF7细胞，如通过DNA的内化所指示。在较早时间点，抗体和DNA主要定位在细胞表面。在较晚时间点，发现DNA内化在泡隔室中。

为了分析半抗原化质粒-染色质的bsAb靶向递送，将如上所述的LeY-Dig bsAb和GFP编码Cy5标记质粒与经由肽附接生成的dig-染色质组装而成的复合物加到MCF7细胞上。将那些细胞以含染色质的复合物的最终浓度接种在8孔室载玻片中，该含染色质的复合物携带组装成质粒染色质的4μg/mL质粒DNA、250nM肽和125nM抗体。此后，用共焦显微镜在1小时、4小时、24小时和48小时对细胞成像，经由Cy5信号检测质粒-染色质。

这些分析的结果显示，质粒DNA被有效地递送至MCF7细胞，如通过细胞上的质粒-染色质的Cy5信号所指示。在较早时间点，抗体和质粒-染色质主要定位在细胞表面。在较晚时间点，发现质粒-染色质被内化在泡隔室中并且检测到GFP受体基因表达，指示细胞核内也呈递质粒DNA(图7，48小时)。

作为对照，也附接抗CD33/洋地黄毒苷bsAb并将其加到CD33阴性MCF7细胞中。使用这一组合，即，不使用相对应的细胞表面受体，质粒/染色质未被递送至细胞内，证实靶向递送是由于bsAb与细胞表面抗原的特异性结合。

双特异性抗体-DNA复合物的抗体介导靶向使得它们能被吸收到细胞内。接着，所递送的质粒在细胞内的存在使得瞬时表达(如实例中所示)、或在整合后的稳定表达和/或功能性成为可能。

已经通过将表达LeY的MCF7乳腺癌细胞暴露于同时结合LeY抗原和洋地黄毒苷的bsAb显示了这一点，其中该bsAb与通过附接dig-肽(dig-NRTN)而洋地黄毒苷化的质粒复合。作为特异性靶向的对照物，在独立的实验中将质粒复合到dig结合bsAb，其识别不存在于MCF7细胞上的CD33抗原。

在MCF7细胞内，通过检测GFP的表达显示了细胞内吸收和功能性，该GFP编码在所递送的质粒内的表达盒上。

生成递送复合物，将其施加到MCF7细胞，之后对经处理的细胞进行荧光显微术成像。这些分析的结果在图8中示出。成像荧光显微术显示，在以非靶向CD33-bsAb-质粒复合物处理的细胞群体中完全不存在荧光。相比之下，在接受细胞表面靶向LeY-bsAb-质粒复合物的LeY+++/CD33-MCF7细胞中，可检测到表达GFP的细胞。使用含抗细胞表面抗原LeY的抗体的复合物进行的处理明显地显示了单个GFP表达细胞(群体的～2％，左图)，而使用含抗CD33抗体的复合物处理的细胞(右图)未显示任何高于背景的GFP表达。因此，半抗原化肽-DNA复合物的bsAb靶向特异性递送和蓄积使其能够被大量吸收到细胞的细胞质/细胞核中，造成一定程度的GFP表达。

双特异性抗体-质粒-染色质复合物的抗体介导靶向使得所递送的bsAb-染色质复合物能被吸收到细胞内并且接着能够具有细胞内功能性。

已经通过将表达LeY的MCF7乳腺癌细胞暴露于同时结合LeY抗原和洋地黄毒苷的bsAb实验性地显示了这一点，其中该bsAb与通过附接dig-肽(例如，洋地黄毒苷化CPXM2、p53等)而洋地黄毒苷化的质粒-染色质组装体复合。作为特异性靶向的对照物，在独立的实验中将质粒-染色质复合到Dig结合bsAb，其识别不存在于MCF7细胞上的CD33抗原。

对于实验设定和递送媒介物生成的概述显示在图9A中。

通过在FACS分析中检测并定量表达GFP的细胞来评估细胞内吸收和功能性(所编码的GFP mRNA的转录和转译)。

通过用双特异性LeY-半抗原结合bsAb孵育半抗原化的质粒-染色质(携带GFP表达质粒)，生成了递送复合物。使用两种不同的bsAb格式。采用的第一种格式是Mayer等人描述的TriFab格式(Mayer,K.等人，Int.J.Mol.Sci.16(2015)27497-27507)。这一bsAb携带两个细胞表面结合位点和一个半抗原结合位点。第二种格式是携带两个细胞表面结合位点和两个半抗原结合位点的四价IgG衍生物(参见，例如，WO 2011/003780；Schneider,B.等人，Mol.Ther.Nucleic Acids 1(2012)e46；Killian,T.等人，Sci.Rep.7(2017)15480)。为了评估细胞内递送和功能性，将bsAb-半抗原-质粒-染色质复合物加到接种在12孔板中的MCF7细胞中，最终浓度为8μg/mL质粒-DNA(经由加入洋地黄毒苷化的DNA结合肽而组装至染色质)、500nM肽和250nM抗体。

通过处理MCF7细胞并且在处理后48小时通过流式细胞术将eGFP质粒表达定量，评估细胞内活性。这些分析的结果在图9B-E中示出。

在使用不具肽和抗体的染色质处理之后，未检测到表达GFP的细胞。此外，使用包含不结合在细胞表面的三重Fab(抗CD33)的染色质复合物处理也未生成表达GFP的MCF7细胞。通过细胞表面结合三重Fab(抗LeY)未组装至染色质中的DNA靶向递送导致了约0.5％的荧光细胞。相比之下，靶向染色质构造体显示了强于PEI转染阳性对照物的GFP递送效力(图9B)。使用具有二价半抗原结合的双特异性抗体而非具有针对半抗原的一价的三重Fab，进一步改善了递送效率而不降低特异性(0％GFP阳性细胞)(图9C)。可通过经由不同序列的肽将半抗原附接至染色质来递送染色质。图9D示出，富有成效地递送至细胞内并不严格取决于肽种类，因为可采用不同的肽(包括CPXM2和衍生自P53的肽及其它)来附接用于靶向细胞内递送的半抗原。

经由化学缀合而附接半抗原的质粒-染色质也可被特异性地递送至MCF7靶标细胞和该细胞内并且导致GFP表达，如图9F中所示。

可使用不同来源的组蛋白构造根据本发明的实体。这包括重组人组蛋白和从天然来源分离的组蛋白，例如，来自小牛胸腺或来自鸡红细胞的组蛋白。因此，在本文提供的实例中，不同来源的组蛋白已经用于质粒-染色质组装，以证明本文所报告的递送***通常是可用的并且不限制为使用具体组蛋白。因此，使用不同来源的组蛋白来组装靶向递送实体。结果在图10中示出。

图10A示出，来自鸡红蛋白的组蛋白(其也含有不存在於其它组蛋白来源中的组蛋白H1)使得GFP表达质粒的靶向特异性细胞内递送成为可能。

图10B示出，未修饰的人类重组组蛋白显示与小牛胸腺组蛋白相当的递送效率。也可使用人类重组组蛋白的生物素化变型来组装复合物，该复合物使得GFP表达质粒的靶向特异性细胞内递送成为可能。所组装的染色质的质量分析显示，组蛋白H3的生物素化影响染色质组装，导致较低质量的质粒染色质(图10C)。染色质质量与递送效力的关联证明，适宜的组蛋白组装是本文所报告的组合物的功能性细胞内递送的先决条件。

在一个实施例中，该组蛋白是重组人组蛋白或小牛胸腺组蛋白。在一个实施例中，该重组人组蛋白未经修饰，即，它未经化学衍生化。

用于大核酸的细胞内递送和活性的另一实例是将质粒上编码的CRISPR成分靶向递送至细胞核。因此，将GFP表达盒替换为编码CRISPR/Cas9成分的表达盒，其访问人类DPH1基因。先前已经描述，基因编辑介导的DPH1失活与对于白喉毒素(DT)的细胞敏感性的评估联合，可用来定量基因编辑的效力(WO 2018/060238；Killian,T.等人，Sci.Rep.7(2017)15480)。对于CRISPR介导的基因编辑，编码表达质粒进入细胞并且变成以足够的水平被表达至关重要。DPH1的所有细胞拷贝的失活(作为基因编辑的后果)转而使得细胞具有DT抗性。这生成了非常稳健的读数，其可通过在基因编辑之后计数DT抗性集落进行定量。

为了评估CRISPR/Cas9的靶向细胞内递送，使用了针对DPH1的gRNA和编码Cas9核酸酶的质粒。接着，通过将细胞暴露至DT并随后测定DT抗性集落，评估编辑成分的细胞内递送效力和表达，如Killian等人先前所述(Killian,T.等人，Sci.Rep.7(2017)15480；WO2018/060238)。结果在图11中示出。

图11示出，编码CRISPR/Cas9实体的质粒变成特异性靶向的并且在作为抗体靶向质粒-染色质进行递送时引起有效的细胞内表达。通过抗体变成靶向至细胞表面的质粒染色质造成其中靶标基因被编辑/失活的细胞比例变高(DT抗性细胞的集落数高)。相比之下，在接受不靶向至细胞的质粒-染色质的细胞中，没有观察到细胞内递送和CRISPR/Cas9介导的编辑。

因此，使用根据本发明的复合物，可实现有效的细胞递送和特异性以及高的核递送效力(如通过表达GFP受体基因的细胞以流式细胞术进行定量)。

使用通过表达GFP受体基因的细胞以流式细胞术进行的定量，也可能将染色质组装对于细胞内质粒DNA递送的影响直接描述为，仅就递送至细胞上而言，使用和不使用染色质组装进行的DNA递送是同样有效的。为了解决报告基因表达的问题，使用各种复合物将MCF7细胞处理48小时，接着经由流式细胞术鉴定表达GFP的细胞。通过与相对应的媒介物和仅有抗体的对照物比较，测定GFP阳性细胞的比率。在存在DNA或染色质的情况下孵育MCF7细胞并未生成表达可检测水平的GFP的细胞，指示没有对于在染色质组装之前和之后的质粒DNA的非特异性吸收。此外，当抗体未结合细胞表面时，抗体-肽构造体的缔合也不生成GFP阳性细胞，如关于抗CD33-DNA以及抗CD33-染色质复合物所示(参见，图14至16；未检测到对于抗体-DNA和抗体-染色质的非特异性吸收)。通过缔合的抗体-肽构造体实现的质粒DNA靶向确实生成了GFP阳性细胞(如在显微镜下观察到的)，但尽管有效递送至细胞，仍尚未达到显著程度，如图14中所示。相比之下，目前相同的抗体-肽构造体靶向染色质将GFP阳性细胞的比率从单个例外情况上升到大量主要群体(超过90％阳性细胞)。最后，使用脂质转染作为阳性对照，导致约60％表达报告基因的细胞。

接下来，通过相对于媒介物对照和完全细胞裂解的LDH释放测量不同处理的细胞毒性。对于大多数转染试剂，脂质转染常常介导一定程度的细胞毒性(约为裂解对照的15％)。其它处理无一显示可检测的细胞毒效应。

因此，染色质组装对于功能性质粒DNA递送的影响出乎意料地高。

之后，通过共焦显微镜评估抗体和DNA在使用不同复合物处理之后的细胞内分布。图7突出显示，在使用靶向(LeY-)染色质、靶向(LeY-)DNA或非靶向(CD33-)染色质处理之后4小时，活细胞中的抗体-Cy3(绿色)和DNA-Cy5(红色)分布。在以染色质和DNA为靶向之后，抗体和DNA呈递在细胞表面以及泡***。两种荧光信号的重叠指示，大多数的抗体和DNA共同定位并且未分离。这些数据清楚地证明，在有和没有染色质组装的情况下，DNA均被靶向递送至细胞表面并经由靶向抗体而内化。通过对使用非靶向染色质复合物孵育之后的MCF7细胞的共焦显微术，确认了靶向***的特异性，因为在细胞表面以及泡内既没有检测到抗体也没有检测到DNA。再者，染色质靶向不仅导致了DNA在细胞表面和泡***内部的强烈蓄积(青色)，也导致了GFP表达(绿色)。对于在3天之后的GFP信号成像，使用未标记的抗体标记降低的染色质递送效力。为了在更详细的成像中将抗体可视化，将细胞固定，并使用抗人类IgG Cy3抗体对抗体进行复染。确认了抗体(红色)以及DNA(伪彩色表示)在泡***内部的蓄积。

也已经解决了染色质递送能否用于尺寸更大且功能更复杂的质粒DNA的问题。因此，将编码针对白喉酰胺合成基因1(DPH1)的CRISPR/Cas9敲除***的质粒与先前公布的基于白喉毒素(DT)的检测联合用于定量CRISPR/Cas9介导的基因编辑(Killian,T.等人，Sci.Rep.7(2017)15480)。这一检测使用由纯合DPH1敲除介导的DT抗性来鉴定，通过Cas9进行的细胞集落基因编辑是成功的。因此，在进行2周的连续DT选择之后，仅其中纯合DPH1被敲除的细胞存活并且显示形成集落。首先，DPH1 gRNA Cas9表达质粒上的染色质组装被转移，从而证明，组装条件适用于生成不依赖于质粒的高质量染色质。之后，使用这一染色质递送Cas9 DPH1 gRNA编码质粒，递送方式与上述用于GFP表达质粒的相同。MCF7细胞使用靶向(LeY-)Cas9 DPH1 gRNA染色质、非靶向(CD33-)Cas9 DPH1 gRNA染色质和靶向(LeY-)GFP染色质处理并孵育3天之后，将细胞暴露于DT两周。最后，固定细胞并在显微镜下计数集落。将集落数与最初接种的细胞数的比率表示为DT抗性集落的百分比，并因此表示为具有纯合基因敲除的集落的百分比。Cas9 DPH1 gRNA染色质的靶向递送导致了近乎4％DT抗性集落，而GFP对照染色质的靶向递送并未导致任何抗性集落，确认仅通过CRISPR/Cas9编辑***的表达发生了集落形成。与上文关于GFP所示的染色质靶向***的特异性一致，使用非靶向(CD33-)Cas9 DPH1 gRNA染色质处理MCF7也未导致DT抗性集落的形成。如果与来自先前实验的所测绝对CRISPR/Cas9敲除频率比较，所测定的DT抗性集落百分比大于或等于60％的表达Cas9的细胞。

讨论

靶向基因递送***的研发面对多种挑战，因为其必须克服几个障碍并因此需要良好平衡的特性(Ibraheem,D.等人，Int.J.Pharm.459(2014)70-83；Mann,A.等人，Mol.Pharm.11(2014)683-696)。例如，DNA递送***必须具有与靶标细胞的亲和性以有效介导DNA的吸收，但同时必须不与血清成分或其它细胞和组织的细胞膜相互作用以最小化DNA的丢失并避免沿着递送路径的脱靶效应(Moffatt,S.等人，Gene Ther.13(2006)761-772；Schatzlein,A.G.,J.Biomed.Biotechnol.(2003)149-158；Varkouhi,A.K.等人，J.Cont.Rel.151(2011)220-228)。此外，DNA必须转运越过膜屏障以进入胞液中，并最终到达细胞核以使得转基因表达成为可能(Cervia,L.D.等人，PLoS One 12(2017)e0171699；Sanders,N.等人，Adv.Drug Deliv.Rev.61(2009)115-127)。因此，DNA转运所需的膜相互作用必须是有效的，但同时必须是足够轻柔的以避免对细胞的细胞毒性。

根据本发明的组合物满足了这些需求。它是一个高度灵活且模块化的基因递送***。可证明，质粒DNA吸收唯一性地由靶向细胞表面处的抗体-抗原相互作用介导。这意味着，与其它只是更优先作用于靶标细胞的递送***相比，根据本发明的组合物提供一种在存在血清成分的情况下具有绝对特异性和活性的***(参阅，Wolff,J.A.and Rozema,D.B.,Mol.Ther.16(2008)8-15；McCaskill,J.等人，Mol.Ther.Nucleic Acids 2(2013)e96；Novo,L.等人，Exp.Opin.Drug Deliv.12(2015)507-512)。

根据本发明的组合物在超过90％的被处理细胞中介导质粒DNA的细胞核递送而没有细胞毒性。因此，提供一种与优化的病毒递送***相当的有效但轻柔的DNA跨膜转运机制(参阅，Munch,R.C.等人，Mol.Ther.21(2013)109-118；Veldwijk,M.R.等人，Cancer GeneTher.7(2000)597-604)。

此外，使用根据本发明的组合物生成的数据清楚地显示，促进DNA跨膜转运的关键成分是质粒DNA组织到质粒染色质中。尽管可在进行和不进行染色质组装的情况下以相当的效率和特异性将质粒DNA递送至靶标细胞，但正确组装的(并且因此是功能性的)质粒染色质介导高比率的转基因表达细胞。因此并且与先前的观察相比，组蛋白组装不影响通过非特异性膜结合进行的DNA吸收，但质粒染色质促进跨膜转运和细胞核DNA运输而无需工程化组蛋白亚基(参阅，Wagstaff,K.M.等人，Mol.Ther.15(2007)721-731和FASEB J.22(2008)2232-2242)。此外，在抗体介导的DNA或染色质细胞表面结合中没有观察到主要的差异。

值得注意的是，尽管该基因递送***即根据本发明的组合物是无毒的、灵活的、高潜力的和特异性的，但它完全由哺乳动物来源的蛋白质和肽组成。因此，预计对于细菌和病毒来源的化合物的安全性和免疫原性的担忧将会非常低。

总之，本文报告了一种用来递送质粒DNA的新颖***，其完全由无毒性的哺乳动物实体构成，具有类似于基于病毒的***的效率和绝对特异性。此外，根据本发明的组合物允许将靶向DNA递送从报告基因表达扩展至治疗上相关的***，例如，CRISPR/Cas9。

上文和下文呈递的实验结果显示，质粒-染色质的bsAb靶向递送能实现大核酸的非常有效的细胞内递送。这一递送***能使得效力(表达GFP的细胞)高达>80％，即，与病毒转染的效力相当而且好于大多数纳米颗粒/转染方法。

比较例

已经检查了适宜的质粒-染色质组装对于靶向细胞内递送效率的影响。

为了解决具有不规则或非特异性组蛋白结合的不适宜染色质组装是否影响功能性的问题，已经使用经修饰的组蛋白进行组装，该修饰借此影响染色质的形成。在上文关于根据本发明的组合物而阐明的相同条件下执行组装反应，与使用未修饰的组蛋白制备的样品相比，使用经修饰的组蛋白制备的样品的质粒染色质质量下降(参见，图12)。比较两种染色质质量对于靶向递送的影响，清楚地证明，适宜的组装对于递送效率是重要的，因为质量下降的染色质的潜力仅为高质量染色质的一半(参见，图13)。

具体实施例

1.一种用于将大核酸靶向递送至真核细胞的细胞核的组合物，其包含：

-组蛋白(一种或多种组蛋白多肽)，

-大核酸，

-半抗原，和

-双特异性结合剂，其具有对于该半抗原的第一结合特异性和对于呈递在该真核细胞上的细胞表面靶标的第二结合特异性(双特异性结合剂，其具有特异性地结合至该半抗原的第一结合位点和特异性地结合至呈递在该真核细胞上的(细胞表面)靶标的第二结合位点)，

其中

-该组蛋白和/或该核酸共价地结合/缀合至该半抗原，

-该组蛋白和该大核酸彼此(非共价地)缔合/形成非共价复合物/形成核小体，并且

2.根据实施例1所述的组合物，其中该组合物包含足够数目组蛋白多肽，以便将大核酸组装至一个或多个核小体中。

3.根据实施例1至2中任一项所述的组合物，其中至多/大约/约1个核小体每150bp大核酸DNA/质粒DNA。

4.根据实施例1至2中任一项所述的组合物，其中该组合物包含约8个组蛋白多肽每至多150bp大核酸/1个核小体每至多150bp大核酸。

5.根据实施例1至4中任一项所述的组合物，其中该组蛋白是(一种或多种组蛋白多肽是)组蛋白H2A、H2B、H3和H4(多肽)的混合物。

6.根据实施例1至5中任一项所述的组合物，其中该组蛋白多肽是小牛胸腺组蛋白、鸡红细胞组蛋白、重组人组蛋白或它们的混合物。

7.根据实施例1至6中任一项所述的组合物，其中该组蛋白是(一种或多种组蛋白多肽是)重组人组蛋白(多肽)。

8.根据实施例7所述的组合物，其中该重组人组蛋白多肽未经化学衍生化或缀合至半抗原。

9.根据实施例1至6中任一项所述的组合物，其中该组蛋白是(一种或多种组蛋白多肽是)小牛胸腺组蛋白(多肽)。

10.根据实施例1至9中任一项所述的组合物，其中该组蛋白是(一种或多种组蛋白多肽是)组蛋白H2A和组蛋白H3(多肽)的混合物。

11.根据实施例1至10中任一项所述的组合物，其中该组蛋白(多肽)是重组人组蛋白H3。

12.根据实施例11所述的组合物，其中该重组人组蛋白(多肽)是重组人组蛋白3.1或3.3。

13.根据实施例1至12中任一项所述的组合物，其中

i)人组蛋白H2A具有SEQ ID NO:01所示的氨基酸序列，

ii)牛组蛋白H2A具有SEQ ID NO:02所示的氨基酸序列，

iii)鸡组蛋白H2A具有SEQ ID NO:03所示的氨基酸序列，

iv)人组蛋白H2B具有SEQ ID NO:04所示的氨基酸序列，

v)牛组蛋白H2B具有SEQ ID NO:05所示的氨基酸序列，

vi)鸡组蛋白H2B具有SEQ ID NO:06所示的氨基酸序列，

vii)人组蛋白H3.1具有SEQ ID NO:07所示的氨基酸序列，

viii)人组蛋白H3.3具有SEQ ID NO:08所示的氨基酸序列，

ix)牛组蛋白H3.3具有SEQ ID NO:09所示的氨基酸序列，

x)鸡组蛋白H3.3具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，

xi)人组蛋白H4具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，

xii)牛组蛋白H4具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，

xiii)鸡组蛋白H4具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

14.根据实施例1至13中任一项所述的组合物，其中该大核酸是一个大核酸分子。

15.根据实施例1至14中任一项所述的组合物，其中该大核酸选自包含至少一个表达盒的表达质粒。

16.根据实施例1至15中任一项所述的组合物，其中该大核酸包含1,000和100,000个之间的核苷酸或碱基对。

17.根据实施例16所述的组合物，其中该大核酸包含1,250和20,000个之间的核苷酸或碱基对。

18.根据实施例16至17中任一项所述的组合物，其中该大核酸包含1,500和10,000个之间的核苷酸或碱基对。

19.根据实施例1至18中任一项所述的组合物，其中该组蛋白是小牛胸腺组蛋白，并且该组合物包含约2μg组蛋白每μg大核酸。

20.根据实施例1至18中任一项所述的组合物，其中该组蛋白是重组人组蛋白，并且该组合物包含约0.8-1μg组蛋白每μg大核酸。

21.根据实施例1至18中任一项所述的组合物，其中该组蛋白是鸡红细胞组蛋白，并且该组合物包含约1μg组蛋白每μg大核酸。

22.根据实施例1至21中任一项所述的组合物，其中组合物包含至少一个半抗原分子。

23.根据实施例1至22中任一项所述的组合物，其中组合物包含两个或更多个半抗原分子，并且两个或更多个半抗原分子是相同的半抗原分子或不同的半抗原分子。

24.根据实施例1至23中任一项所述的组合物，其中该半抗原选自生物素、洋地黄毒苷、茶碱、溴脱氧尿苷、荧光素、DOTAM和螺旋体基序多肽。

25.根据实施例1至24中任一项所述的组合物，其中该半抗原化学缀合至该(一个或多个)组蛋白(多肽)或大核酸。

26.根据实施例1至24中任一项所述的组合物，其中该半抗原化学缀合至DNA结合肽，该DNA结合肽附接至该大核酸。

27.根据实施例1至26中任一项所述的组合物，其中每个组蛋白多肽缀合至单个半抗原分子和/或该大核酸分子缀合至至少一个半抗原分子。

28.根据实施例1至27中任一项所述的组合物，其中该双特异性结合剂选自双特异性抗体、双特异性支架、双特异性肽、双特异性适配体、双特异性低分子量结构。

29.根据实施例1至28中任一项所述的组合物，其中该双特异性结合剂选自双特异性全长度抗体、双特异性CrossMab、双特异性T细胞双特异性、DAF和DutaMab。

30.根据实施例1至29中任一项所述的组合物，其中该双特异性结合剂是双特异性结合剂片段。

31.根据实施例1至30中任一项所述的组合物，其中该双特异性结合剂片段选自DutaFab、F(ab')2、串联scFv、双抗体、tandAb、scFv2-CH1/CL和VHH2-CH1/CL。

32.根据实施例1至31中任一项所述的组合物，其中该(细胞表面)靶标是内化细胞表面受体。

33.根据实施例1至32中任一项所述的组合物，其中该细胞表面靶标是内化细胞表面受体，其选自由以下组成的组：细胞类型特异性碳水化合物；受体酪氨酸激酶诸如HER1、HER2、HER3；IGF1R；细胞类型特异性抗原诸如Mesothelin、PSMA、CD19、CD20、CD44、TfR、LRP、IL-受体。

34.根据实施例1至33中任一项所述的组合物，其中组合物包含该双特异性结合剂的一个或多个分子。

35.根据实施例1至34中任一项所述的组合物，其中该半抗原是生物素，该双特异性结合剂是双特异性抗体，并且该第一结合特异性是包含下列的一对抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域：(a)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列的HVR-H2、(c)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-H3、(d)包含SEQID NO:27的氨基酸序列的HVR-L1、(e)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-L3。

36.根据实施例1至34中任一项所述的组合物，其中该半抗原是洋地黄毒苷，该双特异性结合剂是双特异性抗体，并且该第一结合特异性是包含下列的一对抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域：(a)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQID NO:16的氨基酸序列的HVR-H2、(c)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-H3、(d)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-L1、(e)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-L3。

37.根据实施例1至34中任一项所述的组合物，其中该半抗原是茶碱，该双特异性结合剂是双特异性抗体，并且该第一结合特异性是包含下列的一对抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域：(a)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H2、(c)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HVR-H3、(d)包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列的HVR-L1、(e)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQID NO:37的氨基酸序列的HVR-L3。

38.根据实施例1至34中任一项所述的组合物，其中该半抗原是荧光素，该双特异性结合剂是双特异性抗体，并且该第一结合特异性是包含下列的一对抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域：(a)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列的HVR-H2、(c)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HVR-H3、(d)包含SEQID NO:43的氨基酸序列的HVR-L1、(e)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-L3。

39.根据实施例1至34中任一项所述的组合物，其中该半抗原是溴脱氧尿苷，该双特异性结合剂是双特异性抗体，并且该第一结合特异性是包含下列的一对抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域：(a)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQID NO:48的氨基酸序列的HVR-H2、(c)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HVR-H3、(d)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HVR-L1、(e)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HVR-L2和(f)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HVR-L3。

40.根据实施例1至34中任一项所述的组合物，其中该半抗原是SEQ ID NO:57的螺旋体基序多肽，该双特异性结合剂是双特异性抗体，并且该第一结合特异性是包含下列的一对抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域：SEQ ID NO:55的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，以及SEQ ID NO:56的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。

41.根据实施例1至40中任一项所述的组合物，其中每个半抗原被一个/单个双特异性结合剂特异性地结合。

42.根据实施例1至41中任一项所述的组合物，其中该大核酸编码CRISPR/Cas9。

43.根据实施例1至41中任一项所述的组合物，其中该大核酸包含：

-CRISPR/Cas***核酸，和/或

-哺乳动物细胞内源多肽的表达盒，和/或

44.一种药物制剂，其包含根据实施例1至43中任一项所述的组合物以及药学上可接受的载体。

45.根据实施例1至43中任一项所述的组合物用作药品的用途。

46.根据实施例1至43中任一项所述的组合物用于基因疗法中的用途。

47.根据实施例1至43中任一项所述的组合物在制造药品中的用途。

48.一种治疗患有遗传性疾病的个体的方法，其包括向该个体施用有效量的根据实施例1至43中任一项所述的组合物。

49.一种改变个体的细胞中基因表达的方法，其包括向该个体施用有效量的根据实施例1至43中任一项所述的组合物以改变基因表达。

50.一种用于制备根据实施例1至43中任一项所述的组合物的方法，其包括以下步骤：

b)使用双特异性结合剂孵育在a)中形成的大核酸-组蛋白复合物以生成双特异性结合剂-大核酸-组蛋白复合物，

c)分离和/或纯化在步骤b)中形成的双特异性结合剂-大核酸-组蛋白复合物，从而产生根据实施例1至43中任一项所述的组合物。

51.一种用于将大核酸引入真核细胞中的方法，其包括以下步骤：

a)在适用于将该双特异性结合剂结合至细胞表面靶标的条件下，使用根据实施例1至43中任一项所述的组合物孵育真核细胞，

52.一种转染真核细胞的方法，其包括以下步骤：

53.一种将大核酸转运至真核细胞内的方法，其包括以下步骤：

54.一种将大核酸转运至真核细胞的细胞核内的方法，其包括以下步骤：

55.根据实施例1至43中任一项所述的组合物用于将大核酸靶向递送至真核细胞内的用途。

56.根据实施例1至43中任一项所述的组合物用于将大核酸或其功能片段引入真核细胞的细胞核内的用途。

57.根据实施例1至43中任一项所述的组合物，其中该组合物用于将大核酸其功能片段引入真核细胞内。

58.根据实施例1至43中任一项所述的组合物，其中该组合物用于以大核酸或其功能片段转染真核细胞。

59.一种使用根据实施例51至54中任一项所述的方法获得的细胞及其子代。

60.一种用大核酸转染真核细胞群体的确定亚群体的方法，其包括以下步骤：

-使用根据权利要求1至43中任一项所述的组合物孵育真核细胞群体，该真核细胞群体包括至少两个在至少一个细胞表面抗原中有所区别的亚群体，其中该双特异性结合剂的第二结合特异性特异性地结合至仅呈递在该真核细胞群体的一个亚群体上的细胞表面抗原，从而以大核酸转染真核细胞群体的确定亚群体。

提供以下实例、序列和附图来辅助理解本发明，本发明的真实范畴在所附权利要求书中阐述。应理解，可在阐述的过程中做出改变而不悖离本发明的精神。

附图简要说明

图1所采用的模块和用于生成实体的工艺步骤的示意性概述，这些实体能够进行质粒的特异性靶向且有效的细胞内递送。

A：半抗原化学缀合至质粒-染色质；

B：半抗原经由DNA结合肽附接。

图2通过琼脂糖凝胶电泳分析所组装的染色质；使用小牛胸腺组蛋白八聚体和eGFP表达质粒组装染色质。

A：通过微球菌核酸酶消化分析染色质质量；在组蛋白组装之前(DNA)和之后(染色质)，将peGFP用Mnase处理所指示的时间点(20、80和270秒)。

B：单独使用质粒DNA和使用以所指示的ng(组蛋白)：ng(DNA)比率组装的染色质进行EMSA位移检测。

图3通过化学缀合生成半抗原化的质粒-染色质并经由与链霉亲和素的相互作用进行分析。将8μg/mL染色质用链霉亲和素浸渍液孵育10分钟(以时间框60秒至660秒显示)。层厚度的增益指示染色质结合至Octet***的浸渍液，通过吸收的增加测量：

A：通过赖氨酸侧链缀合来生成生物素化染色质与链霉亲和素的结合；

B：通过在核小体组装之前的质粒DNA生物素化来生成生物素化染色质与链霉亲和素的结合；

C：通过施加生物素化组蛋白进行染色质组装来生成生物素化染色质与链霉亲和素的结合。

图4质粒DNA与肽组装：

A：用来测定细胞穿透肽的DNA结合特性的EMSA位移：在使用衡量(0.5μg)的DNA和递增量(1μg、2μg、4μg)的各种肽以三角形孵育之后，执行凝胶位移。

B：微型热泳分析(MST)：对所指示的肽以5μM和10μM肽浓度执行MST。用肽FALLNRTN和CPXM2孵育DNA，导致荧光的增加。用不带电的HisFALL肽孵育DNA，未导致荧光信号的增加。

图5通过附接半抗原化的DNA结合肽来生成半抗原化的质粒-核小体：

将10μg/mL染色质用链霉亲和素浸渍液孵育15分钟。层厚度的增益指示染色质结合至Octet***的浸渍液，通过吸收的增加测量。该图示出，通过附接bio-CPXM2肽，生成了生物素化的质粒-染色质。

图6生物素化的质粒-染色质与半抗原结合bsAb的复合作用。将蛋白A浸渍液暴露于并结合生物素结合bsAb或洋地黄毒苷结合bsAb(第1结合曲线)。接着，通过第2结合曲线呈递对生物素化的或洋地黄毒苷化的质粒-染色质的暴露和结合：

A：形成bsAb与通过染色质的化学缀合而生物素化的质粒-染色质的复合物；

B：形成bsAb与在染色质组装之前通过质粒DNA的化学缀合而生物素化的质粒-染色质的复合物；

C：形成bsAb与通过将生物素化的DNA结合肽加入质粒-染色质中而获得的生物素化质粒-染色质结合的复合物；

D：形成bsAb与通过将洋地黄毒苷化的DNA结合肽加入质粒-染色质中而获得的洋地黄毒苷化质粒-染色质结合的复合物。

图7将bsAb靶向质粒和质粒-染色质递送至靶标细胞：半抗原化质粒DNA(LeY-DNA)的BsAb靶向递送和内化；经由肽附接而半抗原化的质粒-染色质(LeY-染色质)的bsAb靶向递送和内化；用对照bsAb和经由肽附接而半抗原化的质粒染色质(CD33-染色质)处理。

图8bsAb靶向肽-质粒组装体的细胞内递送和细胞内功能性。

bsAb靶向细胞内质粒递送使得GFP表达能够在靶标细胞中进行(左图)但不能在非靶标细胞中进行(右图)。

图9bsAb靶向质粒-染色质复合物的细胞内递送和功能性：

A：bsAb靶向肽-质粒-染色质递送成分的生成；

B：2+1TriFab格式；将通过双特异性tripleFab进行的染色质(通过加入肽而洋地黄毒苷化)递送与PEI转染进行比较；

C：2+2bsAb格式；通过二价双特异性抗体实现的染色质(通过加入肽而洋地黄毒苷化)的靶向；

D：复合染色质与不同dig-肽的递送效力的比较；

E：通过双特异性抗体和CPXM2肽实现的靶向染色质的荧光显微术图像；

F：通过化学缀合而生物素化的染色质的TriFab介导靶向：将以所指示量的NHS-生物素标记的染色质用抗LeY抗生物素TriFab孵育。用预孵育的TriFab-染色质处理MCF7细胞，TriFab-染色质的最终浓度为8μg染色质/mL和120nM TriFab或两个浓度的四分之一。

图10携带鸡组蛋白或重组人组蛋白的质粒-染色质的靶向递送：

A：用包含双特异性抗体、肽和与鸡红细胞组蛋白组装的染色质的染色质靶向***处理。用细胞表面靶向构造体(LeY-染色质)处理48小时之后，导致10％荧光细胞，相比之下，用非靶向构造体(CD33-染色质)处理则具有背景水平的荧光信号；

B：将各种重组组蛋白八聚体与小牛胸腺组蛋白进行比较。包含具有未修饰的组蛋白3.3亚基的重组组蛋白八聚体的靶向***示出了与小牛胸腺组蛋白相当的递送效力，而包含亚基3.1的染色质显示了略有下降的递送效力。与相对应的未修饰的变型相比，亚基H3的特异性生物素化降低了递送效力；

C：测试了上述B中与组蛋白组装的染色质的质量。使用小牛胸腺组蛋白(1)、具有人类H3.1的重组组蛋白八聚体(2)和具有人类H3.3的重组组蛋白八聚体(4)获得了高质量染色质，因为其带型清晰并且仅有少量的亚核体DNA。与具有人类H3.1(3)和人类H3.3(5)的重组组蛋白八聚体的生物素化变型组装的染色质导致了低质量染色质，因为仅一条带占支配地位并且具有很宽的亚核体拖尾(smear)。

图11以抗体靶向质粒-染色质形式递送的CRISPR/Cas9编码质粒的细胞内递送和活性。作为经由靶向质粒递送导致DPH1基因失活的后果，暴露于LeY靶向质粒-染色质的MCF7细胞(LeY+++，CD33-)变成是DT抗性的。在接受不通过抗体靶向至细胞的质粒-染色质的细胞群体中，没有观察到标志着DPH1基因失活的DT/抗性。

图12通过分析性核酸酶消化和琼脂糖凝胶电泳将高质量和低质量质粒染色质可视化。箭头指示递增的MNase孵育时间。使用人类重组组蛋白八聚体获得了高质量质粒染色质，因为分析性核酸酶消化导致了清晰的带型，仅有少量的亚核体DNA。使用包含生物素化H3.3亚基的人类重组组蛋白八聚体获得了低质量质粒染色质，因为分析性核酸酶消化并未导致清晰的带型，存在高比例的亚核体DNA。通过占支配地位的150-200bp带，确认了组蛋白的部分且不规则的结合。

图13测试了高质量和低质量染色质的递送效力。低质量染色质样品显示降低的递送效力，强调了适宜染色质组装在DNA递送效力上的重要性。

图14递送特异性的流式细胞术测定；在孵育1小时之后，通过流式细胞术分析抗体-Cy3和DNA-Cy5的结合和吸收(在染色质组装之前和之后)。在使用靶向(抗LeY；红色虚线)和非靶向(抗CD33；蓝色虚线)DNA-Cy5复合物处理之后，MCF7细胞的直方图。仅在使用靶向DNA-Cy5构造体处理之后检测到Cy5信号。

图15递送特异性的流式细胞术测定；在孵育1小时之后，通过流式细胞术分析抗体-Cy3和DNA-Cy5的结合和吸收(在染色质组装之前和之后)。在使用靶向(红色)和非靶向(蓝色)染色质-Cy5复合物处理后，MCF7细胞的直方图。结果与在DNA-Cy5递送之后的结果相当。

图16递送特异性的流式细胞术测定；在孵育1小时之后，通过流式细胞术分析抗体-Cy3和DNA-Cy5的结合和吸收(在染色质组装之前和之后)。在使用包含Cy3标记的抗体和Cy5标记的DNA的各种抗体染色质复合物处理之后，MCF7 Cy3(x轴)和Cy5(y轴)信号的等值线图。用包含不具抗细胞表面抗原特异性但具有抗CPXM2肽特异性的抗体的复合物处理的细胞不显示Cy3和Cy5信号(蓝色)。用包含具有抗细胞表面特异性但不具抗bio-CPXM2(抗洋地黄毒苷而非抗生物素bsAb)特异性的抗体的复合物处理的细胞表现出Cy3信号但没有Cy5信号，证明是抗体而非染色质呈递在细胞表面上(绿色)。用包含具有抗细胞表面特异性和抗CPXM2特异性的抗体的复合物处理的细胞表现出Cy3信号和Cy5信号，证明抗体和染色质呈递在细胞表面上(红色)。

实例

实例1

质粒DNA与组蛋白组装以生成质粒-染色质

组蛋白与DNA的组装可通过体外盐梯度渗析以各种规模有效地实现。

使用下列制备反应混合物：在300μL 200ng/mL BSA(Sigma)1倍低盐缓冲液(10mMTris-HCl pH 7.6、50mM NaCl、1mM EDTA、0.05％w/v Igepal CA630)中的150-400μg/mL质粒DNA、2M NaCl和不同量的组蛋白八聚体(小牛胸腺：2μg组蛋白每μg pEGFP质粒DNA或Cas9DPH1gRNA质粒DNA；人类重组组蛋白：0.8-1μg组蛋白每μg pEGFP质粒DNA；鸡红细胞组蛋白：1μg组蛋白每μg pEGFP质粒DNA)。将反应混合物转移至3.5kDa MWCO迷你渗析装置(ThermoFisher Scientific)中，在高盐缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.6、2M NaCl、1mM EDTA、0.05％w/v Igepal CA630)中平衡15分钟。之后，准备一个具有300mL含1mMβ-巯基乙醇的高盐缓冲液的4L烧杯和一个具有3L含1mMβ-巯基乙醇的1倍低盐缓冲液的第二烧杯。将浮子和磁力搅拌棒加入具有高盐缓冲液的烧杯中。在4℃执行盐梯度渗析过夜。因此，缓慢搅拌放置在磁力搅拌器上的烧杯，并且设定蠕动泵以将3L的低盐缓冲液以约300mL/h的速度转移至含有高盐缓冲液的烧杯中。在缓冲液稀释之后，将样品转移至蛋白质低结合管(Eppendorf)中，并通过移液测定体积。

用于染色质组装的质粒包含以下元件：

-pEGFP-AmpR(3967bp)：

-eGFP表达盒(CMV启动子；eGFP编码序列；SV40 PolyA)

-F1复制起点

-氨苄青霉素抗性基因

-Cas9 DPH1 gRNA(8033bp)：

-hU6启动子

-DPH1 gRNA转录模板

-Cas9转录启动的CMV启动子

-包括Myc-Tag和Flag-Tag的Cas9编码序列

-pBR322复制起点

-氨苄青霉素抗性基因

实例2

使用EMSA评估所组装的质粒染色质的电荷抗性

在将组蛋白组装体加载至1％溴化乙锭琼脂糖凝胶中之前和之后，使用500ng的DNA，通过EMSA位移检测来分析染色质的总体电荷，其中位移在180V执行45分钟。

实例3

评估所组装的质粒染色质的核酸酶抗性

对于核酸酶敏感性检测，将2μg的与染色质组装的DNA在缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 7.6、80mM KCl、10％v/v甘油、1.5mM MgCl₂、1mM DTT)和1μL BSA中稀释到50μL的最终体积。为了终止反应，准备了具有4μL终止缓冲液(100mM EDTA、4％w/v十二烷基硫酸钠)的1.5mL管。通过加入50μL MNase混合物(6mM CaCl₂、200ng/μL BSA和40U MNase)开始核酸酶消化。在所指示的时间点之后，将30μL的反应混合物转移至含有终止缓冲液的管内。通过加入1μL蛋白酶K并且在50℃孵育1小时，将DNA脱蛋白化。DNA通过乙醇沉淀纯化并且通过琼脂糖凝胶电泳分析。

实例4

半抗原化质粒-染色质的生成

为了将半抗原偶联至质粒-染色质，在组蛋白与eGFP编码质粒(详情参见实例1)组装之后，通过体积排阻色谱纯化染色质。接着，通过NHS-生物素试剂的化学缀合将生物素附接至所组装的组蛋白八聚体的赖氨酸侧链。因此，在纯化之后，根据制造商的使用说明书，使组装至染色质的100μg DNA进行生物素-XX微型蛋白质标记试剂盒(Thermo FisherScientific)的反应。在生物素化之后，通过7kDa MWCO Zeba旋转脱盐柱(Thermo FischerScientific)移除游离的未反应生物素化试剂。接着，通过使用ForteBio Octet***以链霉亲和素涂层浸渍法测定所得缀合物与链霉亲和素的结合，评估生物素与染色质的附接。对于Octet分析，将生物素缀合的质粒-染色质(Bio-染色质)在210μL PBST缓冲液中稀释到8μg/mL的最终浓度。此后，在30℃，在1000rpm恒速振荡下执行分析。图3A示出，在化学缀合反应之后，质粒-染色质结合至链霉亲和素(Octet分析)。这证实了生物素已经附接至质粒-染色质。

作为另一种选择的将生物素偶联至质粒-染色质的方法是，在执行实例1中所述的核小体/染色质组装之前，将生物素化学缀合至质粒-DNA(采用Label

核酸标记试剂盒，Mirus，根据制造商的使用说明书)。图3B示出，这一过程也导致生物素化的质粒-染色质，通过其结合链霉亲和素的能力表示。

最后，可将商业上可获得的生物素化组蛋白(Active Motif)用于实例1中所述的染色质组装反应中，以生成生物素化的质粒-染色质(图3C)。

实例5

衍生自人类蛋白质的半抗原化肽与质粒DNA的结合

通过EMSA位移检测和/或通过微型热泳分析(MST)来分析肽与质粒DNA的相互作用。

对于EMSA，将500ng的DNA与各种量的肽孵育30分钟。将具有或不具有肽的DNA样品加载至含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中。EMSA位移以180V执行45分钟，并且通过紫外线下凝胶成像器(BioRad)分析。

MST测量质粒DNA在施加温度梯度之后的移动。如果配体(例如，肽)结合至质粒DNA分子，则这一移动改变。因此，如果该移动在肽的存在下改变，则肽与DNA之间发生相互作用。通过肽浓度为5μM和10μM的2bind GmbH(Regensburg)执行MST，检测在以DNA孵育后的荧光增加作为肽与DNA结合的读数。

这些分析的结果显示在图4A(EMSA位移检测)和图4B(MST)中。两种技术都将结合DNA的肽与不结合DNA的肽区分开来。这些实验的结果(汇总在下表中)指示，几种人类肽结合质粒DNA并因此可用来将半抗原附接至质粒DNA。这些包括衍生自人类P53、NRTN、FALL、CPXM2、WNT、ASM3B及其衍生物的肽。

实例6

bsAb靶向肽-质粒组装体的细胞内递送和功能性

通过将GFP表达质粒在PBS中用洋地黄毒苷标记的NRTN肽和双特异性LeY-DigbsAb孵育1小时，生成递送复合物。此后，将复合物加入接种在96孔板中的MCF7细胞中，直到最终浓度为4μg/mL质粒DNA、10μM肽和300nM抗体。48小时之后，对所处理的细胞进行荧光显微术成像。这些分析的结果在图8中示出。成像荧光显微术显示，在以非靶向CD33-bsAb-质粒复合物处理的细胞群体中完全不存在荧光。相比之下，在接受细胞表面靶向LeY-bsAb-质粒复合物的LeY+++/CD33-MCF7细胞中，可检测到表达GFP的细胞。使用含抗细胞表面抗原LeY的抗体的复合物进行的处理明显地显示了单个GFP表达细胞(群体的～2％，左图)，而使用含抗CD33抗体的复合物处理的细胞(右图)未显示任何高于背景的GFP表达。因此，半抗原化肽-DNA复合物的bsAb靶向特异性递送和蓄积使其能够被大量吸收到细胞的细胞质/细胞核中，造成一定程度的GFP表达。

实例7

bsAb靶向肽-染色质组装体的细胞内递送和功能性

eGFP荧光

为了显示bsAb靶向肽-染色质组装体的细胞内递送和功能性，将表达LeY的MCF7乳腺癌细胞暴露于同时结合LeY抗原和洋地黄毒苷或生物素的bsAb，该bsAb与洋地黄毒苷化或生物素化的肽(例如，Dig-CPXM2、Dig-p53和Dig-Wntp53或Bio-CPXM2)复合。作为特异性靶向的对照物，在独立的实验中将质粒染色质复合到dig或bio结合bsAb，其识别不存在于MCF7细胞上的CD33抗原。

通过将GFP表达质粒在PBS中用dig/bio标记的肽(例如，Dig-CPXM2或Bio-CPXM2)以及作为对照抗体的双特异性LeY-Dig/Bio bsAb或双特异性CD33-Dig/Bio bsAb孵育至少一小时，生成递送复合物。此后，将复合物加入接种在12孔板中的MCF7细胞(80,000个细胞/孔)中，直到最大最终浓度为8μg/mL组装至染色质的质粒DNA、500nM肽和250nM抗体。48小时之后，通过流式细胞术使用FACSCanto II(BD Biosciences)进行荧光细胞的定量。

CRISPR/Cas：

同样，已经对编码CRISPR/Cas9敲除***的质粒至细胞核的靶向递送进行分析，以显示通过如本文所报告的组合物递送的大核酸的细胞内递送和活性。

因此，使用抗DPH1基因的CRISPR/Cas9编码质粒而非eGFP质粒，如上所述执行染色质组装反应。先前已经描述，基因编辑介导的DPH1失活与对于白喉毒素(DT)的细胞敏感性的评估联合，可用来定量基因编辑的效力(参见，例如，WO 2018/060238；Killian,T.等人，Sci.Rep.7(2017)15480)。DPH1的所有细胞拷贝的失活(作为基因编辑的后果)转而使得细胞具有DT抗性。这生成了非常稳健的读数，其可通过在基因编辑之后计数DT抗性集落进行定量。

将复合物加入接种在12孔板中的MCF7细胞(2,000个细胞/孔)中，直到最大最终浓度为8μg/mL组装至染色质的质粒DNA、500nM肽和250nM抗体。处理72小时之后，移除培养基，并将细胞暴露于最终浓度为2nM的含DT培养基中。DT暴露继续进行两周，每3至4天更换一次培养基。这一时间段之后，细胞用亚甲基蓝染色，并通过测定如Killian等人先前描述的DT耐性集落来评估编辑成分的细胞内递送效力和表达(Killian,T.等人，Sci.Rep.7(2017)15480；WO 2018/060238)。结果在图11中示出。

实例8

通过共聚焦显微术监控靶向质粒DNA或染色质的细胞内路线和功能性

为了能够进行对质粒DNA和质粒染色质的靶向和路线进行荧光显微术分析，采用Label

核酸标记试剂盒(Mirus)，根据制造商的使用说明书，将Cy5荧光染料化学缀合至质粒-DNA。为了生成荧光质粒染色质，如实例1中所述，使用Cy5标记的质粒执行染色质组装。

对于活细胞成像，将MCF7细胞(NCI)在不含苯酚红并且以10％胎牛血清(FCS)和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素补充的RPMI培养基中培养。将20,000个细胞/孔接种至8孔室载玻片(Lab-Tek^TM,Thermo Fisher Scientific,Braunschweig,Germany)上并令其粘附过夜。玻璃表面已经用PBS中的30μg/ml纤连蛋白在37℃涂覆一小时。如实例7中所述，形成抗体质粒DNA-Cy5和抗体-质粒染色质-Cy5复合物。将样品加入MCF7中，最终浓度为4μg/mL质粒DNA、250nM肽和125nM抗体。在加入之后1小时、4小时、24小时和48小时，使用活细胞荧光显微术跟踪抗体-染色质复合物的内化和GFP表达，跟踪在Leica SP5激光扫描共焦显微镜上使用63×/1.2NA水浸物镜(Leica,Mannheim,Germany)进行。使用台面孵育室(Oko-touch,Okolab,Ottaviano,Italy)将温度、CO₂水平和湿度维持在37℃和5％CO₂。在488nm(561nm)和633nm使用白光激光激发执行序列扫描。使用HyD检测器在495-548nm(GFP)、570-628nm(Cy3)和647-732nm(Cy5)检测荧光发射。用ImageJ(NIH,Bethesda,MD,USA)处理图像。